UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTÍNFACULTAD DE ECOLOGÍA DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS AMBIENTALES Y SANITARIA E.P. INGENIERÍA AMBIENTAL INFORME: Observación de Citotoxicidad en Células de Cebolla (Allium cepa) CURSO: TOXICOLOGÍA Y SALUD AMBIENTAL PROFESOR: BLGO. ALFREDO DÍAZ VISITACIÓN INTEGRANTES: MUÑOZ TAFUR DINA RAQUEL ROJAS LÉVANO NOEMI JENIFFER SÁNCHEZ IMAÑA MARIMAR VALLEJOS TICLIAHUANCA FRANKLIN VÁSQUEZ MUNDACA GISELA CICLO: VI MOYOBAMBA – PERÚ 2017 I. INTRODUCCIÓN El presente informe tiene por finalidad conocer los efectos de tóxicos en vegetales, en este caso de la cebolla y reconocer a través del microscopio los cambios ocasionados por éste como presencia de mitosis atípica. El término de metal pesado refiere a cualquier elemento químico que tenga una relativa alta densidad y sea tóxico o venenoso en concentraciones incluso muy bajas. Los ejemplos de metales pesados o algunos metaloides, incluyen el mercurio, cadmio, arsénico, cromo, talio y plomo, entre otros. Los metales pesados son peligrosos porque tienden a bioacumularse en diferentes cultivos. En un pequeño grado se pueden incorporar a organismos vivos (plantas y animales) por vía del alimento y lo pueden hacer a través del agua y el aire como medio de traslocación y dependiendo de su movilidad en dichos medios. Es importante determinar el nivel de riesgo ambiental de los metales pesados sobre diversas plantas terrestres. Así, el uso de la cebolla, en esta práctica ha sido de gran ayuda para evaluar la toxicidad y el riesgo de sustancias químicas peligrosas, ya que permite obtener meristemos radiculares en corto tiempo. Los ensayos con plantas terrestres, como la cebolla, son muy utilizadas en esta clase de pruebas ya que se les puede usar con muestras coloreadas o turbias, con un mínimo costo de mantenimiento en el laboratorio. La sensibilidad de las especies a los metales pesados varía considerablemente, siendo las plantas vasculares ligeramente más tolerantes. Las diferentes respuestas de las plantas vasculares a metales pesados pueden ser atribuidas a factores genéticos, fisiológicos; así como a las rutas toxicológicas y de destino ambiental de los tóxicos. Por ejemplo: el Pb reduce el crecimiento radicular y la frecuencia de células mitóticas, y el incremento de la frecuencia de células aberrantes en Allium cepa. A continuación, profundizaremos más en el tema y desarrollaremos la práctica, al final, adjuntamos las conclusiones y las referencias bibliográficas. II. OBJETIVOS: 2.1. OBJETIVO GENERAL Que el estudiante observe, reconozca y analice daños asociados a tóxicos en distintas etapas de la mitosis en células meristemáticas de cebollas (Allium cepa). 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Conocer los efectos de sustancias tóxicas sobre los vegetales. Conocer la importancia de la evaluación de riesgos. Determinar si un agente en particular es capaz de inducir daño al ADN. III. MARCO TEÓRICO: Citotoxicidad es un concepto que se puede aplicar en cualquiera de las siguientes situaciones: muerte celular o alteración de su metabolismo. Existen ensayos útiles para la determinación de la citotoxicidad, que son ampliamente empleados por su bajo costo, fácil cuantificación y reproducibilidad. Mediante este tipo de experimentos es posible determinar el potencial citotóxico de compuestos de interés. Los modelos experimentales empleados para valorar la toxicidad de compuestos químicos se fundamentan en el sustrato biológico y en los indicadores de toxicidad. El sustrato es el material orgánico sobre el que se aplica un xenobiótico, mientras que los indicadores de toxicidad son los parámetros que permiten determinar las alteraciones producidas en la estructura o fisiología de los componentes del sustrato de ensayo. Entre los organismos de prueba usados para esta práctica se incluyen las plantas superiores como Allium cepa, la cual es reconocida como excelente bioindicador de genotoxicidad y efectos mutágenicos. Uno de los usos más difundidos de este modelo ha sido la determinación a corto plazo de contaminación ambiental. Además de las ventajas en cuanto a costos, disponibilidad y sensibilidad, cabe mencionar que las características cromosomales de esta especie favorecen la evaluación de aberraciones cromosómicas, lo cual puede ser útil en una interpretación de los posibles mecanismos implicados en la genotoxicidad. La presencia de metales pesados en el suelo tiene una serie de efectos negativos sobre las plantas. Sin embargo, también presentan una serie de mecanismos de resistencia a este tipo de contaminantes. Entre los efectos negativos, se puede encontrar una inhibición del crecimiento de la planta, ya sea de las raíces como del resto de órganos. También tienen lugar un gran número de daños estructurales, puesto que la presencia de metales pesados en el interior de las células provoca la aparición de especies reactivas de oxígeno (ROS), produciendo estrés oxidativo. Esto, además, produce una inestabilidad de las membranas celulares. Los metales pesados también afectan a la planta en sus actividades fisiológicas y bioquímicas. En el caso de la anhidrasa carbónica, el átomo de zinc presente en su centro activo es reemplazado por uno de metal pesado, produciendo una gran disminución de su actividad. Lo mismo sucede con varias de las enzimas implicadas en el ciclo de Calvin. Otros efectos negativos de los metales pesados en plantas son la disminución del contenido en clorofila y del potencial hídrico en las hojas, o el cierre estomático, con la consiguiente falta de CO 2 para llevar a cabo una correcta fotosíntesis. En relación a los mecanismos de resistencia frente a metales pesados, las plantas poseen una gran variedad de ellos. A nivel celular, la planta puede bloquear o reducir el flujo de entrada del metal pesado mediante la regulación de transportadores de membrana. También puede darse un bombeo extracelular del metal. Otro mecanismo de resistencia consiste en quelar al metal en el interior de la célula para que no interfiera con el metabolismo, o incluso llegar a bioacumularlo en vacuolas para expulsarlo posteriormente. Las plantas poseen tres tipos de moléculas capaces de quelar al metal pesado: el glutatión, las fitoquelatinas y las metalotioneínas. El glutatión es un tripéptido que contiene cisteína. Puede unirse al metal y ser excretado posteriormente, o puede atenuar el efecto de la producción de ROS producidas por la presencia del metal en las células. Las fitoquelatinas son oligopéptidos formados por la condensación de varias moléculas de glutatión. Se unen al metal para evitar que produzca daños a la célula y son las más abundantes de las moléculas capaces de quelar metales pesados. Por último, las metalotioneínas son proteínas ricas en cisteína (al igual que las anteriores, con grupos –SH que se van a unir al metal). Su expresión es inducible por el metal pesado. Los tres tipos de moléculas van a secuestrar el metal pesado para luego ser excretado al medio externo. Algunas plantas pueden precipitar o inmovilizar el metal pesado en la superficie o en los tejidos de la raíz para así impedir que llegue a la parte aérea. IV. EXPERIMENTACIÓN MATERIALES: Microscopio. Raíces frescas de cebolla. Mechero de alcohol. Pinzas de relojero. Cerillos. Tijeras. Navaja. Orceína A y B. Lápiz con goma. V. PROCEDIMIENTO 1. Colocar en un vaso con agua bulbos de cebolla. Colocar el recipiente en un lugar templado y oscuro. 2. Una vez que aparezcan las raicillas (2 o 4 días), agregar dentro del vaso una sustancia de su elección con sospecha de ser dañino al genoma (plaguicida, metal pesado, efluente, etc.) y dejar que crezcan uno o dos días más. 3. Cortar con las tijeras unos 2-3 mm de los extremos de las raicillas y depositarlo en un vidrio de reloj en el que se han vertido 2-3 ml de orceína A. 4. Calentar suavemente el vidrio de reloj a la llama del mechero durante unos 8 minutos, evitando la ebullición, hasta la emisión de vapores tenues. 5. Con las pinzas tomar uno de los ápices o extremos de las raicillas y colocarla sobre un portaobjetos, añadir una gota de orceína B y dejar actuar durante 1 minuto. 6. Colocar el cubreobjetos con mucho cuidado sobre la raíz. Dar unos golpecitos sobre el cubre sin romperlo de modo que la raíz quede extendida. 7. Observe con el objetivo de menor aumento para localizar las figuras mitóticas, y posteriormente se pasa a un objetivo de mayor aumento para discriminar detalles. VI. RESULTADOS 1. Elabora un esquema de las diferentes fases de la mitosis bajo condiciones normales: Profase, Prometafase, Metafase, Anafase, Telofase 2. Toma fotografías de campos en los que se observe claramente los diversos estados de la mitosis. 3. Realiza esquemas de los diferentes tipos de alteraciones que observes en relación al estado normal que deben guardar cada fase de la mitosis. VII. DISCUSIÓN VIII. CONCLUSIONES IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: Freyre, S., Estrada, M. y Bolaños, H. (2009) Estudio preliminar de la citotoxicidad y la genotoxicidad de un extracto de origen vegetal conocido como palmo rosado en células meristemáticas de Allium cepa. Revista Memorias – Vol 5 N° 12 Restrepo R., Reyes D., Ortiz M., Rojas, F., Kouznetsov V. (2012) Aberraciones cromosomales en bulbos de cebolla Allium cepa inducidas por moléculas híbridas 4-aminoquinolínicas. Colombia. Disponible en: http://revistas.javeriana.edu.co/index.php/scientarium/ article/view/4022/4235 Truchado, D.. (2014). Efectos de los metales pesados en las plantas. Investigación en salud ambiental y ecotoxicología. Disponible en: https://toxamb.wordpress.com/2014/12/11/efectos-de-los-metales-pesados- en-las-plantas/ X. ANEXOS: Presentación de las muestras por grupos e Introducción al tema a realizar. Procedimiento de la práctica: toma de muestra (raicillas) expuestas a las diferentes sustancias tóxicas Tinción de la muestra y colocación en el cubreobjetos Observación a través del microscopio.