Citotoxicidad inducida por Senecio sp (Chachacoma): Implicancia de la enzima Mn-superóxido dismutasa en cáncer mamario

UNIVERSIDAD DE TARAPACÁFACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA Citotoxicidad inducida por Senecio sp (Chachacoma): Implicancia de la enzima Mn-superóxido dismutasa en cáncer mamario TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE: MAGÍSTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS MENCIÓN BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN Y DEL DESARROLLO NOMBRE ALUMNO SUSANA ALFARO LIRA NOMBRE PROFESOR GUÍA CARLOS ECHIBURÚ CHAU ARICA – CHILE AÑO 2013 Agradecimientos Llegando al final de esta etapa, nace la necesidad de reconocer a aquellas personas que sin su participación, apoyo constante y amistad no hubiese sido posible concluir este trabajo. Debo agradecer de manera especial y sincera al Profesor Carlos Echiburú Chau, por confiar en mis capacidades y aceptarme bajo su tutela para llevar a cabo esta tesis. Su apoyo y confianza en mi trabajo y su capacidad para guiar la investigación ha sido un aporte invaluable, no solamente en el desarrollo de esta tesis, sino también en mi formación como futura investigadora. Las ideas propias, siempre enmarcadas en su orientación y rigurosidad, han sido la clave del buen trabajo que hemos realizado juntos, el cual no se puede concebir sin su siempre oportuna participación. Le agradezco también el apoyo brindado por el proyecto FONDECYT #11110284, por facilitarme siempre los medios suficientes para llevar a cabo todas las actividades propuestas durante el desarrollo de esta tesis. Quiero expresar mis más sinceros agradecimientos a mis profesores del magíster por su dedicación en compartir su conocimiento y en especial al Dr. Mario Valenzuela Estrada por darnos su apoyo en momentos de dificultad, facilitando las dependencias del laboratorio de Biología Molecular donde se realizaron las últimas experiencias prácticas de este trabajo. Y por último y no menos importante, a mi familia y amigos más cercanos, que tuvieron que tolerar mi ausencia, mal humor y momentos de debilidad a lo largo de todo este trabajo. Gracias, porque Ustedes, mi gente linda, confiaron en mi cuando yo no lo hice. A todos Ustedes muchísimas gracias. I ........2 Curva de crecimiento y tiempo de doblaje..............................................................................................7 3........................... 10 3....................................21 4 Objetivos ...............................................................................12 3......12 Polimorfismos presentes en MnSOD ..............................................13 3.....................................1 2............8 3......................... .9 3....20 3.............................................................3 Material vegetal ....................17 3..........................4 Potenciales terapias en aumento de las especies reactivas de oxígeno (ROS) ............................................10 Familia SOD .........1 Generalidades del cáncer .............................................................28 5.... Abreviaturas ............................................6 Mecanismos de muerte celular ..................................13 3........................25 5 Materiales y métodos ...28 5............................ Introducción .....................1 Cultivo celular.............................6 Tratamiento con extracto fitoquímico de Senecio graveolens .....................................9 Muerte celular y enzimas antioxidantes .............................................. Resumen ........................................11 La Mn ..............................................superóxido dismutasa ............................................ graveolens y dosis letal 50 % (DL50).......................................................................27 5...................18 3.......................................................................................................................................................5 Curva de dosis/tiempo respuesta al extracto fitoquímico de S................................................................... graveolens................3 El microambiente tumoral: efecto de la hipoxia ......5 Especies reactivas de oxígeno y muerte celular ..............................................................30 II ................................Índice 1........................................5 3.........................19 3........................................................................................................7 Apoptosis .8 3.........................4 Preparación del extracto crudo de S.................................2 El cáncer mamario...............................................................................13 Compuestos bioactivos anticancerígenos de origen vegetal que utilizan vías de estrés oxidativo como alternativa terapéutica contra el cáncer . ....................................................29 5...................................28 5..........29 5........ ......................................................... ................................................. graveolens en las líneas celulares tumorigénicas derivadas de cáncer mamario .................. graveolens .........................9 Análisis estadístico ............................................................................ Conclusiones .......................................30 5..................................................................................................................................................................................35 6.......32 6 Resultados ...............................graveolens ...................................................6 Determinación de las variantes polimórficas Val16Ala de MnSOD ...5............... 41 7................................. Referencias .8 Determinación del polimorfismo Val16Ala de SOD2 .........................................................................7 Análisis de las proteínas relacionadas con muerte celular ...............................................7 Análisis de expresión proteica ..... Efecto del extracto de S......................................................................4 Efecto citotóxico del extracto fitoquímico de S............................ Discusión.................36 6.......................................3 Cálculo de dosis letal al 50% (DL50) en las células MCF-10F y estandarización de las condiciones de trabajo con el extracto crudo de S........40 6..............................................52 9.................................45 8...34 6............37 6........................54 III .........1 Tiempo de doblaje..2 Curva de dosis/tiempo respuesta del extracto crudo de S..........................5..............33 6......... ......................................... graveolens sobre la expresión proteica de la enzima MnSOD ......39 6..31 5................................... ...... graveolens .........................Expresión proteica de Bcl-2 ...................44 IV ...........38 Figura 7.........................................................................................43 Figura 11..................Gráficos obtenidos a partir de las curvas de dosis/tiempo respuesta al extracto ..................................................34 Figura 3.....................35 Figura 4....................................... .....42 Figura 10..........Determinación de la variante polimórfica Val16Ala en el gen de SOD2 con la .....................Esquema de las vías intrínseca y extrínseca de la apoptosis ....................Expresión proteica de MnSOD ..................36 Figura 5.. graveolens ............................................Expresión proteica de Caspasa -3 .........................................................................Índice de Figuras Figura 1.............................Dosis letales al 50% de S............Efecto citotóxico del extracto fitoquímico de S.............................................................. graveolens ...Curva de dosis/tiempo respuesta .........41 Figura 9..............17 Figura 2............................Curva de crecimiento calculada para la línea celular MCF-10F .......40 Figura 8........... enzima de restricción NgoMIV ............................... crudo de S.......37 Figura 6..............................................Expresión proteica de Caspasa -8 ........ .ABREVIATURAS 1 .1. del inglés hypoxia-inducible factors HRP Peroxidasa de rábano. del inglés apoptosis inductor factor ATG Genes relacionados con autofagia.AP2 Factor de transcripción. del inglés bicinchoninic acid Biotin-16-dUTP Biotina-16-2'-deoxi-uridina-5'-trifosfato BSA Albúmina de suero de bovino. del inglés estrogen receptor GPx Glutatión peroxidasa H2O2 Peróxido de hidrógeno HCl Ácido clorhídrico HREs Elementos responsivos de hipoxia.light chain 3 MCF-10F Línea celular epitelial mamaria no transformada e inmortalizada de forma espontánea. del inglés carbonic anhydrase IX DEPC Dietil pirocarbonato EDTA Ácido etilendiaminotetraacético ER Receptor estrogénico. del inglés Inhibitor apoptosis proteins kDa Kilodaltons. del inglés hypoxia response elements HIFs factores inducibles de hipoxia. del inglés apoptotic peptidase activating factor-1 AIF Factor inductor de la apoptosis. del inglés activating protein-2 APAF-1 Proteína pro-apoptótica. del inglés horseradish peroxidase IAP Proteínas inhibidoras de la apoptosis. Unidad de masa atómica LC3 Proteína asociada a microtúbulos-cadena ligera 3. del inglés bovine serum albumin CAIX Enzima anhidrasa carbónica IX. del inglés Michigan Cancer Foundation-10 floating 2 . del inglés autophagy related genes ATP Adenosin trifosfato BCA Acido bicinconínico. del inglés microtubule-associated protein. del inglés Michigan Cancer Foundation-7 Mg++ Magnesio MgCl2 Cloruro de magnesio msnm Metros sobre el nivel del mar MnSOD Superóxido dismutasa MPT Poro de permeabilización mitocondrial. del inglés mitochondrial targeting signal NaCl Cloruro de sodio NAD Nicotinamida adenina dinucleótido NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NFκB Factor nuclear kappa B NP-40 Nonidet P-40 NQO1 enzima NADPH:quinona óxido-reductasa O2- Radical superóxido OH· Radical hidroxilo OMS Organización mundial de la salud PARP-1 Poli[ADP-ribosa] polimerasa-1 PgR Receptor de progesterona.MCF-7 Línea celular de adenocarcinoma mamario. del inglés polymerase chain reaction PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonil. del inglés phosphate buffer saline PCR Reacción en cadena de la polimerasa. del inglés polyvinylidene fluoride SDS Dodecilsulfato sódico. del inglés sodium dodecyl sulfate 3 . del inglés mitochondrial permeability transition pore MTS Secuencia de direccionamiento mitocondrial. del inglés phenylmethanesulfonylfluoride PVDF Membrana de fluoruro de polivinilideno. del inglés progesterone receptor pb Pares de bases PBS Tampón de fosfato salino. del inglés trisbuffered saline-Tween 20 TIM Translocasa de la membrana interna. del inglés SDSpolyacrylamide gel electrophoresis TBE Tampón Tris-Borato-EDTA TBS-T Tampón tris salino con detergente no iónico Tween-20. del inglés tumor necrosis factor alpha TOM Translocasa de la membrana externa. del inglés translocate of the inner membrane TNFα Factor de necrosis tumoral alfa.SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. del inglés translocate of the outer membrane Tris-HCl Detergente tris con ácido clorhídrico 4 . .RESUMEN 5 .2. se sugiere para éstas una muerte celular independiente de caspasas. El extracto crudo de Senecio activa vías de apoptosis en la línea celular MCF-7 sugiriendo la activación de la vía extrínseca.El cáncer de mama es el tumor más frecuente en las mujeres. Caspasa -8 y Bcl-2. también se estudió la presencia de la variante polimórfica Val16Ala en MnSOD para ver si esta influye en la presencia de la enzima ya que esta variación produce un cambio conformacional que afecta la localización y eficiencia del transporte de esta proteína hacia la mitocondria. se ha encontrado que existen compuestos fitoquímicos de origen vegetal que inducen un efecto citotóxico mediado por vías de estrés oxidativo. se encuentra un arbusto usado para tratar el mal de altura. se correlacionan directamente con los niveles de expresión proteica basales de MnSOD para cada una de las líneas celulares. es decir. MCF-7 y la MDA-MB231. En general. La Mn-superóxido dismutasa (MnSOD) es una de las tres isoformas de SOD. esta característica puede ser utilizada como herramienta para algunas terapias anticancerígenas. Para la vía de muerte celular utilizada por las líneas celulares frente al efecto citotóxico del extracto se midieron los niveles de expresión de proteínas claves relacionadas con muerte celular como Caspasa -3. Se estudió la relación entre la presencia de la enzima MnSOD y la respuesta al efecto citotóxico del extracto. la Chachacoma (Senecio graveolens). El incremento de las especies reactivas de oxígeno se ha asociado con una disminución de la principal enzima de defensa antioxidante. Se observó que los niveles de viabilidad celular luego de aplicados los tratamientos con el extracto fitoquímico. En el altiplano del norte chileno. El extracto fitoquímico de S. a mayor expresión mayor resistencia al efecto citotóxico. las que disminuyeron su viabilidad a menos de un 10%. Algunas especies símiles de este género han sido evaluadas como agentes citotóxicos que inducen una alteración del estrés oxidativo en el microambiente celular como mecanismo de acción. graveolens en líneas celulares derivadas de cáncer mamario: ZR-75-1. mientras que la MDA-MB231 disminuyó sólo a un 50%. enzima que cataliza la conversión del ión superóxido a peróxido de hidrógeno y oxígeno. la superóxido dismutasa (SOD). y su contraparte normal MCF-10F. encontrada en algunos tipos de cáncer mamario. protegiendo a la célula de posibles daños producidos por los radicales libres. Sin embargo. En este trabajo se determinó el efecto citotóxico del extracto etanólico de S. sin embargo. La depresión de esta enzima. que conlleva a un aumento de su inestabilidad genética permitiendo la adquisición de un fenotipo más agresivo. Las líneas celulares más sensibles al tratamiento con el extracto fueron las ZR-75-1 y la MCF-7. En la búsqueda por desarrollar nuevas terapias antineoplásicas. puede ser crucial para desarrollar estrés oxidativo. Para ello. Estudios futuros deben enfocarse en el mecanismo de acción de dicho extracto y en los compuestos activos que están ejerciendo esta bioactividad anti-tumoral. 6 . graveolens es un potencial agente terapéutico que actúa efectivamente sobre las líneas celulares malignas menos agresivas. las células cancerosas poseen un alto grado de estrés oxidativo. dado que no se observan cambios en las proteínas relacionadas con apoptosis en la línea ZR-75-1 y MDA-MB-231. INTRODUCCIÓN 7 ..3. evaden la muerte celular programada (apoptosis).38 millones de nuevos casos. el Ministerio de Salud a través 8 . 3. Se estima que en el año 2008 se diagnosticaron 1. y pueden invadir el tejido circundante y producir metástasis (Hanahan y Weinberg. son capaces de producir nuevos vasos sanguíneos y de mantenerlos (angiogénesis sostenida). causando 458.1 Generalidades del cáncer El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial. según los datos del último GLOBOCAN 2008. Este aumento se deberá al incremento demográfico. 2008). se estima que durante el mismo período de tiempo la incidencia de éste aumentará de 11..5 millones de defunciones.2 El cáncer mamario El cáncer mamario es el tumor maligno más frecuente en la mujer. mayores expectativas de vida y hábitos poco saludables que está adoptando la población. significando un 23% de todos los cánceres diagnosticados en aquel año. en otras palabras. El cáncer se caracteriza por una proliferación descontrolada de células y es un término que engloba a un conjunto de enfermedades que puede afectar cualquier parte del cuerpo. pasará de 7. Además. 2000). En Chile. 2008). en el año 2008 causó 7.5 millones en 2030 (Organización Mundial de la Salud. un 13% de todas las muertes registradas en el mundo (Ferlay et al. Según datos de la OMS. 2008).3.9 millones a 11. poseen una capacidad ilimitada de replicación. Existen alrededor de cien tipos de cánceres con distinta histología y etiología pero que comparten las siguientes características: sus células pueden proliferar sin necesidad de recibir estímulos externos.3 millones en 2007 a 15. La OMS prevé que a nivel mundial la mortalidad causada por el cáncer aumentará en un 45% entre 2007 y 2030..000 defunciones soló en el año 2008 (Ferlay et al.6 millones de defunciones. son insensibles a los factores inhibitorios de crecimiento. El cáncer de mama es la quinta causa de muerte entre todos los cánceres y sigue siendo el más frecuente en las regiones desarrolladas y menos desarrolladas del mundo. Todos estos elementos crean un complejo ambiente de señales intercelulares que le permiten al tumor desarrollarse y progresar. el cáncer de mama puede originarse a partir de los tejidos del estroma. que incluyen a los tejidos conjuntivos grasos y fibrosos de esta (Richie y Swanson. además de eliminar sus elementos de desecho (Hanahan y Weinberg. El tumor tiene un componente no celular que consta de proteínas de la matriz extracelular.100 nuevos casos y en ese mismo año se registraron 1. que en determinados casos pueden promover la metástasis (Hanahan y Weinberg. glándulas productoras de leche. contribuyen al crecimiento del tumor. atrayendo y activando a las células no-tumorales tales como. Incluso. 2011). 2006). las células tumorales son capaces de modificar el microambiente a su favor.. Con menos frecuencia. 2011). la interacción entre la matriz extracelular de este microambiente con las células. 2011. vías que transportan la leche desde los lobulillos hasta el pezón. 2003). con el transcurso del tiempo se ha reconocido como un tejido complejo. 3.del Programa Nacional de Cáncer de Mama. Petrulio et al. Al igual que los tejidos normales. informó que en el año 2009 se registraron 3. generalmente. fibroblastos y células endoteliales para generar vasos sanguíneos y linfáticos (Hiscox et 9 .3 El microambiente tumoral: Efecto de la hipoxia El tumor no es sólo una masa de células que crece descontroladamente. el tumor necesita de vasos sanguíneos para abastecerse de nutrientes y oxígeno. En este contexto.338 muertes por esta causa (Ministerio de Salud. o en los conductos. epiteliales o fibroblastos normales. El cáncer de mama. se origina a partir de las células que se encuentran en los lobulillos. y un componente celular que posee células malignas y células normales tales como fibroblastos. células endoteliales y células provenientes del sistema inmune. no sólo con un aumento de la celularidad sino también en la producción de proteínas extracelulares que mantienen y renuevan el estroma tumoral. . 2011. disminución de la muerte celular y a una neovascularización inadecuada (Nagy et al.. progresando junto con el crecimiento del tumor (Hanahan y Folkman.. 2011). Con todas estas adaptaciones el tumor aseguraría su supervivencia y le otorgaría una mayor ventaja de crecimiento a estas células por sobre el resto de la población.. aumentan el número de transportadores de glucosa a nivel de la membrana citoplasmática. con una pobre formación de piruvato para la respiración mitocondrial. 1996). Este escenario obliga a las células tumorales a adaptarse al nuevo ambiente con respuestas que involucran un aumento del metabolismo de la glicólisis anaerobia. confiriéndole una mayor agresividad (Hanahan y Weinberg. Kim et al. radiación por rayos “X”. 2012. 2012). Las células normales toleran de mejor manera el aumento súbito de los niveles de ROS provocados por un agente exógeno. metástasis. 1996).4 Potenciales terapias basadas en aumento de las especies reactivas de oxígeno (ROS) La selectividad terapéutica es un tema importante en el tratamiento del cáncer. 3. ya que al poseer niveles basales bajos de estas 10 . Este proceso angiogénico se ha observado en las etapas más tempranas de los tumores. mayor resistencia a la radioterapia con radiación gamma. Graeber et al. aumentando la eficiencia en la captación de esta y disminuyendo pero optimizando el uso de la respiración mitocondrial. El microambiente al interior del tumor se vuelve hipóxico como consecuencia de un rápido crecimiento de las células malignas. Por esta razón. Semenza.al. 2010. existen pocos fármacos disponibles para uso clínico y por consecuencia se sigue investigando para desarrollar y/o descubrir nuevos fármacos que cumplan con esta característica tan importante.. a algunos agentes de quimioterapia y pocas expectativas de supervivencia para el paciente (Chouaib et al. 2007). El agente antineoplásico ideal debe ser tóxico para las células malignas y afectar mínimamente a las células normales. Existen numerosos reportes que asocian el estado hipóxico de un tumor con un factor de mal pronóstico para el paciente ya que se ha observado un aumento de la recurrencia del cáncer. poseen una mayor capacidad de reacción ante este tipo de agresión. 2009). Estos ejercen su acción mediante la formación de radicales intermediarios al reaccionar con las flavoproteínas reductasas. Esta diferencia. tales como la citocromo p450 y la NADPH:quinona óxido-reductasa (NQO1) en presencia de NADPH.. entre los estados redox de las células normales y malignas. Pero esta adaptación tiene una capacidad limitada ya que bajo ciertas condiciones de estrés oxidativo sostenido.. 11 . por dar algunos ejemplos. se podría gatillar la muerte celular al saturar las reservas antioxidantes de ésta (Pelicano et al. aumentando sus enzimas antioxidantes como la catalasa.. Szatrowski y Nathan. alta tasa de proliferación celular. La mitocondria es uno de los mayores productores de especies reactivas de oxígeno y su cadena transportadora de electrones es uno de los mayores proveedores de estas especies. 2004). y de niveles mayores al que está adaptada la célula. Para aumentar la cantidad de ROS a niveles tóxicos existen agentes como el trióxido de arsénico. Las células malignas son capaces de adaptarse a un nivel constante y moderado de estrés oxidativo. 1991). superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa.. este compuesto afecta la cadena transportadora de electrones aumentando la producción de iones superóxido (Pelicano et al. 2003). Otra manera de elevar la generación de ROS es mediante el uso de los llamados “cicladores redox”. sienta las bases biológicas para provocar una muerte selectiva de las células tumorales usando agentes que aumentan los niveles de estrés oxidativo o disminuyan las enzimas relacionadas con la defensa antioxidante. La mayoría de las células malignas exhiben elevados niveles de estrés oxidativo asociado a un metabolismo activo.. 2006). 2003. disfunción mitocondrial y a la estimulación oncogénica (Pelicano et al. dos ejemplos de cicladores redox son el gadolinio motexafina y las antraciclinas como la daunorubicina y la doxorrubicina (Trachootham et al. característica que podría ser utilizada en posibles terapias (Trachootham et al.especies reactivas en comparación a sus contrapartes malignas. Estos radicales intermediarios son capaces de generar iónes superóxido en presencia de oxígeno molecular. Otra de las alteraciones que puede 12 . La siguiente ecuación es la representación simbólica de la reacción de Fenton: e 3. 2002). conocida como reacción de Fenton que genera radicales de hidroxilo (Kotamraju et al. 2002). Cuando la cantidad de radicales libres aumenta a un nivel que no puede ser contrarrestado por el sistema antioxidante se produce el llamado estrés oxidativo que. 2012). es normal la producción constante de pequeñas cantidades de radicales libres o ROS. aniones superóxido (O2·-) y peróxido de hidrógeno (H2O2). puede causar de forma directa la liberación de la citocromo c (Simon et al. miembro pro-apoptótico de la familia Bcl-2. La mitocondria juega un papel importante en la activación de la apoptosis ante varios estímulos mediante la permeabilización de su membrana y liberación de la citocromo c (Mates et al. como por ejemplo.. aparte de trabajar como un ciclador redox. lípidos y material genético. Este tipo de daño oxidativo puede llevar a alteraciones en la transmisión de señales. 2000).. puede causar estrés oxidativo mediante la quelación del hierro intracelular. entre otros (Kotamraju et al. la cual se usa como quimioterapéutico en numerosos tipos de cáncer.5 e Especies reactivas de oxígeno y muerte celular Como resultado del metabolismo aeróbico de las células. Por esta razón.. el de mama. 2000). inducción de mutagénesis y gatillar la apoptosis (Mates y SanchezJimenez. expresión del DNA. la célula posee una defensa antioxidante que actúa rápidamente para mantener la homeostasis redox. La doxorrubicina. ovario y pulmón. testículo.. como lo son los radicales hidroxilo (·OH). La antraciclina más utilizada es la doxorrubicina. entre otros. de persistir.Las antraciclinas son antibióticos citostáticos obtenidos a partir de cultivos de la bacteria Streptomyces peucetius. puede oxidar y dañar biomoléculas críticas como proteínas. Bax. puesto que la célula pierde la integridad de su membrana y descarga todo su contenido citoplasmático al medio extracelular provocando una reacción inflamatoria producto de las enzimas y proteasas liberadas. 2007). del reclutamiento de células inflamatorias (McCall. La autofagia. agresión que puede afectar la membrana plasmática o las membranas de los orgánelos citoplasmáticos.7 Apoptosis Este proceso de muerte celular programada. además. y muerte celular tipo III. En pocas palabras la célula se degrada a sí misma (Codogno y Meijer. muerte celular tipo II o autofagia. condensación de la cromatina. evitando el reclutamiento de células inflamatorias que afecten a las células vecinas (Elmore. las que luego se unirán con lisosomas. se caracteriza por el secuestro del citoplasma y orgánelos en vesículas. 2005). La necrosis es un proceso en el cual la muerte es inducida de manera pasiva e independiente de energía. Estos restos celulares luego 13 . involucra una serie de genes que requieren un consumo activo de energía en forma de ATP (Afford y Randhawa.. 3. La célula apoptótica pasa por una serie de cambios morfológicos y alteraciones bioquímicas como lo son: la fragmentación de ADN. 2003). retracción celular y finalmente se produce la eliminación del contenido citoplasmático y nuclear al medio extracelular.provocar el aumento de ROS es la peroxidación lipídica. encapsulado en su propia membrana citoplasmática. lo que también puede inducir apoptosis (Yin y Doung. propios de la célula. 2011). La apoptosis es un proceso controlado dependiente de energía. 3. que afecta a un número reducido de células y no existe descarga del contenido intracelular al ambiente extracelular. por su parte. 2000). Este proceso afecta a la célula que lo padece y al grupo de células que está a su alrededor. Orrenius et al. conocida como apoptosis. para su posterior degradación. también llamada necrosis. 2010.6 Mecanismos de muerte celular Hasta el momento se han descrito tres tipos de muerte celular: muerte celular programada tipo I. y la vía extrínseca. 2002).. hipoxia. Garrido y Kroemer. presencia de citoquinas. Existen dos mecanismos por el cual la apoptosis puede activarse: la vía intrínseca. Todos estos estímulos pueden causar la permeabilización de la membrana mitocondrial por la apertura de poros llamados MPT (MPT. que a su vez se une a la procaspasa -9 formando de esta manera el apoptosoma (Acehan et al. 1997). La citocromo c es una proteína que participa en la generación de ATP en la cadena transportadora de electrones de la mitocondria. o mitocondrial. por sus siglas en inglés Mitochondrial Permeability Transition pore). 2000). Kerr. F. El proceso apoptótico es un complemento importante para la regulación del número de células durante el desarrollo (Hacker. toxinas. Vaux. La vía intrínseca se caracteriza por ser estimulada por señales intracelulares que actúan directamente sobre la mitocondria. Su apertura. renovación de células en individuos adultos (Jacobson et al. Estas señales involucran estímulos como la ausencia de factores de crecimiento. esta se une a la proteína citosólica Apaf-1 promoviendo la oligomerización de esta última. también conocida como vía de los receptores de la muerte (Figura 1). 2004. 2007). 2006. Smac/DIABLO y la serín proteasa HtrA2/Omi. radiación ionizante. Con la formación del apoptosoma... La apertura de estos poros esta mediada por proteínas pertenecientes a la familia Bcl-2: Bax y Bak (Narita et al. 2001). Cuando la citocromo c pasa desde la mitocondria al citoplasma. Estas proteínas son capaces de activar la vía mitocondrial dependiente de caspasas (Garrido et al. J. la procaspasa -9 se activa pasando a caspasa -9 y esta a su vez activa la cascada de caspasas por medio del clivaje de las formas inactivas de las caspasas -3 y -7 las que se encargan de 14 . 2011). infecciones virales y radicales libres (Elmore. 1998). 2002). 2000. e importante medio de defensa mediado por linfocitos NK (natural killer) que eliminan células dañadas por una enfermedad o agentes externos (Norbury y Hickson.son fagocitados por macrófagos o por las células adyacentes. libera desde el espacio intermembranal de la mitocondria al citoplasma factores pro-apoptóticos tales como la citocromo c.. sin descargar residuos al ambiente extracelular que puedan desencadenar una reacción inflamatoria (Hacker. Las caspasas son cisteín-proteasas. que escinden o clivan las proteínas en residuos de ácido aspártico. 2012). La activación de la apoptosis se produce cuando un ligando. Además de las proteínas del citoesqueleto. Las Smac/DIABLO y HtrA2/Omi. Al clivarse PARP-1 se previene la reparación del ADN y se asegura la reserva energética de ATP para el proceso de apoptosis. se une a su receptor específico. 2011). de igual forma. Este enzima se encarga de marcar los daños ubicados en el ADN con una cadena de poli(ADP)ribosa con gasto de ATP y de NAD. antes de ocurrir la muerte celular.. factor de necrosis tumoral α (TN α) (Ashkenazi y Dixit. Los miembros de esta familia se caracterizan por tener de 2 a 5 copias de un dominio extracelular rico en cisteína. uno de los receptores mejor estudiados es el Fas o CD95. Una variedad de proteínas del citoesqueleto son atacadas por estas caspasas contribuyendo a la reorganización del cuerpo celular que ocurre durante el proceso de la apoptosis (Crawford y Wells. pro-apoptótico. se han reportado como proteínas promotoras de la apoptosis inhibiendo la activación de las IAP (del inglés Inhibitor of apoptosis proteins) (Vaux. aproximadamente. 2011). En una etapa tardía.activar al resto de las caspasas. La unión del ligando Fas (FasL) al receptor Fas resulta en la trimerización de Fas. evitando la necrosis por falta de ese recurso energético (Soldani y Scovassi. 1999). 1999).. La endonucleasa G. por ello reciben el nombre de caspasas efectoras (Slee et al. Los miembros más estudiados de esta familia de receptores son as/CD95. 1998).. conocidos como los receptores de la muerte. La vía extrínseca de la apoptosis esta mediada por receptores de membrana. las caspasas tienen como blanco proteínas reparadoras como PARP-1. desde la mitocondria sale un segundo grupo de proteínas apoptóticas las AIF (del inglés Apoptosis Inducer Factor) y la endonucleasa G. se dirige hacia el espacio nuclear y produce cortes en la cromatina promoviendo la condensación del núcleo (Varecha et al. La caspasa -3 también participa en un mecanismo de retroalimentación positiva activando la procaspasa -9 (Slee et al. 2002). Las AIF se trasladan hacia el núcleo y fragmentan el ADN en piezas de 50 a 300 kb. el cual recluta una proteína adaptadora intracelular llamada FADD (del inglés Fas-associated death domain) 15 . pues ésta activa a las pro-caspasas -3 y -7 (Elmore. aumentando la señal de muerte celular y disparando la vía intrínseca de la apoptosis (Kantari y Walczak. este recluta la pro-caspasa -8. encargadas de suprimir la actividad de las caspasas y las proteínas de la familia Bcl-2. La célula no sólo cuenta con proteínas pro-apoptóticas. para así conseguir la inhibición de la apoptosis por la vía intrínseca (D. 2002). Una vez formado el DISC.para formar un complejo de señalización inductor de muerte denominado DISC (del inglés Death-Inducing Signaling Complex) (Wajant. A. puesto que la caspasa -8 cliva la proteína Bid a t-Bid. la cual es activada proteolíticamente y liberada del DISC en su forma activa de caspasa -8. Una vez activada la caspasa -8 el proceso de la apoptosis es iniciado. también existen proteínas especializadas en frenar el proceso de apoptosis como las antes mencionadas IAP. La proteína Bcl-2 interactúa con las proteínas Bax y tBid para inhibir la formación del poro mitocondrial y por consecuencia la liberación de factores pro-apoptóticos. la cual se dirige a la membrana mitocondrial para producir un poro transitorio. liberando las proteínas pro-apoptóticas. 2002).. 16 . Existe un solapamiento entre las vías extrínseca e intrínseca. perteneciente a la familia de las Bcl-2. 2011). Kerr et al. 2007). Tas y colaboradores (2005). Existen varios reportes que involucran a las especies reactivas de oxígeno con un mayor daño en los tejidos y también su influencia en el inicio de la muerte celular. previniendo la apoptosis o gatillándola. El aumento de las especies reactivas de oxígeno pueden inducir la transcripción de proteínas antioxidantes tales como la superóxido dismutasa (SOD) y la glutatión peroxidasa (GPx).. fragmentan el ADN y condensan la cromatina. evaluaron la cantidad de peroxidación 17 . 3. Se destacan las proteínas claves para identificar la activación de la vía intrínseca con caspasa -9 y la vía extrínseca con la caspasa -8.Figura 1. El solapamiento de ambas vías se produce a nivel de las caspasas -3 y -7 y la activación de T-Bid.Esquema de las vías intrínseca y extrínseca de la apoptosis. La apoptosis induce la activación de una cascada de caspasas y proteasas que dan inicio a la fragmentación de proteínas del citoesqueleto.9 Muerte celular y enzimas antioxidantes La intervención de los niveles de enzimas antioxidantes puede influir en la respuesta celular. 3. induce una sobreproducción de H2O2 capaz de provocar muerte celular mediada por autofagia y no por apoptosis (Deruy et al.. En los mamíferos existen tres miembros en la familia de las SOD: la cobre-zinc superóxido 18 .+ O2·. como se demostró al tratar células L929 con zVAD (del inglés benzy-loxycarbonyl-valyl-alanyl-aspartic-acid (O-methyl)-fluoromethylketone) provocando la degradación de la enzima catalasa y causando un desbalance en el metabolismo de ROS. uno de los tipos de SOD. promoviendo la acumulación de ROS y por último la muerte celular (Yu et al. en queratinocitos senescentes se demostró que el aumento de la manganeso-superóxido dismutasa. 2005).lipídica y la cantidad de enzimas antioxidantes en tejidos de cáncer mamario y descubrieron que los tejidos cancerosos poseían una mayor cantidad de peroxidación lipídica en comparación a los tejidos sanos. El aumento de enzimas antioxidantes puede influenciar directamente sobre la reacción de la célula e incluso llevarla a la muerte por medio de procesos no apoptóticos. (Tas et al.10 Familia SOD La familia de las superóxido dismutasas es parte de la defensa antioxidante enzimática de la célula junto con las enzimas catalasa y glutatión peroxidasa. nivelando de esta manera las especies reactivas de oxígeno al interior de la célula.. Incluso se ha demostrado que la degradación de ciertas enzimas antioxidantes puede gatillar la muerte celular por una vía no apoptótica..+ 2H+ H2O2 + O2 El peróxido de hidrógeno luego es procesado por catalasa para obtener agua y oxígeno. 2006). 2010). Además. informaron que los tejidos enfermos poseían mayores índices de actividad enzimática de SOD y GPx. Las SOD catalizan la conversión del ión superóxido (• 2-) a peróxido de hidrógeno (H2O2) y oxígeno (O2) como se muestra en la siguiente fórmula: O2·. . mantienen sólo un 50% de la actividad de MnSOD. 1995).. y se observó 19 . 2003. En ratones knockout de MnSOD la ausencia de esta proteína no afecta el desarrollo embrionario. 1999). citoplasma.. 1999). como las de tipo alveolar II (Folz et al. principalmente. De las tres isoformas de las SOD.. Estructuralmente esta proteína es un dímero con un peso de 32 kDa. compartimento nuclear y en el plasma. Contiene cobre y zinc como subunidades. 2009). gen que codifica para Cu/ZnSOD. es una glicoproteína hidrofóbica de 135 kDa. Se le conoce como un gen de expresión constitutiva. manganeso superóxido dismutasa (MnSOD) y superóxido dismutasa de presencia extracelular (EC-SOD) (Valdivia et al. MnSOD es la única que es esencial para la vida aeróbica (Miao y St Clair. pero al nacer mueren tempranamente.. La expresión de EC-SOD está limitada a ciertos tipos de células. 1995). 2009. Estudios con ratones knock-out heterocigotos para MnSOD. 3. EC-SOD también llamado SOD extracelular. y como su nombre lo indica está localizado en el compartimento extracelular. 1999) y células musculares de los vasos sanguíneos (Stralin et al. Li et al. Generalmente la transcripción de SOD1. en la mitocondria como un mono-tetrámero de 96 kDa de peso que posee un átomo de manganeso en cada subunidad. utilizado por algunos investigadores como gen control (Minc et al. aproximadamente y es codificada por el gen SOD3..11 La Mn-superóxido dismutasa La superóxido dismutasa dependiente de manganeso se encuentra.dismutasa (Cu/ZnSOD). Este miembro de la familia SOD contiene iones de cobre y zinc como cofactores.. Valdivia et al. Su función es mantener bajo control las especies reactivas de oxígeno intermedias que estén presentes en el citosol (Minc et al. Una disminución en la actividad enzimática de MnSOD producto de mutantes inactivos de SOD2 causa muertes prematuras en ratones y en modelos de Drosophila (Duttaroy et al. La enzima intracelular Cu/ZnSOD se encuentra en el espacio intermembrana de la mitocondria. 2009). 2009).. no es inducida por factores externos (Miao y St Clair. encargada de conducir la importación mitocondrial del precursor de MnSOD a través de la translocasa de la membrana externa TOM (del inglés Translocate of the Outer Membrane) y translocasa de la membrana interna TIM (del inglés Translocate of the Inner Membrane) (Pfanner y Geissler. conocida también como MTS (por sus siglas en inglés. El gen SOD2. está localizado en el cromosoma 6q25. 2011). citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α. posee una zona rica en GC. 1991. Esta secuencia señal posee 24 aminoácidos.. IL1-β. mitocondrial targeting signal). 3.. 1993) (Akashi et al.que hubo un incremento en el daño de tipo oxidativo en el ADN nuclear y mitocondrial.. SOD2 es inducible a ser transcrito por múltiples factores de estrés oxidativo in vitro e in vivo por estímulos tales como: exposición a altas tensiones de oxígeno (Fazzone et al.. sin embargo. 2001). Ho et al. la cual posee numerosas secuencias consenso para Sp1. 2003). radiación ionizante (Eastgate et al. 1995). Sutton et al.. 2000).3. AP2 y una para NF-κB. 1994). hipoxia crónica (Balkova et al. dos descritos en el exón 3 el primero (58 T>C) que produce un cambio de isoleucina a 20 . El gen contiene 5 exones interrumpidos por 4 intrones (Wan et al.. 1990. Los monómeros de MnSOD son sintetizados en el citoplasma y poseen en la zona Nterminal una secuencia de direccionamiento mitocondrial.. 1993. 1990) pueden rápidamente inducir la transcripción de SOD2. que codifica para MnSOD. IL-6) (Dougall y Nick.. 1996).12 Polimorfismos presentes en MnSOD Existen por lo menos cuatro polimorfismos en MnSOD descritos: uno en la región promotora (-102 C>T) que produce un cambio en el patrón de unión entre esta región y el factor de transcripción AP2 con una disminución en la actividad transcripcional (Martin et al. La región promotora carece de cajas TATA y CAAT. Una vez en el interior de la mitocondria.. Visner et al. el cual aumenta con la edad de los especímenes (Copin et al.. la MTS es escindida del monómero precursor de la enzima y finalmente estos se unen para formar el mono-tetrámero y así conformar la proteína activa (Okada et al.. 2004). afectando la localización y eficiencia en el transporte de esta proteína hacia el interior de la mitocondria (Bag y Bag. El polimorfismo Val16Ala. Hernandez-Saavedra y McCord. Este polimorfismo produciría un cambio conformacional desde una lámina β plegada (valina-Val16) a una α hélice (alanina-Ala16) de esta MTS. pero los resultados son controversiales. Este polimorfismo Val16Ala se ha asociado a una variedad de cánceres. Se sabe que la isoforma que posee Ala16 posee una mejor eficiencia en el transporte de los monómeros de MnSOD de un orden de un 30 a un 40% en comparación a la isoforma que posee Val16 (Sutton et al. Sin embargo. y una minoría califica a Val16 como factor de riesgo. produce una sustitución de una timina (T) por una citosina (C). 3. el polimorfismo más estudiado es el que sucede en la secuencia señal mitocondrial de la proteína el Val16Ala (Wang et al. 1996.treonina y el segundo (60 T>C) que sustituye el aminoácido leucina a fenilalanina (Borgstahl et al. generando así el cambio aminoacídico de una valina (GTT) por una alanina (GCT). 2003). causado por el cambio de un solo nucleótido (SNP.. por ejemplo. 21 . el vinblastine y el paclitaxel. 2008). Observando estos resultados la lógica nos dicta que esta isoforma estaría relacionada con un aumento en los niveles de ROS y por ende asociada a un mayor riesgo de padecer cáncer. del inglés single nucleotide polymorphism).13 Compuestos bioactivos anticancerígenos de origen vegetal que utilizan vías de estrés oxidativo como alternativa terapéutica contra el cáncer Otro de los ejes de investigación para desarrollar nuevas terapias se enfoca en descubrir compuestos fitoquímicos a partir de plantas.. Sin embargo.. Gracias a estas investigaciones se han extraído nuevos fármacos anti-neoplásicos como. los datos entregan un panorama distinto ya que existen más reportes que califican a la presencia del polimorfismo Ala16 como un factor de riesgo para padecer cáncer y otras enfermedades. 2003). 2001). del codón número 16 de la MTS. perteneciente a la familia de las Asterácea. Senecio graveolens se caracteriza por ser un arbusto pequeño de hasta 40 cms de altura. Teillier.El vinblastine es un compuesto aislado a partir de Catharanthus roseu.. es usual encontrar alcaloides pirrolizidínicos. 2007). 2003). Su mecanismo de acción se basa en la estabilización de los microtúbulos durante la división celular evitando la segregación cromosómica y produciendo un aumento de H2O2 en las células (Alexandre et al. Cisternino et al. WHO. 2006. sino que es necesario encontrar cuáles son los compuestos activos de estas plantas que son capaces de ejercer la acción terapéutica y a la vez. 2003.. Su actividad terapéutica abarca el cáncer de ovario. terpenos y flavonoides (Macel y Vrieling.. Se ha utilizado en el linfoma de Hodgking y en el carcinoma testicular (Modriansky y Dvorak. 2004). la cual está compuesta por aproximadamente 20. La Chachacoma (Senecio graveolens) es ampliamente utilizada como planta medicinal por los pueblos ubicados en la zona andina chilena (Villagrán y Castro.000 especies. mama y pulmón (Rodriguez-Antona. Por su parte. En las células tumorales este agente inhibe la reparación del ADN y los mecanismos de síntesis de ARN (Keglevich et al. 1992. la que sustenta sus bases en el conocimiento popular sobre los efectos positivos que tienen las plantas o infusiones de estas para curar enfermedades. 22 . y mediante la unión a los microtúbulos inhibe el desarrollo del huso mitótico. con un fuerte aroma y crece entre los 4. Dentro de la gran gama de compuestos que se obtienen de este tipo de plantas. el paclitaxel es un alcaloide aislado desde la Taxus brevifolia. 2010). Makarov et al. 1999).400 msnm en el altiplano de la zona norte de Chile (Teillier.. encontrar potenciales nuevos usos. En la búsqueda de nuevos tratamientos y compuestos activos.100 y 4. se ha dirigido la atención y los esfuerzos hacia la medicina natural. 2012. de las cuales más de 930 especies están presentes en Chile (Labbé. Pero el conocimiento popular no basta. Esta planta pertenece al género Senecio. 1988). 2008). En el curso de la proliferación celular actúa como inhibidor en el ciclo celular durante la metafase. 2005). A pesar de que las plantas mencionadas pertenecen todas al mismo género. Bondan et al. graveolens. Por otra parte. En resumen. 2005).. latifolius y se ha demostrado su efecto citotóxico en las células HuH-7. En Sudáfrica. planta conocida como Chachacoma. no ha permitido explorar su potencial uso como agente terapéutico. causando destrucción del citoesqueleto. en líneas celulares de cáncer mamario. El polimorfismo Val16Ala de SOD2. no poseen el mismo efecto tóxico. gen que codifica dicha enzima. se ha observado que Senecio sp es capaz de aumentar los niveles de estrés oxidativo y de Cu-Zn/SOD en eritrocitos de ganado bovino que lo consumieron (Bandyopadhyay et al. 2009). chrysanthemoides desencadena una respuesta apoptótica en macrófagos mediante señalización de estrés oxidativo (Bandyopadhyay et al.. 2005). es de uso común en medicina tradicional el S. razón por la cual también evaluamos su presencia. provenientes de cáncer de mama (Tundis et al. 2009. stabianus utilizando las células MCF-7.. En este estudio consideramos la medición de variables importantes como el microambiente hipóxico que es una de las constantes presentes en las regiones tumorales. 2001). También.. sólo ha sido documentado para S. 2009. S. el presente trabajo comprende el análisis del efecto citotóxico de un extracto fitoquímico derivado de S.La toxicidad inducida por los extractos y aceites esenciales de las plantas del género Senecio se ha documentado por vías de estrés oxidativo. se ha relacionado con incapacidad de ciertos tipos de células de soportar un microambiente saturado con radicales libres. derivadas de hepatoma. Por otra parte... como la Chachacoma. evaluamos la relación del efecto citotóxico con los niveles basales de Mn-superóxido dismutasa (MnSOD). Por ejemplo. Bondan et al. Las sustancias fitoquímicas 23 . fragmentación del núcleo y finalmente apoptosis (Steenkamp et al. el desconocimiento de las propiedades farmacológicas de las especies endémicas de nuestra zona. principal enzima antioxidante mitocondrial que mantiene bajo control los niveles de radicales libres presentes en la célula. El efecto citotóxico ejercido por plantas del género Senecio en células mamarias malignas. ¿qué mecanismo de muerte celular utiliza?. si causa algún efecto citotóxico. la hipoxia tumoral ¿podría ser utilizada como herramienta para crear un ambiente diferencial para eliminar células malignas sin dañar a las células normales que la rodean?.encontradas en la Chachacoma. la enzima MnSOD ¿tiene alguna relación con la sensibilidad celular a una sustancia citotóxica?. 24 . ¿serán efectivas como sustancias anticancerígenas?. Estas son algunas de las preguntas que intentaremos resolver en el presente estudio con el fin de buscar nuevas sustancias de origen natural que puedan ser utilizadas en el tratamiento del cáncer Con todos estos datos nos hemos planteado la siguiente hipótesis: “El extracto fitoquímico de Senecio graveolens (Chachacoma) induce una respuesta citotóxica diferencial asociada a la enzima manganeso-superóxido dismutasa presente en líneas celulares de cáncer mamario”. OBJETIVOS 25 ..4. 4) Analizar la expresión de proteínas relacionadas con muerte celular en respuesta a la exposición del extracto crudo de Senecio graveolens.1 Objetivo general Estudiar la respuesta citotóxica del extracto de Senecio graveolens (Chachacoma) asociada a la enzima manganeso superóxido dismutasa en líneas celulares de cáncer mamario. 4. 26 . 3) Determinar la presencia de la variante polimórfica Val16Ala de MnSOD. 2) Determinar la expresión proteica de MnSOD en respuesta a la exposición del extracto crudo de Senecio graveolens.4.2 Objetivos específicos En líneas celulares de cáncer mamario: 1) Determinar la dosis letal al 50% (DL50) y las condiciones de experimentación del extracto crudo de Senecio graveolens. .MATERIALES Y MÉTODOS 27 .5. 5. Y por último.. 24. 2006). 1978).. todas provienen del American Type Culture Collection (ATCC). 48. MCF-7 y MDA-MB-231. El tiempo de doblaje se calculó con el software Doubling Time utilizando los datos obtenidos en la etapa exponencial de la curva de crecimiento (Roth.2 Curva de crecimiento y tiempo de doblaje Para determinar el patrón de crecimiento y el tiempo de doblaje de las líneas celulares se realizó una curva de crecimiento para cada una de ellas. Las células se cuantificaron mediante la técnica de azul de tripano a las 12.1 Cultivo celular Cuatro líneas celulares derivadas de cáncer mamario fueron utilizadas en estos estudios: ZR-75-1. la línea celular MDA-MB-231 fue aislada desde un adenocarcinoma (Brinkley et al. 1990). se sembró por cuadruplicado una cantidad de 1 104 células en placas de cultivo de 24 pocillos. 2011). como la contraparte normal se utilizó la línea celular MCF-10F. Los medios de cultivo utilizados fueron los recomendados por la ATCC. Las líneas celulares ZR-75-1 y MCF-7 se aislaron de pacientes con carcinoma ductal infiltrante (Engel et al.5. Para ello. Comprende tallos. 1980). raíces y semillas que fueron deshidratadas a la sombra a 20°C durante 5 28 .3 Material vegetal La planta conocida como Chachacoma (Senecio graveolens) fue recolectada en sectores cercanos al Lago Chungará durante los meses de octubre y noviembre.. Las líneas celulares se cultivaron en normoxia con 21% de O2 e hipoxia con 1% de O2. Las últimas tres líneas celulares mencionadas se consideran tumorigénicas. 96 y 120 hrs de incubación (Tirapelli et al. flores. hojas. en ambos casos a 37°C en una atmósfera húmeda y 5% de CO2. La línea celular MCF-10F proviene de un tumor fibroquístico y es considerada una línea no tumorigénica (Soule et al.. 72. 5. por 30 min a 37ºC en modo sweep. se solubilizó con una 29 . Después. que es captado por las células viables. 5.5% de DMSO en todas las soluciones. el extracto de Senecio se traspasó a microtubos de 1. 2008). Una vez finalizado los tratamientos. De esta manera se obtuvo una solución madre de 95. graveolens El extracto etanólico de S. esta solución madre se volvió a sonicar a 37 KHz.. Para ello.9 mg/ml con un volumen final de 2 ml la que se almacenó a 4ºC hasta su uso. Luego de que las células alcanzaron la fase exponencial.4 Preparación del extracto crudo de S. graveolens fue obtenido en los laboratorios de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Finalizando este proceso el material vegetal seco contiene una humedad de 15. 12. se aplicaron los tratamientos con distintas dosis de extracto de S.5 ml. Los períodos de exposición fueron de 4. 5.000 rpm a 20ºC por 15 min. Luego se sonicó a 37 KHz por 3 hrs a 37ºC en modo sweep (movimiento de tipo circular). las células viables se evaluaron con el ensayo de rojo neutro (Repetto et al. Esta solución se centrifugó a 4. graveolens y dosis letal 50% (DL50) Se realizó una curva de toxicidad para determinar la DL50 del extracto etanólico de S.5 Curva de dosis/tiempo respuesta al extracto fitoquímico de S. Antes de iniciar cualquier trabajo. Para este efecto se realizó un lavado con PBS estéril y luego se cultivaron las células con una solución de rojo neutro (40 μg/ml) por 2 hrs en la incubadora. en placas de cultivo de 24 pocillos y se incubaron por 72 hrs para su asentamiento. Para preparar la solución stock de este extracto se disolvieron 192 mg en 2 ml de dimetilsufóxido (DMSO) al 40% diluido en agua desionizada estéril.días a 4500 msnm. graveolens con distintos tiempos de exposición. 24 y 48 hrs en condiciones de normoxia e hipoxia. Este colorante. se sembraron por cuadriplicado las MCF-10F. en una cantidad de 1 104 células. graveolens en un rango de 0 a 1.66%.6 mg/ml con una concentración final de 0. 2 mg/ml de extracto crudo de S. La membrana fue 30 .5% de DMSO.2 mg/ml del extracto de S.7 Análisis de expresión proteica Mediante la técnica de western blot se analizaron los extractos proteicos de células tratadas con 0. 5 mM MgCl2. 1% ácido acético en agua destilada). 130 mM NaCl. 1 mM fenilmetilsufonil fluoruro.0. para luego ser transferidas a una membrana de PDVF.mezcla de desteñido (50% de etanol. graveolens por un período de 24 hrs. 5. graveolens. y 1 mM ortovanadato). 5. El extracto fitoquímico fue sonicado antes de preparar los medios de cultivo con el tratamiento. Se cargó un total de 20 µg de proteínas por línea y se separó mediante electroforesis en un gel de SDS-PAGE. 1% (w/v) NP-40. pH 8. La densidad óptica registrada es directamente proporcional al número de células viables que se encontraban en el cultivo.00 para Windows. La concentración proteica se calculó mediante el ensayo colorimétrico del ácido bicinconínico. Las proteínas se extrajeron por medio de un buffer de lisis (50 mM –Tris-HCl. correspondiente a la DL25.6 Tratamiento con extracto fitoquímico de Senecio graveolens Las líneas celulares fueron tratadas con 0. versión 5. y luego cuantificado mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 550 ƞm. utilizando las líneas de tendencia de las curvas obtenidas y a partir de la fórmula de la curva binomial se reemplazó la incógnita X hasta encontrar los datos correspondientes a DL50 y DL25. durante una hora a 37ºC. con una concentración final de 0. El porcentaje de viabilidad se calculó mediante la siguiente fórmula: Las DL50 y DL25 de cada tratamiento se calcularon con el programa GraphPad Prism. todos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz.UU). EEUU). el cual se usó de acuerdo al protocolo del fabricante. se utilizaron los partidores con-sentido 5’-ACC AAC CAG CAG GCA GCT GGC. St. Los amplicones se incubaron en presencia de NgoMIV a 37°C durante 16 hrs. Pierce Elmer. CA. Sigma-Aldrich. pasado este tiempo la enzima se inactivó a 80°C durante 20 min.8 Determinación del polimorfismo Val16Ala de SOD2 Para la determinación de la presencia del polimorfismo se realizó una extracción de ADN a todas las líneas celulares y mediante la técnica de PCR. Carestream Kodak. Luego.bloqueada con leche descremada durante 1 hr a temperatura ambiente e incubada toda la noche a 4°C con los siguientes anticuerpos: Bcl-2 (SC-7382).’ y anti-sentido 5’-GCG TTG ATG TGA GGT TCC AG. se utilizó en una concentración de 1:5000 y se incubo por una hora a temperatura ambiente. MA. Caspasa 3 (SC-7272). se amplificó la zona que comprende la secuencia señal mitocondrial del gen SOD2. Estos productos de digestión se visualizaron en un gel de agarosa al 3% con bromuro de etidio en tampón TBE. conjugado con peroxidasa de rábano (HRP). Louis. Los fragmentos resultantes de la digestión fueron de 89 y 18 pb para el polimorfismo Ala16 y de 107 pb para el polimorfismo Val16.’. La señal se detectó mediante el uso de un kit de quimioluminiscencia (Western Lightning Chemiluminescence Reagent kit. Como marcador de carga se utilizó la proteína β-actina (A5316. EE. Las diluciones de los anticuerpos variaron de 1:200 a 1:1000. Caspasa 8 (SC-7890) y MnSOD (SC-133134). sobre películas fotográficas (BioMax® light film. El programa de PCR consistió en 35 ciclos de desnaturalización a 95°C por 1 min.’ (Akyol et al. NY.. se realizó una digestión con la enzima de restricción NgoMIV que reconoce la secuencia 5’GCCGCC. extensión a 72°C por 2 min y una elongación final a 72°C por 7 min para obtener un producto de 107 pb. EEUU). 2004). 31 . Para ello. 5. EEUU) con una dilución de 1:10000. El anticuerpo secundario. alineamiento a 61°C por 1 min. se aplicó el test t de student con una significancia del 99% (p<0.9 Análisis estadístico Los análisis estadísticos fueron realizados con la ayuda del programa informático GraphPad Prism. Para demostrar la influencia de los ambientes de normoxia e hipoxia en las DL50 calculadas para el extracto crudo de Chachacoma. versión 5.05). Para demostrar si distintas concentraciones de oxígeno influyen en el comportamiento de las curvas de dosis/tiempo respuesta se realizó un ANOVA de dos vías con un significancia del 95% (p<0.5.01). 32 . Para demostrar el efecto citotóxico diferencial del extracto de Chachacoma sobre la viabilidad de las distintas líneas celulares.01).00 para Windows. se utilizó el test de ANOVA de una vía aplicando el test de comparación múltiple de Dunnett con una significancia de 99% (p<0. Los resultados fueron expresados en promedios ± desviación estándar (DS). 6..RESULTADOS 33 . 6 horas para MCF10F.6. En A) se presenta la curva confeccionada en el laboratorio y en B) la curva generada por el software Doubling Time el cual calcula y genera una regresión exponencial para determinar el tiempo de doblaje de las células. En la Figura 2 se muestran los resultados obtenidos en la línea celular no tumorigénica MCF-10F. 34 . Con los datos de la curva de crecimiento. se ajustó una curva exponencial con la que se calculó el tiempo de doblaje. Las barras de error corresponden a la desviación estándar.Curva de crecimiento realizada a la línea celular MCF-10F. resultando en 24.. Figura 2.1 Tiempo de doblaje Se realizaron curvas de crecimiento y tiempos de doblaje para poder estimar el número inicial de células a cultivar para que las diferentes líneas celulares finalizaran el experimento con un 70% de confluencia correspondiente a la etapa exponencial de su curva de crecimiento. que la respuesta celular fue dosis dependiente. a las 4 hrs de exposición no existe una diferencia significativa entre los ambientes de normoxia y de hipoxia. y para cada una de las concentraciones del extracto crudo se realizaron cuatro réplicas. y a 35 . Se pudo apreciar.. Figura 3. En este ensayo se realizaron cuatro tiempos de exposición. graveolens.05). graveolens En la Figura 3A se muestra el formato utilizado en esta experiencia.6. Como se puede observar en los gráficos de la Figura 4. Sin embargo. B) Imágenes representativas de las células después del ensayo de rojo neutro. se observa en el período de 12 hrs una diferencia estadísticamente significativa (p<0. la cantidad de células teñidas con rojo neutro disminuye de manera directamente proporcional (Figura 3B).2 Curva de dosis/tiempo respuesta del extracto crudo de S.Curva de dosis/tiempo respuesta. Las células se cultivaron en placas de 24 pocillos. graveolens. de manera cuantitativa. ya que al aumentar la concentración del extracto crudo de S. A) Imagen representativa del formato utilizado para la confección de las curvas. con el objetivo de lograr una visión global sobre el comportamiento celular ante el efecto del extracto crudo de S. se presentan las dosis letales al 50% del extracto fitoquímico de S. Gráficos obtenidos a partir de las curvas de dosis/tiempo respuesta al extracto crudo de S. graveolens. La línea celular MCF-10F es más sensibles al efecto citotóxico del extracto hasta en un 52. Figura 4. Interesantemente. esta sensibilidad observada no aumenta con el tiempo de exposición.3 Cálculo de dosis letal al 50% (DL50) en las células MCF-10F y estandarización de las condiciones de trabajo con el extracto crudo de S. Las barras de error corresponden a la desviación estándar. En la Figura 5.01). puesto que a las 48 hrs la 36 . 6. además. En A) se presentan los datos obtenidos en un ambiente de 21% O2 y en B) los datos obtenidos con un 1% de O2. graveolens Las DL50 se calcularon a partir de los datos obtenidos de las curvas de dosis/tiempo respuesta. Con estos datos se puede afirmar de que las células son más sensibles al efecto citotóxico al extracto de Senecio graveolens en un ambiente hipóxico (Figura 4B). Con los datos graficados de DL50 se puede apreciar de manera más precisa que existe una respuesta celular diferencial más sensible bajo hipoxia ante el efecto citotóxico de la Chachacoma.las 24 y 48 horas diferencias altamente significativas (p<0. graveolens observadas en las distintas horas de exposición y en los ambientes de 1 y 21% de O2.23% si esta se encuentra en un medio hipóxico y.01). A las 4 y 12 horas de exposición la variable de oxígeno no influye sobre el valor de la DL 50 del extracto de Senecio. a las 24 hrs de exposición se observa que existe una diferencia substancial de la citotoxicidad al comparar las condiciones de oxígeno del cultivo (p<0. graveolens en células MCF-10F. graveolens en las líneas celulares tumorigénicas derivadas de cáncer mamario Una vez determinadas las condiciones de trabajo con el extracto de Senecio. Las barras de error corresponden a la desviación estándar. con una dosis mínimamente tóxica para la línea celular MCF-10F como contraparte normal.01).4 Efecto citotóxico del extracto fitoquímico de S. fue necesario corroborar si el tratamiento escogido (DL25) es capaz de matar a las células malignas. se realizó un ensayo de viabilidad con rojo neutro en todas las líneas 37 . Sin embargo. Entonces.Dosis letales al 50% de S.DL50 permanece constante. concluyendo un tiempo de tratamiento de 24 horas. (*) Diferencia significativa (p<0.2 mg/ml de extracto crudo el cual equivale a la DL25 en condiciones de 1% O2. graveolens. graveolens.. Figura 5. Con estos datos se logró estandarizar las condiciones de trabajo óptimos para el tratamiento con el extracto de S. la DL50 obtenida en hipoxia es significativamente menor a la obtenida en condiciones de normoxia (p< 0. graveolens. 6.01). una dosis de trabajo de 0. A) Gráfica con los datos de dosis letales al 50% del extracto crudo de S. B) Determinación de las condiciones de trabajo con extracto rudo de S. 08% su población viable (Figura 6). Las tres líneas celulares malignas presentan bajas en su viabilidad que son estadísticamente significativas al ser comparadas con la línea celular normal (p<0. 38 . la línea celular con el fenotipo más agresivo. (*) Diferencia significativa entre grupos experimental y grupo control MCF-10F (p<0. Las barras de error corresponden a la desviación estándar. se mantuvo con una viabilidad de un 75%.95%.01).2 mg/ml del extracto (DL 25) en condiciones de hipoxia (1% O2) durante 24 hrs. se ve afectada en menor grado por el tratamiento disminuyendo a sólo un 50. graveolens. Sin embargo MDA-MB-231. (**) Diferencia significativa entre grupos experimentales (p<0.26% y 5. respectivamente..Efecto citotóxico del extracto fitoquímico de S. La línea celular normal.01).2 mg/ml del extracto de Chachacoma por un período de 24 hrs en condiciones de hipoxia.01).celulares después de ser tratadas con la dosis de 0. Tratamiento de las líneas celulares de cáncer mamario con 0. sin existir diferencia significativa entre ambos. Figura 6. mientras que las células malignas ZR-75-1 y MCF-7 disminuyeron su población viable hasta 9. graveolens no induce cambios en la expresión proteica basal de MnSOD. el extracto de S. Sin embargo.0 mg/ml y 0. graveolens queda por resolver si la expresión proteica de la enzima anti-oxidante MnSOD tenía alguna relación con la capacidad de las líneas celulares de soportar el efecto de la sustancia fitoquímica.5 Efecto del extracto de S. al comparar los niveles de expresión de MnSOD de las líneas celulares con los niveles de viabilidad de la Figura 7. Para ello se realizó un western blot con extractos proteicos de las células tratadas con 0. 39 .2 mg/ml de extracto de S. graveolens.6. graveolens sobre la expresión proteica de la enzima MnSOD Al determinar que las líneas celulares malignas derivadas de cáncer mamario se ven afectadas por el tratamiento el compuesto fitoquímico de S. A mayor cantidad de proteína anti-oxidante mayor es la resistencia al efecto del extracto. existe una relación directa entre los niveles de expresión basal de MnSOD y la resistencia a la citotoxicidad del extracto fitoquímico. Como se puede observar en la Figura 7. 6. Una vez que se tuvo certeza de que los productos de PCR estaban en buenas condiciones.6 Determinación de las variantes polimórficas Val16Ala de MnSOD Dado que existen reportes que involucran la presencia del polimorfismo Val16Ala con la disponibilidad de MnSOD en la mitocondria.. se prosiguió con la digestión enzimática utilizando la NgoMIV para identificar los polimorfismos existentes. graveolens en condiciones de hipoxia. la enzima corta el amplicón de 107 pb.Expresión proteica de MnSOD. En la Figura 8A se muestran los productos de PCR donde se amplificó la secuencia nucleotídica que presenta la variante polimórfica en estudio. En el caso de que se encontrase el polimorfismo Ala. dejando bandas de 89 y 17 pb como 40 . B) Representación gráfica del grado relativo de luminiscencia de la expresión de MnSOD. se determinó la presencia de esta variante en las líneas celulares utilizadas en este trabajo. A) Detección de los niveles de MnSOD en líneas celulares de cáncer mamario tratadas con extracto crudo de S. vale decir presencia de una banda nítida sin ADN degradado observable.Figura 7. . A) Gel de agarosa que muestra las bandas del amplicón SOD2 para las diferentes líneas celulares. como lo ocurrido en las células MCF-10F y la ZR-75-1. Mpm: Marcador de peso molecular. Figura 8. la enzima no digiere el producto de PCR. 6. graveolens es mediada por la vía extrínseca de la apoptosis se realizaron western blots para observar la expresión de caspasa -8.sucedió en los casos de la MCF-7 y la MDA-MB-231. En caso de que la variante Val este presente.7 Análisis de las proteínas relacionadas con muerte celular Con el objetivo de analizar si la disminución de la viabilidad causada por el extracto fitoquímico de S. B) Gel de agarosa que muestra las bandas de 107 y 89 pb obtenidas para las líneas celulares de cáncer mamario. pb: Pares de bases. El nivel de expresión proteica de pro-caspasa -8 (55 kDA) en la línea celular MCF-10F no presentó cambios con el tratamiento (Figura 9A).Determinación de la variante polimórfica Val16Ala en el gen de SOD2 con la enzima de restricción NgoMIV. Por otra parte. dado que no este no posee la secuencia consenso. la línea celular MDA-MB- 41 . Existen diferencias en los niveles basales de la pro-caspasa -8 entre las líneas celulares.Expresión proteica de Caspasa -8. Se observaron cambios 42 .2 mg/ml). En el caso particular de las líneas celulares ZR-75-1 y MCF-7 los niveles de procaspasa -8 no parecen verse afectados por el tratamiento con el extracto crudo. que bajó en un 50. B) Representación gráfica del grado relativo de luminiscencia de la expresión de Caspasa -8. En el caso de la caspasa -3. siendo similares MCF-10F y MDA-MB-231 entre sí.08% su viabilidad.. Figura 9. destacándose la nula señal en la línea MCF-7 y el alto nivel de expresión en MDA-MB-231 (Figura 10).231. células que disminuyeron considerablemente su población viable con este tratamiento de Chachacoma (0. presentó una baja de expresión de la pro-caspasa 8 en un 41%. pues presentan bajos niveles basales de esta proteína en comparación a las líneas celulares MCF10F y MDA-MB-231. graveolens en condiciones de hipoxia. A) Detección de los niveles de Caspasa -8 en líneas celulares de cáncer mamario tratadas con extracto crudo de S. Sin embargo. cabe destacar la similitud en la expresión basal entre ZR-75-1 y MCF-7. se observa que existe una diferencia en los niveles basales de esta proteína en las distintas líneas celulares. en la línea celular MCF-7 la señal de la caspasa -8 activada (18 kDA) aumenta considerablemente cuando es expuesta al extracto. sutiles a nivel de la pro-caspasa –3 con el tratamiento de Chachacoma en las líneas celulares ZR-75-1 y MDA-MB-231, con una disminución en la intensidad de la señal de un 28 y 17% respectivamente. Con el nivel de detección utilizado en estos experimentos no fue posible hallar la señal de la caspasa –3 activada, de aproximadamente 17 kDa, hallándose sólo la señal de la pro-caspasa -3 con un peso de 34 kDa. Figura 10.- Expresión proteica de Caspasa -3. A) Detección de los niveles de Caspasa -3 en líneas celulares de cáncer mamario tratadas con extracto crudo de S. graveolens en condiciones de hipoxia. B) Representación gráfica del grado relativo de luminiscencia de la expresión de Caspasa -3. En la Figura 11, se muestran los resultados del análisis de expresión de la proteína Bcl-2. Se puede apreciar una banda de 33 kDa, que corresponde a la forma fosforilada de esta proteína en las líneas celulares MCF-7 y MDA-MB-231, no así en MCF-10F y ZR-75-1. En las líneas celulares tratadas con el extracto crudo se aprecia un aumento en la intensidad de la señal de la forma fosforilada en un 30% en la línea MCF-7 y en un 34,9% en el caso de MDA-MB-231. 43 Figura 11.- Expresión proteica de Bcl-2. A) Detección de los niveles de Bcl-2 en líneas celulares de cáncer mamario tratadas con extracto crudo de S. graveolens en condiciones de hipoxia. B) Representación gráfica del grado relativo de luminiscencia de la expresión de Bcl-2. 44 7.- DISCUSIÓN 45 el Senecio stabianus. fue capaz disminuir la población viable de las líneas celulares malignas ZR-75-1 y MCF-7 en un 9.95%. 2012). Por estas razones.1 μg/ml de extracto metanólico (Tundis et al. 2007). Se ha probado el efecto citotóxico de otro miembro del género Senecio en la línea celular MCF-7. para observar si el extracto de Senecio graveolens induce un efecto citotóxico de manera diferencial en ambos ambientes. ¿Cuál es el mecanismo por el que el extracto crudo de Chachacoma es más eficaz en condiciones de hipoxia?. DL50 de 35 ηM en MCF-7 46 . metástasis e inestabilidad genómica (Semenza. deberá ser objeto de futuros estudios así como también el compuesto específico que posee la actividad citotóxica.. Si bien la dosis utilizada en este trabajo está por sobre las DL50 de los fármacos como Vinblastine. y paclitaxel. el cual tuvo la habilidad de disminuir la viabilidad celular en un 50% con una dosis de 91. no son de un 21% de O2.. produce una desdiferenciación de las células estimulando el fenotipo agresivo (Vaapil et al.02 μg/ml). incluso hay de 0. 2009).. La dosis utilizada en este experimento. entre 5% en tejidos del cérvix uterino a 13% en los alveolos pulmonares. 2012) y promueve también la angiogénesis. 2011). disminuyendo la población viable de MCF-10F. 2007) y quimioterapia (Rohwer y Cramer. El extracto fitoquímico mostró ser más efectivo bajo condiciones de hipoxia en un tiempo óptimo de tratamiento de 24 horas. y en general en los tejidos normales. 2009). fenotipo o estado de los ganglios centinela (Vaupel. en comparación a la dosis obtenida en condiciones de normoxia en el mismo tiempo de exposición.26% y 5. Existen mucho reportes que indican que los pacientes que poseen tumores hipóxicos generalmente tienen un mal pronóstico. independiente de parámetros clínicos habituales como grado de malignidad. respectivamente.2 mg/ml). se optó por realizar los experimentos de las curvas de dosis/tiempo respuesta en dos ambientes controlados de 1 y 21% de O2. permite el crecimiento de células con una menor respuesta a estímulos apoptóticos (Graeber et al. manteniendo un 75% de viabilidad en la línea celular control MCF10F.. La hipoxia provoca en estos paciente una resistencia a la radioterapia (Moeller et al.1% y menos (Vaupel et al. 1996). sino que corresponden a niveles mucho más bajos.. DL50 de 25 ηM en MCF-7 (aproximadamente 0.Los niveles de oxígeno al interior de un tumor. correspondiente al DL25 (0. . y es expresada selectivamente en los tumores hipóxicos (Chen et al. HCC1395 y HCC1937. Bajo condiciones de hipoxia HIF-α.. del inglés Hypoxia Response Elements) y modula la expresión de múltiples genes que son importantes para la angiogénesis. actúa de manera más eficiente en un ambiente hipóxico. 2006). además. Es posible que la expresión de esta proteína en la línea celular MDA-MB-231 le confiera un fenotipo más agresivo en comparación a las otras líneas celulares tratadas en este experimento y le ayude no sólo a sobrevivir ante el efecto tóxico del extracto de S. 2009). Muchos de estos mecanismos de respuesta.. Ante 47 . son mediados por los factores inducibles de hipoxia (HIFs. 2010). existen reportes en el cual la línea celular MCF-7 y ZR-75-1 son capaces de inducir la expresión de CAIX en un ambiente hipóxico. está ligada al control del pH tumoral extra e intracelular. sin embargo la respuesta celular se ve dependiente de los niveles basales de esta proteína. correspondientes a líneas celulares mamarias provenientes de cáncer de tipo ductal (Chen et al. activan un sin número de mecanismos para lidiar con el ambiente hostil. 2007).. La expresión proteica de MnSOD no se vio afectada por el tratamiento de Senecio. es la primera aproximación con auspiciosos resultados en la investigación de nuevos compuestos activos que podrían ser extraídos desde la Chachacoma. del inglés Carbonic Anhydrase IX Protein) (Li et al. Se sabe que la línea celular MDA-MB-231. 2001). pero MDAMB-231 tiene la particularidad de poseer un nivel basal mayor de CAIX en comparación a MCF-7. del inglés Hypoxia-Inducible Factors) compuestos por las subunidades alfa (HIF-α) y beta ( I -β) (Keith y Simon. Sin embargo. estas dos últimas. CAIX es una enzima anclada a la membrana citoplasmática que cataliza de forma reversible la hidratación del CO2.. supervivencia celular y tumorigénesis (Pouyssegur et al. este complejo proteico se une a los elementos responsivos de hipoxia (HREs.0 μg/ml) (Gruber et al. graveolens sino que también al ambiente hipóxico al que se expuso. planta nativa de la región de Arica y Parinacota.(equivalente a 0. 2010). bajo condiciones hipóxicas es capaz de expresar la proteína anhidrasa carbónica IX (CAIX. con un potencial uso anticancerígeno y que. se estabiliza y heterodimeriza con I -β en el núcleo. Las células para sobrevivir a la hipoxia. Por consiguiente.. las células parecen tolerar mejor el efecto citotóxico de Senecio en comparación a las líneas que poseen bajos niveles basales de esta proteína. en este trabajo las líneas celulares MCF-7 y MDA-MB-231 poseen este polimorfismo y presentan grandes diferencias.. además. puesto que al ser más eficiente en el transporte de MnSOD al interior de la mitocondria. 2008. Uno de los polimorfismos más estudiados que se presenta en el gen SOD2 es Val16Ala. 2006).un alto nivel basal de MnSOD. Se considera como un factor de riesgo el poseer el polimorfismo Ala. adquiriendo un fenotipo más agresivo (Nelson et al. Primero. Sin embargo. Cabe destacar que variadas investigaciones no asocian la sola presencia de este polimorfismo como un factor de riesgo. Dasgupta et al. Kattan et al. Ridnour et al. ya que su efecto citotóxico se ve influenciado por los niveles basales de la enzima MnSOD. sino más bien se asocia a otros factores como. 2008). 2004).. Los niveles basales encontrados en este experimento en las líneas MDA-MB-231 y MCF-7 concuerdan con los reportados en otros trabajos (Ennen et al. lo que activa la expresión de las metaloproteasas (MMP). produciría un desbalance en la generación de peróxido de hidrógeno y por ende un aumento en las mutaciones y una resistencia a la apoptosis (Bag y Bag. reaccionan de distinta manera ante el efecto citotóxico del extracto fitoquímico de Senecio graveolens en función a sus niveles basales de esta proteína. sus expresiones proteicas de MnSOD son distintas entre sí y. Ante estos antecedentes es posible plantear que el mecanismo de acción del extracto fitoquímico de la Chachacoma esté relacionado con las vías de estrés oxidativo. el uso 48 .. es probable que esta pueda ser una de las causas por la que la línea celular MDA-MB-231 sea más resistente ante el efecto del fitoquímico en comparación a las líneas ZR-75-1 y MCF-7 que poseen niveles basales menores de MnSOD. 2011. que produce cambios conformacionales en la secuencia señal que dirige la proteína a la mitocondria. MnSOD juega un rol importante en el desarrollo del cáncer dependiendo de su nivel basal. Bajos niveles de esta enzima en células malignas se correlacionan con una alta tasa de crecimiento celular y altos niveles de esta proteína se asocian con la capacidad de invasión y metástasis que adquieren estas células malignas al incrementar sus niveles de H2O2 producidos por MnSOD. 2003. por ejemplo.. . lo que concuerda con los datos encontrados anteriormente por otros investigadores que detectaron la deleción del gen que expresa esta proteína CASP-3 (Janicke. se analizó la diferencia en la expresión de la pro-caspasa encontrándose discretas diferencias en las líneas 49 .. de progesterona (PgR) y ErbB2. 2011). 2012). La diferencia que se observa entre las células con el polimorfismo Ala puede también asociarse a la expresión de receptores como lo son el receptor estrogénico (ER). proteína que es considerada junto con la caspasa -7 como proteínas efectoras de la apoptosis (Elmore. observamos que en el caso de la caspasa -8 todas las líneas celulares poseen distintos niveles basales de esta proteína. ya que MDA-MB-231 se caracteriza por ser triple negativa y más agresiva en comparación a MCF-7 que es positiva para ER y PgR. 2008). Dado que no fue posible detectar la señal de la caspasa -3 activada en ninguna de las líneas celulares.. Al analizar las proteínas relacionadas con la apoptosis las caspasas -3 y -8.de terapia de reemplazo hormonal (Liu et al.. era necesario corroborar si la disminución en la viabilidad celular mediada por el tratamiento con Chachacoma activaba la apoptosis en general. ZR-75-1 y MDA-MB-231. 1998). el alto nivel de pro-caspasa -3 detectado en la línea celular MDAMB-231 concuerda con reportes anteriores (Vegran et al. Dado que la caspasa -8 es una proteína clave en la activación de esta vía apoptótica. se analizó también la expresión de la caspasa -3. 2007). Por otra parte. Incluso esta deleción no afecta el proceso de apoptosis. 2009). o la presencia de otros polimorfismos en las proteínas relacionadas con la detoxificación de H 2O2 (Cox et al. no así en MCF-10F. puesto que las proteínas que son clivadas por ella son escindidas de igual modo en su ausencia (Janicke et al. 2006). Con este resultado se presume que en el caso particular de la línea celular MCF-7 el extracto fitoquímico de Senecio graveolens estaría activando la vía extrínseca de la apoptosis. y sólo se observa en la línea celular MCF-7 tratada con el extracto fitoquímico la caspasa -8 activada. En el caso de la línea celular MCF-7 no se observó la señal de esta proteína. Aún hay mucha controversia respecto a esto debido a que también hay investigaciones que no encuentran un nexo entre la presencia de los polimorfismos y factores de riesgo (Bag y Bag. se promueve la formación de autofagosomas (Scherz-Shouval et al. situación que también se puede apreciar en la línea celular MDA-MB-231. ya que en las células tratadas con el extracto de Senecio aumenta la cantidad de Bcl-2 fosforilado. lo que se puede atribuir al clivaje de esta proteína activada por la apoptosis. 2006) y en respuesta al factor de necrosis tumoral alfa (TN α) (Djavaheri-Mergny et al. El procesamiento temprano de las caspasas se ha observado en líneas celulares provenientes de cáncer mamario tratadas con el compuesto feniletil isotiocianato. las células tratadas disminuían la expresión de procaspasa -3 en comparación a las no tratadas.celulares ZR-75-1 y MDA-MB-231. al inactivarse Atg4.. Se ha demostrado que las especies reactivas de oxígeno pueden regular la inducción de la autofagia y con esto promover la supervivencia o la muerte celular. este dada por una temprana activación de esta proteína.. 2004). por medio de la oxidación causada por el aumento de ROS. la que no es posible apreciar a las 24 horas de tratamiento con Chachacoma. 2007). Las especies reactivas de oxígeno pueden promover la muerte celular mediada por autofagia por medio de la eliminación selectiva de catalasa (Yu et al. Si el extracto crudo de Senecio graveolens actúa bajo un mecanismo que se relaciona con estrés oxidativo se podría especular que la ZR-75-1 este disminuyendo por un proceso de muerte celular mediada por autofagia. Los resultados encontrados en la línea celular MCF-7 concuerdan con los datos de caspasa 8. El control que ROS ejerce sobre la autofagia inducida por la escasez de alimentos lo hace mediante la regulación de Atg4. Puede que la ausencia de caspasa activada. se puede analizar la expresión de Bcl-2.. Es posible que en el caso particular de la línea ZR-75-1 el extracto crudo esté disminuyendo la viabilidad celular mediante un mecanismo alternativo al de la apoptosis. 50 ... esta proteína anti-apoptótica que al ser fosforilada pierde su capacidad de interactuar con las proteínas pro-apoptóticas y por ende de frenar el inicio de la apoptosis (Tamura et al. Esta proteína es responsable de la desconjugación de LC3II. 2006). 2012). el cual fue capaz de inducir el procesamiento proteolítico de las caspasas -3 y -9 desde las 4 horas de exposición (Syed Alwi et al. Para corroborar la activación de la apoptosis. . Srivastava et al.Aunque la hipoxia en si es un factor de mal pronóstico. 51 . las cuales se activan selectivamente en ambientes hipóxicos. también existen casos en donde un ambiente hipóxico es capaz de producir una sensibilidad aumentada frente a algunas drogas (Wilson y Hay. el 60% de las quimioterapias utilizadas de alguna u otra manera provienen de fuentes naturales incluyendo las plantas (Cragg y Newman. Aproximadamente. 2005. 2000). el cual es de 50 a 200 veces más tóxico en cultivos hipóxicos que en normóxicos (Brown.. la cual es más resistente al efecto citotóxico del extracto de Chachacoma. 2011). La naturaleza ha mostrado ser una excelente fuente de nuevas drogas. Este reporte constituye un primer gran paso en la exploración del potencial anti-tumoral que esconde la Chachacoma.. 2005. 1993). Reportes han mostrado cómo un derivado de estrógeno es capaz de matar selectivamente células leucémicas y no así linfocitos normales mediante la inhibición de las enzimas superóxido dismutasas. incluyendo agentes anti-tumorales.. Stankovic et al. Dado que en esta investigación se observan altos niveles basales de MnSOD en la línea MDA-MB-231. Un buen ejemplo de ello es el compuesto aromático N-óxido tirapazamina. Semenza. Es el caso de las llamadas pro-drogas bioreductivas. planteándolas como un blanco molecular que elimina selectivamente células malignas (Huang et al. como lo es el caso de los factores de transcripción de la familia HIFs (Poon et al. También se ha establecido como foco de estudio la inhibición de proteínas que se expresan selectivamente en ambientes hipóxicos. queda planteada la siguiente interrogante: ¿sería más efectiva la actividad citotóxica del extracto de Senecio graveolens si se inhibe o disminuye el nivel basal de esta enzima?. 2009. 2011). 2003). CONCLUSIONES 52 ..8. se sugiere una muerte celular alternativa a la apoptosis. ya que en las células que poseen mayor cantidad de esta proteína. En el caso particular de la línea MCF-7 se está activando la vía extrínseca de la apoptosis. queda la interrogante de cómo la línea celular ZR-75-1 disminuye su población viable por efecto del extracto de Chachacoma. Además. para así encontrar la forma de sensibilizar la línea celular MDA-MB-231 ante el efecto citotóxico de este extracto. su nivel de viabilidad no disminuye de forma tan considerable como lo fue en el caso de MCF-10F y MDAMB-231. El extracto de Chachacoma es capaz de disminuir la viabilidad de las líneas celulares ZR-75-1 y MCF-7 en más de un 90%. esta disminución es dependiente de los niveles basales de MnSOD. 53 .El presente trabajo es el primer reporte que involucra el efecto citotóxico de un extracto fitoquímico aislado desde Senecio graveolens sobre líneas celulares de cáncer mamario. Este extracto. es capaz de actuar de manera diferencial dependiente de los niveles de oxígeno. Queda por dilucidar cuál o cuáles son los compuestos activos que están ejerciendo la actividad anti-tumoral del extracto fitoquímico de Senecio graveolens y qué mecanismo de acción poseen. El mecanismo por el cual el extracto crudo de Senecio estaría disminuyendo la población celular sería mediante la activación de la apoptosis en las líneas celulares malignas MCF-7 y MDA-MB-231. siendo más activo en un ambiente hipóxico sobre las células de cáncer mamario. Un posible mecanismo de acción de este extracto estaría basado en la generación de radicales libres o en la interacción con esta enzima antioxidante. además de esclarecer su interacción con la enzima MnSOD. tal vez disminuyendo la expresión basal de esta enzima. Dado que no se observan cambios en las proteínas relacionadas con apoptosis en la línea ZR-75-1. REFERENCIAS 54 .9. V. 151-159. 345(1-2). 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