COLORACION ZIEHL-NEELSENPRINCIPIO La Coloración de Ziehl-Neelsen es una coloración diferencial útil en la identificación de Micobacterias, aunque no permite la diferenciación de distintas especies. La característica de ácido-resistencia de estos microorganismos hace de esta coloración un método rápido en el diagnóstico, presuntivo, de infección micobacteriana. Las micobacterias son coloreadas de rojo por la Fucsina y retienen el color a pesar de la acción del ácido y del alcohol Esta coloración es útil en la detección de bacterias del género Micobacterium en muestras de esputo. La presencia de bacilos rojos sobre fondo azul constituye un diagnóstico casi definitivo de tuberculosis. La Coloración de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante primario es la fucsina que tiñe toda la preparación de rojo brillante. Como mordiente se utiliza flameado de la preparación con el colorante. La solución decolorante elimina el colorante primario excepto el de los bacilos ácido alcohol resistente. (BAAR). Por último el azul de metileno tiñe de azul el resto de la preparación. Los BAAR se observan en rojo, todo el resto (contraste) aparece en celeste o azul. UTILIDAD Diagnóstico de enfermedades infecciosas producidas por: a. Micobacterias → Micobacterium tuberculosis (Tuberculosis) y Mycobacterium leprae (Lepra). b. Bacterias del género Nocardia → Nocardiosis (similar a tuberculosis) y Micetoma actinomicótico (micosis subcutánea). FUNDAMENTO Los BAAR poseen una pared celular rica en lípidos y ácidos carboxílicos (ácido micólico) que tienen la propiedad de unirse excepcionalmente fuerte al colorante frio (fucsina de Ziehl) cuando se usa el calor como mordiente. Una vez que se forma este complejo colorante-pared, ni siquiera la acción conjunta del ácido y del alcohol puede deshacerlo, ya que las paredes retienen el colorante en forma "resistente". TECNICA Se realiza el frotis. Se aplica el colorante frio sobre la muestra y se deja reposar. Luego se emplea la llama de un mechero para calentar la muestra hasta la aparición de vapores blancos. El calor se emplea como mordiente, gracias al calor los lípidos de la pared dejan pasar el colorante para que se combine con los ácidos carboxílicos de la pared, así se forma el complejo colorante-pared. Se deja reposar y se lava con .Azul de metileno (también se puede utilizar verde de malaquita para mejor contraste) La fucsina-fenicada debe aplicarse con calor para que el colorante penetre las paredes de las Mycobacterias. pero se recomienda mejor la fucsina-fenicada. ya que se utiliza azul de metileno como coloración de contraste. Azul de Metileno Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido. Acido-Alcohol. se utilizan loas sustancias: 1. por ultimo el azul de metileno. provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. FUNCION DE: LA Fucsina-Fenicada. . En el método de coloración de Ziehl-Neelsen.Acido-alcohol (decolorante) 3. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua.. el exceso del mismo será arrastrado por el agua. en si la función del cristal violeta en la coloración de Ziehl-Neelsen es teñir las Mycobacterias con la aplicación del calor. Se aplica el colorante 2rio. Por otro lado.Fucsina-fenicada (se recomienda mas esta aunque se puede utilizar cristal violeta) 2. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. se aplica como colorante de contraste pero también se puede utilizar el verde de malaquita. que tienen altas cadenas de lípidos y ceras. después de la coloración con colorantes básicos. mostrando al microscopio solo las BAAR. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul. mientras que otras que tal ves se tiñeron se decoloraran. las bacterias acido-alcohol resistentes no se desteñirán. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. Por esto se denominan ácido-alcohol resistente.agua. Las bacterias que no han formado el complejo en su pared (no BAAR) no retendrán el colorante.. Al aplicarse el acido-alcohol. se deja reposar y se lava con agua. • En caso de derrame del colorante. con movimientos de vaivén. se puede filtrar la fucsina directamente cuando se la deposita sobre el extendido a través de un pequeño embudo con papel de filtro. no dejar secar el preparado. • Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos. levantar cuidadosamente la lámina portaobjetos desde el extremo más cercano al operador. • Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y así evitar diluir los reactivos que se utilizarán a continuación. . esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se fije a sus lípidos. Dispensar el colorante con suavidad. sin salpicar y sin tocar con el gotero o con el embudo los extendidos. con un frasco o un grifo. • Con una pinza. • En el término de aproximadamente 5 minutos calentar tres veces hasta emisión de vapores. hasta que observe que se desprenden los primeros vapores blancos. Enjuagar con abundante agua a baja presión. Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solución de fucsina. • Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada recién filtrada. Si el número de baciloscopias a colorear es pequeño. reponer la fucsina.PROCEDIMIENTO DE LA COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN Coloración • Disponer dos varillas de vidrio en forma paralela. • Colocar sobre el soporte las láminas fijadas conservando el orden numérico con el extendido hacia arriba y manteniendo una separación de al menos 1cm entre ellas. a una distancia de aproximadamente 5cm entre una y otra una sobre un soporte dentro del lavabo/pileta de coloración. No hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal. Girar el extendido y lavar con cuidado también la parte posterior. No calentar con mechero. • Filtrar la cantidad de fucsina necesaria para las tinciones a realizar en la jornada. Decoloración • Cubrir la totalidad del extendido con solución decolorante y dejar actuar aproximadamente 3 minutos. • Observar si las láminas conservan la numeración clara y visible. . • Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes más gruesas del extendido a lo sumo conservan un leve tinte rosado). • Enjuagar las láminas en ambas caras con agua a baja presión y limpiar la parte inferior con un algodón si ha quedado coloreada. Coloración de fondo • Cubrir todo el extendido con solución de azul de metileno. • Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos. dejarla actuar entre 1 y 3 minutos y enjuagar nuevamente. volver a cubrir con solución decolorante. apoyándolas en posición vertical en un soporte sobre un papel absorbente. No apoyar papel absorbente sobre el extendido. • Dejar actuar durante un minuto. Si se observan cúmulos rojos o coloración rosada intensa. Si no es así volver a numerarlas. • Dejar secar las láminas a temperatura ambiente. • Enjuagar con abundante agua a baja presión. COLORACION DE ZIEHL NEELSEN CUBRIR CON FUCSINA FILTRADA CALENTAR HASTA EMISIÓN DE VAPORES TRES VECES DURANTE 5 MINUTOS LAVAR CON AGUA CUBRIR CON DECOLORANTE DURANTE 3 MINUTOS LAVAR CON AGUA CUBRIR CON AZUL DE METILENO DURANTE 1 MINUTO LAVAR CON AGUA SECAR AL AIRE .