INTRODUCCIÓNEl término inmovilización de células y enzimas se refiere a células y enzimas físicamente confinadas o localizadas en una cierta región definida en el espacio reteniendo sus propiedades y actividades catalíticas. Asimismo, dependiendo del tipo de inmovilización tanto las células como las enzimas pueden ser inmovilizadas de forma permanente o temporal para ser utilizadas repetida y continuamente en diversos proceso químicos. Por razones técnicas y económicas la mayoría de los procesos químicos catalizados por enzimas o llevados a cabo por células requieren su reutilización o el continuo uso de biocatalizadores durante largos periodos de tiempo. Bajo esta perspectiva, la inmovilización debería ser definida como una técnica capaz de reutilizar o dar uso continuo de biocatalizadores y células. Por lo tanto, la sencillez y el bajo costo de los métodos de inmovilización juegan un papel fundamental en la selección de protocolos de inmovilización. Es por ello que por medio de la inmovilización es posible no solo controlar la ubicación de las células o las enzimas sino también modificar sus propiedades selectivamente. En este artículo inmovilización de inmovilización y inmovilizadas. De soportes o se presenta una breve revisión del estado del arte de la células y enzimas, haciendo énfasis en los distintos métodos de cómo inciden en las propiedades de las enzimas y células igual forma, se discuten aspectos relacionados con la selección de matrices durante el proceso de inmovilización. 1. INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS La investigación sobre inmovilización de organismos unicelulares ha generado gran interés en la comunidad científica, debido a sus grandes ventajas técnicas y económicas respecto a la fermentación tradicional. Entre las principales ventajas que presentan los sistemas biotecnológicos que utilizan células inmovilizadas se encuentra su facilidad para el manejo de una mayor densidad celular comparado con los procesos tradicionales, un mejor control en sistemas continuos y la posible recuperación de la biomasa para su posterior reutilización. En general, los materiales para inmovilizar células deben cumplir importantes requisitos como: ser grado alimenticio (según sea el caso), bajo costo, disponibilidad, no degradables y aptos para condiciones de pH y temperatura bajas (Bakoyianis et al., 1992 y 1996; Bardi y Koutinas, 1994; Fumi et al., 1987; Shimobayashi y Tominaga, 1986). Los métodos de inmovilización de células más usados son la autofloculación (Verstrepen y Klis, 2006; Stewart y Russel, 1986), la adsorción sobre soportes (Bardi et al., 1996) y la incorporación de levaduras en matrices sólidas. La floculación es un proceso que muchas cepas sufren de manera natural (Stewart y Russel, 1986). La adsorción consiste en la adhesión de las levaduras a la superficie externa de un soporte como es el caso del gluten (Stewart y Russel, 1986) o de la DEAE-Celulosa (Lommi y Ahvenaimen, 1990). La incorporación de células a matrices sólidas se realiza por el atrapamiento de las mismas en el seno de un material polimérico. Las matrices más adecuadas son polímeros naturales como el alginato, el carragenato y el agar ya que polimerizan en condiciones muy suaves aunque también se pueden usar matrices sintéticas como poliacrilamida y poliuretano (Groboillot et al., 1994). El “atrapamiento” de levaduras en matrices sólidas puede realizarse por difusión de las células en matrices sólidas sintetizadas previamente (Baron y Willaert, 2004) o por formación de las matrices alrededor de las células (Ramakrishna y Pakasham, 1999). Este método de inmovilización permite conseguir grandes concentraciones de biomasa (Stewart y Russel, 1986) con el uso de reactores fluidizados (Verbelen et al., 2006). Además se pueden inmovilizar en matrices independientes células que no podrían coexistir en contacto directo debido al efecto “killer”(Pérez e et al., 2001). No obstante, al igual que los otros métodos de inmovilización presenta La inmovilización de levaduras en perlas de alginato y poliacrilamida se ha utilizado con éxito en la fermentación de vino blanco y en la producción de etanol (Cachon y Divies.. pH y concentración de SO2. La implementación de sistemas con levaduras inmovilizadas ha sido de especial interés para el área de los vinos espumosos. Esta fermentación es difícil de controlar mediante las técnicas de fabricación tradicionales. fenoles y temperaturas extremas. oeni inmovilizado en perlas de alginato se puede adaptar fácilmente a procesos en continuo sin que se observe pérdida de actividad en procesos de fermentación maloláctica (Fleet et al. Otra ventaja importante de estos sistemas inmovilizados es que el soporte protege la levadura de la acción de inhibidores. 2001). También se han reportado estudios en los que se usan estos dispositivos para la producción de sidra espumosa y vinos de piña (Divies y Deschamps. 2002) En el campo de los vinos espumosos también se ha implementado el uso de membranas acopladas al tapón de la botella que permiten el contacto entre el vino y las levaduras durante la fermentación final (Lemonnier. 1990). No obstante. Esta técnica alarga los tiempos de fermentación. principalmente Oenococcus oeni. estos catalizadores se vuelven más activos y se observa que la fermentación ocurre a mayor velocidad respecto a los casos en los que se emplean levaduras libres (Galazzo y Bailey. metales pesados. 1991). 1986). Otro proceso de interés en el que la inmovilización de células exhibe gran potencial es en la fermentación maloláctica.. Este proceso es esencial en la preparación de muchos vinos. Las más importantes son los posibles problemas de difusión de nutrientes y productos a través de la matriz porosa y la pobre resistencia mecánica de los soportes sólidos (Verbelen et al. Cabe destacar que combinando esta tecnología con el uso de reactores de alta presión y reactores de flujo continuo ha sido posible la producción a gran escala de vinos espumosos con composiciones y propiedades sensoriales similares a los fabricados tradicionalmente en botellas con levaduras libres (Iconomopoulou et al. Debido a cambios en la composición de las células por interacción con el soporte de alginato. ya que la transformación de ácido maloláctico en ácido láctico y anhídrido carbónico reduce la acidez y mejora la calidad de los mostos. En el año 2001 el “Institute Oenologique des Vins de Champange (IOC)” reportó la fabricación de tres millones de botellas mediante el uso de este tipo de tecnología (Divies y Chacon. es de esperar que con un mejor entendimiento de los procesos de fermentación y la fisiología de los microorganismos inmovilizados. Sin embargo.. 1992). Este proceso lento y costoso puede ser sustituido mediante el uso de levaduras inmovilizadas en perlas de alginato sin que la cinética del proceso se vea afectada consiguiéndose las mismas propiedades organolépticas que los vinos producidos de manera tradicional (Yokotsuka et al. 2005). Con base en lo presentado anteriormente es posible afirmar que la producción de vinos espumosos se ha beneficiado con el uso de tecnologías que involucran la inmovilización de células. La forma tradicional de preparación de estos vinos implica el uso de levaduras libres y la posterior eliminación de éstas por medio del “dégorgement”. 1991). pero ofrece la posibilidad de realizar el “dégorgement” de manera más sencilla sin necesidad de enfriar la botella. estos sólidos al ser más sencillos de manejar. 1997). Además. son especialmente sensibles a la temperatura. a diferencia de los flóculos de biomasa. . sea posible implementar esta tecnología a otros procesos de producción. esto es mediante congelación (-25°C) del cuello de la botella donde las levaduras se acumulan por sedimentación durante el “remuage”.desventajas.. En 1991. 2006). también se han reportado resultados en los que sí se observa una pérdida importante de actividad en sistemas parecidos (Naouri et al. se reportó que el O. ya que las bacterias que catalizan dicha fermentación.. permiten un mejor control de la actividad catalítica en reactores de tipo lote y continuos. los cuales se describen a continuación. 2005). Sólidos como los que se proponen aquí podrían usarse en procesos en continuo o en sistemas fluidizados. Los materiales mesoporosos templados mediante aglomeraciones micelares (Taguchi y Schuth.. 2003. especialmente por efecto de la agitación. 2005).. pero al ser la adsorción un fenómeno fundamentalmente electrostático.. 1. Esto hace que estos sólidos tengan un interés especial en la industria vinícola ya que mediante el uso de enzimas podrían modificarse la naturaleza de algunas sustancias responsables de aromas y sabores característicos del vino consiguiéndose productos con propiedades organolépticas diferentes. Muchos de estos sólidos porosos podrían encontrar un lugar importante en los procesos de producción de vinos y fermentaciones alcohólicas en general. aunque siguen sin presentar el tamaño de poro adecuado para la inmovilización de levaduras. Sin embargo. es el uso de membranas microporosas como filtros para retener las levaduras en el reactor. Cabe mencionar que la producción de membranas zeolíticas compactas y con propiedades mecánicas adecuadas no es sencilla y hoy en día sigue siendo un reto para muchos grupos de investigación. hoy en día se han enfocado esfuerzos en el desarrollo de rutas novedosas que permitan el desarrollo de sistemas inmovilizados mediante el uso de materiales porosos diferentes a los polímeros de origen natural que se han usado hasta ahora. 1999). Sampermans et al.2 Otros métodos fermentación de inmovilización de células para procesos de Si bien. durante los procesos en continuo. La inmovilización de las enzimas se conseguiría por difusión de las mismas en los poros del sólido previamente funcionalizado con moléculas que “anclarían” la enzima a la pared del material (Hartmann.. las células se liberan del soporte. cada cepa de levadura presenta un comportamiento diferente (Jin y Speers. lo cual resulta muy costoso cuando se emplean reactores continuos. existe una problemática alrededor del uso de células inmovilizadas. sí permiten la inmovilización de enzimas (Yiu y Wright. temperatura y la agitación (Verstrepen et al... 1997). . 1996) o materiales híbridos orgánicos-inorgánicos como los metilaluminofosfatos-alfa y metilaluminofosfatos–beta (Maeda et al. Además. por este método es difícil inmovilizar grandes cantidades de biomasa (Verbelen et al. 2006). la inmovilización de células por adsorción sobre la superficie de materiales es fácil de conseguir. prueba de ello es su extensa aplicación (Corma. 2003).1 Problemas con la inmovilización de células Si bien. el uso de células inmovilizadas en matrices sólidas ha permitido la implementación de procesos de fermentación en sistemas de flujo continuo.. Los sistemas floculados presentan un difícil manejo debido a que la floculación depende de factores como el pH. 2005). 2005). Para tal aplicación se podrían emplear materiales zeolíticos hidrofóbicos convencionales como la zeolita beta (Camblor et al. Otro caso.. El mayor problema que presenta esta técnica es el bloqueo que eventualmente sufren los poros de la membrana debido a partículas o a las mismas levaduras (Lebeau et al. 1998). Debido a su tamaño de poro pequeño. Además. Los materiales mesoporosos más adecuados para la inmovilización de enzimas serían los sólidos del tipo SBA-15 debido a su gran tamaño de poro (Zhao et al. 1998).1. la concentración de Ca2+. Por otro lado. Las zeolitas y los diferentes zeotipos son materiales microporosos muy usados en diversos procesos catalíticos. el uso de membranas zeolíticas sí podría ser de gran utilidad en procesos de fermentación en los que se requiere eliminar el etanol del reactor de forma selectiva (Bowen et al. Existen numerosos problemas que se presentan a nivel industrial. 1995). no sería posible inmovilizar levaduras dentro de sus cavidades. Asimismo. a temperatura de nitrógeno líquido de manera unidireccional y a velocidad controlada. existen otros métodos modernos que no requieren del uso de dispositivos inmovilizadores complejos. Métodos similares de protección deben usarse si se pretende inmovilizar sistemas biológicos sensibles al proceso de congelación. las levaduras deben difundir por las ventanas que comunican los poros. Parainmovilizar bacterias dentro de una matriz polimérica Gutiérrez et al. es la menos explorada en el campo de la catálisis. metálicas etc. células de Saccharomyces cerevisiae han sido inmovilizadas exitosamente por el método de floculación (T. en lugar de los clásicos polvos que dan como resultado los otros métodos de inmovilización. Mediante esta técnica sería posible sintetizar biosólidos de gran resistencia mecánica en los que no habría grandes problemas de difusión de reactivos o productos. además. En este caso las bacterias se recubrieron con alginato-glucosa para protegerlas durante el proceso de congelación criogénica. También es posible modular el tamaño de poro al jugar con la relación masa suspendida/agua de la suspensión a congelar y con la velocidad de inmersión. El segundo método que posee gran potencial es el uso de materiales porosos sintetizados por congelación unidireccional y posterior liofilización (Choi et al. 2008). al ser reciente. 2010). permite la incorporación de especies biológicas in-situ en la matriz durante la síntesis del material debido a que no se requiere calcinación de ningún molde orgánico. que posteriormente son usadas como moldes que se recubren con precursores de óxidos. No . metales u otros materiales (Grochowicz et al. ya que aunque los poros pueden ser muy grandes. Marrero-López et al. Una vez eliminado el hielo por liofilización se obtiene una matriz porosa de alcohol polivinílico en la que quedan retenidas las bacterias. Las cuales incorporaron a la suspensión alcohol polivinílico y la mezcla se transfirió a una jeringa de insulina. la síntesis selectiva de nanotubos de carbono sigue siendo costosa.A. Por medio del proceso de calcinación de las esferas es posible sintetizar materiales macroporosos de cavidades esféricas regulares conectados por ventanas de menor tamaño.. 2009).9 mm/min) y posteriormente se liofilizó. que en este caso serían las bacterias y el alcohol polivinílico. partieron de una suspensión acuosa concentrada de bacterias E. es en realidad un método sencillo de fabricación de materiales macroporosos que. Otra ventaja de este método es que se obtienen monolitos con la forma y geometría del recipiente que contiene la suspensión que se congela. Este método implica la congelación de una solución de partículas que pueden ser poliméricas. silíceas.. como los nanotubos de carbono. De ahí que estos métodos novedosos de inmovilización de células abran un abanico de posibilidades empleando matrices sólidas de diversa naturaleza. 2008.La inmovilización de levaduras requiere de materiales macroporosos con radios del orden de algunas micras.. El proceso que parece complejo. que inducen la floculación de los micro-organismos. y así de esta forma lograr diseñar sistemas de fermentación que trabajen en reactores continuos. Estos materiales pueden sintetizarse mediante dos técnicas: La primera hace uso de esferas sintetizadas por polimerización en microemulsión. Esta se introdujo en un baño con nitrógeno líquido a velocidad controlada (5. Utilizando nanotubos de carbono. Mamvura. Esta técnica de preparación de sólidos macroporosos. Es común que la inmovilización de levaduras y enzimas con los métodos mencionados anteriormente enfrenten problemas técnicos y científicos. Uno de estos métodos es el uso de catalizadores artificiales inertes. coli protegidas con alginato de calcio y glucosa. La estructura 3D de canales que estos materiales exhiben podría resultar de interés para la fabricación de membranas para la retención de levaduras en reactores en continuo. (2007). Durante el proceso de congelación unidireccional se producen frentes de congelación perpendiculares a la dirección de inmersión en los que los cristales de hielo apartan las “impurezas”. El paso más complejo de síntesis sería la inoculación de las células en el interior del sólido. Aunque esta técnica aporta buenos resultados con respecto a la inmovilización. conservando su actividad catalítica y permitiendo el flujo de sustratos y productos. los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad catalítica no deben involucrar un enlace covalente con el soporte aunque esto puede resultar difícil de lograr en algunos casos. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS En la actualidad. Las enzimas inmovilizadas presentan varias ventajas sobre su contraparte en solución. Los métodos covalentes de inmovilización son empleados cuando existe un . Por lo tanto. y pueden además ser encapsuladas mecánicamente la adición de agentes que formen una película protectora alrededor de la enzima inmovilizada. 2005). atrapamiento y micro encapsulado. las enzimas en este método no son liberadas en la solución en uso. para lograr altos niveles de enlace. se abren nuevos horizontes en el área de investigación y aplicación de estos métodos de inmovilización de células. La inmovilización combina la actividad elevada y específica de las biomoléculas activas. la actividad de la enzima puede verse afectada por el proceso de inmovilización. Los procedimientos más comunes de inmovilización irreversible son el enlace covalente. Por lo cual. como las enzimas o anticuerpos.1. es viable mejorar la estabilidad y actividad de la enzima en función del pH y la temperatura. es importante plasmar una visión sobre las expectativas y potencialidades que tienen estos materiales en el proceso de fermentación alcohólica. la inmovilización también puede presentar ciertas desventajas. además. 1992). Permiten un uso continuo. Asimismo. por ejemplo. además. al ser inmovilizadas quedan protegidas ante enzimas proteolíticas.1 Clasificación de métodos de inmovilización Los métodos de inmovilización de enzimas se clasifican en dos rubros: métodos reversibles y métodos irreversibles (Gupta y Mattiasson. Las enzimas pueden ser inmovilizadas en sustratos naturales y/o sintéticos por medios químicos (uniéndolas al sustrato mediante enlaces covalentes) o físicos (fuerzas electrostáticas o membranas). Wang y Caruso. con la estabilidad química y mecánica del soporte. pero no de proteínas (Heering et al. aumentando así la eficiencia del sistema. 2004. 2. la velocidad de reacción puede estar limitada por la velocidad de difusión de sustratos y productos hacia dentro y fuera del sistema.1 Métodos de Inmovilización Irreversibles El concepto de inmovilización irreversible implica el enlace del biocatalizador a un soporte de manera permanente.Muset. La preparación y estabilización de enzimas ha sido un tema de estudio desde hace casi 50 años (Piug. 1964) y es de interés tanto científico como económico. a) Formación de enlaces covalentes La inmovilización de proteínas por métodos basados en la formación de enlaces covalentes están entre los más usados. la industria requiere gran cantidad de enzimas con el fin de obtener productos con mejores características y menor costo.obstante. reutilización y control de las concentraciones de proteína empleada. 2. Sin embargo. enlace cruzado. surge la motivación para realizar investigación profunda y novedosa fundamentada en el hecho de que los recientes avances en la síntesis de micro y nano materiales porosos aún no se han permeado al campo de la catálisis con levaduras. La ventaja de estos métodos estriba en la naturaleza estable de los enlaces formados entre las enzimas y el soporte. por lo cual el biocatalizador no puede ser liberado sin destruir o modificar su actividad biológica o el soporte. Consiste en mantener la biomolécula unida o atrapada en un soporte físico. permitiendo el paso de reactivos y productos de pequeño tamaño. la implementación de procedimientos que aumenten la estabilidad de las enzimas y permitan su reutilización ha sido por muchos años el objetivo de diversos laboratorios alrededor del mundo. De igual manera. 2. Por ello.. Sin embargo. sin embargo. y ácidos aspártico y glutámico (grupo carboxilo). glutaraldehído) a la enzima en solución.requerimiento estricto de ausencia de enzimas en el producto. uniendo covalentemente los grupos funcionales de las enzimas para formar agregados (Figura 2).. El seguimiento de la inmovilización se realiza cuantificando la concentración de proteína libre (generalmente por el método de Bradford). 2005). El enlace se da entre algún grupo funcional reactivo de la enzima (amino.. oro. Heering et al. las enzimas se encuentran orientadas espacialmente en el soporte b) Formación de enlaces cruzados Con esta técnica los soportes no son necesarios. Las reacciones más usadas involucran las siguientes cadenas de amino ácidos: lisina (grupo amino). Este método tiene como ventaja su sencillez. Los procesos de activación son comúnmente diseñados para generar grupos electrofílicos en el soporte. generalmente recubierto con grupos funcionales orgánicos en la superficie (Monocapas tiol autoensambladas. Generalmente se añade el agente de bajo peso molecular (ej. esto es poco probable y puede verse reducido al dirigir el enlace a sitios específicos y/o con una orientación molecular definida (Wood et al. Figura 1. 1997. ácido bicinconínico). y de la proteína unida covalentemente al soporte (ej. Las desventajas de este método radican en el sitio del enlace. ya que la inmovilización se da por un enlace directo entre enzimas. Tir-hidroxil o His-imidazol) y el soporte previamente activado. Sin embargo. CNBr-Sepharosa. etc. que puede ser mediado o no por un agente de unión. Enzimas inmovilizadas en un soporte físico por enlace covalente. 2004).. cisteína (grupo tiol). Además. . Cis-tiol. es susceptible a cambios pequeños de pH y temperatura en las condiciones de operación (Gódia-Casablancas. ya que puede modificarse el sitio activo o pueden ocurrir impedimentos estéricos que reduzcan la actividad. Los principios básicos que controlan el acoplamiento covalente con matrices son análogos con las usadas en la modificación química de proteínas. Los métodos de acoplamiento en general pueden dividirse en 2 clases: 1) activación de la matriz o soporte por adición de una función reactiva en un polímero y 2) modificación del polímero para producir un grupo activado. la unión por enlace covalente confiere a la enzima una inmovilización más estable a cambios de pH y temperatura en el medio (Queiroz-Claret et al. 1997).) (Figura 1). el cual durante el acoplamiento reaccionan con los fuertes nucleófilos en las proteínas. En este método se enlaza covalentemente la enzima con un soporte insoluble natural o sintético. c) Atrapamiento El método de atrapamiento está basado en la oclusión de las enzimas dentro de una red polimérica que permite al sustrato y a los productos pasar a través de ellos y retener las enzimas (O’Driscoll. ya que las enzimas no están enlazadas a la matriz o soporte. 1975) y por inclusión. agarosa.Figura 2.. Atrapamiento por inclusión. El uso práctico de estos métodos es limitado debido a la baja transferencia de masa a través de las membranas o geles. En algunos casos el gel es sometido a un proceso de secado y molido. el tamaño de los poros no puede ser controlado. debido a las limitantes de difusión que se podrían presentar. dando como resultado esferas de 2 Sm con un tamaño de poro de 35 ± 7 Å (Mureseanu et al. 2005).. quedando atrapadas dentro de la matriz (Figura 3A). y un aumento en la cantidad de enzima cargada más allá de cierto punto no implica necesariamente un aumento de la actividad.. 1963) o atrapamiento por fibras (Dinelli et al.o disacáridos) y surfactantes (lecitina. poliacrilamida. o al añadir agentes policatiónicos o polianiónicos con carga contraria a la enzima o a regiones de la superficie de la misma como el poli(1-vinilimidazol) (PVI) y la poli(etilamina) (PEI) antes de la polimerización (Chen et al. Existen diversos métodos de atrapamiento de enzimas como el de gel (Bernfeld y Wan. La matriz puede ser de origen natural o sintético y de diversos materiales (Sílica gel. microencapsulado (Wadiack y Carbonell. 1976). Enzimas inmovilizadas por enlaces cruzados (líneas negras). 2005). por lo que su actividad no se ve afectada. 1998). 1976). polietilenglicol. Este método difiere de los métodos de acoplamiento covalente descritos anteriormente. La inclusión tiene la ventaja de prevenir el acceso de proteasas y mantener intacta la estructura de la proteína. lactosa. es difícil de escalar y reutilizar ya que el gel puede disolverse bajo ciertas condiciones o tras poco tiempo de uso. diferentes mono. y pueden clasificarse como geles húmedos. En este método las enzimas son colocadas en una solución que posteriormente es gelificada (por temperatura o adición de polimerizantes). obteniendo así mayor área de contacto entre la enzima y la solución que contiene el sustrato (Figura 3B). entre otros). bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB)) (Mureseanu et al. . geles secos (xerogeles) o geles en aerosol (aerogeles) (Figura 3). 3-sn-fosfatidilclorina. carregnatos. También es posible incrementar la capacidad de inmovilización de los geles al utilizar agentes estabilizadores (sorbitol. Sin embargo. Con este método la enzima queda atrapada dentro de una matriz de gel que permite una fácil difusión de productos. Kuiper et al. La microemulsión tiene la ventaja de ser muy sencilla. atrapan la enzima en su interior y permiten el paso de sustratos y productos (Figura 4A). puede tener uso farmacológico en la administración oral de inmunoglobulinas. Además. 2008) (Figura 4B). este método por su naturaleza de interacción suave. La desventaja de este método radica en la pérdida de actividad ante la inmovilidad de la proteína al quedar atrapada en la interface agua/aceite. 2005). etc.. A) gel húmedo. 1999. esto se ve solucionado al controlar el tamaño de poros de las esferas y al dar un tratamiento con un agente que encapsule la proteína (ej. suficientemente porosa para permitir que la enzima funcione en un sistema en solución. nanopartículas de sílice. por microemulsión o liposomas.. Kuiper et al. que posteriormente pueden ser recubiertos con un revestimiento nanocompuesto.) son puestas en suspensión con la enzima por un tiempo dado (aprox. además. entre otros). permite una alta actividad y resistencia a cambios de pH y temperatura (Wang y Caruso. agregando agentes emulsificantes secundarios y espesantes (ej. Atrapamiento por micro-encapsulación. En la microencapsulación las partículas porosas (esferas de sílice con nanoporos. dependiendo de los . También puede llevarse a cabo repetidas veces (emulsión múltiple). y la cantidad de enzima inmovilizada es monitoreada por espectroscopía. Enzimas inmovilizadas por inclusión dentro de una matriz de gel. micropartículas de CaCO3. El método puede ser de dos tipos: por microencapsulación en soportes porosos (con un diámetro de 2-50 nm). pero al mismo tiempo protegida del ambiente degradante. combinando la enzima con agentes emulsificantes y agitando para formar micelas que la protegen de medios ácidos/alcalinos. goma arábiga. para proporcionar una mayor protección. proteasas y durante los periodos de almacenamiento (Chen et al. policloruro de dialilamonio.. o al ser desnaturalizada por el esfuerzo de corte generado durante la preparación de las micelas (Chen et al. 40 min). 2008).Figura 3. 2004). polihidrocloruro de alilamina o poliestirensulfonato) evitando su fuga y protegiéndola de proteasas. 2004. Sin embargo. por la naturaleza de los reactivos utilizados.. polestireno40-b-poili(isocianoalanina(2-thiophen-3-iletil)amida)50. El diámetro de las micelas puede variar de 100 a 250 nm. 1999. Tween 80. ya que generalmente queda atrapada en la superficie exterior y puede desprenderse paulatinamente debido al tipo de interacciones presentes o tras varios ciclos de uso (Volodkin et al. B) esferas del gel seco y triturado.. La desventaja radica en la inclusión de la enzima en el interior de la matriz. las enzimas inmovilizadas pueden ser desprendidas del soporte bajo condiciones no extremas. El uso de métodos reversibles para la inmovilización de enzimas es altamente atractivo.1. ya que la unión es débil y no afecta su conformación. 1997). sin embargo. las enzimas son atraídas y retenidas por medio de interacciones iónicas o fuerzas débiles (puentes de hidrógeno. de la fluidez del copolímero y de la habilidad de la enzima para ser adsorbida en la membrana. Figura 4. Este método consiste en poner en contacto la enzima en solución acuosa con un soporte adsorbente por un lapso de tiempo dado (2-48 h). oro. . Enzimas inmovilizadas por encapsulación. principalmente por razones económicas debido a que el soporte puede regenerarse y recargarse con enzimas nuevas cuando la actividad enzimática decae. Presenta la ventaja de mantener intacta la actividad de la enzima. esta característica hace que al mismo tiempo la unión sea reversible y sensible a cambios de pH y temperatura.2 Métodos de Inmovilización Reversible En el método de inmovilización reversible. interacciones hidrofóbicas) (Figura 5) (Wood et al. fuerzas de Van der Waals. B) Microemulsión en micelas. entre otros) en los cuales. para después lavar el soporte y eliminar la enzima que no fue inmovilizada. 2..emulsificantes utilizados. que a continuación se describen: Por adsorción El método de adsorción emplea soportes orgánicos o inorgánicos que presentan un adsorbente activo (monocapastiol auto ensambladas. Existen distintos método de inmovilización reversible. A) microencapsulación dentro de esferas porosas. 1985). pero pueden presentar problemas como la liberación de enzimas cuando las interacciones son relativamente débiles. Caldwell et al. Dixon. 1974. La resistencia de las interacciones radica en la hidrofobicidad del adsorbedor y de la proteína. La naturaleza de las fuerzas involucradas en la inmovilización no covalente resulta en un proceso que puede ser reversible cambiando las condiciones que influyen en la resistencia de la interacción (ej. o interacciones hidrofóbicas. temperatura y polaridad del solvente). por lo tanto. La inmovilización por adsorción es fácil de realizar y usualmente preserva la actividad catalítica de la enzima. por lo tanto algunas de las posiciones permanecen libres para coordinarse con grupos de enzimas. el cual se basa en la adsorción física o enlace iónico (Messing. 1979). 1982. Kennedy. quitina. Muchos otros ejemplos de enlace reversible con adsorbedores hidrofóbicos ha sido también mostrado en la literatura. donde la adsorción hidrofóbica ha sido utilizada como un principio cromatográfico por más de 3 décadas. 1987). . Yon. la región positiva de la proteína interactúa con el soporte negativo. 1986. Consiste en variables experimentales conocidas como el pH. La hidrofobicidad del adsorbedor puede ser regulada por el grado de sustitución del soporte y por el tamaño de la molécula ligante hidrofóbica. concentración de sales. acido algínico y bases de sílice) por calentamiento o neutralización.Figura 5. Adsorción no específica. 1991. Sales de metales de transición o hidróxidos depositados en la superficie de soportes orgánicos han podido ser enlazados gracias a la coordinación de los grupos nucleofílicos en la matriz. pH. celulosa. Otro método es el uso de interacciones hidrofóbicas. (Cashion. De igual forma es difícil encontrar condiciones bajo la cuales las enzimas permanecen enlazadas fuertemente y activas. En la adsorción física las enzimas son unidas a la matriz a través de puentes de hidrógeno. El método de inmovilización reversible más simple es la adsorción no específica. fuerzas de van der Waals. A) Por adsorción. Quelación o enlace metálico. Woodward. Adsorción hidrofóbica. 1985). Enzimas inmovilizadas en un soporte físico. mientras que enlaces iónicos de enzimas son producidos a través de uniones con sales. 1982). 1976. y la temperatura (Porath. atractivamente económicos. resistencia iónica. La sal metálica o el hidróxido es precipitado en el soporte (ej. Se utilizan principalmente sales de titanio y circonio. El éxito de la inmovilización reversible de la β-amilasa y amiloglucosidasa en soportes de hexilagarosa ha sido reportada (Caldwell et al 1976. Dichos métodos son. Debido a los factores estéricos es posible para la matriz ocupar todas las posiciones de coordinación del metal. Cabral. siendo este método conocido como inmovilización por enlace metálico (Cabral. 1998). con la condición de que el apropiado tiol adsorbente con alta especificad sea utilizado (Carlsson. Las fuerzas electrostáticas globales tienen efecto directo en la adsorción de la enzima.. 2004). Cabe mencionar que aunque la inmovilización sea dirigida a un sitio y/o por un método específico. El soporte es subsecuentemente regenerado lavándolo con un fuerte quelante como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Estos soportes metálicos han sido utilizados ampliamente en cromatografía de proteínas (Porath. la actividad es alta para métodos que usan enlaces disulfuro.. el segundo. 1998)... y un método de estabilización único no asegura que las interacciones sean 100% propias del método (Wood et al. 1998). 1998). A continuación se indican algunas enzimas que han sido inmovilizadas por distintos métodos (Tabla 1). La estabilidad de proteínas globulares en una matriz generalmente depende de las interacciones electrostáticas. cambios en el estado de hidratación y reacomodos en la estructura de la proteína (Volodkin et al. el primero indica que al restringir el movimiento de los segmentos en las cadenas de la proteína se reduce la probabilidad de un cambio estructural irreversible.La elusión de proteínas enlazadas puede ser fácilmente lograda por competencia con ligantes solubles o disminuyendo el pH. Estos métodos son únicos. Kagedal. lo que es crucial para su actividad. 1992. 1997).. . 2005). 2005).. Además. un cambio similar irreversible en la estructura de la proteína ocurre por el choque de los segmentos con la superficie en la que la enzima es inmovilizada o adsorbida (Chen et al. debido a que la reactividad de los grupos tiol pueden ser modulados mediante la alteración del pH.. Formación de enlaces disulfuro. y el pH del medio altera el grado de influencia de estas fuerzas electrostáticas. en especial la interacción proteína-sustrato (Volodkin et al. En algunos casos cuando se estabiliza una enzima por inmovilización. Puntos críticos. Un tamaño de poro similar al tamaño de la enzima es más apropiado para obtener una buena actividad (Mureseanu et al. Un alto rendimiento en la estabilización puede ser logrado al añadir azúcares a la enzima en solución. 2004). un cambio estructural irreversible puede ser prevenido restringiendo el movimiento de los segmentos al encerrar la enzima en cavidades estrechas (Chen et al. 1998). interacciones estéricas.. ya que estos pueden contribuir a mantener la estructura tridimensional de la proteína. el tipo y la cantidad de azúcar utilizado en la estabilización es determinante para generar una alta actividad catalítica (Mureseanu et al. dicha estabilidad es determinada por la combinación de fuerzas electrostáticas globales e interacciones locales específicas (Chen et al. es posible que se rompan los enlaces por medio de una reacción utilizando agentes apropiados como el dithiotreitol (DTT) bajo suaves condiciones. además. los enlaces químicos y las interacciones entre la enzima y el soporte son complejos. además. En lo que concierne a la mejora de la estabilidad de enzimas han surgido dos conceptos fundamentales. porque aunque se forma un enlace covalente estable entre la matriz y la enzima. A pesar de las muchas ventajas de los soportes inorgánicos (ej. los soportes pueden clasificarse en inorgánicos y orgánicos en función de su composición química. ausencia de grupos con carga (el cual previene la adsorción no específica del sustrato y los productos) y es de bajo costo. y es técnicamente difícil recuperar un enzima activa después de una reacción. química y microbial). resistencia mecánica a la compresión. En donde los soportes orgánicos pueden dividirse en polímeros naturales y sintéticos (Cabral y Kennedy. Sin embargo. Brodelius y Mosbach. Se debe controlar la distribución del tamaño de poro en los soportes porosos para optimizar la capacidad y las propiedades de flujo. 1980. biocompatibilidad. fácil obtención. también presenta un carácter hidrofílico. Las propiedades ideales de un soporte incluyen la resistencia física a la compresión. 1991). 1987). la mayoría de las aplicaciones industriales se realizan con soportes orgánicos. resistencia al ataque microbial y bajo costo (Trevan. 1987. El carácter hidrofílico es uno de los factores más importantes que se utilizan para determinar el nivel de actividad de las enzimas inmovilizadas (Gemeiner. 1992). Las características físicas de los soportes (como el tamaño medio de partícula. etc. Los soportes no porosos muestran pocas limitaciones difusionales. así como porque las enzimas inmovilizadas quedan aisladas del medio ambiente. alta estabilidad ante degradación física. los soportes porosos son generalmente preferidos por su alta área superficial que permite una alta carga de enzimas.2 Selección de soportes Las características de las matrices o soportes son de gran importancia en la determinación de la eficiencia del sistema de inmovilización de enzimas. el costo del aislamiento es todavía alto. Por lo tanto. el parámetro de poro y el tamaño de partícula establecerán el total del área superficial. como la mayoría de las enzimas son relativamente inestables. En particular. hidrofilicidad. inertes entre las enzimas y sus derivados. Además de su alta porosidad que influye en su elevada captación de proteínas. la inmovilización de células y enzimas es un proceso prometedor en . CONCLUSIONES En conclusión.) son de gran importancia en el comportamiento del sistema inmovilizador y determinará el tipo de reactor por usar bajo condiciones técnicas. por lo tanto la adecuada selección incidirá en la capacidad de enlace de las enzimas. Asimismo. Una excelente matriz o soporte que ha sido utilizada es la agarosa.2. pero presentan baja capacidad de carga. Buchholz y Klein. entre ellas alta especificidad.2. y que pueden ser usados de modo repetido y continuo” [11]. elevada actividad y gran efectividad a presión y temperatura ambiente. y bajo condiciones que pueden ser optimizadas en el laboratorio. Esto se ve reflejado en un incrementando de la productividad por unidad de enzima.2.la industria. I N M O V I L I Z A C I Ó N Y C A R A C T … El término “confinado y localizado” implica el uso de una fase insoluble y macroscópica que sea catalíticamente activa y la cual se encuentre dispersa en un medio líquido. Biocatalizadores inmovilizados Como ya se mencionó en el Capítulo 2. permitiendo que el proceso biotecnológico sea económicamente rentable [117].2. 5. Objetivos Los objetivos del presente capítulo son: Describir la metodología de inmovilización de las células catalíticas. con las ventajas y desventajas antes mencionadas. Esta propiedad se debe a que el aislamiento del biocatalizador en general es muy sencillo. el empleo de muchas enzimas en la industria se ve limitado como consecuencia de su labilidad en las condiciones normales de trabajo. Contrastar el desempeño del biocatalizador con PAL pura inmovilizada. El transporte de reactivo hacia y desde el biocatalizador está gobernado por difusión.1. Dicha . Las mismas se anuncian a continuación: Reutilización del biocatalizador: una de las ventajas más importantes de los biocatalizadores inmovilizados es la posibilidad de usarlo reiteradamente. libre del catalizador. debido a que son hidrosolubles. químicos y bioproductos de interés científico y económico. con retención de su actividad catalítica y. produciéndose gradientes y haciendo que la concentración varíe en el seno del líquido y dentro del catalizador. de su viabilidad. el término “retención de la actividad catalítica” implica que la metodología de inmovilización debe asegurar al menos el 25% de la actividad original del biocatalizador. si es necesario. 5. REFERENCIAS Capítulo 5 Inmovilización y caracterización del biocatalizador 5. Por otra parte. fármacos. De acuerdo a la European Federation of Biotechnology (1983). A pesar de ello. la utilización de enzimas en la industria ha proporcionado claras ventajas en comparación con los catalizadores químicos. Este proceso puede ayudar a mejorar la producción de alimentos. Fundamentos 5. es difícil recuperarlas de la mezcla de reacción para utilizarla en un sucesivo proceso. pero sobre todo con un enorme campo de aplicación. 22]. Finalmente. cuando hace mención al “uso repetido y continuo” se refiere a que el biocatalizador debe poder separarse fácilmente del seno de la solución para poder reutilizarlo. en contraste con el biocatalizador libre. 140 | CAP Í T U L O 5 . Ventajas y desventajas de la inmovilización de enzimas El uso de biocatalizadores inmovilizados en la industria de bioprocesos confiere una serie de ventajas respecto al uso del biocatalizador libre [17. se definen los biocatalizadores inmovilizados como: “enzimas. al igual que separarlas de los productos de reacción.2. Por otro lado. células u organelas (o combinación de ellos) confinados o localizados en una región definida del espacio. Caracterizar el biocatalizador inmovilizado obtenido. se han podido superar estos últimos inconvenientes.1. Con el advenimiento de la inmovilización de las enzimas. productividad es un requisito esencial para el biocatalizador inmovilizado. los métodos de inmovilización se pueden clasificar en dos grandes categorías [8]: Métodos de retención física: En éstos. las etapas de downstream necesarias para la purificación del producto. pudiendo reducir considerablemente su actividad. Por otro lado. Sin embargo. Adaptación a procesos continuos: los biocatalizadores inmovilizados pueden ser empleados en procesos continuos. la rentabilidad del proceso se puede incrementar mediante las ventajas del uso de biocatalizadores inmovilizados.2. la recuperación de los productos de reacción o del sustrato modificado. Los métodos físicos se pueden clasificar en: Atrapamiento y Retención en membranas (Figura 5. las condiciones de inmovilización pueden ser perjudiciales para el biocatalizador. Por un lado. Esto permite poder C A P Í T U L O 5 . Cuando el biocatalizador se encuentra libre en solución. Como consecuencia.3. brindándole estabilidad y aumentando. la única forma de detener una reacción es inactivando la enzima. Heterogeneidad del sistema enzima-soporte: puede ocurrir que la cantidad de enzima unida a un soporte difiera y con ello se pueden producir variaciones entre batch y batch. Menor contaminación de los productos: mediante el uso de biocatalizadores inmovilizados. un costo adicional. limitando en gran medida la velocidad de reacción. I N M O V I L I Z A C I Ó N Y C A R A C T … 5. Por otra parte. Los métodos . la utilización de enzimas tiene una serie de desventajas. I N M O V I L I Z A C I Ó N Y C A R A C T … 141 automatizar el proceso con la consiguiente reducción de los costos laborales. Estabilización del biocatalizador: el soporte de inmovilización puede proveer un ambiente favorable que protege la enzima de las condiciones de reacción. entre ellas: Pérdida de actividad durante la inmovilización: es posible que parte de la actividad del biocatalizador se pierda durante la inmovilización. Incremento del costo de producción del biocatalizador: la incorporación de la inmovilización en la producción del biocatalizador implica. la vida útil de la misma. Métodos de inmovilización En general. algunos métodos de inmovilización pueden modificar la conformación de la estructura nativa de las enzimas. ya que de ello depende la rentabilidad del proceso. resulta más sencilla. el catalizador inmovilizado siempre será más caro que el biocatalizador libre. Mayor control sobre la reacción: esta característica es importante cuando se debe detener la reacción por algún motivo en particular.1). la enzima queda retenida físicamente en el soporte o carrier. de este modo. 142 | CAP Í T U L O 5 . Barrera difusional: la inmovilización generalmente adiciona una barrera al libre flujo de sustratos y productos. por ejemplo en lechos estáticos en una columna o bien lechos fluidizados. mediante enlaces químicos. Esto evita la contaminación de ambas especies con el catalizador. y por ende. Métodos de unión química: El biocatalizador se mantiene unido al carrier. por las razones anteriormente descriptas. mientras que el biocatalizador inmovilizado es fácilmente removible de la mezcla de reacción. lo cual traduce en gradientes de concentración a través del soporte. Esto dependerá en gran medida del método escogido para llevarla a cabo. polímeros basados en el estireno. En contraposición. que no alterna la estructura y funcionalidad de la proteína. Cada uno de los métodos de inmovilización se describe brevemente a continuación [8. Sin embargo. donde la enzima Inmovilización Retención física Atrapamiento Inclusión en membranas Unión química Covalente Adsorción Entrecruzamiento C A P Í T U L O 5 . Finalmente. Métodos de inmovilización de biocatalizadores. dependiendo de la naturaleza del carrier. ya que dichas interacciones pueden alterar la estructura y funcionalidad de la enzima. Se trata de un método sencillo. colágeno. etc. el rendimiento de inmovilización es bajo y la cinética de la enzima puede ser alterada. polímeros metacrílicos. tirosina e histidina. etc. debido a que las enzimas se encuentran más expuestas. carraginato. Enlace covalente a matrices solubles: Este método se basa en la activación de grupos químicos del soporte. I N M O V I L I Z A C I Ó N Y C A R A C T … la adsorción de la enzima son: el pH del medio. Adsorción sobre matrices insolubles: La enzima se une al soporte mediante interacciones iónicas. 14. requiere poca carga enzimática por unidad funcional y en general es de fácil preparación.1. Los aminoácidos cuyos residuos reaccionan más frecuentemente con el soporte son: lisina. El atrapamiento puede llevarse a cabo en geles.químicos se pueden clasificar en Enlaces covalentes. Algunos factores que influyen en 144 | CAP Í T U L O 5 . la fuerza iónica. para que reaccionen con los nucleófilos de la proteína. el diámetro de poro. 117]: Atrapamiento: Este método consiste en la retención física de la enzima en las en las cavidades internas de una matriz sólida porosa. Se trata de una tecnología flexible. alginato. I N M O V I L I Z A C I Ó N Y C A R A C T … 143 queda retenida en el interior del gel. Algunos de los soportes más empleados son los polímeros de acrilamida. el cual luego se polimeriza por variaciones en la temperatura o bien por el agregado de un reactivo químico. Además. Adsorción y Entrecruzamiento (Figura 5. puede adaptarse a sistemas continuos de producción a gran escala. la . es necesario controlar las condiciones de polimerización y comprobar que no haya interacción químicas con los soportes. ya que la misma se encuentra libre dentro de la membrana. o bien en fibras.1). Algunas ventajas de este método es que no altera la estructura de la enzima. pero retienen a la enzima. cisteína. La metodología se basa en la adición de la enzima a la solución del monómero. Inclusión en membranas: En este método las enzimas se incluyen dentro de membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustratos y producto. Figura 5. de Van der Walls y puentes de hidrógeno. que confiere elevada estabilidad a la enzima antes condiciones desfavorables del entorno. Entre los polímeros más empleados se encuentran poliacrilamida. pueden incorporar una resistencia considerable a la difusión de sustrato y producto a través de ella. donde la enzima queda ocluida a las microcavidades de dicha fibra. Un tipo específico de inclusión en membrana es la microencapsulación. Sin embargo. la cual se logra mediante polimerización sobre la superficie de la enzima dentro de un solvente compuesto por solventes orgánicos y agentes surfactantes. dependiendo de las características de la membrana. pueden sufrir pérdida de actividad más fácilmente que en otros sistemas. Entrecruzamiento: Esta metodología emplea reactivos bifuncionales de bajo peso molecular. etc. química y biológica. Estabilidad física. Por un lado hay columnas de lecho empaquetado. el tipo de reacción y los biorreactores empleados para su aplicación [11]. piedras de vidrio. Un ejemplo de reactivo bifuncional es el glutaraldehído. y no produce cambios de especificidad enzimática. Tipos de biorreactores para biocatalizadores inmovilizados Existen diversos tipos de biorreactores empleados para la utilización del biocatalizador inmovilizado (Figura 5. en los biorreactores que trabajan en forma discontinua o por batch. No tóxicos. carbonato de calcio. entre ellos: Contener grupos funcionales adecuados para inmovilizar el biocatalizador. colágenos. Recién entonces se descarga el biorreactor y se obtiene el producto de interés.4. C A P Í T U L O 5 . En contraposición. Este método puede llevarse a cabo en la superficie de la enzima soluble (CLE). Los mismos constan de un recipiente con agitación. en el interior del biorreactor se llega a un estado estacionario donde la concentración en el interior del seno del líquido es igual a la que sale del biorreactor.2). tiene un bajo costo. debe considerarse el tipo de biocatalizador. Más allá de los aspectos constructivos. El entrecruzamiento entre la enzima y los compuestos bifuncionales producen derivados insolubles. existen dos formas de operación: continua y discontinua o batch. Tipos de biorreactores para biocatalizadores inmovilizado [117]. I N M O V I L I Z A C I Ó N Y C A R A C T … 145 5. tiene la ventaja de ser fácil de preparar. Los soportes o carriers de inmovilización. Pueden operar tanto de forma continua como discontinua. al no requerir de un carrier. se introduce el sustrato en el biorreactor junto con el catalizador y la reacción sigue su curso hasta que finaliza la conversión. En los biorreactores operados de forma continua existe un flujo constante de entrada de sustrato. o bien sobre agregados de la enzima (CLEA). en el cual se incorpora el biocatalizador inmovilizado y el sustrato. deben cumplir una serie de requisitos. Los tanques agitados son la configuración más simple de biorreactor. celulosas. los cuales se unen a la enzima mediante uniones intermoleculares. De esta forma. Este sistema tiene la ventaja de que.2. con lo cual no se requiere de un carrier para que contenga la enzima. Ésta generalmente se emplea en forma continua y puede tener diferentes configuraciones. Resistencia mecánica. etc.2. También son resistentes a incrementos de pH y temperatura. pudiendo perder fácilmente la carga enzimática. la actividad específica del catalizador es elevada. Algunos carriers empleados son la alúmina. Elevada disponibilidad en el mercado. donde el biocatalizador inmovilizado se empaca en la columna y la solución de . etc. tierra de diatomea. carbón. sobre la enzima cristalizada (CLEC).carga enzimática. Otra configuración de biorreactor muy empleada es la 146 | CAP Í T U L O 5 . como método de inmovilización. son poco estables mecánicamente y la unión al soporte es débil. Versátiles para su uso en diferentes biorreactores. La elección de los métodos de inmovilización a emplear dependerá en gran medida del propósito de la bioproceso. a su vez. Por ende. Por otro lado. I N M O V I L I Z A C I Ó N Y C A R A C T … columna. Figura 5. La adsorción. así como también un flujo constante de salida de producto. Económicos. Cada uno de estos biorreactores puede tener diferentes variantes de acuerdo a su aplicación. ya sea por la resistencia a la entrada del sustrato o bien por la resistencia a la salida del producto. tiene libertad de movimiento. de ello dependerá. Efectos de la inmovilización sobre el biocatalizador El proceso de inmovilización puede afectar de diferente manera al biocatalizador. en cuyo caso la enzima perderá totalmente su actividad. a un flujo mayor a la velocidad mínima de fluidización. 5. Una variante de este sistema es el lecho fluidizado. en cuyo caso la reacción se verá parcial o completamente impedida. Esto puede deberse a varios factores. Como consecuencia de estas uniones. Dichos efectos deben tenerse en cuenta a la hora de elegir un método de inmovilización y una forma de operación. Otra causa de estabilización puede ser la protección que confiere el soporte frente al accionar de proteasas. Finalmente. Por un lado.2. la solución pasa a través de la columna. En general. Finalmente.5. donde el biocatalizador en vez de encontrarse empaquetado. Dentro de las resistencias externas se encuentra la resistencia a la transferencia de masa desde el seno del líquido hasta la partícula. la cual está constituida por una película líquida estacionaria denominada capa de Nernst. Efectos sobre la actividad enzimática: como consecuencia del proceso de inmovilización puede perderse parte o totalidad de la enzima. ya que la unión de las proteasas con el soporte disminuye su capacidad de proteólisis. lo que deriva en la pérdida de su funcionalidad. lo cual a su vez también le confiere estabilidad. puede existir un problema de impedimento estérico que impide que el sustrato llegue al centro activo de la enzima. las cuales son independiente del soporte. las condiciones del entorno durante la inmovilización. durante la reacción pueden provocar la desnaturalización proteica.sustrato para a través de ella. En las proximidades de la partícula hay una resistencia externa adicional. Los efectos más relevantes se resumen a continuación [14. debido a la retención de la enzima en el soporte. las concentraciones en la capa de Nernst son menores que en el seno del líquido. o bien. 117]: Efecto en la estabilidad: se ha observado muchas veces un incremento en la estabilidad del biocatalizador una vez inmovilizado. Este tipo de reacción puede tener o no recirculación de producto. aquí se mencionarán sólo algunos de ellos. Adicionalmente es posible que algunos grupos reactivos del soporte reaccionen con un C A P Í T U L O 5 . Otra posible causa puede ser la metodología de inmovilización. la capacidad de agregación se pierde. produciéndose la bioconversión. la estructura terciaria de la enzima se vuelve más rígida y resistentes a la desnaturalización por temperatura o agentes químicos. Por un lado. tenemos resistencias externas. Efectos difusionales: como resultado de la inmovilización es común que se evidencien problemas difusionales que afecten la velocidad de reacción. la cual puede ocasionar un cambio en la estructura nativa de la enzima. Esto puede deberse en principio a la estabilización de la conformación de la enzima por uniones puntuales con el soporte. Por otro lado. las resistencias difusionales internas se deben exclusivamente a la naturaleza del soporte y. En éste último. I N M O V I L I Z A C I Ó N Y C A R A C T … 147 aminoácido que forme parte del sitio activo de la enzima. la facilidad . pueden sortearse por ejemplo. Barreras difusionales del biocatalizador inmovilizado [14]. aumentando la concentración de sustrato en el seno del líquido. disminuyendo el tamaño del biocatalizador. incrementando la agitación. etc.2). Figura 5. . (1) Resistencia externa en el seno del líquido. tanto internas como externas.3.con la que el sustrato llegue al centro de la partícula (Figura 5. (2) Resistencia externa en la película estanca y (3) Resistencia interna del soporte. Las barreras difusionales.