Se denomina TÉCNICA HISTOLOGICA al conjunto de procedimientos aplicados a un material biológico (animal o vegetal) con lafinalidad de prepararlo y conferirle las condiciones óptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes morfológicos a través de los microscopios fotónicos y electrónicos. PROCEDIMIENTOS INMEDIATOS O VITALES Permiten la observación y el estudio de protozoarios, células sanguíneas, células descamadas o disociadas, células en cultivo de tejidos; estructuras muy delgadas y translúcidas como la membrana peritoneal de animales pequeños o epidermis de vegetales, granos de polen etc. suspendidas en los líquidos de su hábitat natural o solución salina balanceada. Para una observación óptima suele utilizarse tipos especiales de microscopios fotónicos como el de campo oscuro o el de contraste de fases: observación al estado fresco. En ciertos casos, cuando se requiera destacar alguna estructura celular o tisular se pueden emplear colorantes inocuos para la vida de las células, no modifican la estructura de ellas ni interfieren en sus funciones. A este procedimiento se le conoce como coloración vital. COLORACIÓN VITAL Puede ser de dos tipos: 1. Coloración intravital, consiste en la administración de colorantes vitales a través de las vías digestiva o intratraqueal; mediante inyecciones sanguíneas, linfáticas, subcutánea, o intraperitoneal. Las soluciones de uso más frecuente son: tinta china, carmín de litio, azul tripan (partículas colorantes que demuestran la capacidad fagocítica). 2. Coloración supravital, En este procedimiento se emplean colorantes que se aplican a células o tejidos provenientes de organismos vivos. Se demuestran: mitocondrias con el verde de Jano, los gránulos de las células cebadas con el rojo neutro, la sustancia granulofilamentosa de los reticulocitos con el azul brillante de cresyl, ramificaciones nerviosas con el azul de metileno; o el ADN y el ARN de las células con naranja de acridina (empleando el microscopio de fluorescencia). PROCEDIMIENTOS MEDIATOS O POSTVITALES Tienen por finalidad preparar células, tejidos y órganos procedentes de seres en los que los procesos vitales se han detenido y es necesario conservar la estructura que tenían en vida. De manera general, para alcanzar este objetivo es necesario realizar los siguientes pasos: - Toma de la muestra - Microtomía - Fijación - Coloración o tinción - Inclusión - Montaje 1 por ejemplo: el alcohol etílico absoluto conserva el glucógeno. el cloruro de calcio conserva e insolubiliza parcialmente a los lípidos. etc. el ácido acético permite una mejor tinción de los núcleos. dependen esencialmente de la prontitud y el cuidado que se aplicó para obtener la muestra a ser procesada mediante los pasos mencionados anteriormente. Es un procedimiento cuya finalidad. el alcohol etílico. Esto se consigue inmovilizando (por coagulación o precipitación) las moléculas proteínicas e inhibiendo principalmente las enzimáticas haciéndolas insolubles. al aplicarlo es Detener la vida de las células e impedir las modificaciones post morten que pueda sufrir la célula (procesos autolíticos). con las características morfológicas que poseían cuando estaban con vida. Estos son: a) Mediante la biopsia: (del griego bios = vida y opsis = visión). el bicromato de potasio. Los fijadores son: a) Gaseosos: como el formaldehído b) líquidos: como el ácido acético. ácido pícrico. el bicromato de potasio facilita la coloración de las mitocondrias. vaginal. al alcohol etílico. se efectúa por mediante agentes químicos denominados fijadores. el bicloruro de mercurio provoca que las anilinas coloreen de manera más brillante a las fibras colágenas. Recomendaciones para la toma de las muestras. Condiciones de un buen fijador Una sustancia fijadora para que ejerza de manera eficiente y adecuada sus funciones debe poseer las siguientes condiciones: Matar inmediatamente a las células. b) mediante la necropsia. La biopsia puede ser: incisional excisional por sacabocados por punción y absorción por raspado por trepanación El estudio de células de superficies epiteliales de renovación constante (mucosas bucal. c) sólidos: como el bicloruro de mercurio. consiste en la toma de un fragmento de tejido u órgano de un ser vivo. el alcohol metílico. Existen diversos procedimientos que permiten obtener muestras de tejidos y órganos para conseguir preparaciones histológicas de buena calidad. las muestras se obtienen de seres muertos: En este caso es recomendable que los tejidos y órganos se obtengan inmediatamente después de producida la muerte. La acción oxidante o reductora de los fijadores le confieren a las células ciertas condiciones que posibilitan una mejor aplicación de las sustancias colorantes. el glutaraldehído. manteniendo la estructura morfológica de células y tejidos sin que ocurran cambios notables en ellos. B) FIJACION. colorearlas y examinarlas. ácido acético. laacetona. el bicromato de potasio. impidiendo la aparición de los procesos autolíticos. Esta acción garantiza la integridad de las células y tejidos. Los tejidos y los órganos provenientes de biopsias y necropsias se seccionar empleando bisturís o navajas de afeitar nuevos. sin hacer presión sobre ellos. etc. No es recomendable el uso de tijeras para cortar los tejidos pues éstas ocasionan compresiones y jalonamientos de los tejidos y órganos que distorsionar su estructura microscópica. gástrica.A) TOMA DE LA MUESTRA La calidad y la fidelidad con que una célula o un tejido muestren una imagen al microscopio. Para tal fin el fijador debe poseer: . se realiza a través de la Citología Exfoliativa. uretral). Los fijadores se clasifican en dos grandes grupos: a) Oxidantes: el tetraóxido de osmio (ácido ósmico). bicloruro de mercurio o “sublimado corrosivo”. En otros casos células obtenidas mediante punción (células sanguíneas o de la médula ósea) se extienden en una lámina portaobjetos para hacer los “frotis”. b) Reductores: el formaldehído. Realiza a través de una operación quirúrgica hecha exprofesamente o durante la intervención quirúrgica efectuada en pacientes y corroborar así un diagnóstico de una determinada lesión. El tamaño de las muestras no debe exceder de 10 mm por lado con un grosor de 5 mm. ácido crómico. que no fije sólo la porción superficial de la muestra sino que alcance las porciones más profundas de la misma. sino que esta tiene lugar después de varios días. que en contados instantes se introduzca con rapidez en el espesor de la muestra Un buen poder de difusión. Las soluciones fijadoras suelen ser fijadores simples. Ejemplo de fijador simple Formol o formalina. etcétera). al rojizo (si tiene pH7. En los animales acuáticos (renacuajos. por lo tanto es aconsejable usar mezclas fijadoras a través de las cuales se acrecientan las cualidades de un fijador y se atenúan sus defectos y desventajas. se aplica diariamente varios centímetros cúbicos de la solución. Fijadores compuestos.unam.facmed. Se presenta como un líquido claro. http://www. Azul de metileno. esto es cuando la alcalinidad es débil. Se emplea también como reactivo indicador para conocer la acidez o alcalinidad de las sustancias con que se pone en contacto. Por la vía digestiva se usa cuando se trata de estudiar lamucosa digestiva. o fijadores compuestos (mezclas fijadoras) en las que utilizan más de una sustancia fijadora. Se aplica por inmersión o inyección. La solución se prepara ensuero fisiológico al 0. Que sea fácil de conseguir y que sea barato. ya que introduciendo en un animal el azul de metileno en inyección endovenosa. Con este fijador se consiguen preparaciones permanentes.Un buen poder de penetración. Conserva bastante bien a las grasas. en la proporción del 1%. hace más visibles sus núcleos. Azul de metileno Como colorante vital.mx/deptos/biocetis/PDF/Portal%20de%20Recursos%20en%20Linea/Apuntes/3_tecnica_histologica. incoloro. tiñe células animales. protozoarios. Verde Jano Es también un colorante supravital. Está considerado como la sustancia fijadora de mayor uso en los laboratorios que realizan técnica histológica. utilizadas para el estudio del tejido nervioso.pdf Colorantes vitales básicos Son aquellos que ejercen su acción en las partes vivas de las células sin alterar su metabolismo. o es anaranjado (sí es superior a pH7. el azul de metileno se emplea principalmente en las coloraciones postvitales o supravitales.5% o al 1%. colorante vital en reticulocitos. que emite vapores sumamente irritantes para la conjuntivas y la mucosa respiratoria. Es un fijador que posee un buen poder de penetración y difusión. Los cuerpos colorados con el rojo neutro pueden conservarse en esta forma si los colocamos por 12-48 horas en el fijador de Mitamura.2 a pH7.40%. Los mejores resultados se obtienen consangre. Son preferidos los colorantes vitales que son retenidos por la célula durante el tiempo necesario para poder realizar la observación Rojo neutro Es una sustancia soluble en agua. El formol comercial consiste en una solución acuosa del gas formaldehido al 39 . Una sola sustancia fijadora difícilmente reúne todas las condiciones para ejercer una buena fijación. Producir cierta dureza a los tejidos sin que se provoque excesiva retracción o hacerlos quebradizos y friables. este se fija en las células nerviosas. No debe disolver componentes celulares. Su acción fijadora se ejerce coagulando las proteínas. Se aplica una gota .6). Para evitar la decoloración del tejido se coloca la pieza en la solución fijadora de Bethe. El paso del animal colorado al agua natural no provoca la decoloración inmediata. hasta ser amarillo cuando tiene pH8. Mantiene de manera adecuada la estructura y facilita la coloración posterior de los componentes celulares y tisulares. y el lavado será con alcohol. se adiciona el colorante al agua donde viven en la proporción de 1 x 100 000 ó 1 x 200 000. y poniendo de relieve sus estructuras. Puede ser administrada a los animales superiores por vía endovenosa o digestiva. En este caso se usa en una solución al 1 x 10 000 en suero fisiológico al 0. Debe de ser de fácil manipulación.6). Endurece bien las muestras.85%. La fijación se hace en 4-24 horas. utilizado para el estudio de mitocondrios. pasa del rojo intenso (si tiene pH7 o menos). cu/Anexo:Colorantes_vitales . Azul naftol. pero ha tenido menos uso en trabajos microscópicos. Azul Jano . que tiene iguales usos y se aplica de idéntica forma que el verde Jano.Se emplea disuelto en agua destilada. al 1% o mejor en suero fisiológico.. Púrpura brillante R. se coloca un cubreobjeto. La fijación se hace en formol al 10%. hasta que el animal tome color azul. Una observación minuciosa mostrará mitocondrios primero en los linfocitos y luego en los leucocitos granulares. Las inyecciones se repiten cada 5 días.. Colorantes vitales ácidos Alizarina roja S. Se aplica en inyecciones intraperitoneales o subcutáneas. y después. y la corporación puede evitarse poniendo vaselina en el borde del cubreobjeto...Tiene propiedades similares al rojo neutro.5-1 cc de solución por cada 20 gramos de peso del animal.Es otro colorante supravital. hasta que todos quedan teñidos.Usado como colorante vital para la levadura.. Violeta neutral. Azul trypan.ecured.en el portaobjeto con sangre fresca.Se ha usado como colorante vital para el tejido nervioso en pequeños invertebrados. La coloración dura varias horas. http://www.Ha sido ocasionalmente usado como colorante vital.. en la proporción de 0. y los cortes se realizan por congelación.