1Análisis Avanzado de Alimentos M Mé étodos electroqu todos electroquí ímicos para el micos para el an aná álisis de alimentos. lisis de alimentos. Métodos espectroscópicos: respuesta de la interacción de radiación electromagnética con el material en análisis. Métodos electrométricos: se basan en la cuantificación de analitos a través de su interacción con corrientes eléctricas. Medición Método Diferencia de potencial Potenciometría Resistencia (conductancia) Conductimetría Corriente vs. voltaje Polarografía Corriente vs. concentración Amperometría Corriente vs. tiempo Coulombimetría Otros: Movilidad Electroforesis Métodos electrométricos: Ejemplos del empleo de métodos electroanalíticos en el análisis de alimentos Principio Ejemplos Potenciometría Electrodos ión selectivos. Titulaciones potenciométricas. Polarografía Electrodo para O 2 Amperometría Electrodos enzimáticos. Coulombimetría Detectores para CG. Tit. automáticos para K.Fischer. Conductimetría Detectores: para cromatografía (HPLC, IC, GC), electroforesis capilar. Determinación de contenido de agua. Propiedades dieléctricas det. de cont. de agua Características mecánicas de los materiales 2 Potenciometría. Electrodos ión-selectivos. Determinación de concentraciones a través de mediciones de potencial Celda de medición: electrodo ión-selectivo (o indicador) + electrodo de referencia + dispositivo de medida. Ión solución Ión membrana Las cargas transportadas durante este proceso generan la diferencia de potencial en la capa límite, cuyo valor depende de la actividad del ión en la solución, a través de la ecuación de Nernst. El voltaje total de la celda de medida es: E = Eo + (RT/z i F) ln a i E es el voltaje de la celda de medida E o es el voltaje de de la celda de medida en condiciones estándar R es la constante de los gases T es la temperatura (en K) z i es la carga del ión F es la constante de Faraday a i es la actividad del ión en cuestión Pendiente de Nernst Tipos de electrodos La composición de la membrana es decisiva para establecer a qué ión o compuesto será selectivo el electrodo. Se puede diferenciar entre membranas: Vidrio Membrana cristalina Membrana líquida Además de comp. iónicos se pueden determinar los gases disueltos en equilibrio con un ión, y sustratos que forman iones durante transformaciones enzimáticas. Membranas de estado sólido. La más empleada es la de vidrio. Los electrodos de vidrio son los electrodos ión- selectivos más ampliamente empleados para la medición de iones H + . Para valores de pH muy altos (pH>10) o muy bajos ( pH<1) hay desviaciones, cuya magnitud depende de la composición de la membrana. 3 pared externa pared interna (E) 1 (H + ) 1 (H + ) 2 = cte (E) 2 Electrodo de vidrio (pH) Electrodo selectivo de H 3 O + Fundamento: Los iones H 3 O + se fijan parcialmente sobre la pared externa e interna de la membrana de SiO 2 y la diferencia de concentraciones, genera un potencial eléctrico (de membrana E M ). Electrodo combinado de pH. El electrodo de referencia externo se incorpora dentro del dispositivo. Electrodos de membrana cristalina se construyen con un precipitado muy poco soluble del elemento en cuestión (por ejemplo, AgCl, AgBr, AgI, Ag 2 S, que sirven para Ag o los aniones). El más conocido es el de F - , realizado con LaF 3 que se emplea para determinar F - en productos de uso dental. Con estos electrodos se pueden determinar Cd +2 , Pb +2 , Cu +2 , CN - . Electrodo de Cl - Existen distintos diseños comerciales que responden a distintos tipos de aniones y cationes. 4 Electrodos de membrana líquida consisten en un solvente orgánico no miscible con agua en el que se disuelven intercambiadores de iones, o ionóforos. El soporte de la solución son discos porosos de plástico que absorben el líquido. Los intercambiadores de iones pueden ser tanto intercambiadores de cationes (como fosfatos sustituidos que responden a Ca ++ o Zn ++ ), o intercambiadores aniónicos (como el ión caprilmetilamonio). Electrodos de membrana líquida El intercambiador líquido forma complejos con el analito. A uno y otro lado de la interfase, tiene lugar el intercambio: [(RO) 2 POO] 2 Ca 2(RO) 2 POO- + Ca 2+ orgánico orgánico acuoso La diferente concentración de Ca 2+ a ambos lados genera un incremento en el valor del potencial que se puede medir Ejemplos Ion intervalo respuesta interferencias Electrodos sensibles a los gases. Son electrodos ión-selectivos que responden a compuestos no iónicos debido a un equilibrio pre- existente entre un gas y la solución en la que los iones son producidos. 5 Electrodo para CO 2 Emplea una membrana permeable al gas, para separar la solución de la muestra de la solución interna del electrodo. El CO 2 disuelto en la muestra difunde a través de la membrana hasta que se alcanza el equilibrio entre la presión parcial de CO 2 en la muestra y en la solución interna del electrodo. CO 2 + H 2 O H + + HCO 3 - [H + ] [HCO 3 - ] = constante CO 2 La concentración de HCO 3 - se puede considerar constante, y H + = CO 2* constante E = E o + k. log H + Donde: E: potencial medido E o : potencial de referencia (una constante) H + : concentración de iones H k: pendiente del electrodo. De esta manera, la concentración de CO 2 es directamente proporcional a la concentración de H + E = E o + k. log CO 2 Electrodo para amoníaco El NH 3 en la solución de análisis difunde a través de una membrana de teflón, por la cual los compuestos iónicos no pasan, hasta el electrolito interno. Esto causa un cambio de pH, de acuerdo con: NH 3 + H 2 O NH 4 + + OH - Este cambio de pH se detecta por medio de un pHmetro. APLICACIONES DE ELECTRODOS SELECTIVOS Nitrato y nitrito en alimentos base de carnes. Determinación de cloruros. Floruros en agua, bebidas etc. Calcio en leche Potasio en jugo de frutas. Nitrato, potasio calcio y cloruro en suelo y aguas Control analítico de cianuro,fluoruro sulfuro en efluentes, aguas naturales..etc 6 Estación de Trabajo para Titulaciones Potenciométricas Alimentos y bebidas · Número de peróxido: grasas y aceites comestibles · Cloruros: leche, manteca, otros lácteos · Acido ascórbico: jugos de frutas y alimentos en general Medio ambiente y Agua · pH y alcalinidad · Calcio y Magnesio · Sulfato · Demanda química de oxígeno (DQO) Industria química y farmacéutica · Determinaciones ácido-base en medio acuoso / no acuoso . Karl Fisher · Determinaciones redox Otra aplicación de los electrodos de pH: Determinación de la actividad enzimática Como consecuencia de la actividad enzimática se generan o se consume protones, lo que causa un cambio de pH. Se puede mantener el pH constante y luego medir la catidad de ácido o base empleados. Sistema pH-stat Ej. para determinación de lipasa, esterasa, proteasa, colinesterasa Polarografía Monitor polarográfico de oxígeno Consiste en una medición polarográfica (corriente vs. Votaje). Cátodo: metal noble (oro o platino) Ánodo: usualmente de plata. 7 Solamente una pequeña porción del electrodo de Pt está expuesta, el resto del alambre está sellado con vidrio o resina epoxi. Una membrana cubre la punta del cátodo de alambre de Pt, y debajo de la membrana una pequeña porción de electrolito permite un contacto eléctrico entre el ánodo y el cátodo. La reacción que ocurre en el cátodo es: O 2 + 4H + + 4e - --> 2 H 2 O Las características de la membrana determinan la velocidad de difusión de O del medio externo hacia el cátodo, lo que determina la sensibilidad, velocidad de respuesta y linealidad del electrodo de O. Otras sondas para O 2 cuentan con un electrodo plano circular de plata, concéntrico con uno plano anular de Pb. A medida que el O 2 difunde a través de la membrana y encuentra el voltaje aplicado, se reduce en el cátodo (el metal del cátodo actúa como una superficie catalítica). cátodo: 2e - + 1/2 O 2 2OH - ánodo: Pb + 2OH - PbO + H 2 O + 2e - 8 E·jemplo: Método de Karl Fischer para la determinación de agua . C 5 H 5 N . I 2 +C 5 H 5 N . SO 2 +C 5 H 5 N +H 2 O 2 C 5 H 5 N.HI +C 5 H 5 N. SO 3 Coulombimetría C 5 H 5 N . SO 3 +CH 3 OH C 5 H 5 N(H)SO 4 CH 3 En un electrodo (de trabajo) se genera iodo electroquímicamente mediante pulsos de corriente. Se obliga al sistema a producir la reacción mediante una corriente constante. Se mide la duración de un pulso con la indicación voltamétrica de punto final, con un electrodo de platino como contraelectrodo. Permite determinar cantidades extremadamente pequeñas de agua. Principio: por cada 1 F que circula se oxida o reduce 1 equivalente gramo de la sustancia. 1F = 96494C I = (V 2 – V 1 )/R = (V 2 – V 1 )/ (ρl/s) I = (V 2 -V 1 ) (κ.s/l) R es la resistencia ρ es la resistividad s es la sección de la muestra l es la longitud de la muestra κ es la conductividad Conductividad eléctrica Análisis de aguas La conductividad está íntimamente relacionada con la suma de la concentración de los iones. Aproximadamente el valor de la conductividad en μS/cm por un factor que oscila entre 0,55 y 0,7 es igual al contenido de sólidos en mg/L. Agua de mar ~ 50000μS/cm; aguas residuales 600 a 2000 μS/cm; aguas de pozo 150 a 1000μS/cm aguas de río de 100 a 3000 μS/cm. En vinos la determinación de conductividad está relacionada con la genuinidad. Conductividad eléctrica La medida de conductividad es función de la concentración y movilidad de los iones. En sistemas de bajo contenido acuoso la limitante para la movilidad es el contenido de agua. En sistemas de alto contenido de agua no hay impedimentos para la movilidad iónica y la conductividad es función de la concentración de iones. La conductividad se mide mediante instrumentos comerciales de lectura directa de µS/cm a 25°C con un ε < 1%. 9 Conductividad (µS) % de sólidos (o T) En definitiva, la conductividad depende de la concentración de iones y de su movilidad, por lo tanto, en un amplio rango de concentraciones o temperaturas, la dependencia será: Partes del Sensor Elemento de reconocimiento Elemento Transductor Convierte el reconocimiento químico en una señal electrónica medible Elemento Amplificador Sensores y biosensores Elementos de reconocimiento molecular – Enzimático (una enzima o una cascada de enzimas) – Immunológico (Antígeno-Anticuerpo) – Genómico (hibridización de DNA) – Células, tejidos, microorganismos – Receptores artificiales – Membranas lipídicas Elementos transductores (generación de la señal) – Eléctrica – Óptica – Acústica – Magnética – Calorimétrica 10 Elementos amplificadores de la señal – Potenciométrico – Amperométrico – Coulombimétrico – Transistor molecular Algunos ejemplos de biosensores enzimáticos para el análisis en el control de alimentos: L-lactato leche, fermentaciones lácticas. Emplea lactato oxidasa y detección amperométrica. Gránulos de almidón dañados y actividad diastásica. Aptitud panadera de harinas Emplea α- amilasa, glucoamilasa y glucosaoxidasa y un electrodo para oxígeno. Glucosa y lactosa leche y productos lácteos, control de hidrólisis de lactosa. Emplea GOD, β- galactosidasa y detección amperométrica. Hipoxantina, inosina e IMP determinación de frescura de pescado. Emplea nucleosidasa, nucleósido-fosforilasa y xantino oxidasa en un electrodo de C vítreo modificado y un electrodo para oxígeno. Glucosa, lactato y colesterol Emplea GOD, LO y CO y un electrodo para oxígeno. Etanol control de fermentaciones. Emplea ADH, NADH y electrodo de pasta de C. Histamina, putrescina y cadaverina. determinación de frescura de pescado. Emplea diamino oxidasa y detección amperométrica. Biosensores electroquímicos Ejemplo: detección de H 2 O 2 para la medición de biomoléculas. Algunos ejemplos de reacciones que liberan H 2 O 2 y permiten cuantificar biomoléculas Medición de glucosa 11 Medición de Sacarosa Medición de glutamina Medición de etanol Y lo mismo para almidón, lactosa, galactosa, etc. Medición del peróxido de hidrógeno generado 1. Mediante un electrodo de Pt El H 2 O 2 se oxida en el ánodo de platino, produciendo electrones. El flujo de electrones es proporcional a la concentración de H 2 O 2 y, por lo tanto, a la concentración de sustrato. Membranas de tres capas. 1. Policarbonato poroso, limita la difusión del sustrato en la segunda capa previniendo que la reacción se vuelva limitada por difusión. 2. Enzima, por ejemplo glucosa-oxidasa. 3. Acetato de celulosa, permite que solo pequeñas moléculas, tales como peróxido de hidrógeno alcancen el electrodo, eliminando muchos compuestos electroquímicamente activos que pueden interferir con la medición. 12 2. Mediante Electrodos recubiertos con films de polímeros redox con HRP (peroxidasa de rábano) Un film de polímero redox que contiene HRP cubre superficie de un electrodo de carbono vítreo y conecta electroquímicamente la peroxidasa al electrodo. El polímero redox reduce el peróxido de H generado electroquímicamente. (Bio)sensores optoelectrónicos Ejemplo: electrodo para determinación de CO 2 . Consisten en un pequeños reservorios de buffer bicarbonato cubierto por una membrana silicona permeable a los gases. El buffer contiene HPTS (ácido hidroxipiren- trisulfónico), un pigmento fluorescente sensible al pH. 13 El CO 2 difunde a través de la membrana hacia el buffer, cambiando su pH. A medida que el pH cambia, cambia también la fluorescencia del pigmento. CO 2 + H 2 O <-> H 2 CO 3 <-> H + + HCO 3 - PTS - + H + <-> HPTS El equipo compara la fluorescencia del pigmento a dos longitudes de onda diferentes para determinar la concentración de CO 2 de la muestra. Biosensores piezoeléctricos La piezoelectricidad es un fenómeno que presentan determinados cristales que al ser sometidos a tensiones mecánicas adquieren polarización eléctrica, apareciendo una diferencia de potencial y cargas eléctricas en su superficie. Los materiales piezoeléctricos son cristales naturales o sintéticos que no poseen centro de simetría. El efecto de una compresión o de un cizallamiento hace disociar los centros de gravedad de las cargas positivas y de las cargas negativas. Aparecen cargas de signo opuesto en las superficies enfrentadas. Muestra Resonancia de plasmón de superficie SPR El plasmón es un fenómeno de densidad de carga electrónica ondulante que sucede en la superficie de una película metálica cuando se refleja luz en condiciones específicas. 14 La resonancia es resultado de la transformación de energía y momento de los fotones incidentes en plasmones de surperficie, y es sensible al índice de refracción del medio del lado opuesto al film que refleja la luz. Existen inmuno sensores ópticos comercialmente disponibles basados en este fenómeno. Se mide el cambio en la posición del detector a través de la caída de intensidad reflejada cuando varía el índice de refracción por la presencia de analito I: blanco. II en presencia de analito. Algunos de los contaminantes que se han detectado con éxito a través de la SPR son: - pesticidas: 2,4-diclorofenol - alérgenos del maní y avellana - toxinas de origen bacteriano (Enterotoxina B) y fúngico: micotoxinas de Fusarium y Aspergillus (zearalenona, DON fuminisina B1 y aflatoxin B1) - microorganismos patógenos: E.coli 0157:H7, Salmonella enteritidis, Listeria monocytogenes, B.subtilis - virus: mosaico del tabaco Además, en el campo de la calidad alimentaria se utiliza la Resonancia de Plasmones Superficiales para la detección, de ácido fólico, biotina y folatos en fórmulas infantiles y leche. Otras aplicaciones para la SPR incluyen la detección de OMG, y los más comunes de estos combinan ADN con transductores piezoeléctricos (QCM) y ópticos (SPR). 15 Sensor con superficie modificada con dextrano dextrano analito oro Las separaciones electroforéticas se llevan a cabo en dos modalidades: Electroforesis convencional Electroforesis capilar Métodos separativos basados en propiedades eléctricas de los componentes: Electroforesis Convencional La electroforesis se define como el movimiento de partículas cargadas en un campo eléctrico. La movilidad de las partículas es proporcional al voltaje aplicado y la carga neta de la molécula e inversamente proporcional a la fricción de la molécula; esta última depende de la forma y el tamaño de la misma. 16 La mayoría de las biomacromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos) poseen determinada carga eléctrica con grupos aniónicos y catiónicos capaz de disociarse. La carga neta de la partícula está dada por el pH del medio y puede modificarse. La velocidad de migración de un ión (v) en el seno de un campo eléctrico, es: v = μ E Donde E es la intensidad de campo eléctrico (V/cm) y μ es la movilidad electroforética La movilidad electroforética es la velocidad de migración de un ión cuando se aplica un campo eléctrico de 1 V/cm. Su signo es igual al de la carga de la partícula. (carga neta) Fricción (forma y tamaño) μ = Entonces q E v = f C COOH H R NH 3 C H R NH 3 C H R NH 3 C H R NH 2 + + COO - + H + K 1 + COO - COO - + H + K 2 Equilibrio ácido/base en aminoácidos P.I. 17 Electroforesis Capilar: El empleo de un capilar permite aplicar un alto voltaje y mejorar la separación de moléculas pequeñas o grandes. Ver Material Dra. Leiva