AntecedentesCapítulo II Antecedentes El ácido cítrico (2-hidroxi, ácido-1,2,3-tricarboxilico) deriva de la palabra latina citrus: “árbol del cítrico”, una fruta parecida al limón. Fue primeramente aislado del jugo de limón en 1784 por Carl Scheele, tiene un peso molecular es de 210.14 Da, contiene tres grupos carboxilos, por lo tanto tiene tres pKa´s con valores de pH de 3.1, 4.7 y 6.4, respectivamente. Este ácido es un intermediario universal del metabolismo en eucariotes y se encuentran trazas en prácticamente todos los animales y plantas (Papagianni, 2007). El ácido cítrico fue producido comercialmente en Inglaterra en 1826 a partir de limones importados de Italia. El jugo de limón fue la base de su producción hasta que en 1919 se desarrollo un proceso industrial en Bélgica con Aspergillus niger y se sintetizó a partir de glicerol por Grimoux y Adams en 1880. Se han reportado diferentes métodos para su síntesis química, utilizando diferentes métodos, pero están muy lejos de ser competitivas con los métodos de fermentación (Papagianni, 2007). Actualmente solo el 1 % de la producción total mundial es extraído del jugo del limón en países como México y Sudamérica donde aún es viable económicamente (Yigitoglu, 1992). Microorganismos productores de ácido cítrico Antecedentes Para la producción por fermentación además de los hongos, se han empleado levaduras y bacterias que han alcanzado producciones en cantidades importantes, como sustrato se ha usado a hidrocarburos (alcanos) y carbohidratos (Mattey, 1999). Se conocen varias levaduras que producen ácido cítrico a partir de diversas fuentes de carbono, tales como: Candida tropicalis, C. catenula, C. guilliermondii, C. intermedia, Hansenula, Pichia, Debaromyces, Torula, Torulopsis, Kloekera, Saccharomyces, Zygosaccharomyces y Yarrowia lipolytica Candida sp, Hansenula sp, Debaromyces sp, Torula sp, Turolopis sp, Kloekera sp, Saccharomyces sp, Zygosaccharomyces sp y Yarrowia sp. De todas ellas, las especies de Candida son las que se han usado industrialmente para su producción, estas son: C. catenula, C. guilliermondii y C. intermedia. Las levaduras son capaces de producir ácido cítrico a partir de varias fuentes de carbono. Por ejemplo, Yarrowia lipolytica se ha estudiado ampliamente, pero produce una gran cantidad de ácido isocitrico, lo cual es indeseable. Este problema ha motivado a usar cepas mutantes de Y. lipolytica, estas son capaces de tener baja actividad de la enzima acotinasa la cual es responsable de la síntesis de ácido isocitrico. Las mutaciones genéticas no han sido bien exploradas, pero ofrecen posibles usos para mejorar los rendimientos y altas velocidades de fermentación (Rymowicz et al, 2010). En tanto entre las bacterias que se han empleado tenemos a Arthrobacter paraffinens, Bacillus licheniformis, Corynebacterium sp y hongos como: Aspergillus niger, A. awamori, A. clavatus, A. nidulans, A. fonsecaeus, A. luchensis, A. phoenicus, A. wentii, A. saitoi, A. flavus, Absidia sp., Acremonium Antecedentes sp., Botrytis sp., Eupenicillium sp., Mucor piriformis, Penicillium citrinum, P. janthinellu, P. luteum, P. restrictum Talaromyces sp, Trichoderma viride y Ustulina vulgaris (Crolla y Kennedy, 2001; Kuforiji et al, 2011). Aunque muchos microorganismos pueden ser usados para producir ácido cítrico, el hongo Aspergillus niger sigue siendo el principal microorganismo productor a nivel industrial. Cepas específicas de A. niger lo sobreproducen y se han desarrollado a partir de diversos procesos de fermentación. Su rendimiento a veces excede el 70 % de la fuente de carbono. Currie (1917) descubrió que algunas cepas de A. niger crecen de forma exitosa en medios con altas concentraciones de azucares y minerales a un pH inicial entre 2.5 y 3.5, los cuales producían altas concentraciones de ácido cítrico. Este descubrimiento sentó las bases para la producción industrial por medio de estas cepas. La principal ventaja de Aspergillus niger es su fácil manejo y cultivo, crece en una gran variedad de sustratos, tiene altos rendimientos. Con el desarrollo de la Biotecnología se han generado varias cepas modificadas genéticamente de Aspergillus niger, donde se han reportado mejores rendimientos. Sin embargo, su uso industrial y estabilidad no ha sido del todo aceptado, ya que la industria se ha basado principalmente en el uso de varios sustratos para incrementar los rendimientos de ácido cítrico (Singh et al, 2011). La producción industrial de ácido cítrico involucra de manera general una etapa de filtración de medio de cultivo que contiene el producto, micelio y otras impurezas. posteriormente este es filtrado y lavado con agua. Aspergillus niger tiene una vía adicional para el catabolismo de la glucosa y es llevado a cabo por la glucosa oxidasa (Hayashi y Nakamura. Sin embargo. 1954). Esta enzima se activa por las altas concentraciones de glucosa y oxígeno en la presencia de bajas concentraciones de otros nutrientes (Mischak et al.Antecedentes Primero se precipita como citrato de calcio. 1951. transforma una cantidad importante de glucosa en ácido . la cual va decreciendo conforme avanza la fermentación (Legisa y Mattey.5 toneladas de desecho (Bauer et al. El ciclo del ácido cítrico La síntesis del ácido cítrico comienza con la glucolisis (Martin y Wilson. Después es tratado con ácido sulfúrico y por último se remueve el CaSO4 formado por filtración. La extracción por solventes es otra alternativa al método clásico (Wenneresten. el problema es que cada tonelada de ácido cítrico producido genera 2. 1988. 1981). Desafortunadamente la glucosa oxidasa. 1988). 1987). Pero también una pequeña fracción se sintetiza por la vía de las pentosas fosfato. Dronawat et al. La ventaja del método de extracción por solventes es que evita el uso de calcio y H 2SO4 y el problema de contaminación. la extracción por este método contiene impurezas que provienen de la melaza o licores de azucares. Este es el único proceso viable de separación y purificación en la industria. en la fase lag de crecimiento. 1988). 1985. Rogalski et al. 1985). Cleland y Johnson. pero no existe evidencia de un bloqueo total de esta vía (Roehr et al. 1983). El piruvato se convierte en oxalacetato y posteriormente en malato en el citoplasma. Lo anterior provoca la pérdida de 2 moles de CO 2 y solamente dos terceras partes del carbono proveniente de la glucosa se convierte en ácido cítrico. este es cercano a uno. Clealand y Johnson (1954) fueron los primeros en demostrar que Aspergillus niger libera una molécula de CO2 durante la conversión de piruvato a Acetil CoA y que se utiliza una molécula de piruvato más una de bióxido de carbono para formar una molécula de oxalacetato. debido a que el oxalacetato se forma en cada vuelta del ciclo de Krebs. 1988). En la glucolisis. Pero debido a la localización extracelular de la enzima. La acumulación de ácido cítrico hace disminuir el pH del cultivo inactivando a la glucosa oxidasa (Mischak et al. Se ha postulado que la concentración de malato estimula el transporte del ácido cítrico fuera de la mitocondria. pero comienza a decrecer cuando se inicia la acumulación del ácido cítrico (Kristiansen et al. este último se convierte en Acetil CoA y oxalacetato. una molécula de glucosa produce 2 moléculas de piruvato. Esta última reacción incrementa el rendimiento del ácido. un coproducto tóxico de la fermentación.5 (Mischak et al. esto se correlaciona con el coeficiente respiratorio (CO2/O2) durante las primeras 70 horas de cultivo. esta puede ser influenciada por el pH y se inactiva a pH´s menores de 3. de . Pero este fenómeno no parece ocurrir durante las fases tempranas de la fermentación (Kubicek et al 1979b). 1985.Antecedentes glucónico. tal como el ácido oxálico. 2002). La síntesis de este compuesto parece depender de la fuente de carbono (Kubicek et al. Roukas y Harvey. 1985). 1988). Aspergillus niger también puede acumular otros ácidos orgánicos. precursores del citrato. Como consecuencia. 1985). Steinbock et al (1994) encontró que la enzima hexocinasa en la cepa ATCC 11414 fue inhibida por citrato. Kubicek-Pranz et al (1990) encontraron que la acumulación de ácido cítrico sucede cuando la concentración de glucosa-fructosa es de 14 % (p/v). Yigitoglu y McNeil.Antecedentes acuerdo a Muller (1975) el ciclo del glioxilato ha estado implicado en biosíntesis. 1994). Cuando se usa glucosa como fuente de carbono por la vía del glioxilato. compitiendo con la sobreproducción de citrato (Kubicek. estimulan la acumulación de ácido cítrico (Trumpy y Millis. La concentración de este intermediario de la glucolisis correlaciona con la alta producción de citrato. 1963). este fenómeno es de interés para la producción de ácido cítrico y su regulación biosintetica aún está en debate (Strasser et al. Debido a la toxicidad del oxalato. se pierde fuente de carbono en esta vía neutral. 1992). La inhibición de la síntesis de ácido cítrico se debió a la quelación del magnesio. La bioquímica de los primeros pasos de la glucolisis aún no es completamente entendida. Xu et al (1989a) encontraron un incremento en la concentración intracelular de fructosa 2-6 bifosfato. 1991. 1979a). 1988). pero uno de los defectos causados por la deficiencia de manganeso es la síntesis de macromoléculas y provoca un incremento en la degradación de proteínas (Ma et al. Pero varios autores han reportado que la adición extra de amonio (NH 4) durante la fermentación de ácido cítrico estimula la velocidad de su producción (Choe y Yoo. el micelio acumula grandes concentraciones de NH 4 (Kubicek et al. Las trazas de iones metálicos. Estos autores también reportan que . particularmente los iones de manganeso. pero cuando eso sucede. sin embargo. Después de 50 años de optimización del proceso de su producción. En resumen. Etapas y tipos de producción de ácido cítrico por fermentación con Aspergillus niger . Bioquímica de la producción y acumulación de ácido cítrico por Aspergillus niger Se han propuesto varias teorías para explicar la acumulación de ácido cítrico por A. en procesos de fermentación. todavía no existe una explicación coherente de la síntesis bioquímica con los factores observados que influencian su rendimiento en biorreactores (Kristiansen et al. nitrógeno y fosfatos estimulan su producción y acumulación. En un proceso de fermentación. siempre han dependido del conocimiento de su bioquímica. ya que los altos rendimientos de este metabolito. aún no se conocen los eventos que estimulan su acumulación. iones hidrógeno y oxígeno. niger.Antecedentes la cantidad de amonio y tiempo son importantes. A pesar de que se han llevado a cabo numerosos estudios sobre la síntesis bioquímica de ácido cítrico en A. no existe un evento bioquímico simple responsable de la sobreproducción ya que se trata de un evento multifactorial. la acumulación de ácido cítrico se lleva a cabo cuando varios nutrientes se encuentran en exceso: fuente de carbono. niger. 2002). Mn. La comprensión de los eventos anteriores es incompleta y las industrias dedicadas a su producción y comercialización mantienen en secreto sus logros alcanzados. Mg). pero cuando se agrega en tiempos inapropiados disminuye la acumulación de ácido cítrico. Pero también se ha demostrado que la limitación de iones metálicos (Fe. . fermentación y recuperación o purificación del producto. 2011). para extraer el ácido cítrico. niger es el microorganismo preferido por sus altos rendimientos. Las charolas deben ser de aluminio puro. período durante el cual las esporas germinan. fermentación de superficie y fermentación en medio sólido. niger crece y flota en la parte alta del medio de cultivo. Además existen tres posibles métodos para producir ácido cítrico por A. las cuales son: preparación e inoculación de medio de cultivo. 2010). Las cámaras de fermentación cuentan con circulación de aire y al pasar por la superficie del cultivo controlan la humedad y temperatura. Se usa a pequeña y mediana escala. 2003). poco equipo y bajo costo de energía. el 99 % de la producción total mundial de ácido cítrico se obtiene por fermentación (Kuforiji et al. se separa el caldo y el micelio. Pero en las charolas de acero se obtienen mejores rendimientos (Soccol y Vandenberghe. se requieren pocos esfuerzos de operación. El aire se filtra por medio de filtros ya que las cámaras se deben de mantener bajo condiciones asépticas y así deben permanecer al menos durante los primeros dos días. El proceso se lleva a cabo en cámaras de fermentación donde existe un gran número de charolas o tinas. a) Fermentación de superficie El micelio de A. este es lavado para separar el ácido cítrico. A. tipo acero o polietileno. niger: fermentación sumergida. La fermentación termina entre 8 y 12 días (Yokoya. Se pueden usar varios tipos de sustrato de acuerdo al tipo de fermentación (Singh et al.Antecedentes Hoy en día. La producción se puede dividir en tres etapas. 1992). tiene altos rendimientos. entre otros (Pandey. menos susceptible a la inhibición por elementos traza. niger (Vanderberghe et al. se hace en medios de cultivo que usan como base a la sacarosa y glucosa con A. Desventajas: Dificultades al escalar el proceso. b) Fermentación en estado sólido Éste proceso requiere poca energía y genera pocos desechos. difícil controlar a los parámetros de cultivo (pH. c) Fermentación sumergida Se estima que alrededor del 80 % de la producción mundial de ácido cítrico se obtiene por fermentación sumergida. mejor circulación de oxígeno. niger se encuentra dentro de la matriz sólida. nutrientes. humedad. este proceso no se utiliza mucho en la industria debido a que se requiere mucho espacio. medio de cultivo a bajo costo. 2006. Este proceso requiere de tecnología simple. así como altos costos en la purificación (Susana y Sanroman. El agua necesaria para el crecimiento de A. utilizando . se requiere de mucho tiempo. 2003). etc. generación de altas cantidades de calor y altos costos de producción. residuos agrícolas. Holker et al.) alto contenido de impurezas. requiere poca energía y bajo costo de mantenimiento. 1999). temperatura. 2004).Antecedentes Desventajas: A pesar de obtener altos rendimientos en la fermentación por superficie. El sólido de soporte puede ser de material sintético. existe riesgo de contaminación. menor riesgo de contaminación y genera menor cantidad de desechos en su recuperación. menor riesgo de contaminación. transferencia de masa y calor. concentración de manganeso y otros metales (Kisser et al. 1999). Este fenómeno está relacionado con la aireación y agitación (Svenska-Sockerfabrik. Los procesos de fermentación sumergida usan fermentaciones en lote y lote alimentado. el crecimiento en pellets de Aspergillus niger es altamente recomendable (Berovic et al. no solamente en relación a la forma de la hifa si no también a la agregación o unión de micelio en forma de pellets. alta productividad y rendimientos. así como desechos agroindustriales (Rivas et al. 1993). 1964). Para la producción de ácido cítrico en cultivo sumergido. 1962). bajo costo en mano de obra.Antecedentes principalmente productos que utiliza la industria del azúcar. pH (Fried y Sandza. Los pellets son pequeños con una superficie dura y lisa (Clark. Dependiendo de las condiciones de fermentación. estas concluyen entre 5 a 12 días. con ramificaciones hinchadas. el micelio de Aspergillus niger es corto. niger durante la fermentación La morfología del micelio es crucial durante el proceso de la fermentación. 1959). Mg). 1980) y cantidad de inóculo (Berry et al. En todos los casos. las cuales tienen puntas apicales. Este tipo de procesos tienen mecanismos sofisticados de control. riesgo de contaminarse y grandes cantidades de desecho (Vanderberghe et al. Morfología de A. Desventajas: Medio de cultivo caro. 2008). El mezclado determina la aireación y transferencia de masa a través del . La agitación es importante para un adecuado mezclado. Mn. sensible a la inhibición por trazas de metales (Fe. 1977). 1995 reporto cultivos con Aspergillus niger en biorreactores agitados mecánicamente de 100 a 600 rpm. reduciendo la formación de . cambiando su crecimiento y dañando a la estructura de las células (Papagianni et al. Se ha reportado que cultivos de A. liberando el material intracelular. Sin embargo. 2003). Por ejemplo. Por medio de análisis de imágenes se demostró que al incrementar la agitación. se disminuía la longitud de los filamentos. La velocidad específica de la formación de ácido cítrico se incremento con la agitación. Papagianni. se ha reportado que el incremento de la agitación daña a las hifas. se forman pellets (Levente y Christian. Smith et al (1990) y Makagiansar et al (1993) reportaron bajas velocidades de síntesis de penicilina a altas agitaciones con Penicillium chrysogenum. los micelios se comenzaron a agregar a las 24 horas de cultivo en todos los experimentos. Pero el exceso de agitación provoca esfuerzos de corte que afectan la morfología del microorganismo. el manganeso es esencial para el crecimiento del micelio. pero la cantidad de producto se mantuvo constante después de 300 rpm. Un prerrequisito esencial para tener la morfología deseada y obtener altos rendimientos es optimizar la concentración inicial de manganeso en el medio de cultivo.Antecedentes reactor y este es crítico para la fermentación de ácido cítrico. Aunque A. 1994). niger es resistente a los esfuerzos de corte. niger deficientes en manganeso (Mn2). Se ha observado que los medios ricos en nutrientes incrementan la velocidad específica de crecimiento y la morfología del hongo. Asimismo la longitud del micelio se redujo por un factor de tres al incrementar la agitación. explicando las bajas productividades bajo condiciones de alta agitación. Elzbieta (2008) obtuvo altos rendimientos con 150 g/L de azucares en el medio de cultivo. Los iones metálicos que deben limitarse son el Zinc. 1987). niger y la producción de ácido cítrico de forma diferente. rendimiento y crecimiento del hongo. Vanderberghe et al (2000) obtuvieron un buen crecimiento de micelio junto a altas productividades de acido cítrico. sino también la concentración es crítico para la fermentación. Pero también es sensible a las trazas de metales que vienen . Algunos metales iónicos (Fe 2+. Manganeso. se encontró que la velocidad de crecimiento se incrementa (a las 48 hrs de cultivo) conforme la concentración de glucosa disminuye. 100 y 150 g/L en un reactor agitado mecánicamente. Sin embargo. 1999). Por ejemplo. Papagianni (1995) reportaron cultivos con concentración inicial de glucosa de 60. Cu2+ y otros) inhiben la producción de ácido cítrico aún a muy bajas concentraciones (Kapoor et al. Mn2+.Antecedentes pellets (Hemmersdorfer et al. 1987). Grewal y Kalra (1995). Hierro. Factores que afectan la producción de ácido cítrico por Aspergillus niger en cultivo sumergido a) Condiciones del cultivo Afectan el crecimiento de A. metales pesados y metales alcalinos. Las trazas de metales influencian notablemente la síntesis de ácido cítrico. No solo el tipo de fuente de carbono. Cobre. Couto y Sanroman (2006) reportaron que se produce alta concentración de ácido cítrico en condiciones donde se genera poca biomasa. porque requiere de ciertas trazas para su crecimiento (Mattey. Por ejemplo. influenciando la velocidad de producción. Zn2+. pero para A. La concentración de las trazas de metales en el medio de cultivo se puede controlar por dos formas: 1) Purificar el medio de cultivo para remover ciertos iones metálicos y después adicionar la cantidad requerida.1 a 500 ppm durante la inoculación o durante las primeras 50 horas de cultivo contrarresta el efecto nocivo del hierro.2 ppm. 2002). Suministros de Mn2+ a concentraciones de 3 g/L reducen drásticamente el rendimiento de ácido cítrico (Rohr et al. Estos autores también confirmaron el papel del manganeso en la regulación de las enzimas del ácido cítrico. 1999). Otros autores también han reportado el efecto benéfico del cobre sobre el hierro (Haq et al. niger en cultivo sumergido y usando melazas como sustrato. por ejemplo en la síntesis de la pared celular. la adición de cobre entre 0. formación de esporas y producción de metabolitos secundarios. la concentración de esos metales debe disminuirse para tener un óptimo crecimiento y síntesis del ácido cítrico (María y Wladyslaw. La concentración óptima de Fe 2+ requerida para su producción varía entre diferentes especies de hongos. 1996). Sin embargo.Antecedentes en las melazas (Majolli y Aguirre. 2) Agregar agentes quelantes al medio para disminuir la concentración de los iones metálicos. La ventaja del último método es que el complejo actúa . 1989). la síntesis de ácido cítrico es severamente afectado por la presencia de hierro a concentraciones de 0. pero también es importante en otras funciones celulares. Por lo tanto. cloruro de amonio y sulfato de amonio son los preferidos (Chundakkadu. 2005). Pero en fermentaciones en sólido se obtienen altos rendimientos sin que haya inhibición. 1999). el alto contenido de azucares favorece una producción alta. La adición de acetato de metilo. y el pH bajo es esencial para la fermentación de ácido cítrico (Mattey. La ventaja de usar sales de amonio es que el pH cae conforme son consumidas. El fosfato de dihidrógeno de Potasio es la fuente más apropiada de fosforo. 1999). el cual se disocia para iones conforme el microorganismo los utilice para su crecimiento (Jianlong.Antecedentes como un buffer metálico. Este es un producto no deseable y reduce el rendimiento del ácido cítrico. Pero el exceso en su concentración activa la síntesis de la enzima aconitasa. Las sales de hierro son esenciales para activar la síntesis de Acetil CoA. El tipo y la concentración de la fuente de carbono es uno de los factores más importantes que determinan la concentración final del producto deseado. es directamente influenciado por la fuente de nitrógeno. De acuerdo a Anwar et al (2009). 1985). por lo tanto importante para producir el metabolito (Milson y Meers. La presencia de trazas de metales en concentraciones toxicas es un problema significativo durante una fermentación sumergida. b) Fuente de nitrógeno Estimula la formación de conidios y la producción del metabolito de interés. la urea. Los componentes . 1988). la cual es responsable de la producción de ácido isocitrico. cobre y zinc favorecen el crecimiento del mecelio y producción de ácido cítrico (Sato y Sudo. y a bajas concentraciones favorece la síntesis del metabolito de nuestro interés. limitación en la transferencia de masa. removiendo con una sustancia quelante para optimizar el crecimiento óptimo del microorganismo. consumo de sustrato (Chundakkadu. estabilidad de sus enzimas.Antecedentes del medio de cultivo juegan un papel importante en el rendimiento final. 2005). La morfología del hongo es un parámetro importante que afecta la producción de ácido cítrico y a su vez. Por el contrario. c) Factores ambientales Varios factores ambientales influencian el bioproceso. se requiere la baja humedad para la generación de biomasa. y competencia con bacterias (Gowthaman et al. 2) Temperatura . tipo de inoculo. 1999). En una fermentación solida. 2011). la toxicidad causada por los metales pesados debe considerarse. reducir la difusión de nutrientes. entre otros. 2001). de acuerdo al tipo de fermentación y requerimientos fisiológicos del microorganismo. entre ellos se encuentran. adición de nutrientes. Pero también se encuentran parámetros de ingeniería. humedad. la temperatura. como lo es la agitación (Shojaosadati y Babaeipor. 1) Humedad Los hongos prefieren ambientes húmedos para su crecimiento. Es importante considerar la concentración de las trazas de metales y otros constituyentes presentes en la biomasa. Por ejemplo. esta depende de los constituyentes del medio de cultivo (Singh et al. minerales. una humedad alta causa la aglomeración del sustrato. pH. optimo crecimiento. 2002) y tamaño de sustrato (Roukas. El no controlar de forma adecuada a la temperatura se puede afectar a la fisiología en varios aspectos. pero también se incremento su concentración en un factor de 1. 3) Aireación En cultivos sumergidos. niger (Jialong. 2002). La aireación también es crítica para remover el calor y mantener la transferencia de humedad (Raimbault. tal como desnaturalización de proteínas. La acumulación de ácido cítrico se incrementa considerablemente conforme se incrementa la tensión de oxígeno disuelto. 4) Agitación . 2000. el cual fue usado como vector para transportar oxígeno al medio de cultivo con A. Sin embargo. Shojaosadati y Babaeipour. afectar la fisiología celular (Pandey et al.4 por la adición de ndodecano al 5 % (v/v). el principal objetivo de la aireación es suministrar oxígeno suficiente para el crecimiento del microorganismo y para remover el bióxido de carbono. distribución del vapor de agua y cantidad de compuestos volátiles producidos durante el metabolismo. 2000). aceleración o supresión en la producción del metabolito. 1997.Antecedentes La temperatura es una de las variables que más afectan el rendimiento de A. 2001). niger para la producción de ácido cítrico. 1998. Shojaosadati y Babaeipour. inhibición enzimática. la excesiva aireación produce esfuerzos de corte. y lo más importante. 2002) regulando de esta forma la temperatura del medio de cultivo. el cual tiene un efecto dañino para la morfología del hongo filamentoso (Lu et al. Pandey et al. 1986). los hongos filamentosos crecen en un rango amplio de pH (desde 2 hasta 9) con un rango óptimo de 3.8 a 6. la agitación permite la distribución de esporas. esta permite la homogeneidad del medio de cultivo. este varía de acuerdo a los requerimientos metabólicos del microorganismo. especialmente a pH bajos. La agitación permite la remoción de la remoción de metabolitos volátiles. con respecto a la temperatura y ambiente gaseoso una mayor interacción entre el área interfacial gas-líquido. 5) pH El pH es otro de los aspectos importantes a considerar en cualquier fermentación. permitiendo la transferencia de oxígeno en el líquido (Trilli. Durante la producción de ácido cítrico. necesidades de agua para el control de la humedad y/o cualquier otro nutriente dentro del medio de cultivo (Suryanarayan. evita la formación de pellets o agregados celulares. 2003). En el caso de la producción de ácidos orgánicos. estos provocan que el pH disminuya. Esta versatilidad para adaptarse es beneficio para los hongos ya que esto minimiza la contaminación por bacterias. se pueden marcar dos tiempos. el primero donde las esporas requieren un pH mayor a 5 para germinar y segundo.0.Antecedentes La agitación es uno de los parámetros más importantes en las fermentaciones aerobias. protege al medio de cultivo contra la desecación o humedad excesiva y mejora las condiciones para el crecimiento microbiano (Mitchell y Berovic. El pH bajo reduce el riesgo de contaminación e inhibe la síntesis de ácidos orgánicos no deseados. . 1998). incrementa la transferencia de calor. Cada microorganismo tiene un rango de pH para su crecimiento. Durante la producción de ácido cítrico. el pH para la producción de ácido cítrico necesita pH´s menores a 2. Sin embargo. Los pellets menores a 1 mm de diámetro están asociados con altas velocidades de producción y altos rendimientos (Magnuson y Lasure. Es necesario que la actividad metabólica de las esporas sea inducida antes de que el hongo comience a usar el sustrato para crecer (Krishna y Nokes. 2001). 1999). De acuerdo a Larroche (1996). 2001). como la mayor duración de la fase lag. las esporas funcionan como biocatalizadores. se pueden almacenar durante largos periodos de tiempo y tienen alta resistencia al daño causado por esfuerzos de corte o insuficiente transferencia de masa cuando no se tiene un control perfecto en las fermentaciones sumergidas (Gowthaman et al. 2001). El pH cambia también de acuerdo de la fuente de nitrógeno seleccionada. Se han reportado varias ventajas para usar esporas en el inoculo en lugar de micelio. 2001. 2003). el microorganismo puede ser crecido bajo condiciones suboptimas para la producción de biomasa.Antecedentes como el ácido gluconico y ácido oxálico pero también permite que la extracción y purificación del ácido cítrico se más simple (Levente y Christian. los tiempos son flexibles para preparar el inoculo. Para sobreproducir el producto deseado. El tamaño y la forma de los pellets del micelio juegan un papel directo en la biosíntesis del ácido cítrico durante una fermentación sumergida (Saha et al. 6) Otros factores . 2004). también trae algunas desventajas. diferentes condiciones optimas para la germinación de esporas y crecimiento vegetativo y excesivo tamaño del inoculo. así como de las características de crecimiento del microorganismo (Gowthaman et al. Krishna y Nokes. pero también puede ser debido al incremento de la actividad de otras enzimas del ciclo de Krebs. péptidos y proteínas de bajo peso molecular durante las etapas tempranas de la fermentación. Las grasas vegetales actúan como fuente de carbono y se . metil acetato. Sikander y Haq (2005). Esos estudios demostraron que la adición de 4 % (v/v). utilizaron concentraciones de metanol. Pandey et al. Taketomi (1961) analizó la adición de metanol a la fermentación y la síntesis de proteínas afecto la síntesis de proteínas pero sin afectar el consumo de nitrógeno. pero también provoca una alta permeabilidad de la membrana estimulando la excreción de ácido cítrico del micelio. El metanol afecta directamente la morfología del micelio y promueve la formación de pellets. (2000) reportan que es necesario mantener la forma de pellets en el cultivo en diámetros menores de 3 mm para una máxima producción. etanol. Lo anterior se atribuye a la lenta degradación del ácido cítrico y a la reducción de la actividad de la enzima acotinasa. isopropanol. etanol. La adición de metanol puede incrementar también la permeabilidad de la pared celular para transportar citrato. isopropanol y acetato de metilo.Antecedentes Se ha observado que la adición de metanol incrementa la producción de ácido cítrico a partir de glucosa y otras fuentes de carbono. lo anterior se ha demostrado con la adición de metanol. La adición de aceites vegetales también incrementa la producción del metabolito (Sikander y Haq. 2005). npropanol. el cual incrementa el rendimiento de etanol. Lo anterior provoco el incremento de la síntesis de aminoácidos. Pero también existe la posibilidad de que el etanol pueda ser convertido a Acetil CoA metabolito intermediario necesario en la síntesis de nuestro metabolito de interés. ácido yodoacetico y agentes axidantes. tales como peróxido de hidrógeno. La naturaleza de la fuente de carbono afecta a la producción de ácido cítrico. una alta concentración de esos inhibidores puede inhibir el crecimiento del micelio y disminuir la producción del metabolito de interés. el glicerol entra directamente al ciclo de Krebs y los ácidos grasos ingresan a través de la glucolisis. Michaelis y Papoutsakis (1990) usaron a el polietilenglicol. 2008). suero sustancias que protegen al micelio de los esfuerzos de corte causados por la hidrodinámica e impulsores del reactor. 2005). estimulando su crecimiento. Se ha estudiado el efecto de otros inductores del crecimiento del micelio. sobre todo en la actividad de las enzimas del ciclo del ácido cítrico (Xu et al. 1989). La adición de inhibidores sobre varias enzimas del ciclo de Krebs. también incrementan la acumulación de ácido cítrico (Adham et al. malonato de sodio. En términos generales. Sin embargo. Hoy en día la producción de biodisel tiene como subproducto al glicerol y es un sustrato disponible y actúa directamente en la síntesis de ácido cítrico (Figenova et al. por ejemplo. solo los azucares que son metabolizados rápidamente por el hongo permiten altos rendimientos.Antecedentes degradan como glicerol y ácidos grasos. fluoruro de potasio. fluoruro de sodio. así que los polisacáridos no son recomendables. azida de sodio. arsenato de sodio. naftaquinona y azul de metileno adicionados a la fermentación. tales como el fluoruro de calcio. Recuperación y purificación del ácido cítrico . extracción y absorción (Figura 1) Figura 1. usando carbonato de . En este caso. Esquema de la recuperación de ácido cítrico por los métodos convencionales Métodos de extracción a) Precipitación Es uno de los métodos convencionales para extraer el ácido cítrico de una fermentación sumergida.Antecedentes La obtención del ácido cítrico producido en fermentaciones sumergidas se obtiene por métodos clásicos como precipitación. el caldo de fermentación se calienta a 50 °C por 20 minutos y es precipitado como citrato de calcio. 2 y 80 °C. La clarificación fue hecha con carbón activado y kieselgur y después mezclado con CaCl2. fue separado del caldo de cultivo como citrato de calcio.8 a 92.07. respectivamente.9 a 100 %. en este caso el rendimiento fue entre 83. El pH optimo y temperatura fue entre 7. El citrato de calcio también fue convertido a ácido cítrico por cromatografía de intercambio iónico. 1979). El ácido cítrico producido por fermentación. lavado con agua caliente y secado entre 90-105 °C. seguido de una evaporación y cristalización.5. Este último fue convertido a ácido cítrico por medio de la adición de H 2SO4 a 80-90 °C. oxálico y gluconico y otros contaminantes orgánicos adicionando cal a pH de 6 agitando constantemente y calentando de forma gradual a más de 80 °C.9 %. Luego el citrato de calcio fue separado por filtración al vacio. El filtrado de la suspensión se calentó a 60 °C y lavada con agua a la misma temperatura.1 y 7. El precipitado (citrato de calcio) es entonces filtrado y lavado con agua varias veces. 2008). usando como fuente de carbono a alcanos. Kunzl y Cechurova (1977) lograron separar el 88 % de citrato de calcio de caldo de cultivo que contenía ácido cítrico.Antecedentes calcio y ácido sulfúrico (Pazouki y Panda. El rendimiento de ácido cítrico fue entre 64. acetato de sodio o Ca(OH)2 para precipitar el ácido cítrico. después es llevado a un acidulador y tratado con ácido sulfúrico. málico. El ácido cítrico también aislado del caldo de fermentación a través de citrato trisódico y . Karklin et al (1984) separo el ácido cítrico de caldos de fermentación usando pH´s entre 6. La solución es nuevamente filtrada para remover el CaSO4 (Kiousdetidis et al. Posteriormente se le agregó más cal hasta alcanzar un pH de 6. extracción supercritica de CO 2 (Shishikura et al.3. El líquido fue concentrado al vacio y finalmente se cristalizó a baja temperatura. 1992) y separación por membranas (Friesen et al. genera problemas alternos. por ejemplo. 1998). 1991). Posteriormente. electrodiálisis (Pinto et al. la solución fue des ionizada y cristalizada. El método de precipitación. donde el ácido cítrico cristaliza como ácido cítrico monohidratado. 1992). extracción por solventes (Pazouki y Panda. El ácido cítrico cristaliza con dificultad y produce bajos rendimientos (Kertes y King.2. Pendl et al (1986) trato el caldo de fermentación con cal hasta alcanzar un pH de 4.86 para obtener ácido cítrico y ácido oxálico. . como la formación de productos indeseables. 1984). El caldo de cultivo que contiene ácido cítrico es decolorado por medio de carbón activado y pasado a través de cromatografía de columnas de resina de intercambio iónico. Su descomposición fue tratada con H 2SO4 a pH de 1.Antecedentes citrato de tripotasio por medio de cromatografía de intercambio iónico (Ramina y Brigmane. La suspensión resultante fue filtrada y lavada con agua a 60 °C. a pesar de ser simple y extenso. 1986). Para eliminar la generación de yeso y CO como coproductos se han utilizado otras técnicas de separación. Pero también existe prioridad por acortar el método e incrementar su eficiencia de recuperación utilizando técnicas avanzadas. seguido de un calentamiento a vapor a 60 °C. por ejemplo. y menor generación de co-productos. c) Adsorción Es difícil lograr altos radios de recuperación usando técnicas de separación convencionales. 1998). El método de extracción por aminas es muy favorecido a pH´s muy bajos (abajo del pKa más pequeño) y se favorece su reactividad con aminas terciarias básicas. La extracción por medio de aminas parece ser un método prometedor par ácidos carboxílicos disueltos en soluciones acuosas. no se evaporan grandes cantidades de agua. Wenneresten (1983) demostraron que las aminas terciarias son muy efectivas para la extracción de ácido cítrico. Baniel y Gonen (1990) reportaron un 90 % de recuperación de ácido cítrico con el método de extracción antes mencionado. analizaron la adsorción de ácido cítrico de soluciones acuosas en resinas de macroporos (Amberlita XAD-4 y . Las ventajas de este método son: consumo mínimo de ácidos y bases minerales. Juang y Chou (1996).Antecedentes b) Extracción por solventes Aunque el método clásico por precipitación es la técnica más utilizada en procesos industriales. tales como las aminas alifáticas de alto peso molecular (Pazouki y Panda. la separación por solventes también ha sido usada para separar ácido cítrico. Se ha reportado el uso de resinas de intercambio iónico para ácidos orgánicos. El ácido cítrico es fácilmente extraído por un gran número de solventes orgánicos. buffer y como sustancia amortiguadora. La extracción en línea de ácido cítrico del fermentador con resinas débilmente básicas ayudaría a evitar la inhibición por producto e incrementar la velocidad de producción y viabilidad celular. Este es uno de los ácidos orgánicos más utilizados en la industria de alimentos. Estructura química del ácido cítrico Debido a su funcionalidad y aceptabilidad ambiental. Figura 2. Gluszcz et al (2004) midieron las propiedades de absorción de 18 tipos de resinas de intercambio iónico para recuperar ácido cítrico y láctico. el ácido cítrico y las sales que produce (con potasio y sodio) se utilizan en diversas aplicaciones industriales. entre ellas como material quelante. Las isotermas de absorción de los ácidos orgánicos fueron altamente favorables y la capacidad de adsorción depende del valor del pH en la solución.2. es un metabolito común en las plantas y animales.3-tricarboxilico( Figura 2)). Estructura y propiedades del ácido cítrico El ácido cítrico (2-hidroxy-ácido-1. encontraron que las resinas con pH básico poseen altas capacidades de adsorción. Takatsuji y Yoshida (1998) también reportaron los mecanismos de adsorción para el ácido cítrico. bebidas e industria farmacéutica (KirkOthmer. Esos .Antecedentes XAD-16) impregnados con tri-n-octilaminas. 2002). málico y acético en resinas comerciales (Diaion WA30) con pH básico. 498-23-7. Entre ellas se incluyen las reacciones de esterificación. Los alcoholes unidos . peso molecular 192. 2002). ácido acetonedicarboxilico. limpieza de químicos y extracción de petróleo (Kirk-Othmer. punto de fusión 153 °C. formación de sales y reacciones anhídridas. es incoloro y forma cristales traslucidos o polvo blanco cristalino. densidad 1. Sin embargo. Su cristal es de forma monoclínica holohedrica. los grupos hidroxilo (OH) terciarios no sufren todas esas reacciones: 1) Reacciones de descomposición Esto ocurre cuando el ácido cítrico se calienta a 175 °C. ácido itaconico. champús. tal como el ácido sulfúrico. 2) Reacciones de esterificación El ácido cítrico es esterificado fácilmente con alcoholes en condiciones azotroficas en la presencia de un catalizador.Antecedentes usos incluyen la elaboración de detergentes. cosméticos. dióxido de carbono y agua (Patentes: 499-12-7. descomposición térmica 175 °C. El ácido cítrico es deliquiscente en aire húmedo y es ópticamente inactivo. 2002). 542-05-2).665 g/mL (Kirk-Othmer. el ácido cítrico se descompone y forma ácido aconítico.13 g/mol. 97-65-4. Algunas otras propiedades son: fórmula molecular (C 6H8O7). a) Propiedades físicas El ácido cítrico anhidro cristaliza en agua a temperaturas de 130 °C. El ácido cítrico experimenta algunas reacciones que son comunes en cualquier ácido orgánico. persulfato.La hidrogenación produce dióxido de carbono. bióxido de carbono y agua (Blair y Zienty. dióxido de manganeso y ácido nítrico. 1979). El producto de la oxidación son ácidos acetodicarboxilicos. cromato. 1941). 4) Reducción La hidrogenación del ácido cítrico produce ácido 1. 6) Formación de quelantes . tales como los peróxidos. hipobromito. ácidos oxálicos.2. ácido fórmico y pequeñas cantidades de ácido metil succínico. 3) Reacciones de oxidación El ácido cítrico es fácilmente oxidado por una variedad de agentes oxidantes. Las sales pueden ser preparadas por neutralización directa de una solución de ácido cítrico en agua usando una base apropiada.3 propanocarboxilico (Seidell.Antecedentes al ácido cítrico alcanzan su punto de ebullición a temperaturas superiores de 150 °C (Seidell. permanganato. hipoclorito. amonio y aminas. periodato. tales como los álcalis. agua. metano. 5) Formación de sales El ácido cítrico forma sales mono. El citrato trisódico es el más ampliamente utilizado en comparación con otro tipo de sal de ácido cítrico. di y tribásicas con muchos cationes. 1941). como sustancia quelante o para formar complejos estables con iones metálicos multivalentes. estabilidad. exceptuando el acero 316 es resistente a la corrosión. el vidrio y plásticos (poliéster. En resumen.Antecedentes El ácido cítrico forma complejos multivalentes con iones metálicos y forma quelatos (Staal. 2002). apariencia del producto o eficiencia del proceso. el ácido cítrico corroe el acero a temperaturas elevadas. 1982). polipropileno. 7) Corrosión En soluciones acuosas. limpio. Aplicaciones del ácido cítrico El ácido cítrico es utilizado en la industria de alimentos. la contaminación por metales afecta el color. debido a sus propiedades únicas. 1989). tiene sabor agradable y es utilizado como acidulante en alimentos diversos Othmer. medicina. Esta propiedad es importante en el proceso del ácido cítrico. citrato de sodio y el citrato de potasio se utilizan para la elaboración de bebidas carbonatadas y no carbonatadas (National Soft Drink Association. cobre y niquel son medianamente corroídos por el ácido cítrico. agricultura e industria química. El ácido cítrico. también es usado para estabilizar emulsiones y otros sistemas multifásicos. isotónicas. polivinil) no son corroídos por el ácido cítrico (Kirk-Othmer. polietileno. Otros metales como el aluminio. Por otra parte. 2002). el ácido cítrico es dulce. utilizan solo ácido cítrico en combinación con sales de citrato para otorgar sabor y propiedades de (Kirk- . Las bebidas bajas en calorías. El ácido cítrico se utiliza para ajustar el pH. Alimentos del mar. además. Inhibe el deterioro del sabor y olor Atrapa metales y evita la oxidación enzimática.10-0. También se utiliza para estabilizar el pH en bebidas dietéticas. Contiene propiedades antimicrobianas Tabla 1. Elaboración de postres y confitería. Frutas y vegetales congelados. Quela y acidifica para conservar a los alimentos congelados e incrementa la actividad antioxidante. atrapa trazas de metales Junto al citrato de sodio. Se usan para quelar trazas de metales iónicos y evita la degradación de los ingredientes de una formulación farmacéutica. el ácido cítrico y las sales de citrato son usados como buffer para mantener la efectividad y estabilidad de una gran cantidad de fármacos. Se puede combinar con ácido málico para obtener perfiles únicos de sabor. evitando el deterioro. Mantiene el color e incrementa el sabor de las frutas enlatadas Evita la oxidación de grasas y aceites. La alta solubilidad del ácido cítrico es importante para la elaboración de jarabes. Reduce su viscosidad Se adiciona junto a otros antioxidantes para bajar el pH y retardar el crecimiento bacteriano. Grasas y aceites. Se adiciona al dulce para dar sabor. y postres congelados antes de su pasteurización. en este caso les confiere una rápida disolución de los ingredientes activos y mejora la palatabilidad. Alimentos congelados. Elaboración de dulces. Existe toda una gama de aplicaciones en la industria de alimentos (Tabla 1).Antecedentes buffer y para incrementar la actividad antimicrobiana. Productos cárnicos. También se utilizan para formular medicamentos efervescentes junto al bicarbonato. Evita la coagulación de sangre y es usado para separar los componentes celulares (fraccionamiento) y . La concentración presente en muchas bebidas carbonatadas y de sabores están alrededor del 0. se utilizan en la industria de la confitería para optimizar las características de gelatinas e incrementan su sabor Se utiliza citrato de sodio en el proceso de elaboración de queso. USO Fabricación de mermeladas y jaleas. También le da cuerpo y textura al queso Estabilizador de cremas batidas y estabiliza lácteos que contienen vegetales.25 % (p/p). evita sabores desagradables y color de pescados y otros alimentos de origen marino Se utiliza para curar a la carne e incrementa la efectividad antioxidante y ayuda a modificar la textura. Usos del ácido cítrico en los alimentos En la medicina. Evita la inversión del azúcar. Ensaladas. Elaboración de quesos Lácteos. Se le adiciona a malteadas. se utiliza para estabilizar las emulsiones de aceite y agua. PROPIEDADES Proveen de sabor y se ajustan al pH del producto para su óptima gelatinización. Se combinan con el ácido ascórbico para evitar el ataque enzimático a vegetales preparados. Es usado como aditivo y formulaciones plásticas para retardar el tiempo de secado y reduce la cantidad de agua requerida para hacer una mezcla. se usan para limpiar metales oxidados. manganeso y zinc. Se usa para remover sulfuro de hidrógeno del gas natural y formando azufre elemental.5 junto al amonio y trietanolamina.Antecedentes plasma. Remueve colorantes que son díficiles de eliminar en la ropa El ácido cítrico ajustado a un pH de 3. También se utiliza en los forrajes para el ganado. las cuales son usadas para dar alta durabilidad y ajusta el pH durante el teñido de telas Limpiador Limpieza de metales Petróleo Desulfación de gas Formulación de concretos y morteros Fabricación de textiles . este va desde elaboración de detergentes hasta la fabricación de cemento para la construcción (Tabla 2). tales como los cascos de barcos. Limpia equipo de acero de la industria y para áreas de difícil acceso. En el sector agrícola. Los citratos de calcio y amonio se utilizan como suplementos minerales o en gomas de mascar para el cuidado dental. USO Fabricación de detergentes PROPIEDADES Se usa para fabricar detergentes en polvo y líquidos. magnesio. El ácido cítrico funciona adecuadamente a altos y bajos pH´s. Atrapa iones de aguas duras y dispersa aceites. y su efectividad no es afectada por la temperatura del agua. el ácido cítrico y sus sales de amonio se usan para atrapar iones solubles como el hierro. Mejora su resistencia y fuerza de construcciones. lo anterior hace al ácido cítrico idóneo Es un limpiador de superficies duras. Acidifica y quela disolventes y depósitos de agua dura. También se usa para mantener un sabor agradable logrando incrementar el consumo de alimentos por parte de los animales. Las soluciones de citrato de aluminio ajustadas a un pH de 7. con el fin de restaurar la eficiencia en la transferencia de calor. estimulando la recuperación de petróleo. Absorbe dióxido de azufre del gas producido por las plantas eléctricas. El ácido cítrico reemplaza a los fosfatos y es menos contaminante. los cuales son micronutrientes utilizados para formular fertilizantes líquidos. El dióxido de azufre es el principal causante de la lluvia ácida. Es útil en la limpieza de reactores nucleares y boilers de vapor. Se utiliza en la construcción para incrementar la eficacia de surfactantes. Actúa como Buffer de resinas de glioxilato. en la formación de quelatos fácilmente digeribles de nutrientes metálicos esenciales. cobre. El uso industrial del ácido cítrico es muy amplio.0 en usada para gelificar polímeros. controla el pH gástrico y mejora la eficiencia de absorción de nutrientes en el intestino delgado. Antecedentes Plásticos Junto con el bicarbonato. quelar metales y evitar la decoloración y descomposición Le confiere volumen. usadas para empacar alimentos. estabilidad y fuerza a materiales cerámicos usados como condensadores eléctricos y fundición. Es un agente quelante en la fabricación de resinas y los esteres de citrato se usan como plastificante de películas de PVC. Aplicaciones del ácido cítrico en la industria Fabricación de papel Cosméticos Cerámica . Se adiciona a cosméticos para ajustar el pH. el ácido cítrico es usado como agente efervescente de espuma de poliestireno. Tabla 2. Se adiciona a la pulpa líquida para blanquear y atrapar iones metálicos y evita la decoloración. Ha reemplazado a los fluoroclorocarbonos de los recipientes de plástico.