23/10/2012PROTEÍNAS BROMATOLOGIA DEFINIÇÃO Substâncias orgânicas complexas (C, H, O, N, S, P, Fe, Cu, Zn). PROTEÍNAS EM ALIMENTOS Polímero de alto peso molecular Unidade básica: aminoácidos IMPORTÂNCIA • nutricional • propriedades sensoriais Prof. Normandis Cardoso Filho – Out. 2012 Curso de Nutrição PROTEÍNAS AMINOÁCIDOS (AA) AMINOÁCIDOS (aa) 2 Cada aminoácido tem uma cadeia lateral (R) Unidades estruturais básicas das proteínas característica, que influencia suas propriedades físico-químicas. Diferenças: tamanho, estrutura e carga elétrica. Arranjo tetraédrico ⇒ atividade ótica ⇒ isômero L e D Só os aminoácidos L são constituintes de 3 proteínas naturais. AMINOÁCIDOS (AA) AMINOÁCIDOS (AA) Apolares ou hidrofóbicas, exemplos: Polares ou hidrofílicos, exemplos: tirosina alanina leucina fenilalanina serina valina triptofano metionina asparagina ácido aspártico glicina ácido glutâmico histidina 1 número e seqüência de aminoácidos na cadeia polimérica. 20-23 % de O. dele deriva todo o arranjo espacial da molécula Varia em 3 aspectos: número. Diferem com o tipo. PROTEÍNAS ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS ESTRUTURA PRIMÁRIA Seqüência linear de aminoácidos Nível estrutural mais importante. Apresentam 50-55% de C. 0-4 % de S. seqüência e natureza dos AA 10 PROTEÍNAS PROTEÍNAS ESTRUTURA TERCIÁRIA ESTRUTURA SECUNDÁRIA Disposição espacial adotada pela cadeia polipeptídica Estrutura helicoidal (α α-hélice) – interações H intra-moleculares Estrutura foliar (folhas pregueadas) – interações H inter-moleculares Organização tridimensional da cadeia polipeptídica contendo ou não zonas de estrutura secundária definidas Estabilização: 11 Ligações dissulfeto (Cys + Cys = cistina) interações de hidrogênio Interações eletrostáticas Interações dipolares Interações hidrofóbicas Forças de Van der Waals Grupos hidrofóbicos dispostos no interior da molécula 12 2 . Vinte tipos de aminoácidos ocorrem naturalmente nas proteínas.23/10/2012 PROTEÍNAS PROTEÍNAS São polímeros de aminoácidos. 8 14 14--18 % de N. 6-8% de H. conformação molecular tridimensional. força iônica. VB.e.. celíacos.A. emulsionantes. não tóxicas e palatáveis.23/10/2012 PROTEÍNAS PROTEÍNAS NO ALIMENTO ESTRUTURA QUATERNÁRIA Resultado de associações não covalentes de unidades protéicas iguais ou diferentes Estas subunidades se mantém unidas por forças covalentes. Têm diferentes estruturas moleculares. Aminoácidos essenciais (lisina. leucina.A. Depende: pH. p. conformação. Fonte de aminoácidos na dieta e de energia. textura ou estabilidade desejáveis ao alimentos. sua capacidade de atribuir obtenção. metionina. presença de outros constituintes Solubilidade Depende: PM. NPU. etc. por exemplo. ovos. Componentes naturais. Proteínas alimentares são digeríveis. como pontes de hidrogênio. interações hidrofóbicas. fenilcetunúricos.R. produto: agentes gelificantes. etc. D). Propriedades funcionais Propriedades nutricionais Aminoácidos essenciais e não essenciais Combinações entre proteínas Avaliação da qualidade nutricional: métodos químicos. métodos microbiológicos Capacidade espumante Formação de massa C. preparação e armazenamento dos aparência. castanhas. e C. textura. tenderness de produtos de carne e peixe. temperatura 3 . PROTEÍNAS Responsáveis PROTEÍNAS por compostos aromáticos e Isoladas são usadas nos alimentos como substâncias coloridas formadas por reações ingredientes térmicas durante funcionais. temperatura. atributos nutricionais e propriedades físico- 13 químicas. concentração. ou enzimáticas ocorridas devidos a suas propriedades espumantes e espessantes. e ligações não covalentes. triptofano.. estruturais de muitos alimentos freqüentemente determinam sua Alergias e intolerâncias – proteínas de leite.A. métodos biológicos (PER. isoleucina e valina) não podem ser sintetizados pelo organismo humano. como pontes dissulfeto. força iônica. 55. O método Kjeldahl é dividido em três etapas: digestão.25%. destilação e titulação titulação. Fator geral (F) na transformação de nitrogênio para proteínas é de 6. existem outros fatores de conversão.6.é padrão e largamente usado. gelatina.38.Kjeldahl IMPORTÂNCIA Conhecer o valor nutritivo da composição centesimal de um alimento e análise para rotulagem Estimar rendimento industrial Avaliar a qualidade (ex. 4 . Considera que as proteínas têm. Não mede proteínas diretamente.23/10/2012 Viscosidade Depende: características intrínsecas.25 (equivalente a 0.5. F = 6. ativação por prótons B. Tem alta precisão e boa reprodutibilidade. quantidade e tipo de proteína. Métodos químicos e físicos Reação do Biureto ** Interação proteína-corante (Dye-binding) ** Método do Reagente de Folin-Ciocalteau ou Método do fenol reagente ** Titulação com formol Espectroscopia no IV ou no UV ** Refratometria Turbidimetria ** Espectroscopia eletrônica Polarografia Proteínas . tamanho da partícula de gordura.70. leite.. É o principal método para determinação de proteínas em alimentos . viscosidade MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO A. %Proteinas = F x %N Fatores de conversão específicos: trigo-5. KJELDAHL Desenvolvido em 1883 por Johann Kjeldahl. pH. Necessita de um fator de conversão (F) para converter a medida de N para proteínas. Métodos que utilizam a determinação de Nitrogênio: Kjeldahl ** Dumas ** Destilação direta Métodos que utilizam técnicas nucleares: ativação por nêutrons. A quantidade de proteínas presentes é calculada a partir da concentração de N no alimento. 16% de nitrogênio.: glúten ⇒ qualidade da farinha) Avaliar a influência nas propriedades sensoriais Determinação Análise de nitrogênio É a determinação mais utilizada. interações protprot. em média. interações prot-dissolvente MÉTODOS FISICO-QUÍMICOS DE DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS Gelificação Depende: interações prot-prot Texturização: coagulação térmica formação de fibras extrusão termoplástica Emulsificação Depende: temperatura.16gN/ g proteína) é usado para muitas aplicações. kjeldahl.protéico e não protéico (purinas. vitaminas. DIGESTOR H2BO3. Diferentes proteínas necessitam de diferentes fatores de correção pois tem diferentes seqüências de aminoácidos 5. e a matéria orgânica em C02 e H20.23/10/2012 MÉTODO KJELDAHL MÉTODO KJELDAHL 1a etapa: Digestão 2a etapa: Neutralização e DESTILAÇÃO O alimento é colocado no frasco de digestão e então digerido pelo aquecimento na presença de ácido sulfúrico (um agente oxidante que digere alimentos). e um catalisador (cobre. aminas. exatidão). Necessita ∆ NH3 com H3BO3 e titulatitula-se com de curva de calibração. amidas. selênio. Desvantagem: utiliza substâncias corrosivas/muito oxidantes DESTILAÇÃO DIRETA Modificação Sem do método de kjeldahl. dosa todo N .(íon borato borato)) (3) DESTILADOR MÉTODO KJELDAHL NaOH 3a etapa: Titulação O conteúdo de N é estimado por titulação do borato de amônio com ácido sulfúrico ou clorídrico. piridinas. Amostra + NaOH/Na NaOH/Na2SO4 MisturaMistura-se ácido. Pode melhorar a técnica precipitando a proteína e separando com lavagem (retira o N não protéico). F dá erros quando o conteúdo em N é muito diferente de 16%. que converte o sulfato de amônio em gás amônia: (NH4)2SO4 + 2 NaOH → 2NH3 + 2H2O + Na2SO4 (2) A digestão converte o N do alimento (ou outro na forma de nitratos ou nitritos) em amônio. etc. no entanto pode carregar peptídeos e aminoácidos. Depois da digestão o frasco de digestão é conectado no destilador de nitrogênio. O gás amônia não é liberado numa solução ácida porque a amônia está na forma de íon (NH4+) que se liga ao íon sulfato (SO42-) e assim permanece na solução: A amônia formada é liberada da solução. calibração. titânio ou mercúrio). Água de arraste Amostra Erlenmeyer com solução de H3BO3 O conteúdo de N é então convertido em proteínas usando um fator apropriado: %Protein = F x %N Falhas do processo (Kjeldahl): 1. Adiciona-se hidróxido de sódio. É usado como rotina em alguns alimentos. mas. 5 . Por destilação por arraste a vapor a NH3 é transferida do frasco de digestão para um erlenmeyer contendo ácido bórico em excesso. digestão. uréia.+ H+ → H3BO3 (4) A concentração dos íons H+ gastos na titulação equivalem à concentração do nitrogênio. digestão. CHON (alimento) (NH4)2SO4 + C02(g) + H20 (g) (1) NH3 + H3BO3 → NH4+ + H2BO3. 3. Não é uma medida ‘verdadeira’ de proteínas. ácido. produtos crus (no qual o tempo é mais importante que a exatidão).). ferricianeto de potássio. e que não contenham substâncias que absorvam no mesmo comprimento de onda que as proteínas. ác. o grau de turbidez. 1914) MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS UV E VISÍVEL Desvantagens: é necessário que as proteínas estejam diluídas em soluções transparentes. interferentes. Preparação Princípio de alimentos exigem muitas etapas: homogeneização.mais rápido. Teste do Biureto (Riegler. Também determina N total. extração por solventes. padrões. Determina proteínas. .melhora precisão. N2 pode ser medido quando passa através de uma coluna que tem um detector de condutividade térmica no final. turbidez. MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS TURBIMÉTRICO Fundamento: Fundamento: medida da turbidez causada pela proteína precipitada. depende da proteína. Absorbância depende do tipo de proteína. proteína. Equipamento . p/sólidos. 36 6 . que podem consumir muito tempo e trabalho. filtração. - Sais de Cu+2 em soluções alcalinas produzem cor violeta ou roxa quando interagem com ligações peptídicas. ácido Sulfosalicílico. comparado com 4-6 horas para Kjeldahl. uns 4-10 minutos por medida. A concentração de proteínas é determinada a partir da curva de calibração. líquidas).F. grupos aromáticos.tricloroacético. Precipitante + proteína → turbidez MedeMede-se Rápido.23/10/2012 MÉTODO DUMAS (1831) MÉTODO DUMAS Necessário converter o teor de N na amostra para teor de proteínas . Problemas: sujeita à erros → pequena qtde de amostra – amostra pode ser não representativa. Medida feita em um Colorímetro ou espectrofotômetro. precipitação de interferentes. precipitantes: precipitantes: ác. As principais diferenças entre os testes são os grupos químicos responsáveis pela absorção da radiação. centrifugação. H2O e N2. Agentes precipitada. Desvantagens: Desvantagens: não é usado p/sólidos. Combustão da amostra (700º-800ºC) Medição do N gasoso O N2 liberado é analisado volumetricamente ou por técnica instrumental. Princípio: Combustão a 700-900°C – produz CO 2. grupos básicos proteínas agregadas. Faz-se a reação e após uns 15-20 minutos lê-se a absorbância a 540 nm. proteínas. simples (proteínas líquidas). exemplo: ligações peptídicas. Sulfosalicílico. -- não necessita de reagentes ou catalisador. As curvas de calibração de absorbância (ou turbidez) versus concentração proteínas é preparada usando uma série de soluções de concentração conhecida. depende de padrões. preto búfalo e preto amino 10B. vermelho A. Reação das proteínas com reagente de fenol Folin-Ciocalteau e reagente de Biureto (Cu+2 em condições alcalinas). Cor C. Mede-se o excesso colorimetricamente. Separação (centrifugação ou filtração) Mede o excesso de corante que não reagiu simples.depende da composição dos aminoácidos. SO3H.com aparecimento de uma coloração azul.23/10/2012 B. Corante DYEDYE-BINDING que reagem quantitativamente com Fundamento: histidina e arginina reagem com + proteína → complexo insolúvel. Métodos Espectofotométricos UV B. Pouco exato .proteínas possuem absorção UV em 280nm (aminoácidos aromáticos: tirosina. Teste do Fenol (FollinFollin-CiocalteauCiocalteau-Lowry) Lowry) Princípio Desvantagens: É lento: operações múltiplas e período de incubação Necessita . de uma curva padrão com proteína conhecida Intensidade da cor depende de cada proteína. laranja 12. Desvantagens: Aquisição do equipamento Por diferença obtémse a quantidade de proteína 7 . não usa reagentes e não destrutivo. exato. Oxidação de aminoácidos aromáticos tirosina e triptofano . fenilalanina. Boa correlação com o Kjeldahl. Lisina. A de Amostra + corante (exc. Rápido. triptofano. Corantes: nucléicos podem interferir.) Formação de um complexo insolúvel corante quantidade de proteína : Corante ligado = corante inicial – corante livre. azul azul → colorímetro (500 a 750 nm) → curva padrão. simples. Ácidos Método DyeDye-binding Corantes proteínas. Teste do Fenol (Follin (FollinFollin-CiocalteauCiocalteau-Lowry) Lowry) Cor formada depende de cada proteína e a intensidade é proporcional à quantidade. Rápido. econômico. Laranja G. .23/10/2012 SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS Solubilidade Determinar a composição de aminoácidos nas proteínas.carga. Cromatografias 45 46 8 . separam os aminoácidos troca iônica.adsorção. afinidade ou por absorção. A . . Cromatografia: proteína é hidrolisada usando um ácido forte ou enzimas libera aminoácidos.tamanho.