Boletín Científico Vol.1 N_2

UNIVERSIDAD RICARDOPALMA Laboratorio de Microbiología Volumen 1, Nº1 Diciembre, 2014 Boletín Científico http://www.urp.edu.pe/biologia/index.php?urp=Laboratorios Página 1 Laboratorio de Microbiología Volumen 1, n°2 Boletín Científico Decano Dr. Tomás Agurto Saenz Director Blgo. Alcides Guerra Santa Cruz Editor General Santiago Justo Arévalo Editor de Estilo Paola Nunja Huamán Editor Científico Marlon Morales Moisela Comité Editor Tania Churasacari Vinces Cindy Cajachagua Pucuhuaranga Diego Santiago Bravo Carla Saldaña Serrano Luis Pabón Rodríguez Miguel Gonzáles Olivos Mario Aguayo Cerna Pavel Pastrana Sumari Miguel Morales Campos Claudia Monge Pimentel Miguel Montero Orozco Roma Ballena Palomino 1° ed., 1° impresión, diciembre 2014 Hecho el Deposito Legal en la Biblioteca Nacional del Perú N° 2014-19353 Editado por: Santiago Justo Arévalo Av. Malecon Asent. H. Nuevo Luriin Mz. A5 Lt. 01, Lurin—Lima Impreso en: Impreso en la Universidad Ricardo Palma, Av. Benavides 5440, Santiago de Surco Diciembre, 2013 Página 2 Laboratorio de Microbiología Volumen 1, n°2 Contenido Editorial Presentación…………………………………………………………………….03 Editorial……...…………………………………………….……………………04 Actividades del Laboratorio Difusión y Exposición de Trabajos de Investigación URP presente en el IV CONCIMAR ...…………………………….….…..05 Encuentro Científico de invierno internacional 2014 (ECI) ...……………..05 Curso-Taller de Redacción Científica ……......…….….……………………….....06 Ciclo de conferencias: Inmunidad y Cáncer.………………..…………….……....07 Proyección Social con alumnos del Colegio EUROAMERICANO….…..….....…08 Reunión de Integración con los Padres de Familia...…...…………...………….....09 Primera capacitación de Interciclo-2014 ...………………………………….…....10 Integrantes Demuestran lo Aprendido en Importantes Laboratorios.…………....11 Visita de estudios a Petramás: Empresa 100% Peruana….….…………….…..….12 Artículos de Divulgación Virus contra Bacterias………………... ...………………………………….…....13 Proteínas Recombinantes…………….. ...………………………………….…....14 Artículos de Investigación Actividad antimicrobiana del extracto acetona-agua de Macrocystis pyrifera (C. Agardh 1820) en bacterias de importancia clínica ………………………...…….15 Determinación de Géneros Bacterianos en el Mar de la Playa Cantolao - La Punta Callao …………………………………………………………………………...20 Efecto antibiótico de Piocianina de Pseudomonas aureginosa sobre Escherichia coli y Staphylococcus aureus …………….……..………...…………………………….......24 MiniReview Aspectos generales de la crianza de Cuy y su agente infeccioso: Salmonella……....28 Fundamentos básicos de PCR convencional y sus variantes..……………….…....34 Integración de la Biotecnología Bacteriana y la Ingeniería Genética de Plantas......43 Página 3 Laboratorio de Microbiología Volumen 1, n°2 Editorial Presentación Les presentamos el segundo número del Boletín Científico del Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Ricardo Palma. En esta nueva edición tenemos el placer de informarles acerca de las actividades realizadas en el presente año, donde se incluyen cursos, capacitaciones, artículos de divulgación, trabajos de investigación y artículos de revisión; todo esto realizado por integrantes del laboratorio con el único deseo de hacer la mejor ciencia posible. Actualmente, la intedisciplinariedad de la ciencia hace necesario que trabajemos en conjunto con otras áreas, es por esto que el divulgar e informar sobre las actividades que se realicen en un determinado lugar no solo sirve para dar a conocer las labores de un equipo, sino pretende además ampliar horizontes a través de la formación de nuevos nexos con otras instituciones y equipos para así mejorar e integrar los conocimientos adquiridos; así, si cada uno aporta de un punto de vista diferente, los logros se hacen más completos y útiles. Les reiteramos nuestros saludos y les deseamos mucho éxito en todas las áreas que se desempeñen y trabajos que realicen, recuerden que todo esfuerzo tiene su recompensa. Equipo de Investigación del Laboratorio de Microbiología En los ciclos biológicos intervienen las bacterias y en la cadena alimenticia son las iniciadoras de los procesos metabólicos. guardan por ser maestros en dar acción a los microorganismo con sendos trabajos de investigación ya al paso de crear el curso y la especialización en genética bacteriana. el éxito depende de ustedes. así como mediante pruebas bioquímicas y moleculares se puede determinar su composición química y su metabolismo. activo. conservados. los alimentos. en animales y plantas. en las que se explora sus actividades metabólicas para transformar y elaborar una serie de productos que se industrializan. aire. en el suelo. coloración. se puede decir que los microrganismos son los verdaderos responsables para que la vida exista y este en desarrollo continuo y aquí en el laboratorio de microbiología un grupo entusiasta. Tomás Agurto Sáenz . los antibióticos que ocupan un alto lugar en producción industrial.Página 4 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. se mira cara a cara a las colonias crecidas en una placa Petri y bajo el microscopio se puede definir su forma. agua. cada vez más transformados. hongos. logrando una mejor identificación de bacterias. y virus que pueblan el mundo. para que sean idóneos e inocuos. n°2 Editorial El Microbiólogo Dr. Robert Koch. así. postulaba que una infección es producida por un agente a quien hay que encontrarlo y este agente debe reproducir el mismo mal al ser inoculado en un animal. Tomás Agurto Sáenz Decano de la Facultad de Ciencias Biológicas Profesor Principal en la Cátedra de Microbiología En un libro titulado “los cazadores de microbios” se relata de los trabajos de científicos que querrán saber y demostrar el porqué de las enfermedades del humano. Existen especies no patógenas. Dr. eso es lo que se hace ahora. Jóvenes sigan adelante. Marlon Morales Moisela en su exposición del tema: “Actividad antibacteriana del Extracto Acetona-Agua de Macrocystis pyrifera (C. además en toda nuestra universidad se expusieron trabajos de investigación relacionados a otras áreas de la ciencia. científica y empresarial nacional e internacional. Alcides Guerra. se llevó cabo el IV Congreso de Ciencias del Mar (IV CONCIMAR). el cual tuvo el principal objetivo de expandir y motivar los trabajos en el área de microbiología marina para sus aplicaciones ecológicas y biotecnológicas. realizado en el mes de Junio en la Universidad Peruana Cayetano Heredia. ENCUENTRO CIENTIFICO DE INVIERNO INTERNACIONAL 2014 (ECI) URP presente en el IV CONCIMAR Santiago Justo Arévalo y Luis David Pabón presentando el panel “Determinación de géneros bacterianos en el Mar de la Playa Cantolao” En este invierno 2014 la Facultad de Ciencias Biológicas tuvo el honor de ser la sede de la sesión de Biología del ECI 2014. estuvo dirigido a la comunidad académica. así como al sector pesquero y a sus representantes. Agardh 1820) en Bacterias de Importancia Clínica” En el año 2015 se realizará el ECI de Verano en las fechas 2 al 6 de Enero donde seguiremos participando con investigaciones que venimos realizando gracias al esfuerzo de todos los integrantes abocados a la ciencia en la Facultad de Ciencias Biológicas. “Extracción y Actividad Antimicrobiana del Pigmento Piocianina de 8 cepas de Pseudomonas aeruginosa” y “Actividad Antibacteriana del Extracto Acetona-Agua de Macrocystis pyrifera (C. Agardh 1820) en Bacterias de Importancia Clínica” La jornada se realizó con éxito con la presencia de estudiantes de varias universidades del país. . El equipo de investigación del Laboratorio de Microbiología se hizo presente con el tema Determinación de Géneros Bacterianos en el Mar de la Playa Cantolao – La Punta – Callao. Nuestro laboratorio manifestó su presencia a través de la presentación de 3 trabajos de investigación: “Determinación de Géneros Bacterianos en el Mar de la Playa Cantolao – La Punta – Callao”. n°2 Actividades Difusión y Exposición de Trabajos de Investigación Con la finalidad de difundir y discutir los resultados de las últimas investigaciones relacionadas a los diversos aspectos de las ciencias del Mar realizadas por investigadores y estudiantes universitarios en nuestro país. Esta se llevó a cabo en el auditorio Biotempo con la dirección del Prof.Página 5 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. Este importante evento. Cabe agregar que en el evento no sólo participaron estudiantes y profesionales de nuestra casa de estudios. Claudio Flores y Priscila Valdivieso. Afiche de Presentación del Curso-taller Cierre del curso Taller de Redacción . n°2 Actividades Curso-Taller de Redacción Científica El 30 de mayo. quienes expusieron y dieron importantes pautas sobre cómo redactar de manera ordenada y organizada un artículo de investigación científica. Universidad Nacional Agraria. contribuyendo en gran medida al desarrollo científico. cómo presentarlo a una revista para que evalúe su publicación. el proceso editorial para la evaluación de trabajos y cómo mejorar la calidad y contenidos de esta. Este evento se realizó con el fin de promover la publicación de artículos científicos en estudiantes y profesionales de nuestra facultad. además de dar a conocer aspectos generales para tomar en cuenta en la edición de una revista científica.Página 6 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. Universidad Nacional Federico Villareal y la Universidad Peruana Cayetano Heredia. el cual contó con la participación de ponentes de la Dirección Científica Académica de ONCOSALUD – AUNA: Joseph Pinto. sino también de otras universidades como la Universidad Nacional de Ingeniería. 6 y 13 de Junio del presente año se organizó el Curso-Taller de Redacción Científica. el ciclo de conferencias conto con la participación de destacados ponentes en el área tales como el Dr. el día 21 de Junio del 2014 en el Auditorio Ccori Wasi – URP. promover nuevas investigaciones. Dicho evento fue realizado con éxito gracias a la acción conjunta del Laboratorio de Microbiología – URP y la Dirección Científico Académica de ONCOSALUD – AUNA. Afiche de Presentación del Ciclo de Conferencias Cierre del Ciclo de Conferencias: Inmunidad y Cáncer . n°2 Actividades Ciclo de Conferencias: Inmunidad y Cáncer En los últimos años las ciencias biológicas se han desarrollado rápidamente. lo que ha permitido el estudio de mecanismos moleculares de defensa de nuestro sistema inmune frente a señales de advertencia de un mal funcionamiento celular. además de crear un foro de debate en aspectos relacionados a los avances en el tratamiento del cáncer. Alfredo Aguilar Cartagena y representando a nuestra casa de estudios el Blgo. Alcides Guerra Santa Cruz. El ciclo de conferencias “Inmunidad y Cáncer” tuvo como objetivos actualizar a los asistentes en las últimas investigaciones sobre la inmunidad del cáncer.Página 7 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. Para contribuir a la formación de los alumnos de esta institución.Página 8 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. Es así como se integran partes fundamentales de la educación y el progreso del país: Colegios y Universidades. realizando su trabajo de graduación del IB asesorado por el Prof. Alcides Guerra y los ayudantes de laboratorio. esta resaltante institución maneja un programa poco común en los centros educativos del país. lo que permite que sus alumnos egresen con un Diploma adicional que les permite postular universidades de alto prestigio internacional una vez terminados sus estudios secundarios. n°2 Actividades Proyección Social con los alumnos de Colegio EUROAMERICANO El Colegio Euroamericano es una escuela situada en el valle de Pachacámac. el IB o Bachillerato Internacional. ha capacitado a alumnos del último año del Bachillerato de Biología en técnicas experimentales básicas de la microbiología como Coloración Gram. la Universidad Ricardo Palma a través del Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Biológicas y como parte de su programa de Proyección Social. Además ha permitido que el alumno Rodrigo Alcorta del Bachillerato de Biología investigue el efecto antimicrobiano de plantas del Perú. ELISA y electroforesis. Alumnos del Colegio Euroamericano en la capacitación de técnicas experimentales básicas de microbiología Alumna Tania Churasacari capacitando alumnos del EUROAMERICANO . Jefe de Laboratorio. Tomás Agurto Sáenz. emitió una muy emotiva y sincera perorata. Jefe de nuestro nosotros y siempre estar ahí.Página 9 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. con su siempre jovial prosa. por ser nuestros guías. Agurto. Visita de los padres a las diferentes ambientes del Laboratorio de Microbiología Palabras del Decano a los padres . el Blgo. el Dr. El Laboratorio de Microbiología. para finalizar esta primera etapa de la reunión. en una muy amena asamblea donde los padres eran los invitados. enterándolos de todas nuestras etapa de nuestras vidas. Decano de la Facultad de Ciencias Biológicas. tomó la palabra el ayudante principal. Alcides Guerra. Santiago Justo. adentrándolos en el panorama de nuestra carrera y la No nos queda más que agradecer a nuestros padres. n°2 Actividades Reunión de Integración con los Padres de Familia también de los proyectos que tenemos en curso. Seguidamente los padres fueron guiados al laboratorio y vieron directamente el lugar de trabajo de sus hijos. Jefe del laboratorio e integrantes del mismo se reunieron con los padres de familia. luego tomó la por haberse dado un momento para compartir con palabra el Blgo. microbiología en la actualidad. actividades realizadas hasta el momento así como consejeros y amigos. Alcides Guerra. quien a nombre de los demás integrantes. apoyándonos en cada laboratorio. celebró en el interciclo 2014 una reunión en la que el Dr. La bienvenida fue en el Auditorio Biotempo y la dio entonces pudieron intercambiar impresiones. donde agradeció la asistencia de todos los presentes. ante esta situación se realizó una capacitación de un poco más de un mes dirigida a todas las personas que deseen compartir conocimientos con los ayudantes del laboratorio Microbiología. Pavel Pastrana. antibiograma. Me siento muy agradecido y cómodo en este ambiente. transformación bacteriana. enséñame y lo recuerdo. me ha ayudado bastante en los cursos que estoy actualmente llevando. ya que aparte de haber adquirido nuevos conocimientos en el área de la microbiología también me ayudó a ser más meticuloso con las técnicas empleadas en un laboratorio y ser más organizado en el día a día. uno de los participantes de la capacitación nos comenta que: “Participar en el interciclo.Página 10 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. además del espíritu científico que nos caracteriza. extracción de DNA bacteriano. del laboratorio de microbiología. La finalidad era que los asistentes se sientan involucrados e identificados como partícipes directos de cada tema desarrollado con la intención de motivarlos en el campo de la investigación. Por otro lado me siento muy contento de haber participado.” . que conozcan que en cada laboratorio “El aprendizaje es experiencia. involúcrame y lo aprendo” Benjamin Franklin de la facultad hay personas que les gusta la ciencia tanto como a ellos. pruebas bioquímicas. purificación de proteínas y electroforesis. y agradezco a los muchachos del laboratorio por permitirme llevar este curso con ellos y brindarme su conocimiento y su confianza. ha sido una muy buena experiencia tanto para mi vida profesional como personal. n°2 Actividades Primera Capacitación De Interciclo-2014 El Laboratorio de Microbiología de la Universidad Ricardo Palma conoce el entusiasmo y ganas de aprender que tenemos los alumnos de la Facultad de Ciencias Biológícas. pues lo aprendido y el material complementario. identificación molecular de una bacteria. todo lo demás es información” Albert Einstein “Dime y lo olvido. esta incluía clases teóricas. prácticas y discusión de papers en temas desde los básicos hasta los más actuales: medios de cultivo. el Laboratorio de Microbiología abre la puerta a sus integrantes en diferentes instituciones de prestigio a nivel nacional e internacional. Santiago podrá acompañar al equipo de investigación que se encuentra liderado por el Dr. le ha dado la capacidad de desenvolverse de manera activa y constante en el área y en las investigaciones científicas De esta manera. n°2 Actividades Integrantes Demuestran lo Aprendido en Importantes Laboratorios El laboratorio de Microbiología viene esforzándose por ampliar las barreras del conocimiento. quien terminó exitosamente su ciclo de prácticas en el Laboratorio Mixto Internacional (LMI) del Institut de Recherche pour le développement (IRD). enfermedades como Leishmania y Malaria.Página 11 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. y técnicas espectroscópicas como cristalografías. ya que el LMI trabaja en conjunto con químicos y farmacéuticos en busca de nuevas opciones para generar antibióticos. pues le permitió aportar con ideas claras sobre técnicas empleadas en pruebas de sensibilidad bacteriana y el mecanismo de acción de los antibióticos conocidos. y hasta contra el mismo cáncer. además tendrá la oportunidad de afianzar sus conocimientos en técnicas moleculares como clonación. Shaker Chuck Farah. un instituto de investigación francés que se encuentra asociado a la Universidad Peruana Cayetano Heredia que viene dedicándose a la investigación del aislamiento y fraccionamiento de productos naturales de planta nativas del Perú con el fin de probar la capacidad de estas contra bacterias. dicroísmo circular y microscopias. en el área de Bioquímica. Santiago opina que estar encargado del laboratorio de Microbiología. integrante veterano del Laboratorio de Microbiología. Santiago Justo exponiendo en Auditorio Biotempo Marlon Morales trabajando con extractos de Pseudomonas aeruginosa . Marlon expresó que su formación en el laboratorio de Microbiología le sirvió de base. ha conseguido la oportunidad de practicar en el Instituto de Química de la Universidad de Sao Paulo. Por su parte. secuenciamiento de ADN. además de formarse con un concepto de interdisciplinariedad en la ciencia. Durante seis meses. Santiago Justo. expresión y purificación de proteínas recombinantes. Es así que dos más de nuestros integrantes han obtenido la oportunidad de realizar prácticas en laboratorios de prestigio a nivel nacional e internacional. Uno de ellos es Marlon Morales. Alumnos en Planta procesadora de Petramás . La gran importancia que tiene esta planta generadora de energía eléctrica a partir de desechos. los integrantes del Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Biológicas realizamos una visita a la primera empresa 100% peruana. la captura del gas se dan en grandes pozos que están conectados a un gaseoducto que llevan el biogás a la Central Térmica. La planta trabaja con el modelo de Desarrollo Limpio de Residuos que consiste en la captura y combustión del biogás generado en el relleno. es que reduce la cantidad de emisiones de gases contaminantes al medio. provincia de Huarochirí. las cuales están destinadas a diferentes procesos en el tratamiento de residuos. la cual es una moderna estación automatizada de succión y quemado del gas conectada a una moderna central generadora de electricidad que finalmente se interconecta a redes que abastecerán de energía eléctrica a diferentes lugares de Lima. ya sea residuos sólidos orgánicos hasta residuos de alta peligrosidad. siendo esta una de las tres plantas procesadoras de residuos sólidos de la empresa Petramás ubicada en el distrito de San Antonio. Petramás gestiona uno de los mecanismos más limpios en el tratamiento de residuos sólidos contribuyendo a mitigar los efectos que el calentamiento global causa al Perú y a todo el mundo. La visita fue al Relleno Sanitario Huaycoloro. productora de energía eléctrica a partir de residuos.Página 12 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. n°2 Actividades Visita de Estudios a Petramás: Empresa 100% Peruana El día 14 de Julio del 2014. Durante el recorrido se observó grandes extensiones de terreno. Los siguientes años realizó los primeros estudios de empleo de fagos para tratar la disentería. n°2 Artículo de Divulgación Por Claudia Monge. Además dicha especificidad de los fagos es a su vez una desventaja frente a los antibióticos puesto que para combatir una infección de bacterias se necesita conocer la cepa específica mientras que con los antibióticos no es necesario este conocimiento por su amplio rango de ataque contra bacterias. La especificidad del ataque de los bacteriófagos constituye por un lado una ventaja para la fagoterapia frente a los antibióticos. donde la fagoterapia fue utilizada para combatir la disentería. Con el paso de los años debido a la aparición de los antibióticos las investigaciones en tratamientos de fagoterapia fueron dejadas de lado. Durante esa época los bacteriófagos o también llamados fagos fueron comercializados para combatir diversas infecciones.blogspot. ya que los fagos atacan directamente a una determinada cepa de bacterias. Figura 1. Representación gráfica de posicionamiento de un fago sobre la superficie bacteriana Fuente: http://bacteriasactuaciencia. Sin embargo. pueden introducir estos genes a las bacterias otorgándoles características no deseadas.html . a la cual los antibióticos no tienen alcance) Por último una gran desventaja de la fagoterapia es que algunos fagos pueden ser portadores de genes de resistencia a antibióticos o de genes que codifican toxinas y por lo tanto. la aparición de cepas bacterianas resistentes a un elevado número de antibióticos obligaron a los científicos a encontrar nuevas formas de combatir las bacterias. mientras que los antibióticos arrasan con todas las bacterias: las patógenas que causan alguna infección pero también con las beneficiosas como las de la flora bacteriana natural del cuerpo. Virus contra Bacterias En 1917 el microbiólogo Félix d’Herelle descubrió que existían virus que eran capaces de parasitar bacterias a los que llamo “bacteriófagos” o fagos. No obstante recién en 1921 se estandarizaron tratamientos por Richard Bruyboghe. Otra ventaja frente a los antibióticos es la capacidad de los bacteriófagos de tener mayor alcance en los tejidos (puede incluso atravesar la barrera hematoencefálica.com/2014/02/e l-redescubrimiento-de-la-terapia-por. El laboratorio de microbiología está en proceso de estandarización de metodologías para el aislamiento de bacteriófagos con miras a posteriores investigaciones en fagoterapia. Especialmente durante la primera guerra mundial.Página 13 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. al usar fagos para tratar infecciones de estafilococos en la piel. en algunos casos es necesario tratar a la proteína para conseguir una forma estable que pueda cumplir su función de manera óptima. las cuales actualmente son de gran utilidad para el desarrollo de las proteínas recombinantes. En el laboratorio de microbiología se viene trabajando en el diseño y construcción de plásmidos. Fuente: http://www. obteniendo ADN recombinante. n°2 Artículo de Divulgación Por Miguel Morales.dfarmacia. luego permitió conocer como el ADN se transmite de una generación a otra. un tipo de enzimas (proteínas que aceleran reacciones químicas) de virus y bacterias. ese fragmento se denomina ADN recombinante y las proteínas producidas a partir de ese ADN: proteínas recombinantes. Además se reconoció que un organismo desde el más simple al más complejo tenía el mismo código génetico. luego se separa la proteína recombinante de las otras proteínas bacterianas en un proceso de purificación (normalmente cromatografías). ADN ligasa. es de ADN a ARN y luego. Como dijo el químico holandés Mulder: “sin proteínas no hay vida posible en nuestro planeta” (en este caso el gen de interés) y por último se ligaran con ayuda de la enzima. Esto les valió a Watson J y Crick F el premio nobel en 1962. así quedaran bases sin aparear que estarán disponibles para aparearse con el fragmento de ADN que contenga las bases complementarias Figura 1. en el vector. dando origen a la ingeniería genética. Proteínas Recombinantes Durante el siglo xx se lograron importantes avances. Para la producción de proteínas recombinantes se siembra bacterias conteniendo el ADN recombinante. También se descubrió que esta información se traduce a proteínas. Metodología general de generación de proteínas recombinantes. uno de ellos fue determinar la estructura de doble hélice del ADN. Una proteína recombinante se genera al colocar un fragmento de ADN en un organismo distinto al original. moléculas imprescindibles para todo organismo. con el objetivo de producir proteínas de interés En el año 1975 Nathans D y Smith H descubrieron biotecnológico.Página 14 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. De manera básica la metodología de producción de proteínas recombinantes es la siguiente: primero se aísla el ARNm que codifica la proteína de interés. a una proteína). el ADN obtenido se inserta en un vector (transporte del gen de interés) “cortado” por unas enzimas de restricción denominadas endonucleasas (“tijeras moleculares” que cortan los enlaces fosfato de la cadena de ADN sin dañar la secuencia de nucleótidos).com/farma/ctl_servlet?_f=37&id=13128906 . Esto quiere decir que el ADN puede ser interpretado y traducido por cualquier otro organismo del planeta. por acción de las transcriptasas inversas se sintetiza ADN a partir de ARN (normalmente la transferencia de información. Los extractos fueron obtenidos de los filoides. acetogeninas. y produciendo metabolitos secundarios que poseen diferentes propiedades. Macrocystis pyrifera es una macroalga de importancia económica a nivel mundial. 1. Pertenece a la división de las Phaeophytas. Guerra A. En este sentido. Ávila J.com INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO: Morales M. se utilizaron discos con 10 mg de Gentamicina como control. fucoxantinas. Pseudomonas aeruginosa. todas las cepas se mostraron sensibles ante la acción de la Gentamicina. por otro lado. Guerra A. Las algas marinas son consideradas una parte importante en los ambientes acuáticos. y. florotaninos. Justo S. Actividad antimicrobiana del extracto acetona-agua de Macrocystis pyrifera (C. R E S U M E N Se evaluó la actividad antibacteriana del extracto acetona-agua de Macrocystis pyrifera. Marlon. Nunja P. 2014. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Ricardo Palma. a su vez. Ávila J. mmarlon14o@hotmail. Nunja P. entre otros metabolitos. Burga L. ya que cumplen un nicho ecológico fundamental equilibrando los niveles de oxígeno en el agua. Laboratorio de Biología Marina y Continental. participando en las redes tróficas. Palabras claves: Macrocystis pyrifera. Staphylococcus aureus y Salmonella enterica del Laboratorio de Microbiología. n°2 Artículo de Investigación Actividad antimicrobiana del extracto acetona-agua de Macrocystis pyrifera (C. Se seleccionaron cuatro cepas de importancia clínica: Escherichia coli. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Ricardo Palma. Introducción Las bacterias se han adaptado a un sinfín de hábitats con diferentes mecanismos de sobrevivencia. conocidas como algas pardas. Extracto acetona-agua. De estos. *Autor para la correspondencia: Morales Moisela. Ningún extracto presentó actividad antibacteriana en ninguna de las cepas evaluadas. por medio de fotosíntesis. Se concluye que Macrocystis pyrifera no posee actividad antimicrobiana ante las cepas de importancia clínica evaluadas. 1(2): 15-19. los estudios relacionados a la actividad antibacteriana de extractos de algas pardas no abundan en la literatura científica. las cuales son conocidas por producir sustancias como diterpenos. Justo S. y menos aún en Macrocystis pyrifera. Actualmente la resistencia bacteriana a antibióticos es un problema de gran importancia en el área clínica. La prueba de sensibilidad se realizó mediante discos de difusión cargados con 30 µl de cada extracto. Partiendo del concepto que ciertas algas producen sustancias bioactivas que impiden el crecimiento de organismos patógenos en su hábitat natural resulta interesante el uso de metabolitos obtenidos de dichos organismos como antibióticos alternativos. la actividad antimicrobiana. entre ellas. A raíz de este fenómeno es que cada cierto tiempo se necesita sintetizar nuevos antibióticos para combatir a estos microorganismos. de una muestra fresca. el presente trabajo busca evaluar la actividad antibacteriana de dos extractos obtenidos de diferentes partes anatómicas de Macrocystis . Agardh 1820) en bacterias de importancia clínica Morales M*. Burga L.Página 15 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. los florotaninos son los que han recibido mayor atención en los últimos 5 años por las diversas propiedades de interés biomédico que poseen. Discos de Difusión. esporófilos y del alga entera de una muestra seca de la especie. Laboratorio de Microbiología. No obstante. Agardh 1820) en bacterias de importancia clínica. Boletín Científico. El contenido fenoles). estos se cuantificaron usando el método de Folin-Ciocalteu (AF) tuvo el mayor CTF (contenido total de usando como estándar floroglucinol. La actividad antibacteriana se clasificó de enero y julio del 2014. Se realizó un tratamiento más utilizando Control 10 g de alga fresca siguiendo el procedimiento antes 12mm ≥ DHI Resistente (R) mencionado. 1g se maceró en con Gentaminica. se procedió con la entre estas sustancias se encuentran los florotaninos. preparación del estándar para el inóculo.1 OD en 625 nm. 2002). actividad antimicrobiana.22 µm (Merck Millipore). Materiales y Métodos Se colectaron ejemplares juveniles flotantes de incubadas a 37°C por 24 horas. posteriormente. Salmonella enterica y estas algas les permiten defenderse en su medio Pseudomonas aeruginosa. DHI ≥ 15mm Sensible (S) finalmente. Clasificación de la actividad antibacteriana obtener un peso constante. Este procedimiento se realizó con tres Laboratorio de Biología Marina y Continental de la repeticiones para cada uno de los extractos. Luego del ajuste del estándar las cepas fueron sembradas en placas con Agar Mueller-Hinton e 2. esporófilos y toda El extracto realizado a partir de toda el alga fresca el alga) se secaron en una estufa a 60°C hasta Tabla 1. Los ejemplares fueron como Resistente (R). luego se evaporó el solvente 12mm ≤ DHI < 14mm Intermedia (I) en estufa. lo cual fue estadísticamente mayor en de fenoles totales (CFT) fueron expresados en mg comparación al resto de extractos (Tabla 2). ninguno presentó una (mg PGE/100 g). Cada cepa fue reactivada natural. El extracto se filtró en papel filtro (Rundfilter 125 mm). n°2 Artículo de Investigación pyrifiera en bacterias patógenas de importancia se ajustó hasta una turbidez de 0. Se cargaron discos con 10 mg de Gentamicina que se 4. las muestras (filoides. Resultados extracción. Discusión usó como control y se dejó en absorción durante 2-3 La actividad antibacteriana de distintas algas horas. contra organismos microbianos y epífitos. El inóculo los cuales son los responsables de la alta actividad . equivalentes de floroglucinol/100 g de alga seca De los extractos evaluados. usando cubetas esterilizadas con radiación clínica U. Sensible (S) e Intermedia (I) transportados en bolsas negras sin agua de mar al (Tabla 1).Página 16 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. alrededor del mundo. se resuspendió en agua destilada y. se filtró a 0.08 OD a 0. Las sustancias bioactivas de Escherichia coli. pertenecientes al grupo de las Phaeophytas se ha Se usaron 4 cepas bacterianas aisladas de diferentes evaluado constantemente en diferentes laboratorios hospitales de Lima: Staphylococcus aureus. asépticamente con 30 µl del extracto algal. Para relacionar la actividad antibacteriana con el DHI: diámetro de inhibición de la sustancia evaluar. Universidad Ricardo Palma. contenido de polifenoles de los extractos.V. El control presentó un La actividad antimicrobiana se evaluó empleando la diámetro de inhibición esperado lo que permite técnica del antibiograma por el método de discos de validar la prueba. oscuridad por 1 hora en 10 ml de acetona: agua Clasificación Diámetro del halo de (7:3) a temperatura ambiente con agitación cada 15 inhibición formado por minutos. además según dicho diámetro. Macrocystis pyrifera (DMR<20 cm) de la bahía de Los halos de inhibición obtenidos fueron medidos Pucusana (12º28’38”LS 76º47’53”LO) en los meses con vernier. en Caldo CASO. las difusión en agar (INS. Previo a la 3. donde se limpiaron de epífitos y sales con agua de caño. Se usaron discos de cepas fueron clasificadas como sensibles a papel de filtro Whatman N° 42 y se cargaron gentamicina (Tabla 3). 94d A: Extracto de alga entera seca. E: Extracto de los esporófilos de una muestra seca.13a A 201. Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa y en cepas patógenas de peces como Vibrio fischeri. también existe el método de pocillos de 6 mm en el medio de cultivo. pyrifera evaluado mediante el método de pocillos. Los discos de difusión fueron cargados con 30 µl del extracto algal y colocados en el medio de cultivo. Vibrio alginolithycus. lo cual influye en su capacidad antibacteriana (Castro M.547 mg/g en épocas de invierno del total de polifenoles que existen en el alga. sin encontrar actividad antibacteriana en cepas clínicas y no clínicas. Finalmente. F: Extracto de Filoides de una muestra seca. Entre estos. los cuales presentaron un resultado positivo de actividad antimicrobiana ante cepas clínicas (Johnsi G. E: Extracto de los esporófilos de una muestra seca. Es así que la extracción acuosa de algas como Sargassum wigthiiy Padina tetrastromatica presentaron actividad antimicrobiana ante cepas patógenas tales como Staphylococcus aureus. AF: Extracto de una alga fresca.57±0.1993). Promedio del diámetro de los halos de inhibición formados en el ensayo con los extractos acetona-agua de Macrocystis pyrifera *C: Control (Gentamicina). 2011). A: Extracto de alga entera seca.Página 17 Laboratorio de Microbiología Volumen 1.01). antibacteriana de varias algas pardas.87±20. varias especies emparentadas con Macrocystis pyrifera presentan una actividad antibacteriana tratadas con diferentes métodos de extracción y de antibiograma. Además se ha usado esta sustancia como control en cultivos de Escherichia coli a una concentración de 2 mg/ml. tal como lo reportó Jeong L (2014) en su trabajo con Eisenia byciclis.93c F 327. El uso de ambos métodos permite la difusión de los extractos. Contenido Total de Fenoles (CTF) de los diferentes extractos evaluados. 2011).87b E 373. La mayoría de algas pardas a las que se les atribuye actividad antibacteriana lo realizan mediante los florotaninos.87±4. Extracto CTF (mg PGE/100 g alga seca) AF 385. es uno de los antibióticos de uso oftálmico que se usan para todas las cepas que se evaluaron en este trabajo. Estos resultados los atribuyeron a que posiblemente existe una concentración mínima de sustancias bioactivas en estas algas las cuales son . El método por discos de difusión es uno de los más usuales cuando se realiza un antibiograma y se encuentra actualmente estandarizado por el Instituto Nacional de Salud del Perú (2002). Por otro lado. tal como se realiza en nuestro trabajo. en la cual se recomienda el uso de antibióticos obligatorios según las cepas que se evalúan. la acción de los solventes en los extractos de algas también influye de alguna manera en los resultados que se obtienen. Las letras indican diferencias significativas (p<0. se usaron 20 µl de extracto acuoso en los discos. la cual posee aproximadamente 34. 2003). n°2 Artículo de Investigación Tabla 2. los cuales fueron cargados con 50 µl del extracto algal. tal como un trabajo realizado en nuestro país donde trabajaron con extractos etanólicos de M. En otros estudios. Tabla 3. No obstante.12±8. En nuestro trabajo se usó Macrocystis pyrifera. AF: Extracto de una alga fresca. Sin embargo.4 mg/g de taninos en épocas de verano y 0. (Johnsi G. F: Extracto de Filoides de una muestra seca. nuestra especie no presentó ningún resultado positivo durante la investigación. la gentamicina. permitiendo también la obtención de resultados positivos (Magallanes C. Min-Seung K. 2008. Falcao V. Campos S. Mi J. Kwang S. López M. Lee M. of selected brown seaweeds from Vedalai coastal waters. 6. Revista Peruana de Biología. Antibacterial activity of cepas de importancia clínica evaluadas. Eun L. Antimicriobial activity of seaweeds from the gulf of Mannar. Orozco R. Parte C. esporófilos. Aishwarya M. Barros M. Gutiérrez M. Biotechnology and β-Lactams against Methicillin-resistant Bioprocesses Engineering 13: 758-764. Yeoun J. aqueous extract from selected macroalgae of southwest coast of India. Synergistic Lee D. pyrifera no posee actividad antibacteriana ante las Udayakumar A. Won-Jae L. 2011. 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Los géneros encontrados fueron: Moraxella. 1. Esquemas de Das S et al (2007) y Oliver J (1982). además de bacterias ampliamente estudiadas como Marinobacter hydrocarbonoclasticus capaz de producir enzimas que degradan hidrocarburos aromáticos. Gonzáles M. motilidad. producción de indol. Santiago. en total se tomaron 5 muestras en frascos estériles a una profundidad de 3m utilizando una vara de madera acondicionada a una jeringa de 20ml. Bacillus. Aeromonas. la diversidad biológica marina comprende todo tipo de organismos que habiten en los mares. Introducción Los océanos comprenden aproximadamente el 70% de la superficie terrestre. Se logró el aislamiento de 20 cepas bacterianas. Oliver J (1982) y el Bergey´s Manual 2da y 7ma edición fueron utilizados para la determinación de géneros. Guerra A. Saldaña C. Laboratorio de Microbiología. Santiago D. 2014. producción de H2S.com INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO: Justo S. estudios recientes en otras partes del mundo han hallado bacterias marinas con propiedades que van desde la producción de pigmentos utilizables (Yada S et al. Con el objetivo de ampliar los conocimientos en la biodiversidad bacteriana del mar peruano. 2008) hasta bacterias que sintetizan nanopartículas de oro a partir de otros compuestos (Shama N et al. 1(2): 22-25 Palabras Claves: Bacterias Marinas. se trabajó con diluciones sucesivas para obtener colonias aisladas. Pabón L. En segundo lugar. Santiago D.are@gmail. Pabón L. Guerra A. Streptococcus y Chromobacterium. Boletín Científico.jus. Saldaña C. Churasacari T. En primer lugar. *Autor para la correspondencia: Justo Arévalo. Acinetobacter. Determinación de Géneros Bacterianos en el Mar de la Playa –La Punta-Callao. Pruebas bioquímicas R E S U M E N Los océanos albergan una gran diversidad biológica. se realizaron muestreos aleatorios en el mar de Playa Cantolao-La Punta-Callao (12º04´06´´ S 77º10´10´´O). Vibrio. luminiscencia. un grupo importante con poca consideración en nuestro país son las bacterias. Universidad Ricardo Palma. Para la identificación se realizaron pruebas bioquímicas que incluían determinación de citocromo oxidasa. Alteromonas. (2007). el bacterioplancton tiene un . Churasacari T.Página 20 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. Alcaligenes. hasta el momento relativamente poco explorada por el humano. Vibrio fischeri que tiene en su genoma el operon LUX (biolumniscencia) o Pseudomonas pseudoalcaligenes productora de enzima que degrada el cianuro. producción de pigmento. Photobacterium. además de las coloraciones Gram y de espora. metabolismo de glucosa. Cajachagua C. Los esquemas propuestos por Das S et al. Facultad de Ciencias Biológicas. Cajachagua C. 2012). Para el aislamiento se utilizó el método de dispersión en placa en Agar Marino. catalasa y desarrollo en anaerobiosis. Gónzales M. santiago. n°2 Artículo de Investigación Determinación de Géneros Bacterianos en el Mar de la Playa Cantolao – La Punta – Callao Justo S*. la diversidad de sus ambientes permite que se desarrolle gran cantidad de formas de vida. además tienen importancia como regulador de la temperatura global y como sumidero de carbono De esta primera idea se desprenden dos principales: la diversidad de especies y la importancia ecológica de los ecosistemas marinos. Página 21 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. Determinación Bioquímica: Se realizaron las siguientes pruebas bioquímicas: 2. producción de pigmento. 1). Se tomaron 5 luminiscencia. muestras. catalasa. (2007). Al cabo de este tiempo se seleccionaron las colonias aisladas y fueron reaisladas en tubos con Agar Marino. el concepto de red trófica clásica ha cambiado a un modelo alternativo más complejo denominado "bucle microbiano". 1983). con jeringas estériles de 20ml. Callao como base para futuros estudios ecológicos y biotecnológicos. El presente estudio tiene como objetivo identificar los géneros bacterianos presentes en el mar de Playa Cantolao.Figura 1 Aislamiento por diluciones sucesivas en medio Marino. lograron ser identificadas hasta la categoría de . En los últimos años. Las muestras de agua fueron géneros transportadas al Laboratorio Microbiología de la Universidad Ricardo Palma en un cooler refrigerado 3. basado en la capacidad de las bacterias heterótrofas de reciclar la materia orgánica disuelta y de hacerla circular mediante diversas interacciones ecológicas a través de los otros componentes del plancton y.Para esto se tomó 1ml de la muestra y se colocó en un tubo con 9ml de agua de mar esterilizada y filtrada obteniendo la dilución 101 . n°2 Artículo de Investigación papel significativo como principal contribuyente en los procesos biogeoquímicos de los ambientes marinos.2) metros utilizando una vara de madera acondicionada Los esquemas propuestos por Das S et al. Recolección de muestras: Se realizaron muestreos producción de H2S. Además se colectaron Oliver J (1982) y el Bergey´s Manual 2da y 7ma 3 litros de agua de mar para la preparación de los edición fueron utilizados para la determinación de medios de cultivo. motilidad. los microorganismos son los almacenadas a 4ºC hasta el momento de la responsables del 98% de la producción primaria e caracterización bioquímica. en el destino de los contaminantes en zonas altamente antropizadas. desarrollo en anaerobiosis. a una profundidad de aproximadamente 3 coloración de esporas. Aislamiento de bacterias: Se utilizó el método de dispersión en placa con medio marino (fig. Las placas fueron incubadas a Tº ambiente (20-25°C) durante 48h. intervienen en todos los ciclos de la materia. con un papel fundamental. se repitió este procedimiento obteniendo 3 diluciones (hasta 10-3). Estas fueron incubadas nuevamente a Tº ambiente hasta observar crecimiento visible y luego fueron En los océanos. producción de indol. citocromo oxidasa. Además los organismos heterótrofos como las bacterias consumen entre el 18% y 77% de carbono orgánico disuelto en el mar (Azam F et al. aleatorios en el mar de la playa Cantolao-La Puntametabolismo de glucosa. Callao (12º04´06´´ S 77º10´10´´O). y representa un componente fundamental en las redes alimentarias . en forma indirecta. también a través de los niveles tróficos superiores del ecosistema marino (Schauer M et al. Resultados En total se obtuvieron 20 cepas. de las cuales 17 a 4ºC. (fig. Materiales y Métodos coloración gram. Por lo tanto el estudio de las bacterias en los ambientes marinos de nuestro país nos permitirá aumentar nuestros conocimientos en la ecología y buscar nuevos recursos aprovechables. a su vez. 2011). Photobacterium y Alteromonas que no fueron encontrados en los trabajos mencionados anteriormente pero sí en este. (2001) en su trabajó con muestras de 2 moluscos bivalvos cultivados en Pucusana y el Callao: Argopecten purpuratus “concha de abanico” y Crassostrea gigas “ostra” logran identificar 6 géneros bacterianos: Vibrio (40%). género. Flexibacter ni Actynomicetes lo que sugiere que estos géneros podrián estar más relacionados a organismos que géneros como Bacillus. Agar Marino (Anaerobiosis). Ab=Aerobio. Discusiones Pellón et al. 8 fueron bacilos gramnegativos y sólo 2 grampositivos. . peje sapo y Tegula atra “caracol” logra identificar 4 géneros: Vibrio (50%). esto puede ser a Tabla 1. Heliaster helianthus “estrella de mar”. (2010) determinan que la cepa más abundante es la correspondiente a Vibrio sin embargo en este trabajo la cepa más abundante fue la de Moraxella. NP=. H. F.F= HughLeifson. Aeromonas (15%). Moraxella (5%). No hay presencia de espora. OXID=Oxidación. n°2 Artículo de Investigación A B E D C F Figura 2: A. MOT=Motilidad. Agar P (pigmentación). Pseudomonas (5%). Pellón et al. B. (2001) y León et al. Flexibacter (5%) y no identificados (20%). Se encontraron 10 géneros. Moraxella y Vibrio sin embargo no se encontró cepas de Flavobacterium. un bacilo y un coco (tabla 1). 4. C. Pseudomonas (10%). Prueba de catalasa. León et al (2010) por su parte en su trabajó con muestras de 5 invertebrados intermareales recolectados en la Bahía de Ancón: Phymactis clematis “anémona”. el presente trabajo reporta la presencia en el ambiente marino de 10 géneros bacterianos entre ellos Aeromonas. E. Cer=Anaerobio. Resultados de las Pruebas Bioquímicas realizadas a las cepas aisladas CAT=Catalasa.Página 22 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. N= No se realizó la prueba. Flavobacterium (10%). Citocromo oxidasa. ANAEROB=Anaerobiosis. 3 no tuvieron crecimiento suficiente para su identificación. Tetrapygus niger “erizo de mar”. SIM. D. Flavobacterium (20%) y Actinomycete (20%). HughLeifson (metabolismo de glucosa). De los cuales. PIG= Pigmentación. Roy A. Pucci. 49-58. Shama N. Exploitation of marine bacteria for production of gold nanoparticles. 2003. Arakawa R. 6(18):1-5. Marine Ecology Progress Series 10: 257-263. estos fueron: Moraxella (23.88%). n°2 Artículo de Investigación causa de que hay mayor asociación de Vibrio con invertebrados que el género Moraxella. Lyla P. Soto I.76%). Seasonal changes in the taxonomic composition of bacterioplankton in a coastal oligotrophic system. Alteromonas (11. Ajmal S. Osaka I. Meyer-Reil A. 2008. León J. Venter S. Bacterias marinas con capacidad antimicrobiana aisladas de moluscos bivalvos en cultivos. Das S. 23(2): 17-21. Moraxella. Revista de biología marina y oceanografía. Acuña A. Revista Peruana de Biología. Vibrio. Pucci G. Enomoto K. 29(6A): 795-798. Fnu A.88%).htm Oliver J. Tiedemann M. Photobacterium (5. Orozco R. Field J. A simple scheme for the identification of marine heterotrophic bacteria. 2009. 6. Massana R.76%). adicionalmente determinan que la mayor cantidad de cepas halladas fueron grampositivas a diferencia del presente trabajo que encuentra que el 80% de los géneros y el 90% de las cepas aisladas fueron gramnegativas. Liza L. 11: 86-92 Shikongo M. 1982. Kaysner C.Página 23 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. 8 (2): 1-3. Balagué V. (citado el 09 de Febrero del 2014). Photobacterium). . Revista Peruana de Medicina Experimental. Chimwamurombe P. Isolation and characterization of two groups of novel marine bacteria producing violcain. 5. Conclusiones Se determinó la presencia de 10 géneros bacterianos. Disponible en: http:// www. Yada S. Deep Sea Research. DELOS. Ruíz C. Pedros-Alio C. 2012. Marine biotechnology. 2013. Orosco A. 2012.76%). 2001. Sharkar M.fda. Taxonomic scheme for the identification of marine bacteria. Bacillus. Referencias Bibliográficas Azam F.88%). León J. 2004. Streptococcus (5. 27(2): 215-21. Alcaligenes (5. Bacteriological Analytical Manual. Bacterias marinas productoras de compuestos antibacterianos aisladas a partir de invertebrados intermareales.88%) y Chromobacterium (11. Aeromonas (11. De Paola A.gov/Food/FoodScienceResearch/ LaboratoryMethods/ucm070830. Vibrio (11. 10: 128-132. An international journal of marine sciences Thalassas. Aquatic Microbial Ecology. Argentina. 2007. esto sugiere y afirma que las grampositivas están mayormente asociados a los suelos y que las gramnegativas más bien habitan asociadas a la columna de agua. Bacillus (5. 44(1). Hosokawa K. O.76%). Pinnaka A. Raje M. Schauer M. FDA (internet). Respuesta antagónica de microorganismos aislados de los cultivos de microalgas en el laboratorio de cultivos marinos. en la zona costanera de Comodoro se reporta en muestras de sedimentos y agua marina 6 de los géneros hallados en este trabajo (Acinetobacter. 31: 163-74. Identificación de bacterias marinas cultivables de la ciudad costera Comodoro Rivadavia. Wang Y. Acinetobacter (5. Aeromonas. Gray J. Fenchel T. Thingstad F.5%). 2010. Además en un estudio realizado en Argentina. Nagasaki K. Torres M. 2(4): 229-246. Microbial cell factories. Llanes M. Identification of putative Vibrio species isolated from processed marine fish using thiosulphatecitrate-bile-sucrose (TCBS) agar. British biotechnology journal. Pellón F.. The ecological role of watercolumn microbes in the sea.88%). 1983. Zou Y. antibiótico R E S U M E N Pseudomonas aeruginosa es una bacteria gramnegativa. Esta bacteria tiene la capacidad de producir varios pigmentos extracelulares. Piocianina. poseen también gran plasticidad génica (Ruiz L. Churasacari T. es un género cosmopolita. Pseudomonas aureginosa es el patógeno más importante de este género. 2007). debido a que es un patógeno oportunista (Francis K y Brown P. *Autor para la correspondencia: Justo Arévalo. Palabras Claves: Pseudomonas aeruginosa. (1978) que constó de una extracción clorofórmica.jus. Universidad Ricardo Palma. este grupo es capaz de utilizar y metabolizar un amplio rango de sustratos. 2012) siendo el más importante en humanos debido al número. Boletín Científico. tanto continentales como marinas (Baumann L et al. Santiago. Introducción Psedudomonas sp. soluble en cloroformo. Elías C. Churasacari T. Justo S. Se utilizaron 8 cepas de Pseudomonas aeruginosa. 2 ambientales. 2007). 2009). la piocianina es una exotoxina perteneciente al grupo de las fenazinas que cuenta con la capacidad de inhibir el desarrollo de organismos competidores. . Se ha demostrado que este pigmento posee actividad antibacteriana (Merino L. 5 nosocomiales y 1 cepa de referencia (ATCC 27853). La extracción de Piocianina se realizó por el método propuesto por Knight et al.are@gmail. Efecto Antibiótico de Piocianina de Pseudomonas aeruginosa sobre Escherichia coli y Staphylococcus aureus. 1. n°2 Artículo de Investigación Efecto antibiótico de Piocianina de Pseudomonas aureginosa sobre Escherichia coli y Staphylococcus aureus. 2014. piocianina (Young G. Facultad de Ciencias Biológicas. por ello puede vivir bajo muy diversas condiciones. y que su producción es activada principalmente bajo efecto de quorum sensing (Williams P y Cámara M. sin embargo sólo la piocianina de la cepa de muestra respiratorio mostró un leve efecto sobre Escherichia coli. 1947).com INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO: Justo S. patógeno oportunista de importancia clínica pues causa gran cantidad de enfermedades intrahospitalarias. 1971). perteneciente a las fenazinas. No se observó diferencias en el efecto de la piocianina de cepas nosocomiales y ambientales frente a Staphylococcus aureus.Página 24 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. Para estimular la producción de piocianina las cepas fueron incubadas por 7 días a 37ºC en caldo P. ya sean orgánicos o inorgánicos. seguida de una extracción con HCl. Elias C. 2007). Guerra A. pioverdina (Merino L. 2007) que actúa como sideróforo en condiciones mínimas de Fe (III) y actúan como inhibidores del crecimiento de microorganismos patógenos en plantas (Bello D et al. 1(2): 26-29. santiago. encontrándose en suelos y aguas. tipo de infecciones y mortalidad asociadas (Ruiz L. 2006) y un pigmento azul. Laboratorio de Microbiología. Además este es un organismo ubicuo debido principalmente a su alta capacidad para metabolizar variedad de sustratos. así mismo es también conocido por su capacidad de sintetizar diferentes pigmentos hidrosolubles extracelulares entre los que se destaca un pigmento verde fluorescente. uno de ellos. A=Ambiental. 5 fueron aislamientos nosocomiales. 1 de un manantial ubicado en la costa verde. 2. entre 0. Cepas de Pseudomonas aeruginosa utilizadas. como control positivo se utilizó discos de gentamicina. Se ajustó la turbidez del caldo CASO. Para la confirmación de las cepas se utilizaron pruebas bioquímicas que consistían en metabolismo de glucosa.10 y 0. Tabla 1. donde fueron previamente inoculadas.08 a 625nm. Prueba de Sensibilidad Para esta prueba se utilizó una cepa de Escherichia coli ATCC 25922 y una cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923. Código Origen Descripción A A B A C N D N Aislamiento de eyecciones de palomas Manantial de la Costa Verde en Playa La Estrella Aislamiento del Hospital Grau Heridas epiteliales aislada en el HNGAI E N Heridas epiteliales aislada en el HNGAI F N Heridas epiteliales aislada en el HNGAI G N Muestra respiratoria aislada en el HNGAI ATCC 27853 ----- Donación del aisladas en el HNGAI N= Nosocomial. luego se ajustó la turbidez del caldo hasta una OD de entre 0. 3. se realizó una primera extracción con cloroformo seguido de una extracción con HCl 0.2N. HNGAI= Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen . Una vez más se realizó la extracción clorofórmica y a partir de esta se cargaron discos de 6 mm de papel filtro Whatman Nº 42 con 10ul del extracto. degradación de citrato.Página 25 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. 1 aislada a partir de eyecciones de paloma. Materiales y Métodos Obtención de Cepas de Pseudomonas Se trabajó con 8 cepas de Pseudomonas aeruginosa (Tabla 1).08 de OD a 625nm. Análisis estadísticos Se realizó la prueba de ANOVA para determinar diferencias significativas entre los efectos inhibitorios de los extractos de piocianina de las diferentes cepas utilizadas. Cada extracto fue probado por triplicado en placas con agar Muller Hinton. Obtención de Pigmentos Las ocho cepas aisladas fueron sembradas en 5ml de caldo CASO por 18 horas a 37 º C. motilidad. agitándose manualmente dos veces al día para favorecer la oxigenación del medio. La fase ácida fue neutralizada con NaOH 0. además de la cepa ATCC 27853 de Pseudomonas aeruginosa. producción de Indol y producción de pigmentos. Extracción de Piocianina Transcurridos los 7 días se tomaron muestras de 10 ml de Caldo P. por último se tomó una alícuota de 1ml y se sembró en 50 ml de caldo P los cuales fueron incubados por 7 días a 37ºC. n°2 Artículo de Investigación El objetivo del presente trabajo es determinar la actividad antibacteriana del pigmento piocianina sobre una cepa de Escherichia coli y una cepa de Staphylococcus aureus.2N hasta observar el cambio de coloración. se centrifugaron a 3000 rpm por 10 minutos y se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio. Resultados No se observó diferencias significativas entre los halos de inhibición del extracto de piocianina frente a la cepa de Staphylococcus aureus (Tabla 2). Sólo la piocianina de la cepa aislada de muestra respiratorio (Tabla 1) mostró un leve efecto inhibitoria sobre Escherichia coli.10 y 0. Mediciones de Halos de Inhibición de concentración y se necesita mayores concentraciones Piocianina frente a Escherichia coli y para inhibir el crecimiento de bacterias gramnegativas. Mandel. Antibiotic action of Pyocyanin. Purificación parcial del pioverdina a partir de caldos de fermentación de Pseudomonas aureginosa. Torres E.79 A la piocianina sobre Proteus morganii sugiriendo que 16. Referencias Bibliográficas Baron S y Rowe J. 6. sin embargo otros autores como Young G (1947) y Nowroozi J et al (2012) han determinado que la Piocianina sí tiene efecto contra Escherichia coli e incluso Nowroozi et al (2011) menciona que las nanopartículas de plata tienen un efecto sinérgico inhibitorio tanto en Escherichia coli como en Staphylococcus aureus. Taxonomy of aerobic marine eubacteria.61 16. Estudios bibliográficos no muestran efecto inhibitorio de la Piocianina sobre Pseudomonas aeruginosa lo que sugiere un mecanismo de protección frente al efecto de este pigmento.5ug por disco. 4. 11(1): 36-39.37 E los trabajos mencionados anteriormente reportaron 16. reportan efecto inhibitorio de 15. aislada de HNGAI. ICIDCA. 20(6): 814-820. Baron S y Rowe J (1981) encuentran que la actividad antibacteriana de Pseudomonasa eruginosa no se manifiesta frente a cepas como Proteus vulgaris.70 G un efecto inhibitorio de la piocianina sobre cepas de 14. esto demuestra que al parecer el efecto de antibacteriano de la piocinana es dependiente de la 5.5 ug por disco resulta en un halo de inhibición de 17 mm para Staphylococcus aureus. Enterobacter aerogenes otras Pseudomonas ni frente a Escehrichia coli.30 21. 1972. de manera muy interesante ninguno de 14. En este trabajo se utilizan discos cargados con 2 ug. Conclusiones La cepa de Staphylococcus auereus se mostró sensible frente al extracto de piocianina de todas las cepas obtenidas de Pseudomonas aureginosa. en mm. coli. Baumann P. Santo J. Un resultado similar se evidencia en la cepa G la cual también mostró halo de inhibición frente a Staphylococcus aureus esto sugiere que las concentraciones obtenidas pueden haber sido inferiores en los otros casos a los 2. . Diaz M.00 F 8. una metodología conocida por ser más directa que coli aureus los discos de difusión. Antimicrobial Agents and Chemoterapy.30 Gentamicina mecanismo que contrarreste la acción de la *Los resultados mostrados son la media de tres ensayos expresados piocianina. Código Escherichia Staphylococcus (1978) que utilizando el método de pocillos en agar. n°2 Artículo de Investigación Tabla 2. Bello D.Página 26 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. 2006. 110(1): 402-429.07 ATCC 27853 Pseudomonas sugiriendo la existencia de un 21. Villa P. Bell A. Baumann L. Journal of Bacteriology. Allen R. M.02 B altas concentraciones del pigmento no permiten el 18. nuestro trabajo también reportó efecto inhibitorio sobre E.00 C desarrollo bacteriano.1513 D Por último. Discusión Stephen et al (1981) realizan un ensayo similar con piocianina donde una cantidad de 2. . Staphylococcus aureus Esto se confirma con el trabajo de Knight et al. por el contrario Escherichia coli se mostró sensible solo frente al extracto de piocianina producido por la muestra G. 1981. 2009. Volumen 1. Pyocyanine Biosinthetic genes in Clinical and Environmental Isolates of Pseudomonas aeruginosa and Detection of Pyocyanine’s Antimicrobial Effects with or without Colloidal Silver Nanoparticles. Hartman. Merino L. Pseudomonas aureginosa: Aportación al conocimiento de su estructura y al de los mecanismos que contribuyen a su resistencia a los antimicrobianos. 12(2): 182-191. 1947.180 pp Williams P y Cámara M. Sepahi A. 39:143 Nowroozi J. Rashnonejad A. Ruiz L. Cell Journal. 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Pigment production and antibiotic activity in cultures of Pseudomonas aeruginosa.Página 27 Laboratorio de Microbiología Artículo de Investigación Francis K y Brown P. 2012. alcanzando las 116500 toneladas consumidas anualmente en todo el Perú (Chauca L. Salmonella se ha identificado como el agente infeccioso bacteriano más importante por ocasionar altos índices de mortalidad y morbilidad. cobayo. Introducción Cavia porcellus denominado comúnmente como cuy. R E S U M E N Actualmente la demanda de cuy para consumo.00Kg de carne de Cuy pero para el año 2006 las cifras se habían incrementado hasta 7762. se necesita de mayor cantidad y rigurosa investigación científica tanto en el agente infeccioso como en el cuy y los sistemas de crianza para mejorar la producción de cuy en el país. Aunque la distribución del cuy no está restringida al Perú. Los sistemas de crianza del cuy se clasifican según su finalidad y la cantidad de individuos criados.)(Moreno A. El cuy ha constituido desde esas épocas una importante fuente proteica. Actualmente viene aumentando la demanda del cuy para la exportación es así que en el año 2000 se exportaron solo 145.66 dólares americanos siendo el principal país de destino Estados Unidos (MINAG. Palabras Claves: Cuy.73Kg con un valor total de 56794. Colombia. tanto al interior como al exterior del país. Bolivia y Perú.com Laboratorio de Microbiología. n°2 Mini-Review Aspectos generales de la crianza del Cuy y su agente infeccioso: Salmonella Justo.Página 28 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. Boletín científico. los sistemas de control empleados actualmente no han sido suficientes para atenuar este mal. Universidad Ricardo Palma.1 kg de carne de cuy por persona anualmente y en la Sierra del Perú 1. Correo Electrónico: santiago. En conclusión.8 kg (INEI. 2009). 1995). en el período de Paracas Cavernas entre 700 a 500 a.C se han encontrado indicios de alimentación con carne de cuy en los pobladores.C – 200 d. 2014. Aspectos Generales de la Crianza del Cuy y Su Agente Infeccioso: Salmonella. los estudios existentes en vacunas contra Salmonella para cuyes son escasos y muy pocos enfocados realmente a proteger al cuy de la Salmonella. Debido principalmente a deficiencias en la técnicas de crianza y falta de investigación. se ha estimado que su domesticación en el Perú se inició hace 2500 a 3600 años por restos de abundantes excretas de cuy encontrados en el templo del Cerro Sechín (Departamento de Ancash). siendo Perú el país con la mayor población.are@gmail. INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO: Justo S. curi. este presenta la mayor población de cuyes alcanzando los 23 240 846 animales. además en el Período de Paracas Necrópolis casi todas las casas tenían un espacio de crianza de cuyes (500 a. 2014). 1989). Producción. 1(2): 3035. S. conejillo de indias y en inglés Guinea pig es un mamífero roedor originario de la región andina. Salmonella.jus. Facultad de Ciencias Biológicas. A nivel mundial se han desarrollado vacunas contra Salmonella pero estas están diseñadas para su principal uso en aves de corral. la producción del cuy atraviesa graves problemas por enfermedades infecciosas las cuales diezman a gran parte de la población en los criaderos. estando el 92% de la población en la sierra y solo el 6% en la costa . viene en aumento.C. se ha estimado que en Lima Metropolitana se consume anualmente 0. La distribución y crianza de esta especie con fines de comercio está restringido a 4 países Sudamericanos: Ecuador. residuos de cosecha y residuos de cocina. se crían entre 20 a 50 cuyes por lugar de crianza (Zaldivar M et al. a diferencia de otros países como Colombia y Bolivia donde la distribución está restringida a algunos departamentos y por lo tanto presentan poblaciones menores. INIA. se utiliza además alimento balanceado. Correa R. Lima (Perú).. El sistema familiar se caracteriza por desarrollarse fundamentalmente como sustento para la alimentación de la familia. Existe una gran diversidad en este género. Sistema de Lugares Número de Crianza donde se cuyes encuentra criados Familiar Cajamarca. Arequipa. Pasteurella spp. Ecuador. 2003). donde el criador puede fácilmente comercializar su producto. se mantienen áreas de cultivo para la siembra del forraje.Página 29 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. S. Caycedo. este sistema mantiene por lo menos 1000 cuyes. enterica comprende más de 2500 serotipos que están ordenados en 7 grupos: I. IIIb. Nariño (Colombia). Producción del cuy según los sistemas de crianza La producción del cuy se puede clasificar en tres niveles de acuerdo al sistema de crianza (Chauca L. L 1995). IIIa. encontrándose casi en la totalidad del territorio. 1000 Ancash (Perú) Comercial Cuzco. De 50 a Comercial Lima. Cochabamba (Bolivia). 2007). Junín y Lima (Perú). Nariño (Colombia). 1997): el sistema familiar. 1997). Por último el sistema comercial se presenta mayormente en empresas agropecuarias. 2000). Chauca L. Shigella sp. y especialmente el género Salmonella (Morales S. 1997. Clostridium sp. Salmonella en cuyes Tabla 1. el familiar-comercial y el comercial. De 20 a 30 Junín. 1991. los productores invierten recursos monetarios para infraestructura. Lugares de Crianza y Número de Cuyes Criados según el Tipo de Sistema. tierra para la siembra de forrajes y mano de obra para el manejo de la crianza (Chauca. (Chauca L. La Paz y Cochabamba (Bolivia) y el 90% de la crianza en Ecuador (Chauca L. Lima (Perú) De 1000 a más Streptococcus zooepidermicus. 1999). además de Cuzco y Arequipa (Peña S. Diplococcus pneumoniae. los cuyes son criados por los miembros de la familia y los alimentan con malezas. Salmonella es un género de bacterias gramnegativas perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. Diplococcus pneumoniae. Junín y Lima (INIA. este sistema se encuentra en departamentos como Cajamarca. 2000). 1999. 1981. Familiar – Cajamarca. El sistema familiarcomercial nace siempre de los sistemas familiares en áreas rurales cercanas a la ciudad. La Paz. este género está dividido en dos especies Salmonella enterica y Salmonella bongori.. Klebsiella pneumoniae. En la crianza del cuy se han reportado diversas enfermedades infecciosas ocasionados por bacterias como Bortedella bronchiseptica. Streptococcus pyogenes. Yersinia pseudotuberculosis. IV. 2012. n°2 Mini-Review (MINAG. Corynebacterium pyogenes. Junín. 1990). II. Escherichia coli. Tanto en Perú como en Ecuador la distribución del cuy es amplia. y se encuentra en departamentos como Cajamarca. Actualmente los serotipos de Salmonella pueden . en este sistema se mantienen entre 50 y 1000 cuyes.. Moncayo R. VI y VII. Lima es el principal departamento con este sistema. y parálisis de los miembros . se ingreso controlado del personal. Morales cuyes el 100% fueron sensibles los 4 primeros S et al (2007) quien menciona que Salmonella antibióticos mencionados. (Gamazo C e Irache J. aunque en muchos casos los animales reptiles y aves hasta mamíferos incluyendo humanos mueren sin mostrar síntoma alguno (Layme A. el serotipo causante de la Salmonelosis en los cuyes. Guamán M. gran susceptibilidad a la salmonelosis en los cuyes. que mayor mortalidad causa presentándose como un por lo tanto. 1972). 2010) y S. entre thiphymurium (Correa R. Esto. Además se ha determinado y hasta la fecha son pocos los estudios realizados en que las variaciones de temperatura y humedad cuyes. el aislamiento de ha reportado mayormente presencia de S.5% a gentamicina y provoca brotes de mortalidad y abortos de hasta el cloranfenicol. sin embargo aún son escasos los reportes con datos Control de Salmonella en cuyes exactos que permitan tener una idea clara de la Actualmente. sin embargo la mayoría roedores y aves contaminados. 1976) de métodos de prevención más efectivos que La principal vía de infección es la oral a través de permitan desarrollar un sistema de crianza con alimentos contaminados. Matsuura A et al. general es generada por este agente causal variando fosfomicina.5% a fosfomicina. esto ocasionado en gran menores índices de morbilidad y mortalidad. n°2 Mini-Review infectar un amplio rango de hospederos. 2007) 2010). alimentos. enrofloxacina. enteritidis cuyes enfermos. Salmonella probadas en cuyes se ha realizado con el La salmonelosis en cuyes se puede manifestar de objetivo de utilizarlas en otros animales y no en el dos formas: crónica o aguda. medida por las malas prácticas de manejo. 2000.5%. deficiente Una forma bastante estudiada para el control de la nivel de bioseguridad que ocasiona presencia de Salmonella son las vacunas. las buenas prácticas de Aunque no existe referencias exactas de cuál es el manejo como: el control de roedores y aves. la mayoría de criaderos realiza el realidad de la salmonelosis en cuyes. no ha permitido que se desarrollen cuadro septicémico agudo que genera muertes en 24 trabajos continuos enfocados a desarrollar una a 48 horas. siendo esta última la cuy (el cuy es utilizado como animal modelo). otros permitirián prevenir hasta cierto punto el brote además de S. Matsuura A et al (2010) quién reporta en un antibióticos son administrados por vía oral a través criadero de Ancash una prevalencia de 61. en cambio se han probado decaimiento. postración. cloranfenicol.83% en lactantes). dublin de enfermedades. los signos más frecuentes son vacuna ideal para cuyes. algunos de control de la Salmonelosis utilizando antibióticos estos reportes son el de Leguía P (1993) que señala como Sulfatrimetoprim. anorexia. pelaje deslucido y cuyes. durante largo tiempo se ha observado una aumento del volumen abdominal (Evans A. 2013) I y Verdugo A. En los casos crónicos se presenta un Salmonella es el principal agente infeccioso en los adelgazamiento paulatino. además resulta interesante recalcar que gran predisponen a la aparición de infecciones (Ramírez parte de la información acerca de vacunas contra A.Página 30 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. 2005). la limpieza constante del criadero. typhi (Dima V et al. ingreso no de vacunas producidas actualmente están destinadas controlado de personal. Sin embargo se sigue requiriendo (Wagner J y Manning P. el 97. el control de sanidad de los (Correa R. adelgazamiento. vacunas contra cepas y serotipos de Salmonella de pelos ásperos y erizados.70% en adultos y 19. amoxicilina. 1989) y S. Estos 65%. 2014). comentó líneas arriba. 2005). que hasta el 95% de muertes de la morbilidad estreptomicina. 2000. Además como ya se Ramírez A (1972) una prevalencia de 65. Matsuura A et al (2010) determinaron los efectos según el estado de desarrollo del cuy que de 40 cepas de Salmonella aisladas a partir de (52. estrés en los cuyes (Figueroa a la industria de aves de corral (Desin T et al. desde posteriores.5% y del alimento balanceado. y el 92. cuáles deben ser las principales medidas de sanidad que deben tomarse. En pocas palabras se requiere de rigurosa investigación científica para poder tener la posibilidad de mejorar la producción del cuy en el país. Typhimurium Cepa atenuada con 0. 1989). Wasfy M. . *Ejemplo de Nomenclatura: Salmonella enterica Serovar Abortusequi = S. 1984. 3(3): 589-596.5% de formalina. aunque en algunos casos llegando a una efectividad del 100%. aún no hay evidencia científica suficiente para poder determinar cuáles son los procesos de la Salmonelosis en el cuy. Typhi (Dima V et al. Conclusiones Actualmente la demanda del cuy viene en aumento tanto al interior del país como en el exterior. Abortusequi (Singh B et al. intravaginal. Reda I. 1975. 46% de protección con S. Reportes de Vacunas Probadas en Cuyes. El-Ebbedy A. aroA-htrA. permite 80-100% de protección. Tyhphimurium. en venta.mutante. 2005). Intramuscular Referencia Singh B et al. Typhi Probado en cuyes recién nacidos. n°2 Mini-Review Tabla 2. Singh B.100% de protección hasta luego de 11 meses. Abortusequi S. se comprobó producción de anticuerpos. Abortusequi Comentario htrA. 1975. Intravaginal y parental. Nafie E. 2005. 1984. La información se resume en la tabla 2. Laboratorios Llaguno. subcutánea. siendo una de las más importantes la salmonelosis. Oral S. 1989. Dima V et al. 2005. A pesar de existir investigaciones que muestren a los serovars Typhi y Enteritidis como los agentes causales de esta enfermedad. cuales son las formas de control que deben Literatura citada Barakat A. S. Cameron C y Fuls J. Smith W y Halls S. Cameron C y Fuls W. Dublin Cepa avirulenta HB 1/17. Typhimurium Bacterina Cuadruple Inactivada. 1975. The Adjuvant effect of Corynebacterium ovis. Immunization of mice and guinea-pigs against Salmonella Dublin infection with live and inactivated vaccine. Dublin (Cameron C y Fuls W. Dublin y 26% contra S. se comprobó producción de anticuerpos. sin embargo se atraviesan serios problemas y pérdidas por causa de enfermedades infecciosas. poca importancia para la crianza de cuyes como S. Barakat A et al. S. Serovar* S. Oral. Vía de Administración Oral. -------------------- S. 1966). Safwat E. S. Gad A. Abortusequi. tomarse en caso de un brote y por sobretodo no existen medidas preventivas bien definidas que nos permitan evitar el desarrollo de la enfermedad.Página 31 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. Revue Scientifique Et Technique De L´Office International Des Epizooties. Subcutánea S. Ecuador y Perú. La Paz y Oruro. 1989. Universidad Politécnica Salesiana. Tesis para obtener el Título de Médico Veterinario. Petrovici M. 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Determinación del Género y Especie de Salmonella en Cuyes Mestizos en Diferentes Sistemas de Crianza en la Comunidad de Oñacapac del Cantón Saraguro. Memoria Primer Seminario Andino de Cuyecultura. present and future. Correa R. Enfermedades infecciosas y Parasitarias en Cuyes. Koster W. Embriología y Patología Veterinaria de la FMV-UNMSM durante el período 2001-2007. 2010. INEI.Página 32 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. Situación de la industria de Cuyes en Colombia. Lacky D. Leguía P. 2014. Draft Reports. Instituto Boliviano de Tecnología Agropecuaria. 1995. imported from Australia. 2013. 2000. Caycedo V. 2009. Lima – Perú. V Curso Latinoamericano de Cuyicultura. Centro Internacional de Investigación para el Desarrollo.org/docrep/w6562s/w6562s00. 2005. 1-65. 1991. Chauca L. Mecanismos Moleculares de Patogenicidad de Salmonella sp. . 85pág. Lima – Perú. Perú: Consumo per cápita de los principales alimentos 2008 – 2009. 42 (2): 63-69. Evans A. Lima – Perú. 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La replicación del ADN consta de tres etapas: iniciación. Este proceso se desarrolla formando horquillas. Por este mismo motivo es importante en el estudio del cáncer. hibridación y extensión. Inverse PCR.com Laboratorio de Microbiología. Universidad Ricardo Palma . la diversidad de aplicaciones que existen han permitido que se generen variantes de la técnica clásica: Nested PCR. A. Boletín Científico. elongación y terminación. 2011). Con la técnica de la reacción en cadena de la . Real Time PCR. con el 14N natural y la incorporación del isótopo de 15N radiactivo. proteínas SSB. para así formar una segunda hebra complementaria (15N) y completar las dos cadenas del ADN (Watson J et al. INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO: Medico A. los cuales se repiten en ciclos para lograr la amplificación. Correo Electrónico: aldhairmedico@gmail. utilizada para amplificar a partir de una o unas pocas copias una secuencia de ADN. RT-PCR.Página 34 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. 2006) (Ochman H et al. n°2 Mini-Review Fundamentos básicos de PCR convencional y sus variantes Médico. 1(2): 3644. propuesta por Watson y Crick (Watson J y Crick F. Fundamentos y aplicaciones R E S U M E N La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular. que ocasiona casi 15 millones de muertes al año en todo el mundo. 1988). Este artículo es un corto repaso de los fundamentos básicos de un PCR convencional y algunas de sus variantes. ya que con ella la célula es capaz de continuar su división celular. es necesario dar énfasis al diseño de cebadores y sus consideraciones básicas. 2013). ADN polimerasa I y III. topoisomerasa. Cebadores. 2014. en la actualidad el PCR es una técnica común e indispensable en los laboratorios de investigación biológica debido a su gran variedad de aplicaciones. demostraron que el ADN celular se replica de la forma. semiconservativa. ARN primasa y ADN ligasa (Karp G. Fundamentos básicos de PCR convencional y sus variantes. 1953). Esta técnica involucra tres pasos principales: desnaturalización. Otras características de la replicación son la secuencialidad y bidireccionalidad desde un punto fijo llamado origen de replicación. Por último. ya que esto aporta la especificidad a la técnica. Introducción Es indiscutible la importancia de la replicación del ADN desde niveles tan simples como el celular hasta niveles ecológicos. El primer objetivo del PCR es desnaturalizar las cadenas sin que se afecte la secuencia de nucleótidos. En la década de los 80. Esto es posible ya que Figura 1. un problema que se Tabla 1. Esquema general de tipos de enlaces en el ADN. Para desarrollar un óptimo PCR se necesitan excelentes cebadores ya que estos les dan especificidad al proceso. 1991) (Saiki R et al. 2003). Fue muy difícil en los primeros experimentos determinar las temperaturas idóneas para la desnaturalización. afectados por este ya que son enlaces covalentes fuertes. 1991). El objetivo del PCR es amplificar ADN hasta obtener un gran número de copias de una secuencia molde. obtenida de Thermus aquaticus (Fig. Hoy en día se realiza este proceso en un equipo denominado termociclador de manera .Página 35 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. Lamentablemente el progreso se vio limitado por la síntesis de cebadores y la purificación de la polimerasa (Kleppe K et al. El uso de una ADN polimerasa termoestable. 1971). porque la ADN polimerasa común variación de temperatura reemplaza a varias se desnaturalizaba a altas temperaturas. de las ADN polimerasa I y III. ¿cuál es el factor que determina que la temperatura sea una gran herramienta en la amplificación de secuencias? Para esto debemos analizar la estructura del ADN (Fig. haciendo de este proceso muy lento y costoso (Erlich H et al. es más. Por el desarrollo de esta técnica Mullis recibió el Premio Nobel de Química en 1993 (Bartlett J y Stirling D. 2). Se aprecia que la fuera termolábil. después de cada ciclo del PCR se debía agregar nuevamente. mientras que los enlaces fosfodiéster no se ven tan por variaciones de temperatura (Tabla 1). a excepción los enlaces puente de hidrógeno son enlaces débiles. Pero. 1). los primeros experimentos de PCR se hicieron a baño María. n°2 Mini-Review polimerasa (PCR) todas estas enzimas. significó un mayor rendimiento en el proceso (Erlich H et al. 1988). (Tomada de: GeneMol: http://genemol. entonces enzimas necesarias in vivo. hibridación y elongación. son reemplazadas por lo tanto se rompen cuando se le aplica calor. Lista de reactivos necesarios para tuvo fue conseguir una ADN polimerasa que no realizar cada proceso. Sin embargo. PCR: ¿Por qué temperatura? La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que fue desarrollada en 1986 por Kary Mullis. Pero debemos saber primero dos cosas: ¿qué son? (Apartado 1) y ¿con qué criterio se diseñan? (Apartado 2). Gobind Khorana en 1971 ya había descrito el principio básico de la replicación de una cadena de ADN utilizando dos cebadores complementarios a los extremos de la secuencia a amplificar.org/ y modificada por el autor del artículo). En este se pueden realizar las variaciones secuenciales repetitivas de temperatura llamadas ciclos con la confianza de que la temperatura del ADN y el tiempo en cada paso sea el correcto.. 3).. a -20°.jpg y modificada por el autor).. aproximadamente.... añade los desoxinucleótidos trifosfatados (dNTPs) mientras se abre camino a lo largo de la cadena de ADN.. Pasos de un ciclo de PCR Cada ciclo consta de tres pasos (Fig.. Extensión (30’’-2 minutos): La ADN polimerasa se adhiere a la cadena tomando como punto de referencia al cebador..qc. todos estos ciclos son precedidos de un ‘inicio’ donde el ADN es desnaturalizado por un tiempo de... con esto se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado (Haras D yAmoros J.60° C generalmente.. Después de todo el proceso se puede colocar la muestra a temperaturas de 4° a 15° si es que se desea conservar a corto plazo (expuesto a acción de nucleasas pero no a formación de cristales de hielo)... Representación de cebadores forward y reverse y su complementariedad de bases con la cadena molde. Figura 2. dependiendo de la cantidad de G/C que tenga. o la unión inespecífica. si se desea a mediano plazo y a -70° .... 5 minutos a 94°-96° C para asegurarse de que tanto el ADN molde y los cebadores estén separados completamente...s vg y modificada por el autor del artículo de revisión) etapa depende del Tm. Hibridación (30’’-2 minutos): Después de separar las hebras de ADN. la temperatura se reduce de modo que los cebadores pueden adherirse a las hebras individuales de ADN. 1. Desnaturalización (1-4 minutos): El ADN molde de doble cadena debe ser calentado hasta los 94-96° C. Los cebadores son cadenas cortas de ADN artificiales de no más de cincuenta nucleótidos (mayormente de 18 a 25 pares de bases) que son complementarios al principio y al final del fragmento de ADN blanco (Rahman M et al 2013). La temperatura incorrecta durante la etapa de hibridación puede resultar en cebadores que no se unen al ADN molde en lo absoluto.ca/images/site/large/thermusaquaticus-dianemontpetitagc. n°2 Mini-Review Apartado 1. 2. Luego de hibridarse es donde la ADN polimerasa actúa y comienza la síntesis de la nueva cadena en dirección 5’ a 3’ (Fig. Y a su vez todos los ciclo son seguidos de un paso de ‘elongación final’. La temperatura de esta Figura 3. bacteria Gram-negativa identificada por Thomas Brock (Tomada de http://www. tamaño de los cebadores y del contenido de G/C de cada uno de ellos y es de 50°. Micrografía de Thermus aquaticus.Página 36 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. .... generalmente de 10 minutos a una temperatura de entre 70° y 74° C.. con el fin de separar las hebras..org/wiki/File:Primers_RevComp. El calor rompe los enlaces puente de hidrógeno que une a las bases nitrogenadas.. El tiempo y la temperatura dependen tanto de la fidelidad y rendimiento de la ADN polimerasa como de la longitud del fragmento de ADN blanco. Cebadores.. El fragmento de ADN a ser amplificado se delimita por los cebadores utilizados.musee-frappier. este proceso es necesario para ADN polimerasas que necesitan activación por calor... 3. (De http://en. 1994).. 4). controlada y programada.wikipedia.. además en cada ciclo. Fase Plateau: No se acumula más producto debido al agotamiento de reactivos y enzima.vk. (Tomado de http://www. 1992). sólo cantidades pequeñas de ADN tienen que estar presentes. La reacción es muy sensible. se hacen limitados. Cambios de temperatura (C°) y tiempo (minutos) controlados en la desnaturalización. así las cadenas más pequeñas de ADN se mueven más rápido que las cadenas más grandes por su menor masa. Previamente se realiza una electroforesis. La electroforesis en gel es un procedimiento que consiste en inyectar ADN en gel y luego aplicarle una corriente eléctrica continua. puede ser de forma vertical u horizontal. Resultados de una corrida de electroforesis con la nucleasas).jpg). Fase lineal: La reacción se ralentiza así como la ADN polimerasa va perdiendo actividad y los reactivos que se consumen. 5). n°2 Mini-Review marcador de ADN. Variantes del PCR Nested PCR (PCR anidado): Es una técnica muy sensible en donde dos conjuntos de cebadores se utilizan en la ejecución de dos PCR consecutivos.me/v412725833/76db/hsbC98fWTs4. Gráfica de amplificación del PCR Puede ser dividida en tres fases (Fig. 2013). Fase exponencial: Esta fase se caracteriza porque la polimerasa está en su máxima actividad y la cantidad de reactivos restantes es alta. El gel por lo general es de poliacrilamida (+ resolución) o de agarosa para ADN/ARN y proteínas (Fig.org/recursos/file.Página 37 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. que contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido. por ejemplo mediante electroforesis. El tamaño del producto de PCR se puede determinar mediante la comparación con un escalera de ADN a la izquierda. Hay dos formas de hacer electroforesis. que se intercala entre las dos hebras del ADN (Garibyan L y Avashia N.php/46/Proyectos/Bi otecnologia/resultado_electroforesis_adn. para evitar que se plieguen de manera indeseada se le agregan sustancias como la betamida y la formamida que rompen los enlaces puente de hidrógeno manteniendo la regla de que la velocidad de migración es inversamente proporcional al tamaño (Karp G. como cebadores y dNTPs.cepazahar. Análisis de resultados El método más común y sencillo consiste en la tinción del producto de ADN amplificado con un colorante químico. En el caso de ADN simple y ARN. 2011). 6): 1. En esta etapa del PCR es en donde se pueden analizar los datos. 2.jpg) o -80° si se quiere a largo plazo (expuesto a formación de cristales pero no a acción de Figura 5. el segundo conjunto es destinado a amplificar un . como por ejemplo el bromuro de etidio (compuesto aromático altamente tóxico y cancerígeno). Como resultado da una migración del ADN a través del gel del polo negativo al polo positivo (esto porque el ADN tiene carga negativa por los grupos fosfato que son atraídos al polo positivo). hibridación y extensión en un ciclo PCR. 3. la cantidad de producto se duplica (suponiendo 100% de eficiencia) (Arnheim N y Erlich H. Figura 4. (Tomado de http://cs412725. Evitar homodímeros: Es importante que un cebador no tenga complementariedad entre más de 3 de los nucleótidos que lo conforman. (Fig. Por lo que un buen diseño de ellos llevará a un óptimo desempeño del PCR. Se conoce también que los cebadores con secuencias inestables (Mucha concentración de A/T o ΔG mayor de -8 kcal/mol) suelen ser más específicos ya que la tasa de apareamiento en lugares incorrectos es menor. de esto depende la cantidad de G/C y A/T (A mayor complementariedad de G/C se tiene menor energía libre de Gibbs) (Fig. También se debe evitar las zonas ricas en poli-A y poli-T ya que es por dónde puede des-hibridarse el complejo molde-cebador (Somma M. Contenido en G/C: La composición de bases del cebador en guanina y citosina debe ser de entre el 50% y 60% y se debe evitar que el cebador contenga zonas poli-G o poli-C que puedan llevar a hibridación inespecífica. Diseño de Cebadores. Tamaño del cebador: Influye en el tiempo y temperatura necesarios para la hibridación y en la especificidad (A mayor tamaño más especificidad ya que eso disminuye el número de lugares posibles de unión). Para eso debemos saber que zonas del ADN molde tienen afinidad entre sí (Fig. También se recomienda que la energía libre de Gibbs sea mayor de -8. Ubicación del cebador: Definir la ubicación antes de ser diseñados teniendo en cuenta un posible rango de variación. Se debe considerar la existencia de dos residuos de G o C en las últimas bases a modo de grapa (por ejemplo GG. 9). Temperatura de hibridación (Th): Es la temperatura utilizada para que los cebadores se hibriden. Ambos cebadores deben tener Th similares porque si no el cebador con Th más alto hibridará inespecíficamente a bajas temperatura mientras que el de Th más baja puede que no hibride a temperaturas altas. En este apartado se verán las consideraciones básicas para el diseño de estos. . Es definida como la temperatura en la cual 50% de los complejos cebador-molde encuentran formados y 50% aún permanecen disociados o sin formarse. Querci M 2007). Un alto contenido de G/C incrementa la temperatura de fusión ya que la unión entre estas bases complementarias tiene 3 puentes de hidrógeno. a diferencia de A/T que solo tiene 2. 8) Estructuras secundarias del ADN molde: Puede que el cebador se vea obstaculizado si la secuencia blanco tiene afinidad entre de bases. Secuencia 3’ terminal: La posición terminal 3’ confiere una unión firme entre el cebador y la secuencia molde. el diseño de un cebador depende de la variante de PCR. Se debe evitar que el cebador deba unirse a zonas con apareamiento de base del molde. generalmente es 4° C menos que la temperatura de fusión y varía directamente proporcional a esta. GCO CG) para que la polimerasa actúe ahí (Figura 6). Una homología parcial en las regiones medias de los cebadores puede que interfiera con la hibridación.Página 38 Laboratorio de Microbiología Volumen 1.0 kcal/mol de preferencia positivo. Temperatura de fusión (Tm): Es una medida de la estabilidad de las secuencias de doble cadena. Evitar heterodímeros: Un heterodímero es la homología entre los dos cebadores. CC. en caso la homología ocurra en los extremos 3’ de cada cebador se dará la formación de dímeros que impedirán la formación del producto por competición. Ya que las regiones de auto-homología pueden formar estructuras parcialmente de dos cadenas que puedan interferir con la hibridación al molde. n°2 Mini-Review Apartado 2. 7). Y esta ubicación debe ser flexible para no perder valiosos nucleótidos de la secuencia de interés. ¿Por qué son importantes los cebadores? La principal razón es porque los cebadores le dan la especificidad al PCR. .rna. (Tomado de Davidson: http://www. Presencia de estructuras secundarias en el ADN molde.rna. Figura 9. Figura 8. Esquema simple de la unión de cebadores a la secuencia molde.22 kcal/mol.edu/ y modificado por el autor del artículo de revisión). (Tomado de The RNA Institute: College of Arts and Science: http://mfold.edu/academics/biology y modificado por el autor del artículo de revisión). Esquema de complementariedad de bases de un cebador de 20 nucleótidos con ΔG de 0. (Tomado de The RNA Institute: College of Arts and Science: http://mfold.Página 39 Laboratorio de Microbiología Volumen 1.albany.davidson. se puede apreciar que en los extremos hay al menos una guanina a modo de grapa. n°2 Mini-Review Figura 7.albany.edu/ y modificada por el autor del artículo de revisión). Página 40 Laboratorio de Microbiología Volumen 1.org/wikipedia/commons/7/7 e/Cycle_range_end-point_PCR. Mediante el empleo de dos o más parejas de cebadores para producir amplicones de tamaños distintos que son específicos para diferentes secuencias de ADN diferentes (Markoulatos P et al. para luego ser separados por Figura 6. en simultáneo. Real Time PCR (PCR a tiempo real): Es una técnica que se basa en el mismo principio que el PCR convencional. pero este método permite amplificar e identificar una secuencia conociendo solo una región interna de la secuencia objetivo es ampliamente usado en genética (Ochman H et al. RT-PCR (PCR transcriptasa inversa): Es una variante de la PCR en la que se usa ARN.jpg y modificada por el autor del artículo de revisión). 2002). 3: producto inespecífico). Determinando si pertenecen al mismo individuo o no. n°2 Mini-Review objetivo secundario dentro del producto de la primera ejecución (Severini G et al. Como la muestra suele ser muy escasa. el PCR puede aumentar la cantidad de ADN amplificando ciertos segmentos polimórficos (variantes en la población). 1993). 1988). Es frecuentemente utilizado en los perfiles de expresión. solo que a este se le añade fluoróforos y además se utiliza un termociclador con sensores de fluorescencia. . Usos y aplicaciones del PCR Huella digital genética: Esta técnica forense permite identificar a una persona comparando su ADN con otra muestra obtenida. durante la amplificación este fluoróforo se une a las moléculas del ADN y los valores de fluorescencia se reportan en cada ciclo (Hirakawa Y et al. Gracias al fluoróforo se miden los productos a medida que se producen. 2: producto específico. b) gráfica de concentración de ADN respecto del número de ciclos empleados c) logaritmo de la concentración de ADN respecto del número de ciclos empleados (Tomada de http://upload.wikimedia. utiliza una enzima transcriptasa inversa para realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). Multiplex PCR (PCR múltiple): Técnica de PCR que permite la detección simultánea de más de una secuencia en una sola reacción. 2010). de la escena de un crimen. (Doak S y Zair Z. incluyendo el inicio de la transcripción y los sitios de terminación. para determinar la expresión de un gen o para identificar la secuencia de un transcrito de ARN. Para luego aplicar un PCR convencional sobre este. o si existe parentesco entre ellas. 2012) Inverse PCR (PCR inverso): Una limitación de la PCR convencional es que requiere cebadores complementarios a ambos extremos de la secuencia blanco. por ejemplo. Gráfica de amplificación del PCR según el número de ciclos empleados a) gel de agarosa donde se realizó la optimización de la cantidad de ADN (en donde 1: escalera. .. se han desarrollado distintas variantes de acuerdo al campo y/o finalidad de su uso. .... 11:30... Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction. los cuales deben compartir con la madre y padre biológicos.F. 133 (3): 1-4. Haras D y Amoros J. Polymerase Chain Reaction Strategy. Medh R. . 1992... XCVI. Biología celular y molecular. Karp G. 6a ed. que al duplicarse también duplicará el gen que nos interesa.. Zaïr Z... 2013. del niño y de él o los presuntos padres y. para así determinar si un individuo porta alguna mutación que explique la presencia de una enfermedad o su aparición en el futuro. Quantitative polymerase chain reaction analysis by deconvolution of internal standard.. D... Kleppe R. que puede introducirse en un vector y luego en un organismo.. 4 (1):43-52. para secuenciarlo o incluso para producir a gran escala la proteína que este gen codifica. Methods in Molecular Biology. Bartlett J y Stirling D. Science... cold probes and clinical diagnosis.: McGraw-Hill Kleppe K. Polymerase chain reaction.... Journal of Molecular Biology. se puede visualizar una serie de fragmentos que tiene el niño. que consta de tres pasos por ciclo (desnaturalización. Metzenberg S. con los cebadores adecuados.Página 41 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. 2012 Real-time reversetranscription polymerase chain reaction: technical considerations for gene expression analysis. Studies on polynucleotides.. 226: 3-6. por ejemplo. Gelfand D.. 1991. Garibyan L y Avashia N. Repair replications of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases.. Sante. hibridación y extensión). Polymerase chain reaction. Detección de enfermedades Cada gen en estudio puede ser amplificado por PCR. 817: 251-70. 56: 341-61. BMC Molecular Biology... Así podemos tener una cantidad suficiente de un gen o ADNc.. Khorana H. Molineux I. Methods in Molecular Biology. A partir de un PCR convencional. Test de paternidad: En esta técnica se amplifica por PCR fragmentos polimórficos de ADN de la madre. Nature. Ohtsuka E. lo que ha permitido estudiar muestras obtenidas desde momias hasta animales y vegetales ahora extintos Conclusiones El conocimiento de los diversos mecanismos moleculares implicados en la replicación ha permitido desarrollar la técnica del PCR y reemplazar el uso de enzimas por variables controladas como la temperatura en aparatos automatizados.. 2011. Sninsky J. Por lo que el uso del PCR se ha extendido a campos desde la biología evolutiva hasta la medicina. A short history of the polymerase chain reaction. 2004.. Análisis de ADN antiguo: Con el PCR se puede analizar ADN que tiene miles de años de antigüedad (siempre y cuando esté en buen estado). 252 (5013): 1643-51. Además el PCR es altamente específico y debe esto principalmente a los cebadores y su diseño.. 61: 131-56. haciendo del PCR una técnica ampliamente usada en el mundo.... Annual review of biochemistry... 2003.. n°2 Mini-Review electroforesis lo que se conoce como ADN fingerprint o huella digital. Erlich H. separándolos mediante electroforesis. y luego ser secuenciados.. Doak S. 1971.. México. 2010. Literatura citada Arnheim N y Erlich H. la que puede ser heredada a sus progenitores y así se maneje su tratamiento. Secuenciación y clonación de genes: La PCR es habitualmente usada para amplificar un determinado gen o un ARNm (representado por un ADNc). Hirakawa Y.. Biología molecular del gen. Horn G. Ochman H. Gann A. Science. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. 1993.[citado 23 Nov 2014]. Giacca M.europa. Gerber A. Journal of Clinical Microbiology.pdf Watson J. Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction. Rahman M. [citado 23 Nov 2014]. Ramos W. Scharf S. Somma M.eu/ capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi% C3%B3n6. Genetics. PCR: A short review. Watson J y Crick F. Cruz A. Camerini. Anwer Khan Modern Medical College Journal 4(1): 30-36. Guerrero P. Venegas D. Disponible en: http://www.ec. 2002. 31(5): 1345. 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Uno de estos organismos utilizados en la ingeniería genética de plantas es Agrobacterium tumefaciens que tiene la capacidad de transferir una secuencia del plásmido Ti al genoma vegetal. . a partir de ello. cuando el botánico Michelli observó hongos en plantas de melocotón. se fosforila la proteína VirG. Correo electrónico: mmarlon14o@hotmail. Esta propiedad. La transferencia comienza con la activación de la proteína receptora virA. y actúa como factor de transcripción para las demás proteínas Vir. bacterias y virus. 2010). principalmente. al igual que los humanos. M. a medida que se desarrollaban nuevas técnicas para cultivar y conservar diferentes tipos de plantas. Esto inició los estudios guiados a la fitopatología. VirE y VirF. Es así que. por interacción con compuestos fenólicos secretados por la planta. operón vir R E S U M E N Los estudios en biotecnología han demostrado que se puede utilizar el mecanismo de infección de microorganismos fitopatógenos para que las plantas expresen moléculas cuya producción actual es ineficiente y de alto costo. las plantas han sido los principales organismos pluricelulares que se han usado como alimento. fuente de vida Desde los inicios de la humanidad. Integración de la Biotecnología Bacteriana y la Ingeniería Genética de Plantas. medicina. causando pérdidas en la productividad de cultivos. por el operón vir del pTi. a este sistema se le denomina vector binario. tumefaciens que no posee una región de TDNA pero sí el operón vir permitiendo la transferencia del TDNA modificado. VirB. La distribución de muchas especies puede llegar a ser global dependiendo del uso al que esté destinado. Esta secuencia se denomina TDNA y el proceso es regulado. como el virus de la papa que afecta al 90% de las plantas cultivadas (Robles L et al.com INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO: Morales M. que producen enfermedades en las plantas (Agrios G. 2014. 2013). área que se ha desarrollado desde 1729. Palabras Claves: Agrobacterium tumefaciens. Las proteínas que se encargan de transportar el TDNA y mantener su integridad son VirD1 y VirD2. dando paso a la determinación de hongos. n°2 Mini-Review Integración de la Biotecnología Bacteriana y la Ingeniería Genética de Plantas Morales. necesitaban de la planta para sobrevivir. ha dado paso a múltiples investigaciones en donde se reemplazan los genes del TDNA por un gen de interés y se acompaña de otro vector de A.Página 43 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. TDNA. En la actualidad mediante la aplicación de esta metodología se pueden obtener plantas transgénicas lo cual permite mejorar la productividad de plantas de importancia económica u obtener sustancias proteicas que son indispensables en otras áreas de la ciencia. el cual está conformado por ocho genes vir (A-H). Las plantas. Boletín Científico. 1(2): 42-51. e inclusive como ornamento. fue en 1997 cuando Chilton M et al. tumoroso que aparecen en la parte basal del eje principal aéreo de la planta. Figura 1. químicos o biológicos. se han identificado genes que son necesarios para . 2). el ambiente y el plantas de tabaco. 2003). concibiendo la idea de que una planta puede expresar un gen que no se encuentre normalmente en su genoma. las células vegetales dañadas tiene la característica de no presentar una pared celular estable lo que conlleva a la alta producción de lignina y flavonoides que permiten dirigir a la bacteria hacia las células susceptibles. denominada así por las agallas de aspecto sistemas (Valderrama A et al. la planta mediante mecanismos moleculares que Posteriormente. 1998). 2003). estas moléculas pueden ser dos proteínas de adhesión en donde se encuentra la vitonectrina y la ricoadhesina. esto se da debido a que Agrobacterium reconoce células vegetales que se encuentran dañadas por factores físicos. la inducción del sistema de virulencia. A partir de ello se comenzó a investigar este mecanismo con el fin de El proceso colonización bacteriana incluye la adherencia del patógeno a la raíz o tallo de la planta. no obstante. tumefaciens (Escobar M y Dadenlar A. estos procesos se pueden sintetizar en cuatro pasos fundamentales: la colonización bacteriana. Sin embargo. En este proceso resalta la participación de un plásmido denominado Ti (Tumoral inductor – “inductor del tumor”) (Fig. se determinó que estos fragmentos involucran una serie de interacciones genéticas que contribuyen a que la bacteria sea capaz de adherirse a la planta y causar la tumoración y transferencia de ADN. procedentes de un bacilo hospedero. o inclusive Una de estas enfermedades es la “Corona de expresar moléculas difíciles de obtener en otros Agallas”. “Corona de Agallas” causada por A. de ADN contenían genes que inducían la formación de tumores en las células vegetales. n°2 Mini-Review De las bacterias a las plantas realizar un mejoramiento genético. (De la Riva G et al. y la integración del T-DNA en el genoma de la planta. por otro lado.Página 44 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. sin embargo este proceso no ha sido descrito genéticamente (Llop P. ya que dichas células vegetales secretan sustancias fenólicas de bajo peso molecular como acetosiringona e hidroxiacetosiringona que son reconocidos por la bacteria. y fue descrita por primera vez por vegetal Fabre F y Dunal F en 1853. ya que eran introducidos mediante un mecanismo de transferencia al genoma de las plantas. la generación del complejo de transferencia (T-DNA). generalmente en la Transferencia de ADN (T-DNA) en la célula base del caule. la bacteria se une a la célula mediante la acción de una molécula en la pared celular sensible a proteasas que es reconocida por la bacteria. reconocieron El desarrollo de la enfermedad está ligado a la fragmentos de ADN en los tumores axénicos de interacción entre el patógeno. 2005). Es así que la investigación causó gran impacto en el área de la genética de plantas. El patógeno coloniza las heridas e infecta gramnegativo: Agrobacterium tumefaciens. posteriormente. El VirA es un receptor dimérico ubicada en el peptidoglicano y la membrana interna. . 1998). virC. virB. que se une a la proteína ChvE la cual reconoce los compuestos fenólicos secretados por la planta y por acción de un sensor kinasa (1). la inducción del sistema de virulencia se refiere a la expresión del operón vir. formando el complejo virTDNA (4). La generación del T-DNA se da mediante la expresión del gen virD2. y que funciona como factor de transcripción para la expresión de los demás genes vir (3) (De la Riva G et al. principalmente. el cual funciona como endonucleasa uniéndose a los bordes (Right border y Left border) del plásmido en el sentido 5’ – 3’. ubicado en la región del VirA que se encuentra en el citoplasma. En segundo lugar. mientras que los otros no se consideran relevantes en la transferencias de ADN: virF y virH. el cual consta de 8 genes: 6 de ellos se han determinado como esenciales: virA. n°2 Mini-Review esta acción como: chvA y chvB. virD.Página 45 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. 2012). virE y virG. que capta los grupos fosfatos del ATP y fosforila al VirG (2) ubicado en el citoplasma de la bacteria. además se añade la función de las proteínas VirE2 que ayuda en el transporte del TDNA y su Figura 2: Mecanismo molecular de la transferencia del TDNA del pTi al genoma vegetal. La proteína VirD2 es la más importante en este proceso ya que guía al TDNA desde el citoplasma bacteriano al genoma de la planta (Rodríguez L. 2013). para facilitar la identificación de una transferencia exitosa. (der. residuos que facilitan la purificación (Ej. es reconocido por las chaperonas de la planta: RocA. este plásmido se utiliza con otro vector que posee el gen de interés con el fin de obtener varias copias del plásmido. como pT7-Blue y pBluescriptII. 2002). Roc4 y CypA (8) que mantienen la inserción del TDNA en el genoma de la planta (Valderrama A et al.Página 46 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. el complejo virTDNA es internalizado en el núcleo de la célula vegetal por la proteína VirD2 el cual contiene dominios de recombinación y ligación (Bako L et al. el vector de expresión presenta un gen que da resistencia a herbicidas. y con la participación de histonas como la H2A (Tzfira T y Citovsky V. que reconocen al virE2 para permitir la integración del TDNA. Tomado de: http://concienciadeplantas. His-6) y un terminador (Shoji Y et al. por otro lado. La ingeniería genética ha encontrado un beneficio propio en la obtención de plantas transgénicas. 2).blogspot. 2003). Existen. actualmente. vectores comerciales con sitios múltiples de clonación (MCS). Es así que se utiliza un sistema de vector binario. 3). n°2 Mini-Review integración (6) (Wroblewski T et al. así se puede tratar a las plantas con dichas sustancias y si no resultan afectadas entonces la transferencia del gen es satisfactoria (Cubero J. Además actúa la proteína VirF cuya función no está completamente determinada. 2001). y subclonado en un plásmido de expresión que posee un promotor. existen proteínas de la planta.html . Finalmente. como Vip1. el plásmido Ti se ha “domesticado” inhibiendo la síntesis de genes de inducción de tumor y desarrollo de la enfermedad y manteniendo los genes de transferencia de ADN: el operón vir (Gutarra B. además. 2005). también.com/2013/03/tecnicas-que-empleamos-parte-1. Además. La transformación: Base de la Ingeniería Genética A partir del mecanismo anterior. 2008). pero se cree que actúa inactivando las enzimas que puedan degradar el TDNA mediante proteólisis (7) (Schrammeijer B et al.) Vector con el gen de interés. 2005). (izq. Este complejo ingresa en el citoplasma de la célula hospedera mediante la acción de las proteínas VirB1-11 y VirD4 los cuales unen la membrana celular de la bacteria con el citoplasma de la célula vegetal (5) formando un puente similar a un proceso de conjugación (McCullen C y Binns A. 2006) (Fig.) plásmido Ti “desarmado”. 2004) (Fig. en los que se ha insertado el gen del Figura 3: Sistema de Vector Binario. 2000) . En nuestro país. el uso de los transgénicos para las actividades mencionadas anteriormente no está permitido debido a la proclamación de la Ley N° 29811 que impide el ingreso. y simultáneamente. Aplicaciones de la Transformación de Plantas mediado por Agrobacterium tumefaciens La ingeniería genética en microbiología y en botánica ha permitido la obtención de organismos genéticamente modificados (OGM). potencial hídrico. en la actualidad. producción y liberación de OGM en el territorio nacional por un periodo de 10 años. es posible la venta de semillas de esta plantas transgénicas (Sebiot. e inclusive pesticidas. y longevidad y sus usos van desde cultivos. Plantas Transgénicas permitidas en Europa. Europa es el principal continente donde se ha permitido el uso de algunos transgénicos que poseen resistencia a herbicidas y plagas. además. 2000). es necesaria la investigación en las áreas de la biotecnología bacteriana y vegetal con el fin de comprobar la viabilidad y uso de los organismos genéticamente modificados y transformados por acción de Agrobacterium tumefaciens. se debe equipar. 2007). tales como colores. alimentación. el cual fue subclonado en otro plámsido comercial de A. tumefaciens: pCAMBIA1390.Página 47 Laboratorio de Microbiología Volumen 1. generalmente. como plagas principalmente. procesamiento. resistencia a factores abióticos como temperatura. Para ello. producción de colores. 2004). además se está evaluando la posibilidad de expresar proteínas cuya producción es baja y poco efectiva y que tienen una importancia en el área de salud. el cual está diseñado con el marcador de resistencia a higromicina. Sin embargo. los cuales pueden expresar características deseables. ornamentación e importaciones (Cuadro 1). n°2 Mini-Review IFNγ controlado por promotores de αAmy y Ubiquitina. 2012). Organismo Característica Usos Maíz Bt-176 Resistente a Pyrausta nubilalis“Taladro” Todos los usos Maíz MON-810 Resistente a Pyrausta nubilalis“Taladro” Todos los usos Maíz T25 Resistente a glufosinato de amonio (herbicida) Maíz Bt-11 Resistente al “taladro” y al glufosinato de amonio Tabaco Resistente a bromoxinil (herbicida) Soya A-5403 Resistente al glifosato (herbicida) Achicoria Tolerante al glufosinato de amonio (herbicida) Todos los usos Importación y procesamiento Cultivo Importación y procesamiento Cultivo Claveles Nuevos colores Ornamentación Claveles Mayor Longevidad Ornamentación Extraído de : “Plantas Transgénicas: Preguntas y Respuestas (Sebiot. y bióticos. tales como las moléculas del sistema inmunológico o antígenos para la producción de proteínas recombinantes (NSTA. es decir que aquellas plantas que hayan sido transformadas deberán ser resistente a este antibiótico y expresar el IFNγ (Chen T et al. Conclusiones Es así que a partir de una patología que parecía tener la capacidad de causar un grave impacto en la economía de la agricultura y más aún en la Tabla 1. adaptar y desarrollar una infraestructura necesaria para la evaluación de estos organismos y su aceptación en el país (MINAM. Cell. Umeda M. 1998. virF. Córdoba: Mundi-Prensa: 375 – 380. 2004. Literatura citada Agrios G. 40:46. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plants transformation. Expression of bioactive human interferon-gamma in transgenic rice cell suspension cultures. la inducción del sistema de virulencia a partir de los genes virA y virG. Trends in Plant Science. McCullen C y Binns A. 800 . Lin Y. Cubero J. Agrobacterium tumefaciens and Plant Cell interactions and activities required for Interkingdom Macromolecular Transfer. 2004. 2006. Llop P. Ayra C. Reglamento de la Ley Nº 29811. 11(2): 263-271. Universidad de Valencia — España. Tiburcio A. virH. 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