UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS PROGRAMA DE BIOLOGÍAMANUAL DE PRÁCTICAS ENZIMOLOGÍA MANUAL DE PRÁCTICAS DE ENZIMOLOGÍA COMPILADORES: Principal: Dra. Florinda Jimenez Vega Colaboradores: Dra. Florinda Jimenez Vega Revisado por: Academia de Biologia 2011 Ciudad Juárez, Chihuahua Universidad Autónoma de Ciudad Juárez 2009 p. 22 Alejandro Martínez Martínez Jefe del Departamento de Ciencias Químico-Biológicas M. 2011 . Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomédicas Aprobados por la Academia de Biología. Ph. Emilio Clarke Crespo Coordinador de la Academia de Biología D.M. en C.C. Antonio de la Mora Covarrubias Coordinador del Programa de Biología Dr. Pag. 1 PREPARACION DE SOLUCIONES DE CONCENTRACION DEFINIDA Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS (BUFFERS) Objetivo El objetivo general de la siguiente practica es el estudiante aprenda a preparar disoluciones en concentraciones definidas en porciento. Florinda Jiménez Vega. normalidad. Disoluciones de concentración en peso A) • • • Preparación de 50 mL de una solución de NaCl al 0.PRACTICA No. Materiales NaCl NaOH HCL Probeta Pipetas Balanza Papel encerado Placa de agitación Barras magnéticas Matraces volumétricos Vasos de precipitado Fosfato de Na Procedimiento I. B) Preparación de 50 mL de una disolución de alcohol etílico al 70% (v/v) Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. 2 de 22 . 30 mL) Colocar la disolución de NaCl en un matráz volumétrico de 50 mL y aforar con agua destilada.9% (p/v) Pesar NaCl en la balanza Disolver los X g de NaCl en agua destilada (aprox. molalidad y molaridad. • • • Con base a la concentración del alcohol etílico comercial determinar el volúmen necesario para tener 35 mL de alcohol etílico. evite todo el contacto con la piel y ojos. Pese el NaOH requerido y colocaro en un vaso de precipitado de 500 mL para su disolución con agua destilada (aprox. Florinda Jiménez Vega. Colocar la disolución en un matraz volúmetrico de 200 mL y aforar con agua destilada. Medir el alcohol en una probeta Colocar el alcohol etílico en un matráz volúmetrico de 50 mL y aforar con agua destilada. Disoluciones de Concentración molar A) Preparación de 200 mL una disolución de NaOH 1 M Nota: Los ácidos y los álcalis son agentes corrosivos. 3 de 22 . B) Preparación de 100 mL de una disolución de NaOH 25 mM a partir de la disolución de NaOH 1M • Aplicar la fórmula C1 x V1 = C2 x V2 para calcular los mL de NaOH 1 M necesarios para preparar 100 mL de una disolución de NaOH 25 mM V1= (C2 x V2)/ C1 Donde: C1= Concentración inicial V1= Volumen inicial C2= Concentración final V2= Volumen final Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. Determinar los gramos requeridos de NaOH para preparar 200 mL de NaOH 1M. Extreme precauciones para su manejo. 150 mL). II. Pag. • • • • Encontrar el peso molecular de la sustancia. Nota: Siempre se agrega el ácido al agua nunca el agua al ácido.6 g (0. Disoluciones de concentración en peso A1) Preparación de 200 mL de amortiguador de fosfatos 0.2 moles) de fosfato de sodio monobásico monohidratado y aforar a un litro con agua destilada (Solución X).2 M (pH 7. Mezclar cantidades necesarias según la tabla para preparar 200 mL de amortiguador de fosfatos (0. 4 de 22 . Disoluciones de Concentración Normal A) Preparación de HCL 1N • • • • • • • Conocer la concentración del HCL concentrado comercial. Pag. Con cuidado agregar poco a poco la cantidad de HCL concentrado requerido. Florinda Jiménez Vega.2 M) pH 7. Calcular la cantidad de HCL conc.2 moles) de fosfato de sodio dibásico y aforar a un litro de con agua destilada (solución Y). Agitar en la placa de agitación Colocar la disolución en un matráz volumétrico de 50 mL y aforar con agua destilada. 30 mL) en un vaso de precipitado.4 g (0. Disolver 28.• Medir el volúmen requerido de NaOH 1M con una pipeta y colocarlos en un matráz volúmetrico de 100 mL y aforar con agua destilada. requerido para preparar 50 mL de HCl 1N.2 M): • • • Disolver 27.0 Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. Colocar el agua destilada (aprox. III.0) Preparar las soluciones stock de fosfato monosódico y fosfato disódico (0. Cantidades que deben mezclarse de las soluciones “X” y “Y” para obtener el pH deseado en el amortiguador de fosfatos. Discusión Bibliografía Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra.2 6.0 61.0 6.6 6.2 7.8 6.0 39.0 Checar el pH de la disolución resultante y ajustar si es necesario. pH requerido 5.5 62.3 19.4 6. Florinda Jiménez Vega.8 7.0 mL de Y 8.0 84. Pag. Resultados Desarrollar los cálculos que realizaron para preparar las soluciones.0 87.5 49. 5 de 22 .0 7.5 68.0 12.5 51..5 31.0 28.0 72.0 18.7 81.5 6.5 73.5 37.5 ß mL de X 92.5 26. 2. durante 5 minutos a 5 ºC. Florinda Jiménez Vega.5 mL de capacidad Tubos cónicos para centrifuga clínica de 15 mL de capacidad Tubos para ultracentrifuga de 10 mL de capacidad Pipetas de transferencia desechables Material biológico Extracto de Higado de pollo Procedimiento Centrifugación bajo condiciones constantes de muestras de diferente origen. 4. Colocar los tubos de centrifuga (previamente marcados) en el rotor de la microcentrifuga refrigerada Eppendorf (cuidando equilibrar todos los tubos correctamente).PRACTICA No. Descongelar los homogenados obtenidos por diferentes tratamientos (mortero. Colocar la tapa y establecer las condiciones de centrifugación a 10.000 rpm. sonicación y homogenizador de tejidos “POLYTRON”) de higado de pollo.5 mL (preparar un tubo del mismo peso para equilibrar los tubos en la centrifuga). Materiales y Reactivos Tubos Eppendorf para microcentrifuga refrigerada de 1. 6 de 22 .2 mL de muestra en tubos de microcentrifuga de 1. 3. 2 CENTRIFUGACIÓN Objetivo Conocer el fundamento de la centrifugación como técnica básica en la separación y separar fracciones de extractos biológicos variando la Fuerza de Centrifugación (RFC). Agitar los homogenizados y colocar 1. 1. perlas de vidrio. Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. Pag. 7 de 22 . Siguiendo las recomendaciones anteriores. por 10 min a 5º.5. Determinar densidad óptica del sobrenadante a 580 nm. Una vez centrifugados los extractos de de higado bajo las diferentes condiciones. Siguiendo las recomendaciones anteriores centrifugar esta muestra a 15. 6. Centrifugación bajo diferentes condiciones de un extracto biológico. 3. centrifugar esta muestra a 30. Calcular las unidades de RFC gravitacionales alcanzadas para cada caso. Colocar 3 mL de extracto de higado de pollo en tubos cónicos para centrifuga de gabinete Beckman refrigerada. 2. Iniciar la centrifugación y recuparar el sobrenadante en recipientes limpios y desechar el sedimento. Pag. Resultados Conclusiones Bibliografía Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. 1.000 rpm. Colocar 3 mL de extracto de de higado de pollo en tubos para la ultracentrifuga Beckman refrigerada.000 rpm por 10 min a 5ºC.5 mL por tubo) de de higado de pollo en tubos (2) para microcentrifuga (Eppendorf). 5. 4. Reportar los resultados en un cuadro comparativo entre el método de centrifugación y la densidad óptica a 580 nm. 10 min y 5ºC. Florinda Jiménez Vega. 6. centrifugar esta muestra a 3500 rpm. Colocar 3 mL (1. para calibrar el espectrofotómetro. de acuerdo al nomograma que se anexa. recuperar el sobrenadante de la manera anteriormente descrita y medir su densidad óptica a 580 nm utilizando agua destilada como blanco. Siguiendo las recomendaciones anteriores. 1.PRACTICA No.4.0 1. Florinda Jiménez Vega.8.8 1. A partir de una alícuota de proteína de aproximadamente 4 mg/mL (C1).4 mg/mL) Conc (mg/mL) C2 0. Marcar para cada concentración 2 tubos Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. 0.4 Microlitros Microlitros alícuota 4 agua mg/ml V1 Volumen final 500 µL V2 2. Pag. 3.0.4 0. Para la cuantificación. 0. Agua Albúmina Celdas para luz visible Procedimiento Elaboración de curva patrón 1. 3 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE LA TECNICA DE BRADFORD Por medio de la siguiente práctica el alumno será capaz de elaborar una curva de calibración para cuantificar la concentración de una proteína.6. se realizara.6 0.2.2 0. realizar las diluciones necesarias para tener alícuotas de 500 uL con las siguientes concentraciones (0. cuando este perfectamente disuelto adicionar 100 mL de ac. 8 de 22 . Almacenar a temperatura ambiente.2 1. Materiales Reactivo de Bradford Disolver 100 mg de Coomassie B-Blue G-250 en 50 mL de etanol por agitación con un magneto. 1.1.2.fosfórico 85% y aforar a un 1Lt CUIDADO!!! (ácido + agua) Filtrar con papel (Listo para ser empleado). 0. cada determinación por duplicado. Determinar absorbancia a 595 nm 9. realizar una regresión lineal de los datos y determinar la curva estándar para cuantificar. Graficar la concentración de proteína (mg/mL) en el eje X y lectura de absorbancia (595nm) eje Y. Incluir un par de tubos sin muestra. 2Mercaptoetanol 1 M.1 M. Adicionar 1 mL de reactivo 7. Triton X-100 ≧ 0.1 %. MgCl. Ac.4. Etanol Sustancias incompatibles con Bradford: Tris 2 M. Información Adicional Verificar que el material empleado se encuentre perfectamente limpio ya que concentraciones muy bajas de detergentes pueden interferir en la reacción. (NH4)2SO4. Florinda Jiménez Vega. Hemosol ≧ 0. Adicionar 100 µL de la proteína de cada una de las concentraciones conocidas 5. Glicerol 99 %. 9 de 22 . Pag. EDTA 0. SDS 1 %. Sustancias compatibles con Bradford NaCl. KCl. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente 8. Acético. intercambiar por agua (será el control) 6. Sacarosa 1 M.1 % Resultados y Discusión Bibliografía Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. Utilizando el programa Excel. 10. Una vez llena la cámara. Preparar el gel de concentración (stacking gel) de acuerdo a la tabla anexa. Una vez polimerizado en el portagel.PRACTICA No. Azul de Coomasie (tinción) (tabla anexa) Soluc. Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. PAGE-SDS (Tabla anexa) Procedimiento Preparación del gel de corrimiento (10%) 1. 3. Florinda Jiménez Vega. La preparación del gel de separación se efectúa de acuerdo a la tabla anexa 2. lavarlo y eliminar el exceso de agua usando tiras de papel Whatman. colocar el peine evitando la formación de burbujas. 4. 10 de 22 . 4 ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES SDS-PAGE Objetivo Conocer los principios y aplicaciones de la electroforesis. Materiales Soluciones proteícas Marcadores de peso molecular Fuente de poder Cámara de electroforesis Puntas de micropipeta Papel absorbente Soluc. Pag. extrapolando el log PM correspondiente y calcular el antiligaritmo. 7. Hacer una grafica del log pM contra la movilidad relativa de los estándares 7. Desprender cuidadosamente el gel de los vidrios dividir el gel. Colocar las muestras y marcadores de peso molecular en los carriles correspondientes. Determinación de la aparente masa molecular de las proteínas 1. Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. Mida la distancia total del principio al fin del gel de corrido 2.5/4. Para cada banda calcula la movilidad relativa: a / total.9 = 0. total = 4.5. Florinda Jiménez Vega. Mida la distancia de la proteína desconocida (X) 4. Pag. 9. una vez dentro. Localizar la movilidad relativa de la proteína de la proteína desconocida. 11 de 22 . Fijar las condiciones de corrimiento en 60 V hasta que entre la muestra al gel de separación. 0. 10. 6. lavarlo con agua destilada y llenarlo con buffer de corrimiento (running buffer).9cm. Mida la distancia del origen a cada uno de los estándares de peso molecular 3.5cm. Teñir el gel utilizando Coomassie Blue.1 5. Resuspender la buffer muestra en proporción 1:4 (si es necesario agregar más azul de bromofenol y glicerol). Una vez polimerizado el gel. cambiar a 100-120 V (2 h) y vigilar que las muestras no salgan del gel. Calcular el logaritmo del peso molecular de cada estándar 6. 8. b / total Ejemplo a = 0. de acuerdo al protocolo anexo. 11. Calcular el peso molecular de las proteínas problema. Pag.Log MW Movilidad Resultados y Discusión Bibliografía Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. 12 de 22 . Florinda Jiménez Vega. 1% de SDS.3 Tris base 45.8 con HCl 1.0 g N’N 4. pH 6.67%C) Acrilamida 146.0 g SDS 15. F) Buffer de corrimiento (5x). preparar en el momento.0 g No incluir el SDS cuando se requiera hacer corrimiento bajo condiciones nativas (PAGE). 2. Filtrar.45 g Agua destilada 150 mL Ajustar el pH 8. 192 mM Glicina.8 Tris base 54. Vida media 30 días. Aforar a 300 mL con agua destilada. 13 de 22 . pH 8.0 N.0 N. Adicionar 1 mL de agua destilada.ANEXO Preparación del Gel y Reactivos para la Electroforesis en Geles de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE) (Laemmli) A) Acrilamida/Bis (30% T. Almacenar a 4 °C C) 0. Pag.8 con HCl 1. agitar suavemente y aforar a 100 mL E) 10% (w/v) Persulfato de Amonio 100 mg de sulfato de amonio.5 M Tris-HCl. Florinda Jiménez Vega. 25 mM Tris.0 g Glicina 216 .0 g Agua destilada 60 mL Ajustar el pH 6. pH 8. Aforar a 100 mL con agua destilada y almacenar a 4°C. Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. B) 1. guardar a 4°C en la obscuridad.5 M Tris-HCl. D) 10% (w/v) SDS Disolver 10 g de SDS en agua destilada.0 g Bismetilenacrilamida 500 mL de agua destilada.8 Tris base 6. 004 mL Gel Concentrador (Stacking) (4mL) Agua destilada 0.4 mL al sample buffer de beta-mercaptoetanol y posteriormente de diluir 1:4 habra que calentar las muestras a 95 °C por 4 min.0 mL 0.8 Acrilamida 10 % SDS Persulfato de amonio Temed 2.5 mL 0.5 M Tris-HCl pH 8.Aforar a 3 L con agua destilada.2 mL 8.5 M Tris-HCl pH 6.6 mL 0. No ajustar el pH con acido o base.8 Acrilamida 10 % SDS Persulfato de amonio 10% Temed 4. Florinda Jiménez Vega.0 mL Diluir la muestra por lo menos 1:4 con el sample buffer.8 mL 1.5 mL 3.7 mL 0.04 mL 0. 14 de 22 .0 mL 2.10 mL 0. *Cuando son condiciones nativas (PAGE) omitir SDS.1 mL 0. H) Preparación de PAGE-SDS 10% Volúmenes requeridos para dos placas del sistema Mini-Gel BioRad MR Gel Separador (Separating) (10 mL) Agua destilada 1. G) Sample Buffer Agua destilada 0.3 mL 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 Glicerol 10 % SDS 0.4 mL 1.1 mL 0.67 mL 0. se debera adicionar 0. *Si el gel fuese en condiciones desnaturalizantesy reductoras.5 (w/v) azul de bromofenol en agua 4. Almacenar a 4°C. Pag. Calentar a 37°C antes de usar en caso de precipitación.004 mL Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. agregar el agua. Teñir con la solución de Coomassie.Tinción de Geles de Poliacrilamida por Coomassie Blue Soluciones Coomassie Coomassie Blue-R250 al 0.1% Disolver 0. Ac. 2. Solución A Solución de fijado / desteñido (Metanol 50%. 3. Acético 10%) Procedimiento 1. Enjuagar con agua destilada. Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra.1 g en solución de desteñido. Desteñir con la solución A hasta que se observen las bandas. 15 de 22 . Sumergir el gel por 10 minutos en solución A. Pag. Filtrar siempre antes de su uso. Florinda Jiménez Vega. dejar a temperatura ambiente hasta el siguiente día. 4. Establecer la cinética.1 M pH 7. Recupere la fracción sobrenadante 5. Pag. Centrifuge a 10 000 x rpm durante 5 minutos 4. 5 COMPORTAMIENTO CINÉTICO DE LA CATALASA Objetivo Conocer los principios sobre el funcionamiento de una enzima y su actividad catalítica Materiales Mortero Hoja vegetal Fosfato de potasio Peroxido de Hidrógeno Celdas de cuarzo Espectrofotómetro Procedimiento 1.PRACTICA No. 16 de 22 .4 (frio). Coloque una hoja en el mortero adicionando 2 mL de la solución de fosfato de potasio 0. Homogenizar 3. bajo las siguientes condiciones: 8. Concentración de sustrato variable y enzima constante a. Florinda Jiménez Vega. 2. Inicie sus mediciones 6. Concentración de enzima variable y sustrato constante Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. Calibrar con un blanco de Fosfato de potasio 7. a) Sustrato 18. Posteriormente se adicionará el sustrato y enzima mezclando rápidamente con ayuda de un parafilm 11.75 µL 37. Para cada uno de los casos. Resultados y Discusión Bibliografía Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra.5 µL 75 µL 100 µL 150 µL 300 µL Enzima 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL b) Sustrato 75 µL 75 µL 75 µL 75 µL 75 µL 75 µL Enzima 5 µL 10 µL 20 µL 40 µL 80 µL 160 µL 9. Determinar su cinética a 240 nm. 17 de 22 . se adicionará un volumen de amortiguador de fosfato de potasio constante de 875 µL 10. Florinda Jiménez Vega. Pag. 6 + Acetato de Sodio 20mM pH 4.0 + NaCl 10 % Acetato de Sodio 20mM pH 4.6 y 5.0 + NaCl 2 % Acetato de Sodio 20mM pH 4. 4.6 + Acetato de Sodio 20mM pH 4. Florinda Jiménez Vega. evitando derramar material dentro del vaso precipitante. 8 y 10%.6 + Acetato de Sodio 20mM pH 4. 2. Acetato de Sodio 20mM pH 4.6 + Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. Realizar un screening con variaciones de la solución precipitante conteniendo una concentración de sales de 2.0 + NaCl 8 % Acetato de Sodio 20mM pH 4.0.0 + NaCl 4 % Acetato de Sodio 20mM pH 4. 4.0 Procedimiento 1.6 + Acetato de Sodio 20mM pH 4. 6 CRISTALIZACIÓN DE LISOZIMA Objetivo Conocer los principios para la cristalización de proteínas puras Materiales Placas de 24 pozos Plastilina Cubreobjetos siliconizados Aire comprimido Vaselina o silicón en grasa Soluciones Lizosima 20mM en Acetato de sodio pH 4.PRACTICA No.6 NaCl 12% en acetato de sodio 20 mM Acetato de sodio 20 mM pH 4. 6. 18 de 22 .0 + NaCl 6 % Acetato de Sodio 20mM pH 4. Pag. Con ayuda de una jeringa colocar silicon en el borde de la placa. Pag. 6. 7. Invertir el cubreobjeto conteniendo 3 gotas de 3µL cada una sobre el pozo de la placa previamente engrasado procurando que selle perfectamente. 2µL y 1µL de la proteína y adicionar 1µL. Colocar el el cubreobjetos limpio 3 gotas conteniendo 2µL.0 + NaCl 10 % 3. Resultados y Discusión Bibliografía Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. Florinda Jiménez Vega.0 + NaCl 2 % NaCl 4 % Acetato de Sodio 20mM pH 5.NaCl 2 % Acetato de Sodio 20mM pH 5. Repetir todas las condiciones planeadas en el esquema. Describa en que consiste el método de difracción de un cristal por rayos X.0 + NaCl 6 % NaCl 8 % Acetato de Sodio 20mM pH 5. 1µL y 2 µL de la solución precipitante. Aplicar 1 mL de solución precipitante conteniendo las concentraciones preestablecidas en cada pozo. 5.0 + NaCl 4 % NaCl 6 % Acetato de Sodio 20mM pH 5. 19 de 22 . 4. Reportar sus observaciones 9. Incubar a temperatura ambiente y vigilar el crecimiento de los cristales por microscopia. 8. en el cual usted me describa el seguimiento que debería de realizar a su muestra una vez obtenido el cristal.0 + NaCl 8 % NaCl 10 % Acetato de Sodio 20mM pH 5. 0 + NaCl 0.1M pH 10. Materiales Bradford Glicina-NaOH 0.1M pH 10. Separar la clara del huevo 2.0. Resultados y Discusión Bibliografía Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra.0 con NaCl 0. Florinda Jiménez Vega. Determine actividad contra lisozima y concentración de proteína en todas las fracciones colectadas. Lave la matriz con amortiguador Glicina-NaOH 0.5M.0 Glicina-NaOH 0. hasta que ya no se detecte concentración de proteína (*) 8. hasta que ya no se detecte concentración de proteína (*) 7. 7 PURIFICACIÓN DE LISOZIMA DE HUEVO BASADA EN EL CAMBIO DE FUERZA IÓNICA EN LOS AMORTIGUADORES Objetivo El alumno será capaz de aplicar los conocimientos básicos para la purificación de enzimas con actividad biológica. 20 de 22 . Lave la matriz con amortiguador Glicina-NaOH 0.1M pH 10.1M pH 10.PRACTICA No. 4. 5. Pag.5M Matriz de intercambio catiónico Procedimiento 1. 3.1M pH 10.0 Homogeneizar bien y filtrar nuevamente para eliminar partículas sólidas (*) Pasar esta solución a flujo lento a través de una columna de intercambio catiónico (10 a 20 mL matriz) previamente equilibrada con amortiguador Glicina-NaOH 0.0 (*) 6. Filtrarla a través de tela para fibra cruda o gasa de poro fino (*) La clara diluirla con 200mL de amortiguador Glicina-NaOH 0.1M pH 10. 25 mg/mL) preparada en amortiguador de fosfatos Incubar a 37°C por 1hora Medir absorbancia a 540 nm Resultados y Discusión Bibliografía Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra.PRACTICA No. 3. Luteus (0. 21 de 22 .5 Espectofotómetro Procedimiento 1. En un tubo de ensaye. Florinda Jiménez Vega. 2. 4. adicionar 100uL de proteína purificada Adicionar 1mL de solución de M. Pag. 8 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE LISOZIMA Objetivo Evaluar la actividad enzimática de la lizosima purificada en el laboratorio Materiales Micrococcus luteus Amortiguador de fosfatos 50mM pH 6. 9 USO DE LA BIOINFORMÁTICA PARA EL ANÁLISIS DE SECUENCIAS Objetivo Aplicación del uso de las herramientas bioinformáticas accesibles en el Internet para el estudio de proteínas y los genes que las codifican. Muestre su árbol filogenético. ii. Punto isoeléctrico iii. BAA99079. 4. Q39837. Elija 3 secuencias de las proporcionadas 2. Florinda Jiménez Vega.PRACTICA No. Materiales Secuencias: AAS65790. 6. 3. Seleccione 3 secuencias similares a nivel de proteína y alinee por Clustal. NP_035564 Procedimiento 1. Determine el sitio de corte del péptido señal (si es que se presenta). i. NP_003113. Describa que tipo de estructura secundaria presenta 5. Peso molecular ii. 22 de 22 . Calcule el porciento de similitud entre ellas. Pag. Determine i. Mencione en que ORF se localiza v. Contenido de aminoácidos iv. Asigne identidad a la secuencia. Resultados y Discusión Bibliografía Manual de Prácticas Laboratorio de Enzimología Dra. Busque la secuencia que le fue asignada a través de su número de acceso del banco de datos NCBI.