CARACTERIZACION DE NAFTOQUINONAS CON HPLC NORMAL

INVESTIGADORES: •SELMA RIBEIRO DE PAVIA •LICINIO FONTOURA DE ALMEIDE •JOSE LUIS MAZZEI •MARIA AUXILIADORA COELHO KAPLAN EXPOSITORES: Asurza Parra Jorge Luis Atauje Alexandra Landeo Mesa Ruddy Lucia Rivera Diaz Flor Jackeline EL PERFIL QUIMICO DE P. SCANDENS (NATIVO) Y P. AURICULATA (CULTIVADA) SE OBTUVO MEDIANTE HPLC (CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION) FASE NORMAL Y FASE REVERSA CON DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS. OBJETIVO ENCONTRAR SIMILARES PATRONES METABOLICOS EN TALLOS Y HOJAS DE DICHAS ESPECIES VEGETALES. PLUMBAGO AURICULATA LAM FAMILIA TAXONOMICA • • • • • • • • REINO : PLANTAE DIVISION:MAGNOLIOPHYTA CLASE : MAGNOLIOPSIDA ORDEN :CARYOPHYLLALES FAMILIA:PLUMBAGINACEAE GENERO:PLUMBAGO ESPECIE :PLUMBAGO AURICULATA NOMBRE BINOMIAL:PLUMBAGO AURICULATA LAM PLUMBAGO AURICULATA LAM El género Plumbago comprende 10 especies de las partes más cálidas del mundo. Hay 5 especies en Sudáfrica. Sinónimos : Plumbago capensis Thunb. Nombre común en castellano : Azulina. Celestina. Embeleso. Jazmín azul. Jazmín celeste. Jazmín del Cabo. Jazmín del cielo. Jazminero azul. Malacara. Plumbago. Distribución general : África Época de floración : Julio. Agosto. Septiembre. Octubre. Noviembre. Diciembre. Formas vitales :Fanerófito. Hábitat : Cultivada en los jardines. Plumbago se utiliza tradicionalmente para tratar : las verrugas, huesos rotos , Heridas. Se toma como un tabaco para dolores de cabeza y un emético para disipar malos sueños. Un palo de la planta se coloca en la paja de chozas para conjurar los relámpagos. TIPOS DE COMPUESTOS CON ACTIVIDAD PLAGUICIDA • Las antiecdisonas son aquellas que interfieren alguna de las fases del proceso de la muda en los insectos. Por ejemplo: La azadiractina,producida por la especie Azadirachta indica (árbol del Nim) de la familia Meliaceae y la plumbagina y la naftoquinona, sintetizadas por el arbusto Plumbago capensis de la familia Plumbaginaceae. Floración y fructificación, con un marcado incremento de los mismos durante los meses de agosto y septiembre. PLUMBAGINA Plumbago scandens L. FAMILIA TAXONOMICA •REINO : PLANTAE •DIVISION:MAGNOLIOPHYTA •CLASE : MAGNOLIOPSIDA •ORDEN :CARYOPHYLLALES •FAMILIA:PLUMBAGINACEAE •GENERO:PLUMBAGO •ESPECIE :PLUMBAGO SCANDENS L CARACTERISTICAS • Plumbago scandens es un subarbusto con flores blancas bastante extendidas en Brasil, encontrándose a lo largo de la costa. • Es una especie nativa que se encuentra en una vegetación típica de "restinga", que se caracteriza por la alta intensidad luminosa, el suelo arenoso y la restricción de agua. Usos: •son atribuidos a preparados obtenidos a partir de raíces, tales como anestésico local y depurativas. • También se usa como infusión o decocción para reducir la inflamación de las articulaciones Entre los compuestos aislados, la plumbagina naftoquinona. PLUMBAGINA NAFTOQUINONA Merece atención por la descripción de numerosas actividades farmacológicas: • antimicrobiano • anti tumoral • tripanocidas • antipalúdico entre otros. Este naftoquinona se encuentra principalmente en las raíces de varias especies del género Plumbago ¿PORQUE SE CONCENTRAN LOS METABOLITOS SECUNDARIOS MAS EN LAS RAICES Y EN LAS HOJAS? • Los compuestos orgánicos constituyen el alimento de la célula y los componentes estructurales de la pared y el protoplasma, además de otros compuestos especiales, tales como las hormonas, pigmentos y enzimas. • Dependiendo de la etapa fisiológica de plantas, estos compuestos muestran cambios en su contenido. , las raíces siempre están expuestas a microorganismos del suelo distintos, que pueden explicar la acumulación de compuestos de defensa tales como la plumbagina naftoquinona. • Puede funcionar en la defensa química de la planta contra patógenos. Durante el desarrollo floral, la planta puede ser más susceptible al ataque de microorganismos, una vez que su metabolismo puede estar involucrado en la transición del ápice caulinar vegetativo en un ápice reproductiva • En la planta, dependiendo de la etapa, pueden variar, y este hecho influye en la producción de sustancias químicas. El aumento en el contenido de compuestos de defensa tales como naphthoquinonas durante el desarrollo floral puede proteger la planta durante un período sensible. PLUMBAGO AURICULATA PLUMBAGO SCANDENS PARTE EXPERIMENTAL  Material botánico Hojas, tallos y raíces de Plumbago scandens L Hojas, tallos y raíces de Plumbago auriculata Lam  Extracción Tallos y hojas Muestra (Tallos y hojas de ambas especies) Lavado Desinfectado Secado Extracción por Maceración con Metanol en mesa giratoria. Triturado Mesa giratoria modelo Shaker Bigger Bill con una velocidad de 50 rpm, a temperatura ambiente. Raíces Muestra (Raíces de ambas especies) Lavado Desinfectado Secado Extracción en soxhlet con cloroformo. Triturado Los extractos de cloroformo de las raíces fueron obtenidos por extracción en Soxhlet durante 30 h. El disolvente se eliminó en un evaporador rotativo Büchi R114 a una temperatura de 40 ° C, equipado con controlador de vacío y baño de enfriamiento. EQUIPO: HPLC shimadzu Class-LC10 EQUIPADO CON DOS BOMBAS LC10AT detector de espectro UV/VIS por una matriz de fotodiodos SPDM10A INYECTOR Rheodyne 7725i, con volumen de inyección (Loop) de 20 uL Columnas: Shim-Pack CLC-SIL 250x4.6 mm Shim-Pack CLC-ODS 259X4.6 mm Pre-Columnas: Shim-Pack CLC-G-SIL 10x4.0 mm Shim-Pack CLC-G-ODS 10X4.0 mm Análisis de naftoquinonas por HPLC en fase inversa Análisis de flavonoides con HPLC en fase inversa Columna: Shim-Pack CLC-ODS 259x4.6 mm Pre-columna: Shim-Pack CLC-G-ODS 10x4.0 mm Fase estacionaria : • C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3); flujo 1ml/min Fase movil: • Acetonitrilo – agua 10:90 v/v Ambas fases con acido trifluoroacetico a 0.05 % Detección mediante escaneo de rango: • 200 nm a 400 nm Durante seguimiento de 3 longitudes de onda: • 220 nm, nm 260 y 340 nm. RESULTADOS. • Se realizo realizó con gradiente de composición de la fase móvil en vista rica producción de flavonoides ricos en ambas especies. • Se comprueba la presencia de estos flavonoides en los espectros de absorción UV/VIS entre el rango de 200 – 400 nm Señales cromatográficas en análisis de extractos metanólicos de Plumbago auriculata y P. scandens Orientina Vitexina-2-O-rhamnosideo C27H30O14 Quercitrina Epigenina 7-O-glucosideo Vitexina Acido Clorogenico Análisis de naftoquinonas por HPLC en fase normal Se realizo usando el modo de elusión isocrática. Naftoquinona plumbagina se aisló por métodos clásicos fitoquímicas y se caracterizo por métodos espectrométricos Fue el primer tipo de HPLC, separaba analitos basándose en la polaridad. Utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar HPLC Cromatografía de fase normal La utilización de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención La fuerza de absorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención. Composición de la fase móvil REGIMEN ISOCRATICO • La composición de la fase móvil permanece constante a lo largo de todo el cromatograma. REGIMEN DE GRADIENTE • La composición de la fase móvil cambia a lo largo de la cromatografía y se emplea para separar mezclas muy complejas QUINONAS • Son muy abundantes en la naturaleza, en el reino vegetal • Coloración desde amarillo pálido hasta negro • Se encuentra frecuentemente en la corteza o la raíz , y en algunos casos en las hojas • Pueden clasificarse en benzoquinonas, naftoquinonas o antraquinonas PLUMBAGO SCANDENS NAFTOQUINONAS • Son pigmentos naturales, que tienen como característica estructural poseer dos grupos carbonilo en las posiciones 1,4 y se presentan con grupos hidroxilo y/o metilo como sustituyentes Se han aislado de plantas, hongos, bacterias, e inclusive de animales. Sin embargo, se encuentran en mayor proporción en plantas superiores de determinadas familias de Angiospermas como: Ebenaceae, Droseraceae, Bignoniaceae, Verbenaceae, Plumbaginaceae • PROPIEDADES DE NAFTOQUINONAS Además de sus propiedades como colorantes las naftoquinonas naturales presentan actividades biológicas importantes Tintóreas Antibacterianos Agentes antiparasitarios Antifúngicos Anticancerígenos Naftoquinona plumbagina • (2-metil-5-hidroxi-1,4-naftoquinona) • Se encuentra en las hojas, corteza y raíces de especies de géneros como Plumbago (Plumbaginaceae) • Se ha descrito el uso de Plumbago zeylanica en el tratamiento del dolor reumático, en donde la plumbagina se muestra como la responsable de tal efecto • Otras actividades de la plumbagina son como antiespasmódica, antibacteriana, antifúngica antiparasitaria y anticancerígena Cromatograma típico a 267mm de extractos clorofórmicos de raíces de Plumbago scandens (a) y de Plumbago auriculata (b) – en fase móvil ciclohexano,cloroformo, isopropanol (50,50,1 v/v) con elusión isocrática Señales cromatográfica en análisis de extractos metanólicos de hojas y tallos y extractos clorofórmicos de raíces de Plumbago auriculata y P. scandens • • • • • • • Se han caracterizado nueve quinonas , como plumbagina naftoquinona se encuentra en los tallos y las raíces de ambas especies El análisis por HPLC en fase normal, demuestra de nuevo la mayor producción de metabolitos en P. auriculata, confirmando lo que ya se había encontrado en el análisis por HPLC en fase inversa El plumbagina se caracterizó en HPLC en fase normal, mostrando un tiempo de retención de aproximadamente 4 minutos La presencia de quinonas se observó en todos los órganos de las plantas en estudio. En P. auriculata predomino quinonas en los tallos P. scandens el mayor número de sustancias metabólicas de esta clase se caracteriza en las hojas Naftoquinona plumbagina se caracterizó como el producto principal producido en las raíces de P auriculata y P. scandens, que representan aproximadamente 12% a 20% del extracto crudo. • Su identificación se realizo mediante comparación con el estándar espectrométrico. CONCLUSIONES • Los perfiles cromatogràficos de hojas, tallos y raíces de las especies Plumbago auriculata y P. scandens fueron caracterizados por HPLC en fase normal y fase inversa para estudios de normalización química de estas especies, determinando principalmente flavonòides y naftoquinonas. • La especie Plumbago auriculata mostró una mayor representación de las clases químicas analizadas, y una mayor producción metabólica. Con la identificación de la presencia de cuatro flavonòides, un ácido o derivado fenólico y plumbagina naftoquinona. • Este estudio reafirma los datos ya obtenidos en estudios anteriores de quimiosistemàtica de orden Plumbaginales. La plumbagina naftoquinona, presente en grandes cantidades en las raíces de ambas especies, puede indicar una desviación metabólica para su producción, que debe cumplir un papel muy importante en estas especies. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS  Olga Lock de Ugaz . Investigación Fitoquimica:Métodos en el estudio de productos naturales pp. 182-195. Editorial PUCP.  I.Katime , O. Katime . Cromatografía líquida de alta eficacia Fuente : http://es.wikipedia.org/w/index.php?oldid=39444406  López L, Lluvia Itzel; Leyva, Elisa; García de la Cruz . Las naftoquinonas: más que pigmentos naturales . Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, vol. 42, núm. 1, enero-marzo, 2011 pp.6-17. Asociación Farmacéutica Mexicana, A.C..  María Emilia Carretero Accame. Compuesto fenólicos: Quinonas. Revista Panorama Actual Med 2000; 24 (236): 778-782 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS • Dahlgren, R. M. T.; Bot. J. Linn. Soc. 1980, 80, 91. • Joly, A. B.; Botânica: Introdução à Taxonomia Vegetal, Companhia Editora Nacional: São Paulo, 1977, p. 542. • Lima, O. G. de; D'Albuquerque, I. L.; Maciel, G. M.; Maciel, M. C. N.; Rev. Inst. Antibiot. 1968, 8, 95. • Gupta, M. M.; Verma, R. K.; Uniyal, G. C.; Jain, S. P.; J. Chromatogr. 1993, 637, 209 PAGINAS WEB:  hppt:// issuu.com/kathycharrimacassi/docs/hplc#download  Hppt://www.upct.es/~minaeees/fundamentos_analisis_cromatografico.pdf  hppt://www.ulpgc.es/hege/almacen/download/39/39360/separaciones_por_cromato grafia_1.pdf  hppt://dspace.ubu.es:8080/trabajosacademicos/bitstream/10259.1/64/1/Mart%C3% ADnez_Santamar%C3%ADa.pdf