UNIVERSIDAD ESTATAL AMAZÓNICAESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL CIENCIAS DE LA VIDA ANALISIS INSTRUMENTAL PRACTICA N°4 Tema: LISIS CUANTITATIVO DE CAFEINA EN MATERIAL VEGETAL SECO DE LA PLANTA ILEX GUAYUS, MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA ULTRAVIOLETA DIRECTA Integrantes: Ante Blanca Lorena Bravo Gualinga Víctor Ortiz Natali Sánchez María Docente MSc. Rubén Darío Ledesma Fecha 01/12/2017 Puyo – Ecuador -2017 La espectrofotometría UV-Vis se ha empelado ampliamente en el análisis de muestras biológicas o ambientales.líquido con cloroformo.0 g/100 mL (80 °C). OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL: Ejercitar la metodología analítica para la cuantificación de cafeína por espectrofotometría ultravioleta directa OBJETIVOS ESPECIFICOS: Determinar la longitud de onda máxima absorción de la disolución patrón. Calcular la concentración de cafeína presente en la muestra de guayusa. 67. longitud de onda (λ) y permite encontrar la longitud de onda de máxima absorción. Su solubilidad en agua se incrementa notablemente por la temperatura: 2. 18. Con base en que la Absorbancia guarda una relación lineal con la concentración. es decir. se comprende la existencia de una relación de proporcionalidad entre ambas.6-dione) es un alcaloide del grupo de las xantinas. UNIVERSIDAD ESTATAL AMAZÓNICA ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL CIENCIAS DE LA VIDA ANALISIS INSTRUMENTAL INTRODUCCION La espectrofotometría UV-Vis es un método óptico de análisis basado en la absorción molecular. La cafeína (1.0 g/100 ml (100 °C). manipulando la disociación de la cafeína (base débil) por medio de la adición de ácidos y bases. lo cual permite la cuantificación de analitos. promover un electrón desde un orbital de baja energía a uno vacante de alta energía. es por eso que es factible emplear la decocción con agua caliente como método idóneo de extracción desde las muestras ambientales que la contienen. .7-Trimethylpurine-2.19 g/mol. levemente disociativa y estimulante por su acción antagonista no selectiva de los receptores de adenosina. En el espectro UV-Vis se registra Absorbancia (A) vs.3. Para la eliminación posterior de interferencias se emplea la extracción líquido . Su fórmula global es: C8H10N4O2 y su masa molar: 194. La Ley de Bouguer-Lambert-Beer: A = ε c l. expresa matemáticamente la relación directa y lineal entre la absorbancia y la absortividad molar.17 g/100 mL (25 °C). que actúa como una droga psicoactiva. la concentración y el camino óptico. El compuesto a analizar se irradia con luz de energía suficiente como para provocar transiciones electrónicas. Típicamente. al parecer. para una extracción Soxhlet se requiere solamente donde el compuesto deseado tiene solamente una solubilidad limitada en un solvente. ya que la técnica se basa en la extracción de grasas de una muestra. a través de un solvente afín. Pastaza. El aparato de Soxhlet fue creado por el químico alemán Franz Von Soxhlet en 1879. UNIVERSIDAD ESTATAL AMAZÓNICA ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL CIENCIAS DE LA VIDA ANALISIS INSTRUMENTAL MARCO TEORICO: Ilex guayusa: Es un árbol nativo de la Amazonía occidental. (Cuello. 2004). ya sea en operaciones rutinarias (pipetas graduadas) o en aquellas que se necesite precisión científica (pipetas volumétricas). La Ley de Beer-Lambert estipula que la absorbancia de una solución es directamente proporcional de la concentración de la solución. Están destinadas a medir líquidos. pero está presente también en las provincias de Sucumbíos. Sus hojas contienen altas concentraciones de cafeína y antioxidantes (flavonoides). saponinas. prende y crece mejor. Estas últimas poseen un bulbo y se usan para transferir un volumen definido de líquido (L. Morona Santiago y Zamora Chinchipe. 2013) Balanza Técnica: Es utilizado para realizar las mediciones donde se utilizan patrones de masa cuyo grado de exactitud depende de la precisión del instrumento. 2003) Extractor Soxhlet: Es un material de vidrio que se utiliza para la extracción de compuestos contenidos en un sólido. Orellana. Se aprecia que la guayusa se cultiva y crece bien especialmente en el pie de monte Amazónico desde el sur de Colombia hasta el norte de Perú. en la alta Amazonía ecuatoriana. 2011). Espectrofotómetro UV-Visible Es utilizada generalmente en la valoración cuantitativa de soluciones de iones metálicos de transición y compuestos orgánicos. (Zamora. 2016). pero a diferencia de una báscula o un dinamómetro. Su cultivo es tradicional y se remonta a siglos atrás y pertenece a la tradición agro-silvícola del pueblo Kichwa amazónico del Ecuador. Al igual que en una romana. ambos absorben la luz. Sobre todo se encuentra en la provincia de Napo. El método es aplicable en muestras de alimentos en general. los resultados de las mediciones no varían con la magnitud de la gravedad (Torres. Pipetas: Son recipientes tubulares de vidrio o de plástico. en especial en la provincia de Napo. por lo que la espectrofotometría UV-Visible puede usarse para determinar la concentración de la solución (Universidad de Granada. Pero una ventaja comparativa importante es que la guayusa está presente y. . ya que la estructura del matraz evita perdidas de la sustancia o solución contenida (agitación o evaporación). es un compuesto químico de formula NaOH. la cual posee una estructura cónica en la zona del medio y en la zona superior se aprecia una boca con cuello estrecho. Las cubetas de flujo permiten que la disolucion circule continuamente a travez de la cubeta. Cuando se habla de Matraz Erlenmeyer. Agua Destilada: El agua destilada es un protóxido de hidrógeno. (Dìaz. Hidróxido de Sodio: También conocido como lejía. Laboratorio quimico. agua potable. la soda cáustica es ampliamente utilizada en muchas industrias. Formando una solución fuertemente alcalina cuando se disuelve en un disolvente tal como agua. 2007) Espectofotometria de luz ultravioleta. (Harris. en estado líquido y de vapor.Son especialmente utiles para medir la absorvancia de una disolucion que sale de una columna cromotografica. 2009). 2008). Este tipo de agua se utiliza para disoluciones y experimentos (Duran. Es más seguro que un vaso de precipitado. UNIVERSIDAD ESTATAL AMAZÓNICA ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL CIENCIAS DE LA VIDA ANALISIS INSTRUMENTAL Celda de vidrio para lectura: Las Celdas o Cubetas para Espectrofotómetro son recipientes de plástico. 1990) . soda cáustica o sosa cáustica. textiles. la elección del material de fabricación es importante dependiendo del método espectrométrico que se utilice y la naturaleza de la muestra (Anonimo. Matraz: Frasco con Base redonda. La fórmula del agua destilada es H2O pura. Se puede tapar fácilmente utilizando algodón o tapa (Anonimo. es decir no contiene cloro ni otras sales. además. vidrio o cuarzo que se utiliza para realizar lecturas espectrofotométricas a líquidos. 2011) Celdas o cubetas de cuarzo. y otras sustancias que están presentes en el agua corriente que sale del caño.La espetrofotometria ultravileta-visible supera al resto de metodos opticos de analisis en lo referente al analisis cuantitativo y es tambien una tecnica auxiliar. se está hablando de un matraz graduado que contiene marcas que indican un determinado volumen. magnesio. Se encuentran en distintas capacidades. y al ser destilada mantiene su fórmula. Es ideal para agitar soluciones. Lo que tiene en especial es que se le ha quitado el calcio. sobre todo como base química fuerte en la fabricación de pulpa y papel. 2014). jabones y detergentes. es decir H2O. (Olsen. Para que una Celda o Cubeta para Espectrofotómetro funcione adecuadamente requiere estar completamente limpia y sin ralladuras. La espectrofotometria de absorcion ultravioleta-visible fue uno de los primeros metodos fisicos que se aplico al analisis cuantitativo y a la determinacion de estructuras. Dibujar el espectro en una hoja de Excel y determinar la longitud de onda de máxima absorción. .Calcular la concentración de cafeína en la muestra por el método del patrón externo. . transferir a un matraz aforado de 100 mL y enrasar con agua destilada. UNIVERSIDAD ESTATAL AMAZÓNICA ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL CIENCIAS DE LA VIDA ANALISIS INSTRUMENTAL MATERIALES: EQUIPOS E MATERIALES MUESTRAS REACTIVOS Y INSTRUMENTOS DISOLVENTES -Balanzas -Pipetas graduadas -Hojas secas de Ilex -Ácido clorhídrico . .Pesar 0. tomar 5 mL y colocar en un matraz aforado de 25 mL.Realizar un espectro en el intervalo 250 – 300 nm realizando mediciones de absorbancia cada 5 nm contra un blanco.3 g de la muestra de hojas secas de guayusa. .Dejar enfriar y alcalinizar con NaOH 0. . . añadir 1mL de HCl 0. . .Dejar enfriar.CHCl3 -Vaso de precipitación -Papel filtro -Probetas graduadas PROCEDIMIENTO: Preparación de la disolución estándar (patrón) de cafeína y registro del espectro.HCl 0.01 M y enrasar con agua destilada.NaOH 1 -Soxhlet filtración M . . .Evaporar el cloroformo hasta sequedad en baño de María y redisolver la cafeína añadiéndole 50 mL de agua destilada caliente (60ºC – 90ºC). .Extraer en embudo separador con dos porciones de cloroformo de 15 mL cada una y reunir los extractos clorofórmicos.1 M (20 gotas).Leer la absorbancia de la muestra problema a la longitud de onda se máxima absorción determinada a través de su espectro.Filtrar en caliente. Procesamiento y análisis de la muestra. añadir 1 mL de HCl 0.01 -Planchas de calentamiento -Equipo de reflujo guayusa M -Espectrofotómetro UV-Vis -Embudos de -Hidróxido de sodio . . .Reflujar con 100 mL de agua destilada por 15 minutos. . transferir a un matraz aforado de 25 mL.Tomar 1 mL de disolución madre de cafeína de 1000 mg/L.Matraz Erlenmeyer -Cloroformo .De la disolución anterior.01 M y enrasar con agua destilada. 763 1.056 1.689 255 0.800 265 1.973 280 1.22 0.064 Longitud de Onda Máxima: LONGITUD DE ABSORBANCIA ABSORBANCIA (PATRON) ABSORBANCIA (PATRON) ONDA (PATRON) 2500 2.5 270 2.064 0 0 2500 255 260 265 270 275 280 285 0 0290 0295 300 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300 En este gráfico podemos observar que la máxima longitud de onda es de 275 ya que en esta longitud encontramos absorbancia del patrón de 2.763 1.973 260 1.800 285 1. • Cálculos para encontrar la Concentración de la muestra (C2) (Ilex guayusa): 𝑪𝑴 𝑪𝑷 𝐶𝑃∗𝐴𝑀 = 𝑨𝑷 𝐶𝑀 = 𝑨𝑴 𝐴𝑃 𝑚𝑔 𝐶𝑃∗𝐴𝑀 40 𝐿 ∗0.763 1.CALCULOS Y RESULTADOS Datos Recolectados: LONGITUD DE ABSORBANCIA ABSORVANCIA ONDA (PATRON) (MUESTRA) 250 0.3341.310 𝐶𝑀 = = 𝐶𝑀 = = 𝑪𝑴 = 𝟔.8 285 1.334 2.228 290 0.064 295 0.013 1.973 2000 2 2.649 500 290 0.5 0.8 1500 1.013 275 2.056 0.689 255 0.013 2.228 1.310 280 1.334 265 1.649 0.228 1 1000 0.5 250 0.228 0.056 260 1.220 300 0.689 0.649 295 0.22 0 300 0.763 270 2.056.056 .334 275 2.056 1. 𝟎𝟑𝒎𝒈/𝑳 𝐴𝑃 2.0132. 02 𝑚𝑔∗1000 𝑔 100ml 3. 𝐶2∗𝑉2 C1*V1= C2*V2 𝐶1 = 𝑉1 𝑚𝑔 𝐶2∗𝑉2 6.066.15 mg/L 𝑉1 5𝑚𝑙 30.07 g/Kg (Ppm) 1000 Los resultados obtenidos nos quieren dar entender que la concentración de cafeína en material vegetal seco de la planta Ilex guayusa es de 10.02mg 1000𝑚𝑙 X 100ml 3.3 𝑔 10.67 mg 0.07g/kg(Ppm) .3 g 𝑋= = X = 10.03 𝐿 (25𝑚𝑙) 𝐶1 = = 𝐶1 = C1 = 30.02 mg 0.066.15mg 1000ml 𝑋= = X= 3. UNIVERSIDAD ESTATAL AMAZÓNICA ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL CIENCIAS DE LA VIDA ANALISIS INSTRUMENTAL • Cálculos para encontrar la Concentración de cafeína en la muestra (Ilez guayusa) (C1) por medio de la ley de VOLUMETRIA.15mg ∗ 100ml 30.67 X 1000 g 𝑋= = X = 10. por lo tanto estas son más efectiva en la medición de absorbancia. ( Lorena Bravo) ✓ Después de obtener las absorbancias con distintas longitudes de onda solicitadas se observó que a los 300nm se obtuvo la menor absorbancia con un valor de 0. ✓ Se recomienda tener cuidado con el manejo de los reactivos como el cloroformo. ✓ El valor de la absorbancia de la muestra se obtiene con la mayor longitud de onda obtenida en la medición de espectrofotometría del patrón. ✓ Al leer la absorbancia de la muestra problema con una longitud de onda de 275nm nos dio un absorbancia de 0.064. ✓ Se tiene que seguir correctamente el procedimiento para obtener unos datos y resultados verídicos (Lorena Bravo).056.07mg/L de concentración de cafeína en una muestra de 0. . ✓ Se debe ser cuidadoso con la cristalería ya que es muy frágil y se puede quebrar (María Sánchez). OBSERVACIONES: ✓ Para obtener el valor de la absorbancia de la muestra por medio de espectrofotometría ultravioleta directa se debe trabajar con el pico de longitud de onda obtenido en la absorbancia del patrón. ✓ Los equipos de trabajo deberían ser equitativos en integrantes para que. nos dio un pico de absorbancia de 2. (Blanca Ante) ✓ Al medir las absorbancias entre 250-300nm con intervalos de 5nm se obtuvo un pico de mayor absorbancia con la longitud de onda 275nm.( María Sánchez) ✓ Después de colocar y agitar el extracto de guayusa y el cloroformo se logró extraer la cafeína presente en la Ilex guayusa. UNIVERSIDAD ESTATAL AMAZÓNICA ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL CIENCIAS DE LA VIDA ANALISIS INSTRUMENTAL CONCLUSIONES: ✓ Determinamos por el método de patrón externo un 10. al momento de realizar la práctica. (Natali Ortiz) ✓ Al añadir el cloroformo al extracto de guayusa y agitar el embudo separador suavemente se dio la formación de aire acumulado y tuvimos que abrir la llave del embudo para liberarlos. ácido clorhídrico y el hidróxido de sodio ya que son corrosivos (Blanca Ante). (Lorena Bravo Rengel).310. todos aprendamos de una manera efectiva (Natali Ortiz).( Víctor Gualinga) RECOMENDACIONES ✓ Es importante profundizar el conocimiento de los métodos de cuantificación ya que nos permiten ser más presos en los resultados de las próximas prácticas de laboratorio (Víctor Gualinga).(Blanca Ante) ✓ En el espectrofotómetro de ultravioleta directa utilizamos celdas de cuarzo ya que son transparentes y no absorben radiaciones innecesarias. (Victor Felipe Gualinga Santi).3g de Ilex Guayusa como material vegetal seco. (Natali Ortiz). ✓ Al realizar las mediciones con las distintas longitudes de onda entre 250-300nm. (María Jasmine Sánchez). (2004). Analisis quimico cuantitativo. Equipo Soxhlet.pdf Universidad de Granada. G. P.lifeder. (1990). INSTRUMENTACIÓN PARA ESPECTROSCOPIA. (2011). Obtenido de file:///C:/Users/NOEMI/Downloads/lectura3%20(1). Obtenido de https://www. Metodos opticos de analisis . R. (2008).ugr.com. (2003).iica.A. D. UNIVERSIDAD ESTATAL AMAZÓNICA ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL CIENCIAS DE LA VIDA ANALISIS INSTRUMENTAL BIBLIOGRAFÍA Cuello.pdf Harris.A. D. Lifeder. c. mexico: revertè S. Olsen. E. L. (05 de 2013). (2007).htm Dìaz.es/~quiored/espec/uv. Química Orgánica.int/docs/B3414e/B3414e. Obtenido de http://rosagerlam.blogspot. España: revertè S. Obtenido de http://www. Anónimo. C.com/ . Obtenido de http://repiica.com/hidroxido- de-sodio/ Zamora. embudo. pinzas de laboratorio. Embudo separador vaso precipitado. matraces aforados. UNIVERSIDAD ESTATAL AMAZÓNICA ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL CIENCIAS DE LA VIDA ANALISIS INSTRUMENTAL Anexos pesando la muestra de hojas colocando 0. HCl Disolución patrón. . Reactivos: NaOH. pipetas. Espátula.3g de guayusa reflujar por extractor soxhlet secas de guayusa en el balón volumétrico Filtrando en caliente después de reflujar Cristalería: probetas. UNIVERSIDAD ESTATAL AMAZÓNICA ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL CIENCIAS DE LA VIDA ANALISIS INSTRUMENTAL Colocando 20 gotas de NaOH Midiendo cloroformo Agregando cloroformo al extractor Extrayendo el cloroformo de guayusa en el embudo separador Evaporándose el cloroformo Se toma 5mL de la disolución que se Ingresando la longitud de onda en el Con baño María prepara para redisolver la cafeína espectrofotómetro de ultravioleta al agregar agua caliente (50mL) .