Biotecnologia de La Reproduccion

Transferencia de embrionesPrefacio Con la finalidad de incrementar la tasa reproductiva de la hembra bovina se desarrolló la transferencia de embriones hace 20 años. La experiencia obtenida en ese tiempo indicó que el efecto de la transferencia de embriones sobre la multiplicación de la descendencia es limitado, sin embargo permitió el desarrollo de una nueva constelación de biotecnologías al permitir disponer de embriones en estadios tempranos durante su tránsito uterino. En la actualidad los embriones bovinos son congelados, divididos, clonados, microinyectados y cultivados in vitro durante un tiempo más o menos prolongado. La necesidad de disponer de un gran número de embriones en estadios más tempranos, durante su tránsito oviductal, motivó el estudio y desarrollo de su pro-ducción in vitro. Este libro fue escrito para médicos veterinarios, genetistas, biólogos, estudiantes de medicina veterinaria y biología, interesados en los fundamentos básicos e implementación práctica de la manipulación embrionaria como así también en los actuales métodos biotecnológicos de la reproducción bovina y su impacto genético. El contenido del mismo fue dividido en tres partes para su mejor desarrollo y comprensión. La primera parte describe en detalle la información descriptiva, el modus operandi y los resultados obtenidos y esperables con el empleo de la transferencia de embriones. Se dio especial importancia a la descripción y discusión de los diferentes métodos y técnicas como así también a los tratamientos más empleados. En la segunda parte se presentan las biotecnologías asociadas que son aplicadas en la práctica y las que se encuentran aún en la fase experimental. De las técnicas aplicadas en la rutina médicoveterinaria los autores hacen referencia a las que fueron desarrolladas o aplicadas en sus laboratorios y en los de otros autores. De aquellas sobre las que no existe aún información suficiente en la especie bovina, se recurrió a la descripción en otras especies. En la tercera parte se hace referencia a las aplicaciones de las biotecnologías descriptas en la producción animal, considerando estrictamente sus efectos sobre el mejoramiento genético. Es nuestro deseo que este libro contribuya a responder a las necesidades e interrogantes de profesionales y estudiantes y con ello a desmistificar la técnica de la transferencia de embriones y sus biotecnologías asociadas en la especie bovina. G.A. Palma G. Brem Munich, enero de 1993 Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Indice de autores Indice de autores Ricardo H. Alberio. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria, Prof. titular de la Cátedra de post-grado de Fisiología Animal de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Mar del Plata. Técnico del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Balcarce. Depto. de Prod. Animal, Unidad Integrada FCA-INTA. C.C. 276. 7620 Balcarce, Buenos Aires. República Argentina. Ulrike Berg. Farmacóloga, Dr. en Ciencias Naturales. Miembro del staff científico de la Cátedra de Producción Animal Molecular de la Universidad Ludwig-Maximilian, Munich. Lehrstuhl für Molekulare Tierzucht der Ludwig-Maximilians-Universität, München. Veterinärstraße 13, 8000 München 22. República Federal de Alemania. Gottfried Brem. Med. Vet., Ing. Agr., Dr. en Medicina veterinaria. Prof. titular de la Cátedra de Producción Animal Molecular de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich, República Federal de Alemania Miembro ordinario de la Academia de Ciencias de Rusia. Prof. invitado de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Budapest, Hungría. Lehrstuhl für Molekulare Tierzucht der Ludwig-Maximilians-Universität, München. Veterinärstraße 13, 8000 München 22. República Federal de Alemania. Jorge Cabodevila. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Prof. Adjunto de la Cátedra de Obstetricia y Ginecología de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional del Centro de la Pcia. de Buenos Aires. Pinto 399, 7000 Tandil, Buenos Aires. República Argentina. Annette Clement-Sengewald. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Miembro del staff científico de la Cátedra de Producción Animal Molecular de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich. Miembro científico del Laboratorio para la investigación del clonado de Bavaria. Bayerische Klonierungs-forschungsgesellschaft GmbH & Co KG. Hackerstraße 27, 8042 Badersfeld. República Federal de Alemania. Peter Dovc. Ing. Agr., Dr. en Ciencias Agrarias. Miembro del staff científico del Instituto de Producción Animal de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich, República Federal de Alemania. Institut für Tierzucht der Ludwig-Maximilians-Universität München. Veterinärstrße 13, 8000 München. República Federal de Alemania Horst Kräußlich. Ing. Agr., Dr. en Ciencias Agrarias. Prof. emérito de la Cátedra de mejoramiento Animal y Director del Instituto de Producción Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich. Dr. honoris causa otorgado por la Universidad de Gödöllö, Hungría. Dr. honoris causa otorgado por la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich, Alemania. Institut für Tierzucht der Ludwig-Maximilians-Universität, München. Veterinärstraße 13, 8000 München. República Federal de Alemania. Gustavo A. Palma. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Prof. libre de la Cátedra de Anatomía y Fisiología Animal de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Mar del Plata, Argentina. Miembro de la carrera de investigador científico del Concejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Argentina. Miembro del staff científico de la Cátedra de Producción Animal Molecular de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich. Miembro científico del Laboratorio para la investigación del clonado de Bavaria. Bayerische Klonierungsforschungsgesellschaft GmbH & Co KG. Hackerstraße 27, 8042 Badersfeld. República Federal de Alemania. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Transferencia de embriones Horst Reichenbach. Med. Vet., M.Sc., Dr. en Medicina Veterinaria. Miembro del staff científico de la Cátedra de Producción Animal Molecular de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich. Lehrstuhl für Molekulare Tierzucht der Ludwig-Maximilians-universität, München. Hackerstraße 27, 8042 Badersfeld, República Federal de Alemania. Gonzalo Rivera. Med. Vet., becario del Concejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Argentina. Laboratorio de Reproducción y Lactancia (LARLAC, CONICET). CC. 855, 5500 Mendoza, República Argentina. Sergio Torquati. Med. Vet. Centro Integral Bahía Blanca de Inseminación Artificial (CIBBIA). Ruta 35. Km 9,5; 8000 Bahía Blanca, Buenos Aires. República Argentina. Eckard Wolf. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Miembro del staff científico de la Cátedra de Producción Animal Molecular de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad LudwigMaximilian de Munich. Lehrstuhl für Molekulare Tierzucht der Ludwig-Maximilians-universität, München. Veterinärstraße 13, 8000 München 22. República Federal de Alemania. Abreviaturas y símbolos Abreviaturas y símbolos AA ADN AMPc ADNc ARNm B Be Bp BSA Bt PT, BV CE CG Cito B CL COB COB Cov G d DMSO E E2 ec eCG EPE-HAP ES FD FF FIV FSH FSH-p GH G/L GnRH h h2 HCG HE HMG IA IETE IGFI LH LUV M Mt MC Mc MCCG MCCO aminoácidos ácido desoxirribonucleico adenosin monofosfato cíclico ácido desoxirribunucleico complementario ácido ribonucleico mensajero blastocisto blastocisto expandido blastocisto protruido bovine serum albumin, albúmina sérica bovina blastocisto temprano padres de toros ciclo estral células de la granulosa citocalasina B cuerpo lúteo células del oviducto bovino complejo ovocito blastómero covalencia progreso genético día dimetilsulfóxido embrión estradiol células embrionarias equine corionic gonadotropin, gonadotrofina coriónica equina extracto de pituitaria equina célula embrionaria primordial totipotente folículo dominante fluido folicular fecundación in vitro follicle stimulant hormone, hormona folículoestimulante follicle stimulant hormone porcine, hormona folículoestimulante de origen porcino growth hormone, hormona de crecimiento, somatotrofina intervalo generacional gonadotropin realising hormone, hormona liberadora de gonadotrofinas hemi heredabilidad human corionic gonadotropin, gonadotrofina coriónica humana hemi-embriones gonadotrofina menopáusica humana inseminación artificial International Embryo Transfer Society, Sociedad internacional de transferencia de embriones Insulin like growth factor I, factor de crecimiento similar a la insulina hormona luteinizante luz ultravioleta mórula mórula temprana microcirugía mórula compacta medio condicionado con células de la granulosa medio condicionado con células del oviducto Palma & Brem Transferencia de embriones y biotecnología MCI MFCZ MOET MP MPM MV, KM OD OI OT pb, pB PBS PBSS P4 PCR PEG PGF2 PIV PLFR PMSG PV, KV RN RS SOTE SFB SVC STH TL TE VEM VNTR ZP masa celular interna medio de fusión celular de Zimmermann multiple ovulation and embryotransfer, ver SOTE membrana pelúcida modified Parker's medium, medio Parker modificado madres de vacas ovario derecho ovario izquierdo oxitocina pares de bases solución fosfatada bufferada solución fosfatada bufferada con suero progesterona polymerase chain reaction, reacción en cadena de polimerasa polietilenglicol prostaglandina F2 producción in vitro restrictions-fragment-large polymerase pregnancy mare serum gonadotropin, gonadotrofina sérica de yegua preñada padres de vacas reproducción normal respuesta superovulatoria superovulación y transferencia de embriones suero fetal bovino suero de vaca en celo somatotropin hormone, hormona somatotrófica tirodes lactato transferencia de embriones valor de la eficiencia de los mellizos variable numberd tandem repeats zona pelúcida Biotecnología 1 BIOTECNOLOGIA EN PRODUCCION ANIMAL A. Clement-Sengewald, G. Palma & G. Brem Introducción La mayor intervención del hombre en el pool genético de los actuales animales domésticos fue a través de la domesticación. Ninguna otra medida productiva puede o podrá afectar el componente genético poblacional en una forma tan completa. En los comienzos de la domesticación el hombre no produjo cambios en la reproducción de los animales. De esta forma se mantuvo la selección natural. Posteriormente se observó que la reproducción programada de los animales conducía a un aceleramiento de la selección. A través del aprovechamiento de la variabilidad genética podían criarse animales, que respondían mejor al fenotipo establecido, o sea aquellos que poseían las características externas deseadas. Con el tiempo se establecieron programas de mejoramiento que no respondían solamente al deseo de una persona sino de varias y más tarde al objetivo de agrupaciones de criadores. El empleo de la genética poblacional como también de los métodos genético-estadísticos permitió, junto con la aplicación de la inseminación artificial, el desarrollo de exigentes programas de selección y evaluación de la descendencia. Con el desarrollo de la biotecnología se alcanzó un nivel, en el cual es posible la manipulación dirigida del genoma o determinados genes con mayor rapidez. Es posible además alcanzar la manifestación de algunas particularidades productivas, las cuales con la selección natural o programas de mejoramiento serían difíciles de alcanzar. Las técnicas reproductivas, mediante las cuales es posible afectar el genoma de los animales (cuadro 2), se diferencian de las técnicas génicas, las cuales se ocupan de los genes en forma individual (cuadro 3). Técnicas reproductivas Las técnicas reproductivas abarcan la inseminación, la congelación de semen, la micromanipulación, la producción in vitro, el clonado y la congelación de los embriones. Los tratamientos hormonales de inducción y sincronización del celo de las hembras receptoras de semen y embriones como así también de las donantes de embriones, garantizan en muchos casos que las mencionadas técnicas se cumplan con éxito. La técnica reproductiva de mayor aplicación es la inseminación artificial (IA) y con ella la congelación de semen. A pesar de la resistencia presentada originalmente por razones éticas se reconoció rápidamente una de las ventajas de la IA con la disminución de las enfermedades infecciosas transmitidas a través de la cópula. Con la misma celeridad se observó que era posible obtener una mayor descendencia de un solo macho dividiendo el semen de un eyaculado en porciones e inseminando con las mismas varias hembras simultáneamente. De esta forma es posible aprovechar el potencial de los machos en forma intensiva y mejorar así la estimación del valor genético de los reproductores, dado que las particularidades heredables son mejor evaluadas con un gran número de hijos. La conservación de semen congelado en nitrógeno líquido posibilitó su almacenamiento durante décadas, sin que ello afecte la fertilidad del mismo. La IA juega, junto con la congelación de semen, un rol de importancia en la producción bovina. La inseminación artificial en las especies ovina, porcina y equina no alcanzó un significado equivalente al existente en la especie bovina. En las dos últimas es necesario modificar aún los métodos empleados para mejorar los resultados. La técnica de inseminación artificial por medio de laparoscopía en la especie ovina permite actualmente obtener resultados satisfactorios, lo que abrió las posibilidades del comercio internacional de semen. La transferencia de embriones es una técnica reproductiva en constante desarrollo. Su evolución es observable particularmente en la especie bovina. La TE asociada a la superovulación de las donantes (capítulos, II al VIII) puede aumentar considerablemente el número de la descendencia por donante y de esta forma multiplicar el componente genético materno (capítulo XVII). En la tabla 1 se resume el significado que tiene la transferencia de embriones actualmente en Europa. Lamentablemente se Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 2 Clement-Sengewald, Palma y Brem dispone de poca información de la TE en países sudamericanos aunque las actividades y comercialización con embriones frescos y congelados son actualmente relevantes en Argentina (cuadro 1), Brasil y Paraguay. Tabla 1: Transferencias de embriones en Europa durante el año 1991 (8th Scientific Meeting, A.E.T.E., Lyon, 11-12 sept. 1992) Embriones por donante Útiles Transferidos (n) frescos % 5 62 5 54 4 59 6 32 3 43 4 71 6 49 5 50 3 50 6 63 Pais Alemania Bélgica Francia Holanda* Inglaterra* Checoslovaquia Union Soviética* Irlanda España Italia Lavajes de donantes (n) 4170 2169 7896 2521 2141 1507 4800 979 306 1060 Σ 9 8 8 s.i. s.i. 7 10 7 7 9 Congelados % 38 46 41 68 57 29 51 50 50 37 s.i.: Sin información; *: registros de la misma fuente del año 1990 Producción de terneros por medio de transferencia de embriones durante un año (7.917.92) en la República Argentina (Memorias de la Sociedad Rural Argentina, 1992) Raza Aberdeen Angus Holando Argentino Hereford Limousin Fleckvieh Otras Total Descendencia (n) 804 704 556 129 83 121 2897 Cuadro 1: A través de la TE es posible aumentar el progreso genético, porque a través del aumento del número de embriones y terneros el potencial genético de la hembra puede reproducirse y emplearse con más eficacia. Razas y animales exóticos pueden, según las necesidades, reproducirse rápidamente. La eficiencia de los programas de selección y cruzamiento aumentan considerablemente con la aplicación de la transferencia de embriones. Junto con la TE es preciso también mencionar la congelación de embriones por medio del método estándar y vitrificación (capítulo IX). El almacenamiento de los embriones congelados se lleva a cabo en nitrógeno líquido (-196oC). De la misma forma que el semen los embriones pueden almacenarse durante décadas. Las ventajas que ofrece esta técnica es una mayor eficacia y ahorro en el uso de las receptoras en un programa de TE, facilidad en el transporte de los embriones y en consecuencia la posibilidad del comercio de material genético. De esta forma los animales nacen en el lugar de destino y se adaptan al macro- y microclima Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com Biotecnología 3 de la región. La congelación de los embriones permite la formación de reservas genómicas en forma de bancos de embriones. Ello tiene particular importancia en la conservación de razas en peligro de extinción, cuya producción y mantenimiento en establecimientos ganaderos son sumamente costosos. Cuadro 2: Objetivos de las técnicas reproductivas en el bovino - IA y Congelación de semen Combate y disminuye enfermedades sexuales Empleo intensivo del potencial genético del macho y mejoramiento de la estimación del valor genético (prueba de la descendencia) - Sincronización del celo inducción de la ovulación y el parto Facilidad en el manejo reproductivo y productivo Disminución de la mortalidad neonatal - Superovulación, TE, congelación de embriones Optimización del potencial de la hembra Rápida reproducción de individuos exóticos o razas en peligro de extinción Formación de bancos de reservas genómicas Facilidad en la importación y exportación del material genético - Manipulación y microcirugía de embriones para la producción de mellizos monocigotas y quimeras Aumento del número de animales nacidos por embrión recolectado Optimización de la estimación del valor genético Creación de modelos de investigación - Determinación del sexo Selección del sexo de acuerdo a los objetivos establecidos - Producción in vitro de embriones Ahorro de donantes Producción de embriones de vacas donantes que no responden a los tratamientos superovulatorios - Clonado de embriones por medio de transferencia nuclear Variabilidad libre de recombinaciones de genotipos individuales Aumento del número de terneros por embrión La TE posibilitó la microcirugía de los embriones, con la producción de mellizos monocigotas (capítulo X) y quimeras a través de la combinación de mitades de embriones diferentes. Por medio de la división de los embriones es posible aumentar el número de embriones producidos en un programa convencional de TE de 0,6-0,7 a 0,9-1,2 terneros por embrión dividido. Los mellizos producidos de esta forma constituyen modelos adecuados en producción animal e investigación. Las pruebas llevadas a cabo con mellizos idénticos permite una mayor exactitud de la estimación del valor genético de los padres, dado que la varianza de los mellizos es menor que las de los hermanos enteros y medio hermanos (capítulo XX). Posibilita también la evaluación de la influencia ambiental sobre los reproductores; si los animales idénticos se crían en medios diferentes su condición genética idéntica facilitará la determinación de cada diferencia ambiental (foto 1). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 4 Clement-Sengewald, Palma y Brem Foto 1: Mellizos monocigotas de la raza Fleckvieh producidos por medio de Micromanipulación (BREM, capítulo X) La producción microquirúrgica de quimeras puede llevarse a cabo de dos formas. En primer lugar a través de la inyección de células en el blastocele de embriones, en este caso se espera que las células inyectadas tomen parte en el desarrollo del embrión. Otro método es la producción de quimeras a través del agregado de embriones o hemi-embriones diferentes en una misma zona pelúcida (figura 1). Las dos o más mitades o embriones enteros a agregar son liberados de la membrana pelúcida y posteriormente las combinaciones deseadas nuevamente transportadas a una zona pelúcida común. El nuevo embrión, producto del agregado, se organiza rápidamente y se transfiere de acuerdo con el programa convencional. Embrión I Embrión II Embrión I Embrión II Fig. 1: Modelo de producción de quimeras a partir de varios embriones Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com Biotecnología 5 Si se emplea como marcador el color de piel, la presencia de la quimera se determinará por los diferentes colores del pelaje (foto 2). Foto 2: Quimera producida con las razas Fleckvieh y Murnau Werdenfelser (BREM, 1986) Las quimeras se emplean en la investigación genética básica de mutaciones y fallas genéticas dado que es posible establecer como se comportan dos líneas diferentes en un individuo y su efecto sobre el desarrollo corporal. Intensos trabajos de investigación en los últimos 10 años hicieron posible la producción in vitro (PIV) de embriones (capítulo XI) y de la misma forma su cultivo hasta estadios transferibles en condiciones convencionales. Las ventajas de la PIV de embriones son numerosas: disminución del costo de los embriones, disponibilidad de embriones en estadios tempranos de desarrollo a bajos costos, dado que con la producción in vivo la recolección de los embriones del oviducto se lleva a cabo por medio de cirugía. El número de donantes pude reducirse. La PIV de embriones puede ser utilizada además en aquellos casos en los cuales una vaca no puede ser sometida a los lavajes convencionales o debe ser sacrificada. Esto es particularmente importante cuando se trata de animales de alto valor genético como así también razas en peligro de extinción (foto 3). Foto 3: Ejemplar de la raza Murnau Werdenfelser en peligro de extinción, obtenido por medio de la producción in vitro de embriones (BERG, capítulo XI) www.reprobiotec.com Biotecnología de la Reproducción 6 Clement-Sengewald, Palma y Brem Hace pocos años se emplea la técnica de transferencia nuclear en la producción de clones, esto es, la posibilidad de producir varios embriones genéticamente idénticos (capítulo XII). Con ayuda del clonado es posible transferir algunos embriones para probar los animales nacidos mientras otros tantos permanecen congelados. Si el resultado de las pruebas es positivo los embriones pueden descongelarse emplearse como donantes de blastómeros en un reclonaje. En teoría se dispone de un número ilimitado de núcleos para nuevos reclonados. Las aplicaciones de esta técnica son interesantes como numerosas: las pruebas de evaluación con estos animales es más exacta por la menor variabilidad genética de los clones, posibilitando una evaluación más precisa de las influencias ambientales. Ahorra animales de experimentación y de prueba (por ejemplo, descendencia) frente a aquellos con un menor vínculo familiar. Con la multiplicación de animales de alto valor genético puede acelerarse el progreso genético. Además es posible destinar un embrión para diagnosticar el sexo del clon, lo que permite seleccionar los animales producidos también por su sexo. Técnicas génicas Las técnicas génicas conocidas también como de ingeniería genética incluyen el clonado de genes, el análisis de los mismos para el diagnóstico de determinadas variantes génicas, que llevan consigo particularidades positivas o negativas y la transferencia génica (Cuadro 3). Cuadro 3: Objetivos de las técnicas génicas en producción animal - Producción génica de productos a través de la transformación de células de levaduras, de bacterias o de animales mamíferos con un ADN recombinante in vitro - Formación de un banco de genes para la conservación de material genético - Modificación génica de los microorganismos del rumen con el objeto de alcanzar una digestión más eficiente y la disposición endógena de producir componentes metabólicos esenciales - Métodos analíticos (Análisis génico) Ayuda en la orientación de análisis génicos posteriores Estudio de la relación entre marcadores ADN e importantes características productivas - Diagnóstico Estudio genético y diagnóstico de fallas genéticas Determinación de variantes génicas definidas para características deseadas Determinación de la identidad de la ascendencia de animales reproductores ("impresión digital ADN") - Transferencia de genes Mejoramiento de la calidad de productos animales Producción de animales resistentes a enfermedades Mejora de la eficiencia productiva Producción de proteínas (Gene Farming) En la técnica de producción génica de sustancias por medio de la transformación de células de levaduras, de bacterias o de mamíferos se introduce un ADN recombinante en las células a fin de capacitarlas en la producción de proteínas. De esta forma pueden producirse hormonas, vacunas y otras sustancias en forma idéntica a la natural, pura y a bajos costos. Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com Biotecnología 7 El empleo de microorganismos ruminales modificados génicamente permitió reducir el nivel de hidrólisis de nitrógeno, la proteólisis y la producción de lactato regulando la relación de acetato, propionato y butirato. A través de los organismos ruminales modificados genéticamente se espera una digestión más eficiente y una mejora de la disponibilidad de aminoácidos y vitaminas. Este método de técnica génica se encuentra aún en la fase de prueba y sometido a discusión sobre su libertad de aplicación, dado que los microorganismos del rumen son liberados también en el ambiente. El análisis genómico tiene el objetivo de describir una especie animal en forma progresiva y completa con ayuda de métodos celulares y génicos. El mismo pretende identificar los genes y analizar sus secuencias de nucleótidos para aclarar finalmente el modo de efecto de genes o complejos de ellos (capítulo XV). Contrariamente a la especie humana, sobre la cual se discute el conflicto ético de analizar la totalidad del genoma, ese aspecto no juega rol alguno en producción animal. Un análisis completo significa, sin embargo, costos y esfuerzos muy grandes, razón por la cual sólo se llevan a cabo análisis parciales. Los conocimientos obtenidos en la especie humana, más avanzados que en otras especies, convierten a la primera en una modelo adecuado para el análisis del genoma de los animales de interés zootécnico. Una vez identificado el gen deseado pueden buscarse las variantes naturales del mismo y emplear los animales portadores en programas de mejoramiento. El número de genes identificados en animales de interés productivo no supera en la actualidad los 100. En el hombre se identificaron hasta ahora más de 3000 genes. El análisis genómico comprende 3 áreas: Mapa génico Análisis de acoplamiento Caracterización individual de genes El mapeo génico pretende determinar la localización de características heredables en los cromosomas y establecer una relación lineal entre ellos. Entre los métodos de mapeo se incluyen el empleo de híbridos celulares, la hibridación in situ, la microdisección cromosómica y la subordinación de una característica al efecto conjunto de varios genes. Los mapas génicos sirven de orientación en el genoma. Cuanto más exacto es el conocimiento de la estructura y localización individual de los genes, más exacto es el reconocimiento de la totalidad del genoma. El análisis de acoplamiento genético pretende determinar la distancia entre dos localizaciones génicas. En producción animal se intenta establecer una relación entre marcadores ADN y características de importancia productiva. De esta forma el marcador ADN se convierte en el punto de partida del segmento que contiene el gen de interés. Actualmente se dispone de dos métodos de análisis de acoplamiento genético: polimorfismo del largo del fragmento de restricción (restrictions-fragment-large-polimorphisms) PLFR y el VNTRs. El PLFR basa su actividad en la capacidad de las enzimas de restricción de cortar una cadena de ADN sólo en aquellas posiciones donde se encuentran las secuencias de bases que responden a la enzima de restricción. Si se modifican sólo los pares de bases, se originan fragmentos de restricción de diverso largo, que pueden separase con ayuda de electroforesis en gel. Si la característica en cuestión aparece en una familia, se aisla el ADN de cada uno de los miembros y con ayuda de enzimas de restricción y una sonda de ADN se producen muestras fragmentadas. Cuando el marcador genético se encuentra ubicado lo suficientemente cercano al segmento de ADN que codifica la característica a estudiar, se heredará siempre junto con él. Esto es, están acoplados. El segundo método de acoplamiento es el conocido como "variable numberd tandem repeats" (VNTR). Estas son pares de bases muy cortas ordenadas en tandem con diferente número de copias y que pueden estar distribuidas en gran número sobre todo el genoma. La diferencia de largo se establece por medio de PLFR. La diferencia se basa en que dada la frecuencia de su presencia con este método se aumenta la posibilidad de establecer un acoplamiento. El tercer campo de análisis genómico es el de la caracterización individual. Genes individuales de Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 8 Clement-Sengewald, Palma y Brem importancia para la producción animal son caracterizados en su estructura de secuencia ADN a fin de establecer un cuadro exacto de los fenómenos hereditarios a nivel molecular. Un ejemplo de ello es la aracnomegalia en la raza Braunvieh europea, gen letal con un índice endémico de 5%. Etiológicamente se supone un defecto en los genes responsables de la producción del colágeno. Si ese gen fuera identificado a nivel molecular podría ser evaluada su presencia en cada reproductor de forma tal de eliminar a los portadores. Con el diagnóstico génico se pretende en producción animal reconocer variantes génicas, que influencian en forma positiva ciertas características de interés productivo. En la actualidad existen dos métodos diagnósticos disponibles para determinar segura y rápidamente la presencia de esas variantes génicas: hibridación y sonda de ADN o PCR (Polymerase-Chain-Reaction). La hibridación consiste en el corte de la hélice de ADN en fragmentos por medio de enzimas de restricción, los fragmentos son separados electroforéticamente. Genes individuales pueden ser identificados con ayuda de una sonda génica, dado que ésta se deposita en el fragmento de ADN. PCR permite obtener de un sólo fragmento de ADN varios millones de copias en un lapso de pocas horas. Estas se hacen visibles con ayuda de una minielectroforesis, ahorrando el trabajoso método de hibridación. Con ambos métodos de diagnóstico génico pueden identificarse variantes génicas aún cuando se presentan en estado heterocigota. Un ejemplo de ello es la determinación del sexo de embriones, que se lleva a cabo con PCR antes de la transferencia (capítulo XV). El principio del fenómeno conocido como impresión digital ADN se basa en que si el genoma total de los animales fuera cortado y evaluado con diferentes pruebas se observaría que ningún animal es idéntico a otro, respondiendo al mismo principio de la impresión digital. A ello se lo denomina polimorfismo del lugar de corte. El mismo está determinado por fenómenos de mutación natural y tiene como consecuencia diferentes largos de fragmentos de restricción, lo que establece un modelo individual para cada animal. En teoría puede identificarse cada animal sin riesgo de confusión. Dado que el ADN se transmite a la descendencia y las mutaciones ocurren raras veces se emplea este método para la determinación de la ascendencia, ya que los hijos portan sólo fragmentos de ADN que están presentes en los padres. La transferencia de genes (capítulo XIII) se estableció como técnica a partir de la década de 1980 transfiriendo, en primeras experiencias, secuencias recombinadas a ratones. A partir de 1985 se informó sobre los primeros animales domésticos transgénicos. Para la transferencia génica es importante que cada gen sea aislado, caracterizado y recombinado con elementos reguladores adecuados. Ello ocurre gracias a la ayuda de métodos biológico-moleculares. La transferencia génica debe llevarse a cabo en lo posible en estadios embrionarios tempranos, a fin de que la estructura génica se integre en todas las células corporales. Por esa razón el mejor momento del desarrollo del individuo es el estadio unicelular. Para llevar a cabo la transferencia de genes existen 3 técnicas disponibles: la microinyección de ADN en el pronúcleo de los cigotos, la transferencia a través de vectores retrovirales y a través de células totipotentes transformadas genéticamente. El espectro de aplicaciones de la transferencia génica en producción bovina es grande. En primer lugar pueden mejorarse la calidad o la composición de sus productos. Ejemplos de ello son: la producción de leche libre de lactosa para aquellas personas que sufren de insuficiencia de lactasa, la mejora en la composición cárnea de la res, la producción de animales resistentes a enfermedades, la producción de proteínas importantes para el hombre en animales. En ese "gene farming" se acoplan promotores a interesantes estructuras génicas (factores de la coagulación, por ejemplo) y transfieren a animales que producirán la proteína deseada. Además se pretende modificar el equilibrio dinámico entre la biosíntesis y degradación de determinados productos a través de enzimas claves para favorecer la producción de ciertos productos de regulación compleja. La investigación y desarrollo de estas técnicas significan un esfuerzo económico de magnitud y una inversión de tiempo muy grande. Es de esperar, sin embargo, que los resultados brindarán importantes aportes a la producción animal. Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com Alberio 9 MANEJO DE DONANTES Y RECEPTORAS R.H. Alberio Introducción La producción de embriones por las donantes y la transferencia a receptoras es el trabajo básico de la transferencia de embriones. El manejo de las donantes para maximizar la producción de embriones y el de las receptoras para tenerlas disponibles en el momento oportuno y para que tengan una buena fertilidad, forma parte de las tareas más importantes de la TE. La evolución hacia un sistema de manejo eficiente toma tiempo y paciencia y varía ligeramente de situación en situación. Donantes El manejo de las donantes es uno de los puntos críticos. Si estas hembras no están reproductivamente bien y en un adecuado estado de balance nutricional el programa puede fracasar antes de haber comenzado. Sólo ocasionalmente se deberá trabajar con vacas que carezcan de una óptima historia reproductiva o que tengan algún problema reproductivo determinado. Estos son casos especiales que no siempre se pueden rechazar y en los cuales las probabilidades de éxito son menores. En tales casos se debe prevenir al propietario sobre el mayor riesgo y el animal será tratado en relación con el problema detectado. El manejo de la donante debe comenzar bastante antes de entrar en el programa y en esta etapa se deberá cumplir con el propietario para que comprenda y aprecie cómo debe ser manejada la vaca y cuál es su responsabilidad en ello. Por ejemplo, si la vaca irá a un Centro de TE es importante señalar al propietario la necesidad de establecer un seguro para la misma como se hace con un toro cuando va a un Centro de IA. Si la vaca tiene un ternero al pie, es conveniente que el mismo sea destetado o dejado con una vaca ama. Esto es particularmente importante si la donante es trasladada a un Centro de transferencia. No sólo importa por la salud del ternero sino también para el mejor rendimiento de la madre a quien, además del stress del cambio se suma el de la lactancia y cuidados del ternero. Muchas vacas ciclarán en forma irregular en los dos primeros meses posparto si están bien nutridas y luego comenzarán a ciclar más regularmente. Otras no ciclarán mientras tengan su ternero al pie aun estando bien nutridas y esto no constituye una patología sino que es una respuesta natural en los mamíferos. Una alternativa de manejo cuando hay varias donantes con cría, es llevar a los terneros a mamar una o dos veces por día. Algunas razas requieren esto más que otras por lo que sus necesidades se establecerán en función del conocimiento que se tenga de la misma. Las vacas primíparas o las vacas viejas representan un problema particular en estos casos. En general se debería disponer de una buena historia reproductiva de una donante antes de incluirla en un programa de TE. Muchos productores no hablarán fácilmente de sus vacas problema y un cuidadoso cuestionario permitirá detectar tales situaciones. Es frecuente escuchar por ejemplo "la vaca está seca porque el ternero murió de diarrea" o "que no ha parido este año porque fue preparada para una exposición". Lo que no se dice es que la muerte del ternero o la exposición han ocurrido dos o tres años antes y que luego de ese período la vaca no ha quedado nuevamente gestante. Con respecto al estado nutricional, uno de los problemas importantes en TE es paradojicamente el inverso al que ocurre en la vaca de cría; es decir el de las vacas demasiado gordas. El propietario deberá ser advertido que este exceso de alimentación tiene un efecto negativo sobre la reproducción, la lactancia y la longevidad. Indicaciones referentes a las hembras que son trasladadas al Centro de transferencia Si bien la mayoría de estas observaciones aparecen como obvias, es siempre conveniente hacer un Biotecnologia de la reproduccion www.reprobiotec.com Alberio 10 repaso de las mismas para asegurarse de su cumplimiento. - Al llegar la vaca al centro, se deberán tomar todos los datos posibles tales como día, hora, nombre del propietario y del transportista, tipo de animal, número de caravana o tatuaje, etc. Se determinará el estado general del animal, presencia de golpes, lastimaduras, etc. con lo que se hará un informe firmado por el transportista. - Se pesará la vaca y su peso será registrado. - Se hará una revisación completa del animal ya que, si bien el tracto genital es de particular interés, también se deberá determinar la existencia de problemas de locomoción, ojos, abscesos, etc. los que serán informados al propietario. - Suele ocurrir que se envían vacas preñadas por descuido o por simple desconocimiento de su estado. No hacer abortar a estos animales sin consultar a su propietario. - Si la vaca se encuentra con alguna infección o problema especial, se establecerá un tratamiento adecuado para el caso previniendo nuevamente al propietario. - Cuando las vacas van a un potrero definitivo y reciben ración, es conveniente separarlas de acuerdo a edad, tamaño, estado (seca o lactando), presencia o ausencia de cuernos. La ración como único alimento o como suplemento de la pastura será balanceada para permitir el mantenimiento del peso o ligeras ganancias de acuerdo con la edad, condición corporal y estado fisiológico. Un énfasis particular debe ser puesto en lo correspondiente a la suplementación mineral. Se debe recordar asimismo que los animales necesitan más energía en tiempo frío y húmedo que en cálido y seco. La presencia de parásitos debe ser controlada cuidadosamente, ya que su incidencia es mayor en sistemas con alta concentración de animales. Aproximadamente cada 60 días se deberá realizar un tratamiento de rutina. La revisación y cuidados de los animales deben ser exhaustivos y en general, no se cargan en los costos de mantenimiento. Cuánto tiempo se debe mantener la vaca en el sistema? En general esto es una decisión del propietario y no se la debe tomar por él, a menos que la vaca ya no produzca embriones en cantidad que justifique continuar con los tratamientos o que haya aparecido algún problema. En principio, una vaca de alto valor genético debe permanecer el mayor tiempo posible en un programa de TE. En cuanto a la producción de embriones en forma permanente, el tiempo de estadía varía en la mayoría de los casos de una vaca a otra. Habrá hembras que luego de uno o dos tratamientos disminuyen su producción y otras que la mantienen por años. En tanto una vaca produzca terneros cuyo precio justifique los costos, ésta debería permanecer en el sistema. Muchos productores se preocupan sin embargo por el retorno de la vaca al servicio luego de un tiempo. Esto es correcto si sólo es necesario un número determinado de embriones, pero se deberá tener en cuenta que al poner la vaca en servicio se perderá como mínimo un año en la producción de embriones. En ese año la vaca puede morir, enfermar, quedar estéril o ser superada por otra vaca. Es necesario sin embargo remarcar que desde un punto de vista biológico no hay problemas para preñar vacas que han estado sometidas a TE salvo que tengan un problema reproductivo específico. Lo único que puede ocurrir es que una vaca mantenida por largos períodos en un programa de TE necesite mayor número de inseminaciones para concebir. Esto suele ocurrir cuando hay un gran apuro en dar servicio a la vaca luego de la última recolección. Pero si se espera 2 ó 3 meses, al primer o segundo servicio concebirá sin problemas. Cuando una vaca está lista para retornar a su lugar de origen, se deberá hacer un chequeo clínico completo y se elaborará un informe para el propietario. Cualquier problema observado durante la estadía deberá ser protocolado e informado. Biotecnologia de la reproduccion www.reprobiotec.com Alberio 11 Receptoras Las receptoras forman una parte esencial del programa de TE y también uno de los problemas más serios. Las buenas receptoras son caras, su mantenimiento costoso y su estado de salud es crítico para el éxito de la TE. Ya sea que el programa se lleve a cabo en el campo o en un Centro, la obtención y mantenimiento de las receptoras condicionarán el éxito o el fracaso del mismo. Desde el punto de vista reproductivo una buena receptora es la hembra capaz de recibir un embrión y llevarlo a término. Más aún, la receptora deberá ser capaz de parir sin grandes dificultades y luego alimentar al ternero de manera que le permita expresar su potencial genético. En consecuencia, deberá ser de buen tamaño, tanto general como reproductivamente sana y de buena capacidad lechera. Esto no parece ser tan complicado, sin embargo tanto el tamaño como la producción de leche pueden tener significados diferentes. El tamaño de la receptora dependerá del tipo de animal (embrión) que se transferirá. De acuerdo con las tendencias actuales, particularmente en las razas para carne, se busca un gran tamaño de ternero con pesos al nacimiento de 40 ó 50 kg y aún más. Por lo tanto, no se deben tener dudas de elegir hembras de gran tamaño. La edad de la receptora es un aspecto importante en el cual sin embargo, no hay coincidencias entre autores. En general se difiere en el criterio sí es mejor una vaquillona que una vaca que ya ha parido alguna vez. Una forma de tomar el problema que puede resumir las diferentes posiciones es la siguiente: la vaquillona permite obtener tasas de preñez ligeramente superiores, sin embargo los problemas de manejo durante la gestación, el parto y la lactancia pueden producir resultados finales inferiores a los de las vacas. El uso de vacas multíparas, con historia reproductiva conocida, que garantiza en cierta manera su comportamiento futuro, sumado al hecho de tener menos problemas de parto, hacen que éste sea finalmente el animal de elección. Se debe recordar que el genotipo del embrión transferido es diferente al que la vaca hubiese tenido en un servicio de la propia raza. Uno de los errores más frecuentes que se cometen al hablar de las receptoras, es relacionar su tamaño con el tamaño al nacimiento del embrión transferido. Mucha gente cree que a mayor tamaño de la receptora, mayor tamaño de la cría y viceversa. El largo de gestación y el peso al nacimiento son determinados genéticamente y poco afectados por el ambiente uterino de la receptora. Su genética no juega ningún rol en el tamaño o estructura del ternero resultado de una transferencia. Este concepto no parece tener actualmente la certeza que se le asignaba años atrás. Si bien es cierto que la genética de la receptora no influye en la genética del embrión, el ambiente uterino (especialmente el espacio o tamaño) parece tener una interacción con el genotipo del feto mayor que la supuesta. Algunos trabajos con animales de laboratorio han demostrado la magnitud de esta interacción y la misma es coincidente con observaciones empíricas provenientes de trabajos en bovinos. El punto importante es no poner embriones que darán nacimiento a terneros de gran tamaño en vacas que son demasiado pequeñas y en general disponer de vacas grandes que minimizan los problemas y permiten expresar el potencial de crecimiento fetal. De acuerdo con nuestra experiencia bajo condiciones extensivas los resultados con vacas jóvenes (primera y segunda parición) han sido superiores a los obtenidos con vaquillonas y los problemas de parto en las primeras son casi inexistentes. El programa de alimentación de las receptoras es vital en el éxito final de la transferencia. La hembra gestará y amamantará a los terneros de mayor valor del establecimiento. Criará terneros que son mayores a los que hubiera producido y deberá proveer nutrientes en forma suficiente para que se exprese el potencial genético del ternero. Ante estas consideraciones, la receptora preñada no debe ser tratada como cualquier otra vaca de cría sino, al menos, como lo son las donantes. Biotecnologia de la reproduccion www.reprobiotec.com Alberio 12 Uno de los puntos críticos es dónde conseguir vacas receptoras. Lo ideal es obtenerlas del propio establecimiento con el consiguiente conocimiento de su historia reproductiva. Estas vacas serán a su vez portadoras de inmunidad a las bacterias y virus locales y la pasarán a sus crías. Su stress será menor al haber sido criadas en el lugar. En general las tasas de preñez que se obtienen en este tipo de receptoras suele superar en 10 a 15% a las obtenidas en animales recientemente incorporados. Si la situación anterior no es posible, se deberán comprar receptoras. Desde el punto de vista reproductivo, la mejor receptora es la vaca preñada o la que tiene un ternero al pie. Sin embargo, estas vacas cuestan más y tienen mayores problemas de manejo que una vaca seca. Otra alternativa es comprar vacas con preñez de 90 a 120 días, hacerlas abortar y usarlas como receptoras un mes más tarde. Si bien esta metodología se lleva a cabo sin inconvenientes, la desconfianza que este manejo implica hace que no sea aconsejable salvo que se esté muy seguro en su aplicación. En general se tiende a comprar vacas secas o vaquillonas, es a veces una buena opción la compra de animales lecheros de descarte por baja producción. El manejo de los animales en estas condiciones es mucho más simple que con las vacas con cría. La compra de vacas exige precauciones y tratamientos particulares según los casos. Una vaca preñada o con cría "habla por sí sola" y no requiere muchas más información. Si se compra una vaca vacía, es importante saber si tuvo o no servicio, si el mismo fue por medio de IA o natural, cuánto duró, etc. ya que en cada caso el problema puede ser diferente. Otro aspecto de importancia en la compra de vacas vacías, es verificar este estado ya que es frecuente encontrar una buena proporción de ellas en condición gestante. Una vez conseguidos los animales, éstos serán sometidos a un exhaustivo examen clínico tanto general como ginecológico en particular. Se tomarán muestras de sangre para determinar brucelosis y cualquier otra enfermedad endémica en la región de compra. Se procederá a la correcta identificación de cada animal estableciéndose una ficha individual. Si tienen preñez reciente se abortarán con prostaglandina. Se harán las vacunaciones de rutina y se desparasitarán. Deberán ser alimentadas de manera tal de ganar 500 a 600 g/día. Se detectará celo dos veces al día y si una vaca no ha sido vista en celo en 25 días, será palpada de nuevo y se procederá de acuerdo al diagnóstico. La sincronía de celos entre donante y receptoras puede obtenerse de formas diferentes. Si la disponibilidad de receptoras es muy alta (feed-lot) es probable que los animales en celo en un día determinado sean suficientes para los embriones producidos ese día. Esto no es lo más frecuente. En general se procede a utilizar diferentes esquemas de sincronización artificial de los celos. Esto implica en primer lugar que las hembras sean cíclicas y en segundo lugar, que alrededor de sólo un 70% responderá al tratamiento. Los tratamientos pueden seguir la rutina clásica de doble aplicación de PGF2 con un intervalo de 11 días o alternativas de menor costo. Ejemplo: palpar un número mayor del necesario, elegir aquellas con cuerpo lúteo e inyectar con PGF2alfa. Esta inyección se hará el día previo a la inyección de PGF2alfa que reciben las donantes ya que en éstas últimas, la presentación de celo es más temprana y la ovulación se puede extender durante un período que puede superar las 12 h. Cada receptora podrá tener tres oportunidades "buenas" de quedar gestante. Esto significa haber sido transferida correctamente con un buen embrión. Las tasas de gestación en la primera y segunda transferencia son similares y disminuyen en la tercera oportunidad. Luego de esto la caída es alta y no justifica el mantenimiento de esta vaca. La tasa de abortos en las receptoras preñadas puede ser ligeramente superior a la de vacas servidas normalmente. Por ello nunca se deberá entregar una receptora sin verificar previamente su estado de gestación. En síntesis, el manejo de las receptoras incluye la elección de hembras de buena calidad que sean reproductivamente aptas, que tengan un buen nivel de alimentación y estén libres de enfermedades. Los sistemas para conseguirlas son tan variados como oportunidades aparezcan. No olvidar que las receptoras constituyen uno de los puntos clave de la TE exitosa y por ello deberán ser tratadas en consecuencia. Biotecnologia de la reproduccion www.reprobiotec.com Programa de TE 13 PROGRAMA DE TRANSFERENCiA DE EMBRIONES J. Cabodevila Introducción La transferencia embrionaria puede ser llevada a cabo en Centros de TE o directamente en el campo. Existen opciones intermedias, por ejemplo, que las donantes se encuentren en un Centro de TE donde se efectúa la recolección de los embriones, las receptoras en un campo cercano, donde se llevan a cabo las transferencias. La organización del programa de TE es diferente en cada una de estas circunstancias. En todos los casos, comienza con la selección de las donantes y finaliza con el diagnóstico de preñez efectuado a los 60 días post-transferencia. En general, la selección de hembras como donantes es responsabilidad del productor y al profesional le queda la opción de aceptarlas o no después de: 1. 2. Efectuar una anamnesis exhaustiva considerando especialmente los antecedentes de superovulación. Llevar a cabo un examen clínico a donde se considere el estado corporal y el estado de los órganos genitales (ver planilla de anamnesis y examen clínico de donantes). Teniendo en cuenta la variabilidad que existe en la respuesta a los tratamientos de superovulación y la importancia económica que tiene la sincronización de las receptoras en la financiación de un programa de TE, es conveniente efectuar el mismo, con un mínimo de 3 donantes. Para ingresar a un programa de TE, las donantes seleccionadas deben cumplir los siguientes requisitos: - Tener un período post-parto no menor a 60 días, habiendo registrado un ciclo previo de duración normal. - Haber transcurrido más de 50 días de un tratamiento superovulatorio anterior. - Es conveniente que al efectuar el tratamiento la donante no se encuentre con cría al pie. Para facilitar la comprensión del programa se debe considerar en primer término, la sincronización de celos en las donantes y luego en las receptoras. Sincronización de celos en donantes La forma más común de sincronizar el celo en las donantes es mediante la administración de PGF2alfa o sus análogos sintéticos. Otra forma, es prolongar la fase luteal de manera artificial mediante la administración de progesterona o progestágenos. Cuando se inyecta PGF2alfa, puede ocurrir: - Que todas las donantes presenten celo inducido o natural en los próximos 5 días. - Que no todas presenten celo. En ese caso, al administrar una segunda dosis de PGF2alfa 11 días después, todas las donantes estarán en fase luteal. Luego de la presentación del celo natural o inducido (día 0 -cero-), el tratamiento de superovulación puede comenzar indistintamente entre los días 8 y 12 del ciclo estral. Es decir que, la inducción puede comenzar en el mismo momento en aquellas donantes en las que la diferencia entre sus días 0 no sea mayor de 4 días. En el cuadro 1 se presenta un programa de TE donde la sincronización de celos entre donantes y receptoras se lleva a cabo con PGF2 y la inducción a la superovulación con FSH-p. La sincronización de celos en las donantes puede efectuarse también mediante el empleo de distintos dispositivos con Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 14 Cabodevila progesterona o progestágenos (PRID®), esponjas intravaginales, implantes subcutáneos (MAPLETOFT, 1987) o directamente inyectando diariamente progesterona durante 9 días (MAPLETOFT, 1982). La utilización de progesterona o progestágenos tiene la ventaja de poder comenzar el programa de TE en forma inmediata independientemente que la donante se encuentre en fase luteal. Donantes Receptoras 1a dosis PGF2α Día 0 (natural o inducido) 07h 5 mg FSH-p 19h 5 mg FSH-p Día 10±2 Día 11±2 07h 4 mg FSH-p 19h 4 mg FSH-p 2a dosis* PGF2α Día 12±2 07h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2α 19h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2α Día 13±2 07h 3 mg FSH-p 19h 3 mg FSH-p + detección de celo detección de celo e IA Detección de celo Día 0 = celo inducido Día 14±2 Día 15±2 IA Recolección de embriones método no quirúrgico Día 7±1 TE Cuadro 1: Programa de TE donde la sincronización de celos entre donantes y receptoras se lleva a cabo con PGF2alfa y la inducción a la superovulación con FSH-p. * La sincronización de celos en receptoras puede efectuarse también administrando una sola dosis de PGF2alfa a hembras seleccionadas, mediante palpación transrectal, por poseer un cuerpo lúteo. En el cuadro 2 se describe un programa de TE donde la sincronización de celos en las donantes se lleva a cabo con progesterona o progestágenos. La sincronización de celos en las receptoras no sufre variaciones con respecto a lo descrito en el cuadro 1. Durante el período de detección de celo en donantes y receptoras, cuadros 1 y 2, es conveniente efectuar 3 detecciones diarias (mañana, mediodía, tarde) empleando el método visual, 30 minutos en cada oportunidad. Biotecnologia de la Reproducciön www.reprobiotec.com Programa de TE 15 Día 0 Colocación del PRID, esponja intravaginal o implante subcutáneo Día 7 07h 5 mg FSH-p 19h 5 mg FSH-p Día 8 07h 4 mg FSH-p 19h 4 mg FSH-p Día 9 07h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2α retiro del PRID, esponja o implante 19h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2α 07h 3 mg FSH-p Día 10 19h 3 mg FSH-p + detección de celo detección de celo e IA IA Día 0 = celo inducido Día 11 Día 12 Día 18 Recolección de embriones método no quirúrgico Cuadro 2: Programa de TE donde la sincronización de celos en las donantes se lleva a cabo con progesterona o progestágenos Sincronización de celos en receptoras La transferencia de embriones puede efectuarse indistintamente sobre celo natural o inducido. Hay que tener en cuenta que para obtener buenos resultados de preñez, el celo de las receptoras deberá tener una sincronización no mayor a las 24 h con el de la donante, ver capítulo VIII, (ROWSON y col., 1972). La sincronización de celos con PGF2 se describió en la Tabla 1. Cuando se efectúa la administración de una sola dosis de PGF2 a hembras seleccionadas por poseer un CL es necesario reservar un número mayor de receptoras por donante porque el diagnóstico de CL mediante palpación transrectal tiene una eficacia que varía entre el 71 y el 96% (FORTIN, 1989). En general, considerando que el promedio de embriones transferibles por cada donante es alrededor de 5, se sincronizan 8 receptoras por donante dado que algunas deben ser descartadas antes de efectuar la transferencia por razones diversas: quistes ováricos, celos anovulatorios, imposibilidad de cateterizar la cérvix. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 16 Cabodevila La donante presenta celo generalmente 48 h post primera administración de la PGF2alfa. Se efectúan 2 inseminaciones, la primera a las 8-12 h del comienzo del celo y la segunda IA, 12 h después de la primera. En cada IA, se utiliza una dosis de semen de óptima calidad. Cuando la donante no presenta celo, la decisión a tomar dependerá de cada situación en particular. Hay que tener presente que las donantes que sufren un desfasaje en la presentación del celo o que directamente no presentan celo generalmente tienen una respuesta superovulatoria pobre o nula. Toda la información relacionada con donantes y receptoras se anota en las planillas respectivas. Luego de la transferencia, en las receptoras se controla el no retorno. A los 14 días post-transferencia puede extraerse una muestra de sangre para efectuar un dosaje de progesterona en plasma. Finalmente, a los 60 días post-transferencia se hace la palpación transrectal. Manejo de la hormona El FSH-p se diluye en solución fisiológica estéril (la relación 1 mg = 1 ml, es la más práctica) y se conserva refrigerada o congelada. Es conveniente fraccionarla de manera tal que la totalidad de la hormona descongelada sea utilizada en el mismo momento. Caso contrario hay que refrigerarla sin volver a congelarla. La hormona debe ser descongelada o calentada a temperatura ambiente. Biotecnologia de la Reproducciön www.reprobiotec.com Programa de TE 17 PROTOCOLO DE SUPEROVULACION DONANTE N : .......................... PROCEDENCIA: ...................... FECHA ÚLTIMO CELO: ................ OBSERVACIONES ................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. .................................................................................................................................................................. SUPEROVULACION: DILUCION: ....................................... ESQUEMA DE TRATAMIENTO: .................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................... ..................................................................................................................................................................... FECHA DEL CELO: ...................... INSEMINACION ARTIFICIAL: 1o I.A.: 2o I.A.: OBSERVACIONES: ....................................................................................................... ............................................................................................................................................... TACTO PREVIO: OVARIO DERECHO OVARIO IZQUIERDO ........................................... ........................................... HORA: ............... DROGA: .................................... RAZA: ........................................ EDAD: ........................................ FOLICULOS: ............................................. CUERPOS LUTEOS: .................................. RECUPERACION DE EMBRIONES: DIA: ........ OBSERVACIONES: ....................................................................................................... . ............................................................................................................................................ EVALUACION MORFOLOGICA: EMBRIONES VIABLES: CLASIFICACION: ........................................... EMBRIONES ANORMALES: ........................................... OVOCITOS SIN FERTILIZAR:........................................... TOTAL RECUPERADO: CELO POST-SUPEROVULACION: .................................... ........................................... firma del profesional Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 18 Cabodevila TRANSFERENCIA DE EMBRIONES PROTOCOLO DE DONANTES Donante N : Raza: Edad: Peso actual: Fecha última participación en Exposición Rural: Comentarios: Número de partos: Fecha del último parto: Para la última gestación cuántos Servicios Recibió?.... Ha sido repetidora?: Fecha del último celo: Fecha último servicio: REVISACION CLINICA Estado Corporal: Estado de los órganos genitales en general: Estado de los ovarios en particular: O.D. Tamaño: Folículos: Cuerpos Lúteos: .............. .............. ............. O.I. .............. .............. .............. 1.Normal, 2.Distócico, 3.Ternero Muerto 4.Cesárea Tipo de parto: Procedencia: Semen que se utilizará: Prueba de enhebrado con pipeta de I.A.: Fecha: Resultado: Biotecnologia de la Reproducciön www.reprobiotec.com 1. Pasa sin Dificultad 2. Pasa con Dificultad 3. No pasa Programa de TE 19 ANTECEDENTES DE SUPEROVULACION PRIMER TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis: SEGUNDO TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis: Total de Ovocitos y Embriones Recuperados: Embriones Transferibles: Preñeces: Terneros Nacidos Vivos: Semen utilizado: Total Ovocitos y Embriones Recuperados: Embriones Transferibles: Preñeces: Terneros Nacidos Vivos: Semen utilizado: TERCER TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis: CUARTO TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis: Total de Ovocitos y Embriones Recuperados: Embriones Transferibles: Preñeces: Terneros Nacidos Vivos: Semen utilizado: Total de Ovocitos y Embriones Recuperados: Embriones Transferibles: Preñeces: Terneros Nacidos Vivos: Semen utilizado: Bibliografía FORTIN, M. 1989. Sincronización de celos en bovinos con prostaglandinas. Aspectos prácticos. CABIA, 15: 29-39. MAPLETOFT, R. 1982. Superovulation and recovery of ova from the bovine. Proc. Owners. Managers Workshop IETS, 37-50. MAPLETOFT, R.1987. Sincronization of donor cows and recipients. XI Jornadas de Reproducción Animal del CIAVT. Venado Tuerto, Pcia. de Santa Fe. ROWSON, L., LAWSON, R., MOOR, R., BAKER, A. 1972. Egg transfer in the cow: Synchronization requirements. J. Reprod. Fert. 28: 427-431. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 20 Rivera REGULACION NEUROENDOCRINA DE LA FUNCION OVARICA G. Rivera Introducción. Control de la secreción de gonadotrofinas La secreción de gonadotrofinas hipofisarias (LH y FSH), es el principal factor que regula la función ovárica. Neuronas hipotalámicas especializadas (decapeptidérgicas), producen y secretan la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH), que controla la función hipofisaria. A su vez, otros sistemas de neuronas (catecolaminérgicas y opioidérgicas) integran la información del medio externo (luz, temperatura, olores, interacciones sociales) e interno (concentración de esteroides), y convergen sobre la neurona decapeptidérgica para regular su función (KALRA y KALRA, 1984). La GnRH es secretada en forma de pulsos discretos (CLARKE, 1988), que -vía sistema porta-hipofisario- alcanzan la adenohipófisis. Los pulsos de GnRH determinan la secreción típica de pulsos de LH/FSH. Los esteroides ováricos afectan la secreción de LH/FSH a través de un mecanismo de retroacción negativa (GOODMAN y KARSCH, 1980; CLARKE, 1988; PRICE y WEBB, 1988). La progesterona (P4) inhibe la liberación de LH, que es secretada en pulsos característicos de baja frecuencia (1 c/6-8 h) y gran amplitud durante la fase luteal (RAHE, 1980). Cuando se produce la luteólisis, la concentración de P4 en sangre disminuye y aumenta la frecuencia de los pulsos de LH. Estos, estimulan la producción de andrógenos tecales, que son convertidos a E2 en las células granulosas. El E2 estimula la secreción de pulsos de LH de alta frecuencia, pero de baja amplitud (GOODMAN y KARSCH, 1980; KARSCH, 1987). En el control de la secreción de FSH interviene, además de E2, la inhibina que es un péptido de origen ovárico (FINDLAY y CLARKE, 1987). Regulación endocrina de la función ovárica El ciclo estral (CE) de la vaca tiene una extensión media de 21 días. El celo dura aproximadamente 18 h y la ovulación tiene lugar 15 h después de la finalización del mismo. El CL se desarrolla y la secreción de P4 aumenta entre el 4 y 12 día del ciclo y permanece constante hasta la luteólisis. La regresión del CL es variable y ocurre entre el 15 -20 día del CE (HANSEL y ECHTERNKAMP, 1972; LUQUE y col., 1983). Con el objeto de hacer un análisis detallado de las interacciones endocrinas durante el CE, es conveniente dividirlo en 3 etapas (HANSEL y CONVEY, 1983): - fase folicular o de regresión luteal - fase periovulatoria - fase luteal Fase folicular o de regresión luteal Las concentraciones de P4 en sangre, decaen abruptamente a niveles 1 ng/ml entre las 24-36 h de iniciada la luteólisis, ya sea en forma natural (DIELEMAN y col., 1986) o inducida por PGF2 (SCHAMS, 1987). La caída de las concentraciones de P4 por debajo de un determinado nivel "umbral", en presencia de concentraciones bajas de E2, elimina la retroacción negativa sobre la secreción de gonadotrofinas. Consecuentemente, aumenta la frecuencia de la descarga de LH y, en menor grado, la de FSH (SCHAMS, 1987). En esta fase, la hipófisis secreta aproximadamente 1 pulso de LH/FSH cada 60 min. El incremento en la frecuencia de pulsos de LH/FSH estimula el desarrollo de un folículo grande, que secreta cantidades crecientes de E2. El E2 se secreta en forma de pulsos, que son detectados en la vena cava (SCHAMS, 1987), concomitantes o inmediatamente después de los pulsos de LH. El grado de desarrollo folicular al momento de la luteólisis determina el tiempo que transcurre hasta que un folículo completa su crecimiento y es capaz de producir cantidades suficientes de E2 como Biotecnología de la reproducción www.reprobiotec.com Regulación neuroendócrina 21 para iniciar el celo y la onda preovulatoria de LH (IRELAND y ROCHE, 1987). DIELEMAN y col. (1986) determinaron que un folículo con un diámetro <8 mm alcanza un tamaño preovulatorio (20 mm) durante los 2,5 días previos a la onda de LH. Fase periovulatoria Durante este período se producen importantes fenómenos: inicio del celo, onda preovulatoria de gonadotrofinas y ovulación. El intervalo entre el inicio de la luteólisis y el comienzo del celo es de 58-60 h aproximadamente (DIELEMAN y col., 1986). Los niveles de E2 aumentan desde la regresión luteal hasta alcanzar un plateau el día previo al inicio del celo. Dicha elevación del E2 provoca el comportamiento propio del celo (HURNIK, 1987) y desencadena la onda preovulatoria de LH. Esta, tiene una duración de 6-10h, se inicia junto con el celo y alcanza su valor máximo (pico) 4-5 h más tarde (RAHE y col., 1980; DIELEMAN y col., 1986). Mediante la toma de muestras de sangre c/5 min se determinó que el intervalo entre pulsos de LH/FSH previo a la onda gonadotrófica es de 38-40 min (WALTERS, 1984). Durante la onda preovulatoria, tanto la descarga de LH (RAHE y col., 1980; WALTERS y SCHALEMBERGER, 1984), como la de FSH siguen un patrón pulsátil (WALTERS y SCHALEMBERGER, 1984). El E2 actúa mediante los siguientes mecanismos para desencadenar la secreción preovulatoria de LH: * Aumenta la sensibilidad hipofisaria al estímulo de la GnRH (KESNER y col., 1981). * Aumenta el número de receptores para GnRH en las células hipofisarias (SCHOENEMANN y col., 1985). * Estimula la síntesis de gonadotrofinas, dado el incremento que se observa en el contenido de ARNm para estas hormonas previo y durante la onda de LH (LANDEFELD, 1985). * Aumenta el efecto "preparador" (self-primming effect) de la GnRH (KESNER y col., 1981; PADMANABHAN y col., 1981), esto es, el proceso mediante el cual la GnRH incrementa la respuesta hipofisaria a exposiciones sucesivas de esta hormona. * Establece un mecanismo a nivel hipotalámico que culmina en la liberación de una onda de GnRH, que a su vez induce la onda de gonadotrofinas (HANSEL y CONVEY, 1983). Las observaciones de WALTERS y SCHALEMBERGER (1984) determinaron que las concentraciones de E2 disminuyen al menos durante los 60 min previos al comienzo de la onda de LH y aumentan con su iniciación. Los mismos autores propusieron que esta disminución en los niveles de E2 es la señal que dispara la onda de LH, al remover su efecto inhibitorio sobre el hipotálamo. Después de la onda preovulatoria, no se detectan pulsos de LH durante 6-12h (WALTERS y SCHALEMBERGER, 1984), lo que refleja el agotamiento del contenido pituitario de esta hormona. Sin embargo, la secreción de FSH continúa y se produce un segundo pico de la misma (HANSEL y CONVEY, 1983; IRELAND y ROCHE, 1987; WALTERS y SCHALEMBERGER, 1984), que parece deberse a la remoción del feed-back negativo de la inhibina al destruirse su fuente de producción (folículo) al momento de la ovulación. Fase luteal El CL se desarrolla completamente durante la primera semana post-ovulación y la concentración de P4 en plasma aumenta hasta alcanzar un pico al dia 10 del ciclo (HANSEL y col., 1973). Un segundo pico de E2 se produce en este momento, cuyo origen es la presencia de folículos estrógeno activos en el ovario (IRELAND y ROCHE, 1987). La secreción de LH continúa en forma de pulsos, que son menos frecuentes a medida que avanza la fase luteal (WALTERS y col., 1984). Las concentraciones elevadas de P4 determinan una pulsatilidad de LH de baja frecuencia y gran amplitud (RAHE y col., 1980). Durante la fase luteal media la frecuencia de secreción de pulsos de FSH es mayor que la de LH Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 22 Rivera (WALTERS y col., 1984) y aquellos son seguidos por pulsos de P4. Esto indicaría que la FSH también es un importante estímulo para la secreción de P4 en la vaca y que los esteroides ováricos modulan la secreción de FSH en menor extensión que la de LH. Función del cuerpo lúteo El cuerpo lúteo ocupa una posición central en el proceso reproductivo de los mamíferos. La P4 es el producto de secreción endocrino primario, aunque el CL secreta prostaglandinas (PG), una variedad de hormonas peptídicas y proteicas (relaxina, oxitocina, vasopresina) y en algunas especies estradiol (NISWENDER y NETT, 1988; SCHAMS y col., 1987). La P4 prepara el endometrio para la implantación y mantiene la gestación. Si no hay fecundación la función luteal declina y se reanuda el ciclo ovulatorio, lo que indica que una segunda función del CL es bloquear la ovulación. El CL está formado por dos tipos de células esteroidogénicas; las células luteales grandes y las pequeñas. Las primeras derivan de las células de la granulosa y las segundas de las células tecales (HANSEL y DOWD, 1986; AULETTA y FLINT, 1988). No obstante se observa una población de células grandes que derivarían de células pequeñas de origen tecal, dado que unen anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tecales (ALILA y HANSEL, 1986). Las características principales de cada tipo celular pueden resumirse como sigue (SMITH, 1986; AULETTA y FLINT, 1988; NISWENDER y NETT, 1988): si bien ambos tipos celulares producen P4 in vitro, las células pequeñas son más sensibles a la LH, poseen mayor cantidad de receptores para esta hormona y la respuesta es mediada por el sistema AMPc-adenilato ciclasa. Las células luteales grandes poseen menos receptores para LH (la mayor parte de los receptores son para PGF2 y E2) y producen oxitocina (OT). A diferencia de las células luteales pequeñas, en éstas la producción de P4 sería controlada (al menos parcialmente) por el sistema Ca++ - fosfatidil inositol quinasa C. La regulación de la función luteal es un proceso complejo. En ella intervienen factores tróficos y líticos que estan presentes en forma concurrente durante todo el ciclo estral y por lo tanto la estimulación o la inhibición de la síntesis y secreción de P4 depende del balance entre estos factores. Factores luteotróficos Numerosos estudios in vivo e in vitro han demostrado que la LH es el factor luteotrófico más importante en la vaca (HANSEL y CONVEY, 1983; SMITH, 1986; NISWENDER y NETT, 1988). La administración de LH in vivo prolonga la vida del CL (DONALDSON y HANSEL, 1965; HANSEL, 1967) e in vitro estimula la secreción de P4 (HANSEL; 1967), mientras que el suero anti-LH provoca luteólisis in vivo (HOFFMAN y col., 1974). En un estudio detallado de la fase luteal (WALTERS y col., 1984), se observó secreción de pulsos adicionales de FSH (en relación a los de LH) que fueron seguidos por pulsos de P4. Por otra parte, se ha descrito la presencia de receptores para FSH en el CL bovino (MANSS y col., 1984). En conjunto estas observaciones demuestran que tanto la LH como la FSH ejercen una importante acción luteotrófica en la vaca. A diferencia de los animales de laboratorio, la prolactina no tiene acción luteotrófica en la especie bovina (HOFFMAN y col., 1974). Algunos compuestos derivados del metabolismo del ácido araquidónico (AA) también tienen acción trófica sobre el CL (HANSEL y DOWD, 1986). La metabolización del AA (MILVAE, 1986) produce -vía cicloxigenasa- 3 compuestos principales: PGI2 (prostaciclina), PGF2 y tromboxano A2. A través de la vía lipoxigenasa se generan diversos metabolitos, siendo los más importantes los leucotrienos y las lipoxinas. La PGI2 estimula la síntesis de P4 in vivo e in vitro (MILVAE y HANSEL, 1980b). El contenido y la biosíntesis de PGI2 en el tejido luteal es mayor en los estadios tempranos del CE (MILVAE y HANSEL, Biotecnología de la reproducción www.reprobiotec.com Regulación neuroendócrina 23 1983). Además, la relación PGI2/PGF2alfa como la producción de P4 disminuyen con el envejecimiento del cuerpo lúteo (MILVAE y HANSEL, 1983). La administración de indometacina, un inhibidor de la vía cicloxigenasa entre los días 4-6 del ciclo estral, reduce la secreción de P4 y la vida del CL (MILVAE y HANSEL, 1985). La información precedente demuestra que la prostaciclina es un importante regulador de la función luteal. En forma directa, actuaría sobre las células luteales estimulando la producción de P4 a través de un aumento intracelular en los niveles de AMPc (HANSEL y DOWD, 1986) indirectamente mediante su acción angiogénica y aumentando el flujo sanguíneo hacia el ovario (SMITH, 1986). Factores luteolíticos Aún no se conocen exactamente los mecanismos que provocan la luteólisis ni cuál es la señal que la inicia. La regresión luteal es consecuencia de una compleja interacción entre receptores y hormonas, donde intervienen por lo menos la PGF2alfa, la oxitocina y el E2 (AULETTA y FLINT, 1988). La PGF2alfa parece ser el factor uterino endógeno que inicia la luteólisis en los rumiantes (INSKEEP y MURDOCH, 1980; NISWENDER y NETT, 1988). El tratamiento de animales intactos con inhibidores de la síntesis de prostaglandinas tales como la indometacina (TROXEL y KESLER, 1984) o la inmunización pasiva contra PGF2 (FAIRCLOUGH y col., 1981; COPELIN y col., 1989) bloquea la luteólisis espontánea en la vaca. ARMSTRONG y HANSEL (1959) observaron que la administración de oxitocina entre los 2-6 d del ciclo estral provocó luteólisis y retorno al celo en vacas intactas pero no en animales histerectomizados. En aquéllas con histerectomía unilateral la oxitocina indujo luteólisis sólo cuando el cuerno uterino remanente era ipsilateral al ovario con CL (GINTHER y col., 1967), lo que sustenta la hipótesis de un mecanismo de transferencia útero-ovárico local. No obstante, no hay evidencias concluyentes sobre la presencia de tal mecanismo en la vaca. Si bien la administración de OT durante la fase luteal temprana indujo un aumento en las concentraciones de PGF2 en la vena uterina y una declinación en las de P4 en yugular, los niveles de PGF2alfa en la arteria ovárica permanecieron bajos y fueron semejantes a los observados en circulación periférica (MILVAE y HANSEL, 1980a). La luteólisis en la vaca es consecuencia de una interacción entre la secreción de OT luteal y la de PGF2alfa endometrial (AULETTA y FLINT, 1988). La OT luteal es producida por las células luteales grandes en el bovino (SCHALLEMBERGER y col., 1984; O'SHEA, 1987). La tasa de síntesis es mayor en la fase luteal temprana y luego se almacena, de tal forma que el contenido de OT en el tejido luteal aumenta en la fase luteal media-tardía. Al iniciarse la luteólisis la secreción de OT se incrementa en forma paralela a los niveles de PGF2 (SCHAMS, 1987; PETER y col.1989). La PGF2alfa estimula la secreción de OT luteal (SCHAMS, 1987) y ésta a su vez, induce la secreción de PGF2alfa endometrial (MILVAE y HANSEL, 1980a). Este mecanismo de feed-back positivo es responsable de la regresión del CL (AULETTE y FLINT, 1988). La sensibilidad del mecanismo mencionado está condicionada por el medio esteroidal endógeno. En vacas ovariectomizadas el E2 estimula y la P4 deprime la secreción de PGF2 inducida por OT (LAFRANCE y GOFF, 1988). En vaquillonas, las concentraciones de P4 no caen por debajo de 1 ng/ml hasta 32 h posteriores a la aplicación de PGF2 durante la fase luteal media, mientras que durante la fase luteal temprana o tardía la declinación se produce dentro de las 24 h (BERARDINELLI y ADAIR, 1989). SILVIA y TAYLOR (1989), observaron una relación positiva entre la magnitud de la respuesta a OT y la tasa de E2/P4 en la fase luteal temprana y tardía, pero no en la fase luteal media. Aparentemente la variación en la respuesta a la OT está relacionada con la fluctuación en la cantidad de sus receptores endometriales a lo largo del CE. Los receptores para OT alcanzan una concentración máxima durante el celo, disminuyen a niveles casi indetectables durante la fase luteal media y aumentan nuevamente entre los días 18-19 del CE (SCHAMS y col., 1987). En ovejas el E2 induce la formación de receptores para OT (Mc CRAKEN, 1984). Durante la fase luteal la P4 bloquea la acumulación nuclear de receptores de E2 y en consecuencia, la capacidad de E2 para mantener la síntesis de receptores para OT. Cuando la acción de la P4 sobre el útero comienza a disminuir (fase Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 24 Rivera luteal tardía), el E2 estimula la síntesis de receptores para oxitocina. Las concentraciones basales de ésta interactúan con sus receptores uterinos, lo que amplifica la liberación endometrial de PGF2alfa y desencadena la luteólisis (Mc CRAKEN, 1984; SCHALEMBERGER y col., 1984; SCHAMS y col., 1987). La PGF2alfa ejercería sus efectos luteolíticos a través de los siguientes mecanismos (AULETTA y FLINT, 1988; NISWENDER y NETT, 1988): disminución rápida del flujo sanguíneo luteal, desacople del complejo receptor LH-adenilato ciclasa, y acción citotóxica sobre las células luteales. Numerosos experimentos demuestran que el E2 es un potente factor luteolítico en la vaca (HANSEL y col., 1973). El E2 administrado en forma sistémica durante la fase luteal media provoca luteólisis (ELEY y col., 1979) y la destrucción folicular mediante irradiación X prolonga la función luteal (VILLA-GODOY y col., 1981). La secreción de PGF2 aumenta en respuesta al suministro de E2 en forma local o sistémica (TATCHER y col., 1984), lo que demuestra una interacción entre estas hormonas durante la luteólisis en rumiantes. En relación a la luteólisis inducida por PGF2alfa intervienen dos factores principales en la variabilidad asociada a la sincronización de celos: el estadio del ciclo estral al momento de la aplicación y la dosis utilizada. BERARDINELLI y ADAIR (1989), demostraron la existencia de una interacción entre ambos factores que puede sintetizarse así: con dosis bajas se observa una proporción creciente de vacas en celo a medida que el estadio del CE avanza (envejecimiento del cuerpo lúteo), mientras que con dosis altas la proporción de vacas en celo es mayor, aún en los estadios iniciales del ciclo y máxima en la fase luteal tardía. La confluencia de los factores mencionados explicaría la variación observada en las respuestas a los tratamientos de sincronización de celos con agentes luteolíticos. Crecimiento y desarrollo folicular Aspectos morfológicos La gametogénesis en la hembra incluye dos procesos: ovogénesis y foliculogénesis. Durante la vida fetal (50-130 d de gestación), se produce la multiplicación (mitosis) de las ovogonias. Aproximadamente a los 80 días de la gestación los ovocitos inician la meiosis, deteniéndose el desarrollo (arresto meiótico) en el estadio de dictiotene de la profase I (WASSARMAN, 1988). La meiosis se reanudará sólo en algunos ovocitos, después de una onda preovulatoria de LH en cada CE (animal adulto). La función primaria del folículo ovárico en mamíferos es la liberación de un ovocito apto para ser fertilizado. La foliculogénesis puede ser definida como la formación de folículos maduros, preovulatorios (de De GRAAF), a partir de una reserva de folículos primordiales (SPICER y ECHTERNKAMP, 1986). La foliculogénesis comienza en la vida fetal con la formación de los folículos primordiales. Este proceso consiste en: crecimiento del ovocito, diferenciación de una capa de células granulosas (planas) y de una capa celular (teca interna) por fuera de la membrana basal (GREENWALD y TERRANOVA, 1988). Se constituye así una reserva de folículos cuyo crecimiento se encuentra detenido (nongrowing pool). Los folículos primordiales entran a la reserva de folículos en crecimiento (preantrales y antrales) por medio de un estímulo no identificado aún, que parece ser independiente de la presencia de las gonadotrofinas (SCHAMS, 1987). Después de la reanudación del desarrollo, se forman los folículos primarios, que se caracterizan por poseer una capa de células granulosas cuboidales y un mayor desarrollo de la teca interna. Cuando el folículo presenta dos o más capas de células granulosas cuboidales se denomina folículo secundario. Ambos, primario y secundario, son folículos preantrales. El número relativamente constante de folículos preantrales presentes en el ovario a través del CE, se ha descripto frecuentemente, como una evidencia de la independencia de su crecimiento en relación al nivel de gonadotrofinas. No obstante, diversos estudios (GREENWALD y TERRANOVA, 1988) demostraron que el número de folículos preantrales disminuye significativamente luego de la hipofisectomía en varias especies (rata, hamster, oveja), lo que indica que el desarrollo folicular aún desde sus estadios iniciales es influenciado por las gonadotrofinas. Biotecnología de la reproducción www.reprobiotec.com Regulación neuroendócrina 25 El paso siguiente en la foliculogénesis es la formación del antro, por medio de la coalescencia de pequeñas gotas de fluido folicular (FF) secretadas por las células granulosas. El número de folículos antrales o terciarios depende del nivel de gonadotrofinas. Un porcentaje inferior al 1% de los folículos desarrollará hasta la fase preovulatoria, mientras que el resto sufrirá un proceso de regresión o atresia. La atresia puede comenzar en cualquier estadio del desarrollo y se caracteriza por: picnosis y fragmentación de las células granulosas, invasión leucocitaria, pérdida de contacto intercelular, aumento de la permeabilidad de la membrana basal, hipertrofia de las células tecales y disminución de la secreción de E2 (RYAN, 1981; GREENWALD y TERRANOVA, 1988). Dinámica folicular. Su importancia La producción económica del número máximo de embriones de excelente calidad es uno de los objetivos clave para el éxito de los programas de transferencia embrionaria a nivel comercial. Esto tiene una estrecha relación con la comprensión de los mecanismos que controlan el crecimiento y la maduración del folículo y del ovocito. Los procesos recurrentes de crecimiento folicular y ovulación, son regulados por complejas interacciones entre hormonas, factores de crecimiento y sistemas de comunicación intercelular. La amplia variabilidad observada en respuesta a los tratamientos superovulatorios responde entre otros, a factores inherentes al animal (MAPLETOFT y MURPHY, 1987). Uno de ellos es el estadio del ciclo o "status" ovárico al momento de iniciarse el tratamiento. A continuación se analiza la dinámica del crecimiento folicular a lo largo del ciclo estral. Desarrollo folicular durante el ciclo estral GOODMAN y HODGEN (1983), sugirieron el uso de los siguientes términos para describir la folículogénesis: * Reclutamiento: Etapa en la que un grupo o "cohorte" de folículos adquiere la capacidad de responder a las gonadotrofinas y necesita de ellas para seguir creciendo. * Selección: Proceso por el cual sólo "unos pocos" folículos reclutados escapan a la atresia y continúan su desarrollo. * Dominancia: Es el conjunto de mecanismos por los que un folículo alcanza un tamaño marcadamente superior a los demás, es responsable de la mayor parte de la secreción de E2, puede detener el crecimiento de otros folículos y/o adquiere la capacidad de continuar su desarrollo en un medio hormonal adverso para el resto de los folículos. Existe una amplia variación entre animales en cuanto a la distribución de los folículos antrales a lo largo del ciclo estral. No obstante, mediante el examen histológico se ha observado la presencia de un folículo único (>10mm de diámetro) por par de ovarios, en la mayoría de los días de un ciclo. Este folículo posee varios mm de diámetro más que el que le sucede en tamaño. Usualmente lo acompañan en la superficie ovárica, 2 a 4 folículos de 4-8mm de diámetro y 20-40 folículos de 1-3mm (IRELAND, 1987). RAJAKOSKI (1960), fue el primero en sugerir la existencia de "dos ondas" de crecimiento folicular durante el CE bovino. La primera, entre los días 3 y 12 del CE, culmina con el desarrollo de un folículo de tamaño ovulatorio que generalmente sufrirá atresia. La segunda, desde la mitad del ciclo en adelante, termina con el desarrollo del folículo ovulatorio. No obstante, la evaluación estadística de los datos que sustentan esta hipótesis ha sido cuestionada por SPICER y ECHTERNKAMP (1986), quienes propusieron un modelo de desarrollo continuo en el que la tasa de entrada de folículos al crecimiento, la tasa de crecimiento y la tasa de atresia se aceleran a medida que se acerca el momento de la ovulación. Algunos estudios (DUFOUR, y col., 1972; MATTON y col., 1981) han determinado el recambio (turnover) folicular durante el CE in vivo, mediante la inyección de tinta India en el estroma que rodea a los 2 ó 4 folículos más grandes presentes en el ovario (mediante laparotomía). El folículo Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 26 Rivera más grande marcado dentro de los 3 días que preceden al celo ovuló en 8/8 vaquillonas (DUFOUR, y col., 1972). Cuando la marcación fue previa, algún otro folículo ovuló, lo que indica que el folículo ovulatorio puede ser identificado confiablemente sólo dentro de los 3 días previos al celo. MATTON y col. (1981), determinaron que uno de los 2 folículos más grandes por par de ovarios presentes al día 3 del CE, persistió hasta el día 13 y desapareció hacia el día 18. De los 10 folículos más grandes marcados el día 13, sólo uno permaneció como el 2 folículo de tamaño ovulatorio del CE. Estos datos refuerzan la hipótesis de las 2 ondas de crecimiento folicular propuesta por RAJAKOSKI (1960). Mediante las técnicas mencionadas (histología, marcación in vivo), la mayoría de las observaciones son sólo puntuales (en el tiempo y en el animal), lo que dificulta la obtención de un cuadro exacto de la dinámica del crecimiento y regresión folicular en el ciclo estral. Con el advenimiento de la tecnología del ultrasonido (ecografía), y con ella la posibilidad de realizar un monitoreo diario sobre el mismo animal, se observó la presencia de 2-3 folículos dominantes durante el ciclo estral (PIERSON y GINTER, 1988; SAVIO y col., 1988). El primer folículo dominante, fue detectado en promedio en el dia 4 del ciclo estral y alcanzó un diámetro máximo (13-16mm) hacia el día 6-7. Luego sobrellevó un período de estabilidad relativa entre los días 6-10, y comenzó a involucionar hasta no ser detectable hacia el día 15 del CE. Los folículos medianos "no dominantes" de la 1 onda cesaron su crecimiento cuando se desarrolló el FD. El segundo folículo dominante fue detectado hacia el día 10 cuando fue ovulatorio (KNOPF y col., 1989) ó 12 cuando no lo fue (SAVIO y col., 1988). En este caso regresó y no pudo ser identificado hacia el día 19 del ciclo. El tercer folículo dominante (ovulatorio) fue identificado en promedio el día 16, y alcanzó su tamaño máximo el día 21. El segundo folículo dominante ovuló en los ciclos de duración más corta (GINTER y col., 1989), lo que sugiere que el momento en que se produce la regresión del cuerpo lúteo, determina la presencia de 2 ó 3 FD durante el CE. SAVIO y col. (1988), observaron que la tasa de crecimiento fue mayor para el primero y tercero de los folículos dominantes, lo que implicaría que durante la fase luteal media la velocidad de crecimiento disminuye probablemente debido al feed-back negativo de P4 sobre las gonadotrofinas. Este momento quizás sea el de mayor dificultad para estimular el crecimiento folicular, lo que tendría implicancias en las respuestas a los tratamientos superovulatorios iniciados en dicho período. Secreción de E2 durante el ciclo estral Los cambios en la concentración de E2 en cada vena ovárica durante un CE, constituyen el mejor marcador endocrino para describir los procesos de selección y dominancia (IRELAND y ROCHE, 1982). En las especies mono-ovulatorias, la producción de E2 simétrica es indicativa del proceso de selección, mientras que la secreción asimétrica de E2 lo es de la fase de dominancia. Algunas evidencias indican que un folículo único es responsable de la mayor parte del E2 secretado durante el CE. Un folículo estrógeno-activo, que posee varios mm más de diámetro que el que le sigue en tamaño, está presente durante el estro, otro durante la fase luteal temprana y otro en la fase luteal media (31). Estos folículos tienen concentraciones de E2 más altas que las de P4 y andrógenos (E2/P4+A) en el FF. En cambio, los folículos 6 mm de diámetro que acompañan a los anteriores, son estrógeno-inactivos (atrésicos) puesto que las concentraciones de P4+A son mayores que las de E2 en su fluido folicular. Los folículos más grandes secretaron 500-1000 veces más de E2 que los pequeños cuando fueron removidos e incubados in vitro (STAIGMILLER y ENGLAND, 1982). A lo largo del ciclo estral se producen 3 picos de E2, tanto en circulación periférica como en venas ováricas, que son coincidentes con los períodos de dominancia folicular (IRELAND y ROCHE, 1987). Modelo para la foliculogénesis durante el ciclo estral (IRELAND y ROCHE, 1982; IRELAND, 1987) Durante el CE se suceden períodos recurrentes de crecimiento y atresia folicular (turnover) Biotecnología de la reproducción www.reprobiotec.com Regulación neuroendócrina 27 independientemente de la presencia o ausencia de progesterona. La FSH desempeña un papel fundamental en el proceso de reclutamiento folicular, en tanto que niveles basales de esta hormona son suficientes para permitir el crecimiento de una "cohorte" de folículos de 4-8 mm y luego el desarrollo de un folículo dominante. Este, suprime el crecimiento de los otros folículos medianos y grandes que lo acompañan (atresia). Los folículos dominantes que desarrollan en presencia de un CL activo (primero en ciclos c/2 folículos dominantes y segundo en ciclos c/3 FD) también sufrirán atresia, debido a la ausencia de un patrón pulsátil apropiado de LH capaz de estimular la síntesis de andrógenos y en consecuencia de estrógenos, suficientes como para desencadenar una onda de LH. El FD (no atrésico) presente al momento de la luteólisis, recibirá una frecuencia de pulsos de LH adecuada (1 c/40-60 min) que estimulará su maduración final, la secreción de E2, la descarga preovulatoria de LH y la ovulación. Las etapas de selección y dominancia constituyen un proceso que involucra 3 componentes: * Capacidad de respuesta del folículo preantral a las gonadotrofinas: determinado por el número de células granulosas y/o tecales o bien por la cantidad de receptores para gonadotrofinas. * Síntesis y secreción de factores inhibitorios por el folículo dominante: se ha demostrado que el folículo produce factores hormonales y no hormonales que pueden controlar la selección modulando la respuesta a las gonadotrofinas. Así, el folículo dominante inhibe el desarrollo de los otros folículos que lo acompañan, pero no su propio desarrollo. Uno de los factores implicados es la PRF (proteína regulatoria folicular), que bloquea la actividad aromatasa de las células granulosas in vitro. En la fase de dominancia, el folículo secreta cantidades elevadas de proteína regulatoria, que inhibiría la síntesis de E2 en los folículos no dominantes y provocaría su atresia. * Establecimiento de un sistema feed-back entre el folículo dominante y la hipófisis: el FD posee en el fluido folicular concentraciones de inhibina y E2 marcadamente superiores a las de otros folículos. Un sistema de feed-back negativo largo clásico se establece entre el folículo dominante y la hipófisis a través del cual disminuyen los niveles periféricos de FSH, lo que bloquea el reclutamiento de nuevos folículos. Mecanismos de acción de las gonadotrofinas Los mecanismos de acción de las gonadotrofinas sobre las células granulosas y tecales han sido revisados ampliamente (RICHARDS, 1980; IRELAND y ROCHE, 1982; NISWENDER y NETT, 1988). Las células granulosas de los folículos preantrales poseen receptores p/FSH, mientras que los receptores p/LH sólo aparecen cuando se forma el antro. En cambio, las células tecales poseen receptores p/LH desde el estadio preantral, pero nunca desarrollan receptores p/FSH. Durante la foliculogénesis, la FSH induce la síntesis de sus propios receptores y luego los de LH en las células granulosas. La teoría denominada "dos células, dos gonadotrofinas" (ERICKSON y col., 1985), es la que mejor explica la biosíntesis de esteroides en el ovario. Las gonadotrofinas se unen a sus sitios receptores y activan el sistema de respuesta adenilato ciclasa-AMPc. La adenilato ciclasa posee una subunidad regulatoria (prot G) que es activada por nucleótidos de guanina. Posee además, una subunidad catalítica que metaboliza ATP a AMPc cuando está unida a la prot G. Como resultado del incremento en los niveles intracelulares de AMPc, se produce la activación de las proteín-quinasas que estimulan la fosforilación de enzimas esteroidogénicas y en consecuencia, la síntesis de esteroides. Durante la foliculogénesis las células de la teca responden a LH, principalmente mediante la activación de la enzima que cliva la cadena lateral del colesterol (SCC) y las enzimas que intervienen en la biosíntesis de andrógenos. Los andrógenos tecales atraviesan la membrana basal y son convertidos a estrógenos (sistema aromatasa) en las células granulosas. El desarrollo de un sistema aromatasa activo, regulado por la FSH, constituye un paso clave para la iniciación de la dominancia folicular. El E2 es un potente amplificador de los efectos de la FSH, aunque otros factores (esteroideos y proteicos) modulan la acción de las gonadotrofinas. La acción de la LH sobre las células luteales involucra además Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 28 Rivera del clásico sistema adenilato ciclasa-AMPc, un mecanismo donde interviene el metabolismo de fosfolípidos tales como el fosfatidil-inositol (HANSELy DOWD, 1986; SMITH, 1986; NISWENDER y NETT, 1988). Después de la unión de la hormona con su receptor, una enzima cliva el fosfatidil-inositol 4-5 difosfato en diacilglicerol (DG) y trifosfato de inositol (IP3). El IP3 libera Ca++ intracelular, mientras que el DG activa una proteín-quinasa Ca++ dependiente (quinasa C) que desencadena una respuesta celular. Luego de una serie de conversiones el IP3 y el DG se combinan para resintetizar el fosfatidil-inositol 4-5 difosfato. Este mecanismo parece tener mayor importancia en las células luteales grandes. Otros mecanismos de regulación Además del control endocrino, existen mecanismos de regulación paracrina y autocrina de la función ovarica (HAMMOND y col., 1988). El sistema endocrino clásico involucra a diversas glándulas endócrinas que secretan sus hormonas a la circulación (sanguínea o linfática) a través de la que son transportadas hasta sus órganos blanco. Los mecanismos de regulación parácrina implican la difusión local de factores de crecimiento o regulación a las células efectoras. Esta forma de comunicación intercelular tiene gran importancia durante el desarrollo embrionario, previo al establecimiento del sistema circulatorio. La regulación autócrina es un proceso a través del cual una célula secreta una hormona, factor de crecimiento o regulación, para el cual posee receptores funcionales. Diversas sustancias han sido caracterizadas como hormonas intraováricas (factores de regulación paracrina y autocrina), bajo los siguientes criterios (TSAFRIRI, 1988): a) ser encontrada en ovario sin existir evidencias de un origen extraovárico; y b) demostración de su efecto biológico en el ovario in situ, in vitro o en preparaciones de células ováricas in vitro. En el FF tanto como en extractos ováricos se han aislado numerosos moduladores de la ovogénesis y de la foliculogénesis (IRELAND y ROCHE, 1982; TSAFRIRI, 1988), entre los más importantes se encuentran: inhibidor de la maduración ovocitaria (OMI); factores de crecimiento y mitogénicos: factor de crecimiento epidermal (EGF); factor de crecimiento fibroblástico (FGF); factor de crecimiento de origen plaquetario (PDGF); factores de crecimiento semejantes a insulina (IGF-I/II), proteína regulatoria folicular (FRP), factores angiogénicos, péptidos semejantes a GnRH, etc. Para muchas de estas sustancias se han determinado receptores en las células ováricas. Por ejemplo para el IGF-I, que estimula la mitosis de las células granulosas y la esteroidogénesis in vitro (HAMMOND y col., 1988). ECHTERNKAMP y col. (1990), demostraron que las vacas genéticamente seleccionadas por producción de mellizos dicigóticos, poseen concentraciones de IGF-I en suero y en el fluido folicular más altas que las no seleccionadas. El IGF-I participa en la regulación de la foliculogénesis y es aparentemente mediador de un componente genético responsable de las ovulaciones múltiples en la vaca. Conclusiones El amplio desarrollo de las técnicas radioinmunológicas durante los últimos 20 años, ha posibilitado conocer detalladamente los ritmos de secreción endocrina y las interacciones entre los componentes del eje hipotálamo-hipófisis-ovario. El establecimiento de las bases fisiológicas del proceso reproductivo de la vaca permitió el desarrollo de diversos métodos para el control del ciclo estral, de gran importancia para el incremento de la eficiencia reproductiva y para los programas de mejoramiento genético. Asimismo, el estudio de la función ovárica mediante la ecografía y las diversas técnicas de biología molecular, contribuyó a una mejor comprensión de la foliculogénesis y de la regulación luteal. Biotecnología de la reproducción www.reprobiotec.com Regulación neuroendócrina 29 A pesar de los esfuerzos realizados, aún se desconocen muchos mecanismos fisiológicos de la actividad neuroendocrina del ovario, como por ejemplo: I) II) III) IV) Factores que controlan la maduración ovocitaria El ingreso de los folículos con crecimiento detenido al pool de folículos en crecimiento La regulación de la secreción de FSH, inhibina y activina Los mecanismos por los que un folículo dominante suprime el crecimiento de los demás folículos durante la fase de dominancia y V) Sistemas de comunicación intercelular que intervienen en el desarrollo folicular, la esteroidogénesis y la regresión luteal. Bibliografía ALILA, H.W., HANSEL, W. 1984. 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Esto debe complementarse con un régimen óptimo de insemina-ción artificial, utilizando semen de muy buena calidad. DONALDSON (1984e), demostró que a pesar de que se cumpla con todos estos requisitos, la respuesta superovulatoria (RS) resulta muy variable. En un estudio retrospectivo que incluyó 1263 donantes, el autor encontró que solamente el 68% de las hembras inducidas a superovular produjeron embriones transferibles. El 32% restante lo integraron: 7% de donantes en las que no se produjo estimulación ovárica. 7% de donantes en las que no se recolectaron ni ovocitos ni embriones. 17% de donantes en las que no se obtuvieron embriones transferibles. 1% de donantes en las que no se efectuó la recolección de embriones porque presentaron celo antes de administrársele la prostaglandina F2 (PGF2 ) durante el tratamiento hormonal. Estos porcentajes, con algunas variaciones, se repiten cada vez que se analiza la producción de embriones de un número significativo de donantes superovuladas. A continuación se analizan los factores responsables de la variabilidad en el RS y se aportan recomendaciones prácticas tendientes a disminuirla. Variabilidad de la respuesta superovulatoria El análisis se efectúa en base a lo propuesto por MAPLETOFT y MURPHY, 1987) quienes consideraron por un lado, la variabilidad debida a los tratamientos hormonales y por otro, la variabilidad inherente a la donante y su medio ambiente. Variabilidad debida a los tratamientos hormonales Gonadotrofina empleada: La inducción a la superovulación se efectúa principal-mente con gonadotrofina sérica de yegua preñada -PMSG- o con extractos de pituitaria porcina que generalmente se conocen como FSH-p, a pesar de que en muchos casos contienen mayor cantidad de hormona luteinizante -LHque de hormona folículo estimulante -FSH-. La PMSG, también denominada gonadotrofina coriónica equina -eCG-, es una glicoproteína producida por los cálices endometriales y se comprueba biológica-mente entre los días 35 y 140 de gestación. La relación FSH/LH de esta hormona varía durante la preñez. (GODKE y col., 1978; PAPKOFF, 1981) La PMSG debido a su elevado peso molecular no atraviesa el filtro renal y por lo tanto, tiene larga vida media en sangre. Esto permite inducir superovulación en la hembra bovina mediante la administración de una dosis única entre los días 8 y 14 del ciclo estral (SAUMANDE y CHUPIN, 1984). Sin embargo, su permanencia prolongada en sangre provoca un crecimiento folicular disperso, con niveles altos de Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 34 Cabodevila & Torquati estrógenos que afectan tanto la tasa de fertilización como la calidad embrionaria. Además de generar procesos inmunitarios que hacen necesario, en tratamientos posteriores, emplear una mayor dosis de hormona para lograr el mismo efecto (RAMAKRISHNA y RAMACHANDRAIAH, 1989). BINDON y PIPER, (1977) informaron la utilización de un suero anti-PMSG para eliminar los efectos indeseables de esta hormona, luego de inducida la superovulación. Distintas especies han sido empleadas para obtener este suero: pavos (DHONT y col., 1978), cabras (KUMMER y col., 1980), bovinos (KIM y col., 1987; SAUMANDE y CHUPIN 1981) y ovinos (KIM y col., 1987). Asimismo, se han efectuado estudios in vitro e in vivo para determinar la efectividad de esos sueros (SAUMANDE y CHUPIN, 1987). También se han hecho estudios comparando anticuerpos mono y policlonales (DIELEMAN y col., 1987; GRASSO y col., 1989; MOYAERT y col., 1985). El momento más oportuno para administrar el suero anti-PMSG es luego de producido el pico preovulatorio de LH (ALFORAIJI y col., 1989; DIELEMAN y col., 1987); en la práctica, en el momento de la primera o segunda IA (SAUMANDE y CHUPIN, 1984; WANG y col., 1987) debido a que el suero antiPMSG reacciona en forma cruzada con las gonadotrofinas hipofisiarias y puede interferir con el pico preovulatorio de LH (DHONT y col., 1978). La mayoría de los investigadores coincide en señalar que la administración del suero anti-PMSG produce una mejora en los parámetros con los que se mide la RS, o sea: número de ovocitos y embriones recolectados (KUMMER y col., 1980) y número de embriones transferibles (DIELEMAN y col., 1987; 1989; KUMMER y col., 1980; SAUMANDE y CHUPIN, 1981). La misma puede atribuírse a un incremento en las tasas de ovulación y fertilización (BOLAND y col., 1981; DHONT y col., 1978; KUMMER y col., 1980). También se ha comprobado en los animales tratados con suero anti-PMSG, menor duración del celo (DHONT y col., 1978; KUMMER y col., 1980; MOYAERT y col., 1985), menor número de folículos mayores de 10 mm no ovulados (DHONT y col. 1978; MOYAERT y col. 1985; SAUMANDE y CHUPIN, 1981) y una mayor normalidad en la esteroideogénesis folicular (KUMMER y col., 1980; MOYAERT y col., 1985). Si bien en general el suero anti-PMSG mejoró los resultados de la superovulación con esta gonadotrofina, también se registran casos en los que no ejerció ningún efecto beneficioso (CHUPIN y PROCUREUR, 1988; ZEITOUN y col., 1988). A los efectos de profundizar el conocimiento de los mecanismos de acción de la PMSG y del suero anti, se han efectuado recientemente numerosos estudios endócrinos y de histología folicular (BEVERS y col., 1988; CALLESEN y col., 1989a,b; DIELEMAN y col., 1988a,b, c, d, e). Estos estudios han demostrado que la neutralización de la PMSG, pocas horas después de producido el pico de LH, sincroniza la maduración folicular y acorta el período en el que ocurren las ovulaciones múltiples. La FSH-p es la gonadotrofina más empleada en el pasado y el presente de la superovulación de hembras bovinas. El tratamiento de superovulación con esta hormona se basa en la administración de dos dosis diarias durante 4 ó 5 días (LOONEY y col., 1981), comenzando en general entre los días 9 y 13 del ciclo estral (DONALDSON, 1984). ELSDEN y SEIDEL, jr. (1990) emplean también el dia 14 del ciclo. En el cuadro 1 se presentan resultados de tratamientos efectuados para comparar la respuesta superovulatoria a la PMSG y a la FSH-p. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Superovulación 35 Cuadro 1: Comparación de la respuesta superovulatoria después de tratamientos con PMSG y FSH-p Gonadotrofina Ovocitos y embriones recolectados x ± DS Embriones transferibles x ± DS 4 3 2 4±1 6±1 Autor/es PMSG (2500 UI) + anti PMSG FSH-p1 (28 mg) FSH-p2 (400 mg) purificada PMSG (3000 UI) FSH-p (40 mg) 5 5 4 7±2 9±2 KIM y col. (1988) MAPLETOFT (1980) PMSG (2500 UI) FSH-p (50 mg) 6±6 9±7 3±5 4±4 MONNIAUX (1983) y col. PMSG (300 UI) PMSG (3000 UI) + anti PMSG FSH-p (32 mg) 1 NR NR NR 9b 5a 5a FOOTE y col. (1989) Burns-Biotec, Oakland, CA 2 Folltropin®, Vetrepharm, Ontario NR: no registrado. Los valores con letras diferentes dentro de una misma columna difieren significativamente (p < 0,05). En menor medida, se han utilizado extractos de pituitaria equina -EPE- o -HAP-, ovina (FSH-o) (ALBERIO y col., 1991b; DONALDSON, 1989) y una gonadotrofina aislada de la orina de mujeres menopáusicas -HMG-. El extracto de pituitaria equina se administra en dosis diarias decrecientes durante 3 ó 4 días. Fué utilizado a fines de la década del 70 obteniéndose resultados similares a los logrados con PMSG (DANNER y col., 1979 y 1980). La utilización repetida induce la producción de anticuerpos (ALWAN y col., 1988) y por consiguiente provoca una caída de la respuesta superovulatoria (YIGEZU y col., 1988). La HMG es un preparado altamente purificado de vida media muy corta. Requiere un esquema de administración idéntico al de la FSH-p (LAURIA y col., 1982a; LINDSEN y col., 1986; Mc. GOWAN y col., 1983; STORRING y col., 1976). Los resultados de superovulación con esta hormona son comparables con los de la PMSG (ABDUL SAEED y col., 1989; NEWCOMB, 1980) y con los de la FSHp (CRITSER y col., 1982; LAURIA, y col., 1982b; MAPLETOFT y col., 1988a,b). ALCIVAR y col. (1984) observaron con la HMG un porcentaje de preñez menor luego de la transferencia no quirúrgica de los embriones con respecto al obtenido con la FSH-p. A fin de evitar la gran variabilidad en las propiedades bioquímicas y biológicas que presentan las gonadotrofinas, ha sido producida una FSH bovina (FSH-b) mediante recombinación de ADN (BELLOWS y col., 1991; CHAPPEL y col., 1975; WILSON y col., 1988). Los resultados preliminares Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 36 Cabodevila & Torquati obtenidos son altamente satisfactorios (LINDSELL y col., 1988). Dosis de gonadotrofinas En los tratamientos de superovulación, la existencia de una relación dosis-respuesta ha sido demostrada para distintas gonadotrofinas y en razas diferentes (DONALDSON, 1984b; 1985; Mc GOWAN y col., 1983; PAWLYSHYN y col., 1986; SAUMANDE y CHUPIN, 1986b; WANG y col., 1988; WU y col., 1988a; ZEITOUN y col., 1988). Esto significa que cuando la dosis se incrementa más allá de lo óptimo, el número de ovulaciones no aumenta y el de ovocitos fertilizados y embriones transferibles disminuye (ver Cuadro 2). Los efectos negativos de altas dosis de gonadotrofinas se relacionan con los fenómenos de sobreestimulación ovárica que serán considerados cuando se trate la influencia de la edad de la donante. En los animales sobreestimulados, generalmente se obtiene también una menor tasa de recolección (ovocitos y embriones recolectados/cuerpos lúteos palpados y observados). Se han adjudicado para ello distintas razones: a) Retención de ovocitos en los folículos luteinizados y en los CL (MONNIAUX y col., 1983). b) Retención de ovocitos y/o embriones en los oviductos (Mc GOWAN y col., 1985). c) Niveles muy altos de estrógenos producidos por los grandes folículos no ovulados que bloquearían la capacidad de captación de las fimbrias con la consiguiente caída de ovocitos en la cavidad abdominal (BOOTH y col., 1975). A pesar de que en la práctica, cuando una donante no responde a la dosis inicial de FSH-p (generalmente 28 a 40 mg Armour) es común incrementar la misma para un segundo tratamiento; el análisis de la información disponible revela que este aumento de la dosis de gonadotrofina no es útil en el tratamiento de donantes "problema". Además, al incrementar la dosis de gonadotrofina aumenta el porcentaje de recolecciones en las que no se obtienen embriones transferibles (DONALDSON, 1984; ver Cuadro 3). Relación FSH/LH de la serie de gonadotrofina: En los mamíferos, la foliculogénesis depende tanto de la FSH como de la LH. Las gonadotrofinas utilizadas para inducir superovulación tienen relaciones FSH/LH diferentes. Las preparaciones hormonales producidas en un momento determinado y bajo las mismas normas de procesamiento presentan igual número de serie. La relación FSH/LH de cada serie de gonadotrofina es distinta (MURPHY y col., 1984). En el caso de la PMSG, la diferencia se debe a variaciones individuales entre donantes y también al momento de la gestación en el que es obtenida la hormona (GONZALEZMENCIO y col., 1978). En la FSH-p las variaciones se relacionan fundamentalmente con la dificultad para separar ambas hormonas a partir de extractos hipofisiarios (LINDSELL y col., 1989). Únicamente la HMG se caracteriza por poseer cantidades equivalentes de FSH y LH que además, permanecen constantes. Se han hecho numerosos estudios para establecer relaciones FSH/LH óptimas para la superovulación de hembras de razas distintas, productoras de carne o leche (ALBERIO y col., 1989; 1991a; CABODEVILA y col., 1989; CHUPIN, y PROCUREUR, 1984; 1985; DONALDSON, 1987; HILL y col., 1984; 1985; LAURIA y col., 1983; LINDSELL y col., 1986a, b; MAPLETOFT, 1980; SHMIDT y col., 1988). CHUPIN y col., (CHUPIN y PROCUREUR, 1985) observaron que las donantes de razas lecheras son más sensibles que las productoras de carne, a cantidades excesivas en la preparación hormonal. A fin de corroborar esta información, ALBERIO y col. (1991) trataron vacas Holando Argentino con una FSH-p cuya relación FSH/LH fue 10. Las mismas donantes fueron tratadas alternativamente de manera diferente: En un caso, se mantuvo la relación FSH/LH 10 constante y en el otro, se le incorporó a la FSH-p cantidades crecientes de LH pura a partir de la 3ra. inyección. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Superovulación 37 Cuadro 2: Respuesta superovulatoria obtenida con distintas dosis de gonadotrofinas Embriones obtenidos 12 ± 11 15 ± 12 11 ± 9 12 ± 11 7± 7 7± 8 1 ± 0,5b 4 ± 1b 14 ± 2a 15 ± 3a 5b 19a 25a 15a 0,8 6 8 8 8 9 6 3 5 3 Hormona FSH Dosis 24 mg 28 mg 38 mg 40 mg 50-52 mg 60 mg Transferibles 5±6 6±6 5±6 5±6 4±5 3±4 1 ± 0,4 3±1 7 ± 1b 2 ± 0,7a 3 6 5 0,2 0,3 3 3 3 3 3 2 NR NR NR (%) 57 ± 37a 45 ± 35a 52 ± 34a 43 ± 42a 47 ± 36a 40 ± 38b NR NR NR NR 55 34 20 1 38 52 40 41 35 33 40 43 25 15 Autor/es DONALDSON (1984) HMG 25% 50% 100%+ 200% MAURER y col. (1985) FSH-p 15 mg 30 mg 45 mg 60 mg PAWLYSHYN y col. (1986) FSH-p** 5 mg 10 mg 15 mg 20 mg 25 mg 30 mg 40 mg 1500 UI 3000 UI 6000 UI WU y col. (1988) ZEITOUN y col. (1988) NR: no registrado; *: equivale a 1050 UI de actividad de FSH como de LH. **: FSH-p con bajo contenido de LH, 20 mg = 35 mg FSH standard NIH. Todas las FSHs están expresadas en unidades Armour. Los valores con letras diferentes dentro de una misma columna difieren estadísticamente (p < 0,05). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 38 Cabodevila & Torquati Cuadro 3: Porcentaje de recolecciones en las que no se obtuvieron ovocitos ni embriones en relación a la dosis de FSH-p (DONALDSON, 1984) Dosis de FSH (mg) 35 35-42 533 17%a 30%a 42 180 21%b 44%b No de recolecciones Sin ovocitos y embriones recolectados Sin embriones transferibles 393 12%a 27%a Los valores con letras diferentes dentro de una misma línea difieren estadísticamente (p < 0,001). La respuesta superovulatoria en ambos tratamientos fue similar. Sin embargo, cuando se incorporó la LH se obtuvo una respuesta menor en el 50% de las donantes siendo afectada de manera significativa la tasa de recolección. Una cantidad excesiva de LH en la preparación hormonal provoca: - menor tasa de ovulación (DONALDSON y WARD, 1987; FAROOKI, 1981). - menor tasa de fertilización (DONALDSON, L. y col. 1986). - menor número y porcentaje de embriones transferibles (CHUPIN y PROCUREUR, 1984; DONALDSON y col., 1986; DONALDSON y WARD, 1987. El número de ovulaciones se vería disminuido al alterarse la relación andrógenos-estrógenos que es crítica para evitar la atresia de los folículos antrales (FAROOKI, 1981). Las donantes tratadas con preparaciones hormonales con un contenido excesivo de LH presentan niveles altos de progesterona en el momento del celo. Este hecho se debería a una acción luteotrófica ejercida por la LH sobre los folículos preantrales y los grandes folículos luteinizados. El aumento en los niveles de progesterona, acelera el transporte de los ovocitos (CRISMAN, y col., 1980) y de esta manera, sería el responsable de la menor tasa de fecundación. El menor número y porcentaje de embriones transferibles también podría estar relacionado con el desequilibrio endócrino que producen las preparaciones hormonales con una cantidad excesiva de LH (MAURER y ECHTERNKAMP, 1982; MULLINS y col., 1980). En el Cuadro 4 se presenta un resumen de tratamientos de superovulación efectuados con FSH-p con diferentes relaciones FSH/LH. Dosis y frecuencia de administración de la PGF2 durante la inducción Durante el tratamiento de superovulación, independientemente de la gonadotrofina que se emplee, a las 48-72 h de haber comenzado la inducción, se debe administrar PGF2 o alguno de sus análogos sintéticos (PERRY y DONALDSON, 1984). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Superovulación 39 Cuadro 4: Resultados de tratamientos superovulatorios efectuados con FSH-p con diferentes relaciones FSH/LH. Ovocitos y embriones recolectados x + DS 4a 10b 5a 11 ± 10 12 ± 10 0,5a 3a 7b 4±5 4±3 10 6 6 6 4 6 9 8 4±1 9±2 5±1 Embriones transferidos n (%) 2a (52a) 6b (55) 2a (35) 3±4 6 ± 7 (47 ± 35) 0,5a(NR) 2a (NR) 5b (NR) 3 ± 5 (68) 3 ± 2 (62) 7 (NR) 6 (NR) 4 (76) 4 (76) 3 (69) 0,8(NR) 5 (NR) 5 (NR) 2 ± 0,7 3 ± 0,7 2 ± 0,7 Relación FSH/LH 2000 500-3000 140 8,2 100 0,1 0,5 8,7 0,02 3,9 Comercial A Comercial B 0,2 3 3,9 100 10 5 1,25 2,5 5 Autor/es DONALDSON y WARD (1987) DONALDSON y col. (1986) CHUPIN y col. (1984) ALBERIO y col. (1989) BECKERS (1987) CABODEVILA y col. (1989) SCHMIDT y col. (1988) HASLER (1983) NR: no registrado Los valores con letras diferentes dentro de una misma columna difieren estadísticamente (p< 0,05). La regresión completa del CL durante la inducción tiene vital importancia dado que influye sobre: a) el porcentaje de donantes que presentan celo -muy importante si se tiene en cuenta que la presentación de celos- se correlaciona positivamente con el grado de estimulación ovárica (DONALDSON, 1984). el número de ovocitos y embriones recolectados y www.reprobiotec.com b) Biotecnología de la Reproducción 40 Cabodevila & Torquati c) el número de embriones transferibles (PHILLIPPO y ROWSON, 1975). La dosis, el número de veces en que ésta se divide y la vía de administración, dependen de la PGF2 o del análogo que se utilice. En el caso de la PGF2alfa, se ha observado que es más importante el número de veces que se administra que la dosis total (DONALDSON, 1983; LOONEY y col., 1985). La información disponible sobre el efecto de la aplicación intravenosa o intramuscular sobre el número de embriones transferibles es contradictoria (ALMEIDA, 1987; PERRY y DONALDSON, 1984). Para el Cloprostenol, la utilización de una dosis doble a la necesaria en un tratamiento luteolítico standard, dividida en dos aplicaciones, ha tenido un efecto beneficioso sobre la respuesta superovulatoria. Resta confirmar si el mismo se debió al empleo de una dosis mayor o a la administración fraccionada (HUTTER y col., 1988). Sin embargo, en Francia (G.I.E. Nord Est Embryo, comunicación personal) utilizaron la doble dosis de Cloprostenol por varios años y en la actualidad, emplean una única dosis sin observar variaciones en la respuesta superovulatoria. En estudios comparativos, el Delprostenate tendió a producir un número mayor de embriones transferibles que el Cloprostenol y el Tiaprost (CABODEVILA y col., 1989). En cambio, no se registraron diferencias entre PGF2alfa, Cloprostenol (DONALDSON, 1984f; PERRY y DONALDSON, 1984) y Fenprostaleno (PERRY y DONALDSON, 1984). Modificaciones en los esquemas de tratamiento Las modificaciones en los esquemas de tratamiento se limitan exclusivamente a la FSH-p. Entre las innovaciones menores, se destaca la introducida por CHUPIN y PROCUREUR (1982) quienes comprobaron que la respuesta superovulatoria era mayor, administrando dosis diarias decrecientes en lugar de dosis constantes, durante los 4 ó 5 días de tratamiento. La utilización de dosis decrecientes no resultó en una mejora en la respuesta superovulatoria cuando se utilizó FSH-p con bajo contenido de LH (MAPLETOFT, 1988). Teniendo en cuenta que el actual esquema de aplicación de la FSH-p representa un problema desde el punto de vista práctico, se han implementado distintas modificaciones con el objeto de resolverlo: a) Reducción en la duración del tratamiento. A diferencia de lo ocurrido cuando se redujo la duración del tratamiento de 5 a 4 días, el acortamiento a 3 días produjo una disminución de la respuesta superovulatoria (GARCIA y col., 1982; MAPLETOFT, 1988). La administración de FSH-b durante 3 días ha permitido (BELOWS y col., 1991; JONES y WILSON, 1992) obtener una respuesta superovulatoria mayor a la que se registra con los tratamientos clásicos con FSH-p. b) Administración de una sola inyección. Otra forma de simplificar el régimen, fue reducir las 2 dosis diarias, con 12 h de intervalo, a una sola inyección por día (Mc Farland y col., 1985). Se utilizó un vehículo gelatinoso a los efectos de retardar la liberación de hormona a sangre (LOONEY y col., 1981; WARFIELD y col., 1986). A pesar de haberse obtenido resultados preliminares similares a los de los esquemas tradicionales, esta innovación fue dejada de lado. DEMOUSTIER y col., 1988 observaron que la FSH no es detectable en plasma a partir de 10-12 h postinyección. A pesar de ello, recientemente se ha insistido con esta innovación, obteniéndose con una sola inyección diaria, una respuesta superovulatoria similar a la que se registró con un tratamiento clásico (CAMPARA, comunicación personal). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Superovulación 41 c) Cambios en la vía de administración. La FSH-p generalmente se administra por vía intramuscular en solución salina. Las modificaciones en este sentido se han orientado por un lado, a utilizar la infusión continua por vía intra-arterial (GUILBAULT y col., 1987) o intravenosa (GODKE y col., 1978; WARREN y col., 1978) tratando de mantener un nivel de hormona constante en sangre y por otro, en emplear la vía subcutánea bajo la forma de un implante en vehículo gelatinoso (LOONEY y col., 1982; SCHALLEMBERGER y col., 1988; WUBISHET y col., 1986b). En todos los casos, se han obtenido respuestas superovulatorias menores que con los tratamientos tradicionales. GUILBAULT (1990) cree que cuando se utilizan las vías intraarterial o intra-venosa se produce una saturación de los receptores a FSH. BO y col. (1991) indicaron que administrando 400 mg NIH de FSH-p (Folltropin®) en una inyección subcutánea de 20 ml el primer día de tratamiento, es posible obtener una respuesta superovulatoria comparable con la del esquema de inyecciones múltiples. Recientemente el mismo grupo de investigación (HOCKEY y col., 1992) logró obtener 9 embriones transferibles (15 recolectados) aplicando igual dosis y de la misma forma a donantes de razas productoras de carne. Dosis mayores condujeron a una disminución del número de embriones recolectados y transferibles. Combinación de las gonadotrofinas con otras hormonas La asociación más importante es la que se efectúa con progesterona o progestágeno a los efectos de sincronizar los celos de las donantes que ingresan a un programa de TE. Cuando se utilizan progesterona o progestágeno y a diferencia de lo que ocurre con la PGF2 , el programa puede comenzar en forma inmediata independiente-mente de que las donantes se encuentren en fase luteal. Además, puede inducirse la superovulación en donantes que se encuentran en anestro post-parto (DONALDSON, 1984). Se utilizan implantes subcutáneos con progestágenos y dispositivos intravaginales con progesterona (PRID®) o progestágenos (esponjas) durante 9-11 días, comenzando el tratamiento de superovulación 48 h antes del retiro del implante o del dispositivo (ALBERIO y col., 1991e); ELLINGTON y col., 1987). La información sobre administración de FSH-p y PMSG en el curso de un tratamiento con progestágenos es muy abundante (PERRY y DONALDSON, 1984; SHEA y col., 1984; HILL y col., 1984; KIM y col., 1987; LUSSIER y CARRUTHERS, 1987; LOONEY y col., 1988; HERRLER y col., 1989). En muchos casos, se obtuvo una respuesta superovulatoria menor que la registrada con los tratamientos iniciados sobre ciclos naturales o inducidos con PGF2 (ALMEIDA, 1987a; 1987e; SCHALLEMBERGER y col., 1988). ALBERIO y col. (1991e) partieron de la hipótesis que la respuesta superovulatoria de los animales cíclicos depende del momento del ciclo estral en que se induce la superovulación. Para demostrarlo, colocaron esponjas intravaginales en distintos momentos del ciclo. El tratamiento superovulatorio comenzó siempre 7 días después de haber colocado las esponjas. Se utilizaron 32 mg Armour de FSHp divididos en 8 dosis decrecientes, administradas cada 12 horas en 8 dosis decrecientes, administradas cada 12 horas. Las esponjas permanecieron durante 9 días, al retirarlas se administró la 1ra. PGF2alfa. Como control, se utilizó un grupo de vacas que recibieron el mismo tratamiento superovulatorio, comenzando el día 9 del ciclo estral. El esquema utilizado y los resultados obtenidos se presentan en la tabla 1. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 42 Cabodevila & Torquati Tabla 1 Respuesta superovulatoria de donantes tratadas previamente con progestágeno en diferentes momentos del ciclo estral (ALBERIO y col, 1991e) Grupo Colocación de la esponja, dias 0-6 7-13 14-20 8-12 CL n 6±4 7±4 4±3 7±6 O/ER n 5±4 5±5 2±4 8±6 ETr n 4±3 4±5 2±3 5±5 I **** n= 12 II **** n= 12 III **** n= 12 Control IV **** n= 12 *: FSH-p; *: FSH-p + PGF2 + retiro de la esponja CL: cuerpos lúteos palpados O/ER: Ovocitos y embriones recolectados ETr: Embriones transferibles Cuando la superovulación fue inducida en el curso de un tratamiento con progestágenos la respuesta superovulatoria resultó inferior, especialmente cuando comenzó a administrarse la FSH-p al final del ciclo estral (Grupo III). GARCIA-WINDER y col. (1988) utilizaron implantes y no administraron estradiol en el momento de su colocación. Obtuvieron una respuesta semejante a la de los controles no implantados pero la tasa de recolección resultó inferior. Adjudicaron este hecho a desbalances endocrinos que pueden haber afectado el transporte de los gametos. Esta observación no fue corroborada por otros investigadores (WU y col., 1988b). PATTERSON y col. (1992) superovularon donantes de raza Aberdeen Angus jóvenes (alrededor de un año de edad) provocando el celo con progestágeno administrado en forma oral. La tasa de embriones transferibles (19-29%) no fue diferente estadísticamente entre los grupos tratados con progestágeno y prostaglandina respectivamente. A pesar de la inconveniencia de superovular hembras que presentan baja fertilidad o ciclos estrales irregulares, la asociación de progesterona o progestágenos con gonadotrofinas puede ser útil para lograr en estas donantes una mayor sincronía y reducir el número de ovocitos sin fertilizar y embriones degenerados (ALBERIO y col., 1991e; ELSDEN y col., 1983). La aplicación de hormona liberadora de gonadotrofinas GnRH o gonadotrofina coriónica humana -HCGen hembras inducidas a superovular, tiene por objeto provocar el pico preovulatorio de LH en el momento adecuado y producir así, una ovulación más sincrónica. La GnRH o su análogo sintético buserelina, se han administrado en el período comprendido entre las 48 hs. pos-inyección de la PFG2 y las 24 h de iniciado el celo. Estos tratamientos generalmente no modificaron la respuesta superovulatoria (FAROOKI, 1981; PRADO DELGADO y col., 1984; 1989; VOSS y col., 1989). Sin embargo, WUBISHET y col., 1986a) obtuvieron una mayor tasa de fecundación y un mayor número de embriones transferibles. La administración de HCG no modificó significativamente ninguno de los parámetros con los que se mide la respuesta superovulatoria (KUNKEL y col., 1987). En trabajos experimentales, la FSH-p ha sido combinada con estrógenos y la PMSG con antiesteroides ováricos. La suplementación con estrógenos tuvo por objeto aumentar el número de folículos antrales pequeños que alcanzan el estado preovulatorio (SAVAGE, MAPLETOFT, 1984). Normalmente llegan a este estado únicamente los folículos que tienen un alto tenor de estrógenos lo que les permite sintetizar receptores a LH en las células de la granulosa, siendo éste un requisito imprescindible para el proceso Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Superovulación 43 de foliculogénesis. La administración de 17ß estradiol o cipionato de estradiol, 36 h después de la PGF2 , no mejoró la respuesta superovulatoria (ELLINGTON y col., 1987; SAVAGE y MAPLETOFT, 1987). Por el contrario, el cipionato de estradiol disminuyó el número de embriones transferibles en vaquillonas (ELLINGTON, y col., 1987). En estudios efectuados en animales hipofisectomizados se comprobó que la secreción de gonadotrofinas tiene dos mecanismos de control. Al feed-back ejercido por la inhibina se le suma un sistema local mediado por esteroides ováricos (BINDON y PIPER, 1977; CAHILL, 1984). En primera instancia, se trató de incrementar la tasa de ovulación provocando directamente la inmunización activa contra estos esteroides, los resultados fueron negativos. Posteriormente, a vacas inmunizadas contra testosterona se las indujo a superovular con PMSG obteniéndose en un caso, un número mayor de ovulaciones que en el grupo control no inmunizado (BOLAND y col., 1985) y en otro, ningún beneficio sobre la respuesta superovulatoria (G.I.E. Nord Est Embryos, comunicación personal). Variabilidad inherente a la donante y su medio ambiente: Las diferencias individuales y de medio ambiente son la mayor fuente de variación de la respuesta superovulatoria (SUITOYUS y VASHKAS, 1989; XU y col., 1988). Estado del ovario en el momento del tratamiento Los folículos primordiales, formados durante la vida intrauterina comienzan paulatinamente, durante la vida reproductiva, su proceso de desarrollo. En éste, los folículos primordiales se convierten sucesivamente en preantrales (primarios o secundarios) y antrales, siguiendo luego la atresia (en la gran mayoría de los folículos) o la ovulación (IRELAND y ROCHE, 1983). El motivo por el cual los folículos primordiales comienzan a desarrollar convirtién-dose en preantrales no es conocido. La formación del antro folicular es independiente del nivel de gonadotrofinas, sin embargo el número de folículos que alcanzan tal desarrollo sí depende del nivel de éstas. Cuando se efectúa un tratamiento superovulatorio, la administración de gonadotrofinas tiene por objeto incrementar el número de folículos preantrales que se convierten en antrales y reducir a su vez el número de folículos antrales que sufren atresia. MOOR y col. (1984) demostraron que las gonadotrofinas exógenas provocan la ovulación de folículos antrales de tamaño mediano. Una mayor proporción de estos folículos se encuentran en los ovarios entre los días 0-5, y 9-13 del ciclo estral. Esto hizo suponer una mejor respuesta superovulatoria a tratamientos efectuados en esos días. LINDSELL y col. (1985 y 1986b) compararon tratamientos de superovulación que comenzaron en diferentes días del ciclo estral. Observaron un número inferior de ovulaciones y de embriones recolectados en las que comenzaron el día 3 con respecto a las que lo hicieron el día 9 (ver Cuadro 5). Surgió entonces la hipótesis de que la respuesta superovulatoria depende de otros factores, además del número de folículos receptivos a las gonadotrofinas presentes en un momento determinado del ciclo estral. Entre estos factores estarían: .- la presencia o no de un folículo dominante no ovulatorio (GRASSO y col., 1989a). .- la concentración de hormonas esteroideas en el fluido y el número de receptores a las gonadotrofinas presentes en las células de la teca y de la granulosa (IRELAND y ROCHE, 1983). .- los niveles de aromatasa en la células de la granulosa (Mc. NATTY y col., 1984). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 44 Cabodevila & Torquati Cuadro 5: Producción de embriones en vaquillonas superovuladas en cuatro días diferentes del ciclo estral (LINDSELL y col., 1986). Día del ciclo estral CL palpados x ± DS 3 6 9 12 9 ± 2b 11 ± 2ab 16 ± 1 12 ± 2b Ovocitos y embriones recolectados x ± DS 10 ± 2 11 ± 3 17 ± 3 12 ± 4 Embriones transferibles x ± DS 3±1 4±2 7±1 4±2 Los valores con letras diferentes dentro de una misma columna difieren estadísticamente (p< 0,05). El tratamiento de superovulación puede comenzar en días diferentes dentro del período comprendido entre los días 9 y 13 del ciclo estral, sin que se modifique la respuesta superovulatoria (CABODEVILA y col., 1989; DONALDSON, 1984a; LERNER y col., 1986). Con el objetivo de tener un mayor número de folículos receptivos a las gonadotrofinas en el momento del tratamiento, se ha administrado al comienzo del ciclo estral fluido folicular o FSH-p en baja dosis. Los resultados han sido dispares (ALBERIO y col., 1991b; GUILBAULT y col., 1987; LUSSIER y CARRUTHERS, 1987a; 1989; RAJAMAHENDRAN y col., 1987; TOTEY y col., 1989; 1990; GRASSO y col., 1989b). Efecto de la edad El efecto que tiene la edad de la donante sobre la respuesta superovulatoria ha sido muy estudiado en ganado lechero. HASLER y col. (1981) y HARRISON y col. (1982) obtuvieron un número mayor de embriones transferibles en las donantes de 3 a 6 años que en las vaquillonas y las vacas mayores de 10 años. En otro trabajo de los mismos investigadores no se repitieron tales diferencias (HASLER y col., 1981). LERNER y col. (1986) sostienen que existe una interacción entre la edad de la donante y la dosis de gonadotrofina (ver Figura 1). Según su interpretación, cuando animales jóvenes son tratados con dosis elevadas de gonadotrofinas, se produce una sobreestimulación ovárica donde muchos folículos comienzan a desarrollar pero pocos son capaces de ovular y la mayoría sufre luteinización o se atresian. Los motivos serían un insuficiente aporte sanguíneo a determinados folículos debido a limitantes físicas del ovario para albergar tantos folículos en crecimiento y por otro lado, alteraciones endocrinas con excesiva producción de esteroides ováricos que interfieren con el propio desarrollo folicular y la ovulación. En su trabajo, observaron que al aumentar la edad de la donante disminuyeron el número de ovulaciones, la tasa de fertilización y la calidad embrionaria. La disminución en el número de ovulaciones se debería a una menor disponibilidad de folículos capaces de responder a las gonadotrofinas exógenas. Al haber menos folículos en crecimiento, los niveles de inhibina bajarían y habría un aumento de la FSH endógena que haría que en estos animales, en cualquier momento del ciclo estral, los folículos en crecimiento estuvieran en un estado de desarrollo más avanzado que aquellos folículos en los animales más jóvenes. Al comenzar el tratamiento con gonadotrofinas, los folículos más maduros serían los primeros en producir grandes cantidades de estrógenos. Por lo tanto, los ovocitos dentro de estos folículos, estarían expuestos a altas concentraciones de estrógenos por largos períodos antes de la ovulación, comparándolos con los ovocitos dentro de los folículos menos Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Superovulación 45 desarrollados. Esta exposición a alta concentración de estradiol podría ser la causa de la disminución en la tasa de fertilización y en la calidad embrionaria. El aumento de la tasa de fertilización y de embriones transferibles observado por estos autores cuando incrementaron la dosis de FSH-p en los animales viejos, se debería a un aumento en la proporción de folículos relativamente menos maduros que fueron estimulados a desarrollar rápidamente. Coincidentemente con ello PATTERSON y col. (1992) obtuvieron sólo un 20% de embriones transferibles (2,4/120) de vaquillonas prepúberes sincronizadas con prostaglandina y superovuladas con 40 mg de FSH-p. Basado en estas observaciones, resulta claro que para lograr un alto número de embriones transferibles, la dosis de gonadotrofina debe ajustarse a la edad de la donante. Manteniendo una dosis de gonadotrofina constante, el número de ovocitos y embriones recolectados debería aumentar con la edad en los animales jóvenes (debido a una disminución en el grado de sobeestimulación ovárica) hasta alcanzar un pico y luego disminuiría con la edad en las vacas más viejas (debido a una menor disponibilidad de folículos en crecimiento). En razas productoras de carne, se observó que con el transcurrir de los años si bien se mantuvo el número de ovulaciones, la tasa de fertilización y la calidad embrionaria disminuyeron (DONALDSON, 1984a). Esto no pudo ser corregido aumentando la dosis de FSH-p (MOOR y col., 1984). Figura 1: Número de embriones producidos en función de la edad de la vaca y la dosis de FSH (LERNER y col., 1986) Efecto del estado nutricional de la donante El estado nutricional de la donante puede influenciar tanto las tasas de ovulación y de fecundación como la viabilidad embrionaria. En la mayoría de los estudios realizados, se ha considerado únicamente la importancia de la nutrición en animales inducidos a tener ovulaciones dobles para que gesten mellizos. En estos trabajos, tanto la respuesta ovárica a los tratamientos hormonales como la tasa de fecundación no han sido modificadas por variaciones en el peso diario de ± 500 g (DUN, 1980). El efecto del stress nutricional sobre la viabilidad embrionaria, en los estadios preimplantatorios, no ha Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 46 Cabodevila & Torquati sido estudiado en el bovino pero si muy extensamente en el ovino con resultados contradictorios (CUMING y col., 1975; EDEY, 1966; 1970a, b, c; GUILBAULT y col., 1990). Teniendo en cuenta que la alimentación con raciones con alto contenido energético, eleva los niveles plasmáticos de ácido propiónico y glucosa, se ha hipotetizado que este aumento de la glucemia podría estimular a los centros hipotalámicos y consecuentemente incrementar la actividad ovárica (HOWALAND y col., 1966). En base a esto, se han efectuado trabajos en animales superovulados, suplementándole la ración con monensina sódica. Se ha registrado un aumento en la ganancia de peso diaria y en el número de CL (ORTUNO y CARSON, 1985), sin embargo no se ha modificado el número de embriones transferibles (SAUMANDE y CHUPIN, 1986a). Como la respuesta resultó variable, queda por definir aún la condición corporal más adecuada para lograr un mayor efecto. La suplementación con monensina puede constituirse en una alternativa de interés en la superovulación de vaquillonas, si se repite lo observado por (HARRISON y col., 1982) quienes lograron en los animales suplementados, una mayor respuesta a bajas dosis de FSH-p administradas para inducir ovulaciones dobles. Esto permitiría utilizar tratamientos de superovulación con dosis bajas de gonadotrofinas evitando así, los fenómenos de sobre estimulación ovárica. Historia reproductiva: Deben considerarse aquí dos situaciones totalmente diferentes, por un lado, la TE ha demostrado ser un método alternativo útil para el diagnóstico y tratamiento de aquellos casos en que la infertilidad no se debe a problemas intrínsecos del embrión sino al medio ambiente uterino o algún otro factor materno (BOWEN y col., 1978; MAPLETOFT, 1980). Por otro lado, existen estudios en los que se observó claramente que las donantes que ingresan a Programas de TE con antecedentes de infertilidad tienen una menor producción que aquellas donantes consideradas sanas (GUNN y col., 1972). Los problemas de fertilidad incluyen anormalidades detectables por palpación transrectal (quistes ováricos, adherencias e infecciones uterinas) y otras no diagnosticadas por palpación y aún por laparoscopía como por ejemplo, obstrucciones oviductales. En un estudio comparativo (HASLER, y col. 1981), se demostró que en las donantes infértiles el número de embriones transferibles es menor y que los porcentajes de preñez son más bajos. Además, una mayor proporción de estas donantes, en el momento de efectuar la recolección, no produjeron embriones transferibles (ver Cuadro 6). Cuadro 6: Efecto de la historia reproductiva sobre la respuesta a la primera superovulación (HASLER y col., 1983) Estado reproductivo Parámetros Fértil No de animales x de ovocitos y embriones recolectados/donante x de embriones transferibles/donante Donantes sin embriones transferibles No de embriones transferidos Receptoras preñadas % 666 10 Infértil 318 6 6a 2b 14a 3707 68a 51b 604 58b Los valores con letras diferentes dentro de una misma línea difieren estadísticamente (p< 0,05). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Superovulación 47 En otro estudio con resultados similares, ELSDEN y col. (1978) dividieron para su análisis a las donantes infértiles según la etiología fuese o no conocida (ver Cuadro 7). En el grupo de donantes con infertilidad diagnosticada y que se trataron previamente a la superovulación, los autores encontraron diferencias en la respuesta según las distintas etiologías. La respuesta en las vacas con quistes ováricos fue inferior a la de las donantes con adherencias. Las tratadas contra infecciones uterinas se colocaron en un nivel intermedio dado que la respuesta ovárica fue buena pero hubo un alto porcentaje de ovocitos sin fertilizar debido probablemente a modificaciones en el medio uterino que resultaron perjudiciales para los espermatozoides. Cuadro 7: Superovulación de donantes infértiles (ELSDEN y col., 1979). Estado reproductivo Adherencias 3 8ab 4a 3a 10 Parámetros Número de tratamientos CL/tratamiento Embriones transferidos/tratamiento Preñeces/tratamiento Σ de preñeces Infección uterina 11 10a 2ab 1ab 12 Quistes ováricos 16 4b 0,2b 3 3 Los valores con letras diferentes dentro de una misma columna difieren estadísticamente (p< 0,05). Efecto de los tratamientos sucesivos El efecto que tienen los tratamientos sucesivos sobre la respuesta superovulatoria no puede ser separado del que ejercen la edad de la donante y la dosis de gonadotrofina. La mayoría de los investigadores coincide en que la respuesta superovulatoria disminuye con los tratamientos sucesivos. Algunos sostienen que el número de embriones transferibles declina a partir del cuarto o quinto tratamiento (BASTIDAS y RANDEL, 1987b; HERRLER y col., 1988), otros ubican esta declinación a partir del tercer tratamiento (DONALDSON y PERRY, 1984a; WARFIELD y col., 1986). Este criterio no es compartido por DONALDSON, y PERRY, 1983) quienes no encontraron variaciones en la respuesta superovulatoria a lo largo de diez tratamientos sucesivos. Es conveniente que los tratamientos estén separados por un período mínimo de 60 días dado que este lapso es el que tardan los folículos primarios en alcanzar el estado preovulatorio (ALI DINAR y col., 1987; LUSSIER y CARRUTHERS, 1987). Si no se respeta este período mínimo, la respuesta superovulatoria se afecta notoriamente (ver Cuadro 8). Cuadro 8: Promedio de embriones transferibles según el intervalo entre tratamientos (SHALOVILO y col., 1989) Embriones transferibles Intervalo entre tratamientos 80-90 días 45-60 días 1o tratamiento 4 1 2o tratamiento 5 3 3o tratamiento 3 2 4o tratamiento 6 - Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 48 Cabodevila & Torquati SAUMANDE y CHUPIN (1977) concluyeron que las respuestas pobres a un primer tratamiento superovulatorio tienen alta repetibilidad. Esto fue corroborado por LAMBERSON y LAMBETH (1986) quienes informaron un 64% de repetibilidad para las respuestas pobres al primer tratamiento y aproximadamente un 45% para las medias o altas. Efecto de la raza Las donantes que ingresan en Programas de TE presentan diferencias en su estado nutricional, sanitario y reproductivo, como también en el número previo de tratamientos de superovulación. Por lo tanto, no cabe considerar la producción de estas hembras como totalmente representativa de la raza. En un estudio retrospectivo sobre 1596 tratamientos de superovulación efectuados en donantes de 13 razas distintas productoras de carne, DONALDSON (1984e) encontró que la raza de la donante es un factor de variación en aspectos tales como: - número de ovocitos y embriones recolectados - número de embriones transferibles - porcentaje de embriones transferibles - número de preñeces/recolección - porcentaje de preñez La proporción de hembras que presentaron celo y el momento de aparición del mismo fue diferente en las distintas razas. Sin embargo, este factor no fue considerado por no ser determinante del número de preñeces/recolección como los porcentajes de preñez fueron influenciados por la raza de las receptoras, siendo imposible discriminar estos efectos de los de la raza de la donante. La comparación de estos resultados con otros de donantes de raza Holstein, ubica a esta raza en un término medio en lo que respecta al número de ovocitos y embriones recolectados, mejorando su performance cuando se considera el porcentaje de embriones transferibles (HASLER y col., 1981; WALTON y STUBBINGS, 1986). En un estudio retrospectivo hecho en donantes de razas lecheras y productoras de carne, se observó en la raza Jersey una mayor proporción de donantes con respuesta ovárica excesiva, sin aumentar el número de embriones transferibles/ recolección (HOLM y col., 1987). En ganado Bos indicus, independientemente del grado de respuesta ovárica, los resultados pueden ser alterados por las características propias del tracto genital de estas hembras que ofrece dificultades para efectuar la recolección (ELSDEN y col., 1979). Efecto estacional En algunos trabajos realizados en Canadá y EE.UU. no se demostró un efecto estacional sobre la respuesta superovulatoria (CRITSER, y col., 1980; MASSEY y ODEN, 1984). Sin embargo, un menor número de embriones transferibles ha sido observado durante el invierno en Texas, EE.UU. (ALMEIDA, 1987b) y en verano, en Israel y Arabia Saudita (BOLAND y col., 1981; GORDON y col., 1987). En un trabajo experimental, PUTNEY y col. (1988) sometieron a las donantes a elevadas temperaturas en el período comprendido entre la IA y la recolección y observaron que el calor produce una mayor proporción de embriones degenerados y retardados. Se puede concluir que la respuesta superovulatoria puede ser alterada por situaciones climáticas extremas (NEWCOMB, 1980), dependiendo éstas si Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Superovulación 49 ocurren en invierno o verano según la ubicación geográfica del lugar donde se realiza el tratamiento. Conclusiones A pesar de los avances que se han registrado en el conocimiento de la fisiología reproductiva de la hembra bovina en los últimos diez años, la variabilidad en la respuesta superovulatoria permanece en niveles similares a lo observado a fines de la década del setenta (ELSDEN y col., 1978). Para reducir tal variabilidad es necesario en primer lugar, optimizar las preparaciones hormonales y luego efectuar el tratamiento en hembras fértiles, en el momento adecuado y en un ambiente propicio. Los tratamientos hormonales deben producir un número elevado de embriones transferibles y ser de fácil aplicación. Hasta ahora, para cumplimentar el primer requisito se ha insistido en encontrar una relación FSH-LH adecuada. Sin embargo, la respuesta superovulatoria se modificó únicamente cuando las relaciones fueron muy dispares. Posiblemente, la purificación de los extractos hipofisiarios sea más importante para evitar que lleven incorporados otras hormonas que para encontrar una relación definida. BECKERS y col., (1988) sostienen que los extractos poco purificados pueden ir acompañados por hormonas tales como la de crecimiento -STH- que podrían competir con las gonadotrofinas por los receptores ováricos. La simplificación de los tratamientos puede conseguirse empleando PMSG, si se logra mantener el nivel de resultados alcanzado en algunos trabajos en los que se utilizó con el anti suero correspondiente (DIELEMAN y col., 1987). Con el mismo objetivo y debido a las ventajas prácticas que ofrece, debe ser motivo de mayor investigación la combinación de gonadotrofinas con dispositivos o implantes con progesterona o progestágenos. Si los resultados preliminares obtenidos con la FSH-b se confirman, la producción de hormona por recombinación de ADN resolverá el problema de la variabilidad debida a los tratamientos. La inducción a la superovulación debe efectuarse en presencia de un cuerpo lúteo funcional y evitando la acción de los folículos dominantes no ovulatorios (GORDON y col., 1987). La mejor forma de determinar la presencia de un CL funcional es, de manera indirecta, a través del dosaje de progesterona. A tal fin, ha comenzado a utilizarse la medición en plasma empleando la técnica enzima inmunoensayo (ELISA) (ALI DINAR y col., 1987; ALLEN y FOOTE, 1987) o leche, mediante un procedimiento colorimétrico (HERRLER y col., 1988). Del mismo modo, la ecografía es considerada la técnica más idónea para el seguimiento de la dinámica folicular (SAVIO y col., 1988). Recomendaciones finales En base a experiencias personales recogidas y a los datos obtenidos de otros autores, se hacen algunas recomendaciones prácticas tendientes a disminuir la variabilidad en la respuesta superovulatoria: 1. 2. Elegir como donantes hembras fértiles. Inmediatamente antes de comenzar el tratamiento de superovulación, controlar la funcionalidad de los ovarios. En caso de no poder recurrir al dosaje de progesterona y a la ecografía, utilizar la palpación transrectal. Utilizar extractos hipofisiarios purificados. Adecuar la dosis de gonadotrofina a la relación FSH/LH del preparado hormonal, a la raza de la donante y a su edad. También deben tenerse en cuenta los antecedentes de tratamientos superovulatorios previos. www.reprobiotec.com 3. 4. Biotecnología de la Reproducción 50 Cabodevila & Torquati 5. En el caso de hembras superovuladas por primera vez: a) Tratar con una dosis media (32-36 mg Armour). b) Si no responde, efectuar otro tratamiento empleando la misma dosis y si nuevamente no responde, descartar esta hembra como donante. c) Si en el primer tratamiento se registra una respuesta baja, aumentar la dosis a 40 mg Armour. d) Si la respuesta al primer tratamiento es alta, con embriones de mala calidad, bajar la dosis a 2830 mg Armour. Dejar transcurrir un mínimo de 50 días post-parto hasta efectuar un trata-miento superovulatorio. Entre tratamientos, debe transcurrir un período mínimo de 60 días. 6. Bibliografía ABDUL SAEED, S., HUTCHINSON, J., BROADBENT, P. and DOLMAN, D. 1989. Hormonal profiles in superovulated Hereford x British Friesian heifers. Theriogenology 31: 253. ALBERIO, R., IOVANNITTI, B., PALMA, G. y CABODEVILA, J. 1989. Evaluación de la respuesta superovulatoria de dos extractos de hipófisis con diferente proporción de FSH/LH. Rev. Arg. Prod. 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Su recolección y transferencia con éxito dependen de varios factores. En primer lugar de la resistencia de éstos para sobrevivir y llegar a término después de ser recolectados del tracto genital, evaluados in vitro y transferidos a un genital receptor, con cambios de medio y temperatura. En segundo lugar depende de que la técnica de obtención no ponga en peligro la integridad del tracto genital, a fin de poder repetirla tantas veces como sea deseable y conveniente. La primera técnica de recolección de embriones bovinos usada hace aproximadamente dos décadas, fue quirúrgica. La misma requería anestesia general, inducida por medio de barbitúricos y mantenida por medio de inhalación (halotano). Por medio de una incisión de 15 cm de longitud en la línea media, por delante de la glándula mamaria, se extraían los cuernos uterinos con los ovarios. El lavaje de los cuernos y oviductos se llevaba a cabo el día 5-7 introduciendo catéteres de goma a través de la pared dorsal del cuerno uterino y en la ampolla del oviducto. Cada cuerno era lavado con volúmenes variables de 40-60 ml de una solución buffer (M 199). La manipulación quirúrgica del útero y de los ovarios conduce a lesiones que provocan formación de fibrina y adherencias. Para minimizar ese efecto fue necesario trabajar con buenas condiciones de asepsia, lavando el útero y los órganos adyacentes con solución fisiológica estéril, conteniendo heparina. Con estas precauciones era posible llevar a cabo el lavaje a una vaca sólo tres veces como máximo, lo que constituye una seria limitante en el uso repetido de esta técnica. La tasa de éxito varió entre 50 y 70% de embriones y ovocitos obtenidos, en función del número de cuerpos lúteos presentes. Otra variante de la recolección quirúrgica fue el by-pass propuesto por TESTART y GODARD-SIOUR (1975), colocando la sonda a través de la pared uterina por medio de vaginotomía (Fig. l) bajo anestesia epidural. Fig. 1: Método transvaginal GODARD SIUR, 1975) (TESTARD y Después de la colocación, el catéter de goma era fijado por medio de un balón inflable. El útero era lavado con 50-70 ml de medio. Esta técnica permitió obtener 40-50% de embriones. Las infecciones y adherencias en los cuernos uterinos y oviductos constituyeron las desventajas que limitaron, como en el caso anterior, la repetibilidad de la recolección e impidieron su difusión en la práctica. Ello provocó uno de los mayores cambios en la técnica de transferencia de embriones de la década del `70. Aunque las Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Recolección de los embriones 59 primeras experiencias con la recolección no quirúrgica de embriones se remontan a la década del cuarenta (ROWSON y DOWLING, 1949), recién a partir del trabajo de SUGIE y col. (1972) se obtuvieron resultados satisfactorios y repetibles (SEIDEL y col., 1977). Métodos no quirúrgicos de recolección La posibilidad de colocar en la especie bovina la sonda a través de la cérvix abrió nuevas posibilidades a la recolección de embriones, simplificando el procedimiento y disminuyendo el trauma uterino. Para ello se crearon diferentes modelos de catéteres: rígidos (SUGIE y col., 1972), semirígidos (RASBECH, 1976) y flexibles (DROST, 1976; NEWCOMB y col., 1978; HAHN, 1978). Los mismos podían tener 2 vías, una para insuflar el balón de goma e inmovilizar el catéter y la segunda para inyectar y recolectar el medio. RASBECH desarrolló en 1976 un sistema semirígido de recolección, a partir de una sonda Foley de 2 vías. El volumen de aire a insuflar oscilaba entre 12-15 ml. La inyección de medio se llevaba a cabo con una jeringa de 60 ml. La sonda Foley era introducida en un tubo rígido, quedando libre el extremo anterior, a partir del balón para el aire y el extremo posterior. Los resultados obtenidos por el autor (tabla 1) indican el éxito de la técnica propuesta, que constituyó el punto de partida de los catéteres flexibles de 2 vías, empleados actualmente. Las experiencias y recomendaciones de RASBECH siguen aún vigentes. Tabla 1: Resultados obtenidos con la recolección no quirúrgica de embriones con el catéter semirígido de RASBECH (1976) CL (n) izq. 7 2 9 6 der. 6 3 7 3-4 Ovocitos/embriones recolectados (n) izq. 7 2 7 5 der. 4 3 4 3 Medio de lavaje recolectado (%) izq. 86 100 100 100 der. 96 100 100 100 Vaca Nr. 1 2 3 4 Los catéteres de 3 vías permiten inyectar el medio por la segunda vía mientras la tercera conduce el líquido fuera del útero. En la actualidad se emplean catéteres rígidos y flexibles, de 2 y 3 vías, y 3 métodos de recolección (PALMA y col., 1991): Circuito cerrado con flujo continuo Circuito cerrado con flujo discontinuo Circuito abierto con flujo discontinuo Circuito cerrado con flujo continuo Con este método (ELSDEN, 1976; GREVE y col. 1977) se emplean catéteres de 3 vías, rígidos (CASSOU, 1984, Foto 1) o flexibles (BRAND y col., 1978). Una vía, destinada a la inyección del medio de lavaje, se conecta al frasco que contiene la solución por medio de una tubuladura de goma látex o silicona. La solución puede inyectarse por gravedad, colocando el frasco con el medio a aproximadamente 1 m por encima del frasco recolector o con una jeringa, con el mismo procedimiento que el método de flujo discontinuo (Fig. 2 y 3). Por la segunda vía se inyecta aire o medio para llenar el balón y por medio de una tercera vía se recolecta la solución de lavaje, sin interrumpir la descarga. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 60 Palma Fig. 2: Esquema del circuito cerrado con flujo continuo adaptado de ELSDEN (1976) Circuito cerrado con flujo dicontinuo Con este método se usa el catéter de 2 vías (Foto 3, Fig. 3a), una jeringa de 50-60 ml (Fig. 3b), una válvula automática o manual (Fig. 3c), una unión de vidrio o plástico en forma de T o Y (Fig. 3d) y las tubuladuras (Fig. 3 I y II). La válvula, que se coloca a la salida del frasco (Fig 3 c), permite extraer el medio e inyectarlo en el interior del cuerno uterino. Luego de la inyección de un volumen variable de medio (30-50 ml) se interrumpe el flujo de llenado para proceder a la segunda maniobra; el cuerno es vaciado por la misma vía. Al ocluir la tubuladura de inyección (Fig. 3) la unión de vidrio en Y desvía el medio a la segunda tubuladura (Fig. 3 II) que lo conduce al frasco recolector. Fig. 3: Esquema de circuito cerrado con flujo discontinuo (adaptado de BRAND y HOOGEKAMP, 1986) Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Recolección de los embriones 61 Circuito abierto con flujo discontinuo Inyección y recolección con una jeringa. Esta técnica se emplea con los catéteres flexibles de 2 vías (Fotos 3, 4, 5 y 7) y no requiere de tubuladuras (Fig. 4). El medio se inyecta y recolecta por la misma vía y con la misma jeringa (50 ml). Con ésta se descarga un volumen de medio fijado por el operador (Fotos 1 y 2) quien, como en el caso anterior, debe palpar el cuerno uterino determinando y controlando su llenado a fin de evitar lesiones de la pared uterina por exceso de medio. Las maniobras siguientes variarán de acuerdo al tipo de técnica de lavaje que se aplique. Algunos operadores fijan y masajean el útero durante la inyección del medio. Esta operación es particularmente importante cuando el animal no está fijado con una elevación del tren anterior, que facilite el retorno del líquido de lavaje. Las dimensiones y peso del útero requieren que éste sea elevado por el operador. Cuando la donante es fijada con una elevación anterior algunos operadores no manipulan los cuernos uterinos, sólo verifican una vez el llenado. Luego retiran el brazo del recto y continúan con la inyección de medio hasta completar el volumen preestablecido de líquido. La recolección de los embriones en esta posición facilita el lavaje en animales con pariciones múltiples, aun cuando se emplee además el masaje de útero. Esta forma es aplicada en los Centros de TE donde ya se cuenta con la infraestructura necesaria. Presenta la ventaja que la manipulación no irrita al animal y facilita la operación. Mientras se descarga la jeringa en el frasco recolector el catéter es ocluido con una pinza hemostática o un clamp. Fig. 4: Esquema del circuito abierto con flujo discontinuo. Inyección y recolección con una jeringa Foto 1: Recolección por medio del sistema del sistema abierto. El operador inyecta el medio de lavaje regulando el volumen de inyección y masajeando suavemente el cuerno uterino Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 62 Palma Foto 2: La recolección del medio inyectado se lleva a cabo aspirando el medio con ligera presión negativa y elevando simultáneamente el cuerno uterino por su pared ventral Ventajas y desventajas de tres métodos de recolección Todas las técnicas, con sus diferentes modificaciones, como así también los catéteres mencionados se emplean en la práctica con el mismo éxito. Por lo tanto, las diferencias entre ellos, como así también las ventajas y desventajas observadas, no constituyen elementos de juicio excluyentes de uno u otro. El operador será el que determine, en función de su experiencia, medios e infraestructura disponible, qué técnica es la más adecuada para su modus operandi. Independientemente de esos factores, su destreza es el factor más importante en la tarea de obtener los embriones. El sistema de circuito cerrado con flujo continuo (fig. 5) permite, en su concepción teórica, un lavaje más aséptico frente al método de inyección y extracción con jeringa, ya que el medio es conducido desde el útero hasta el filtro o el frasco de recolección sin solución de continuidad. Ello es particularmente importante cuando los lavajes se llevan a cabo en lugares abiertos. Sin embargo la tubuladura no es fácil de lavar y secar, lo que puede provocar en la práctica, contaminaciones bacterianas, como consecuencia de un lavado insuficiente o químicas, provocadas por un mal enjuagado o por la deposición de sustancias esterilizantes (dióxido de etileno) en los restos de humedad. Fig. 5: Circuito cerrado de 3 vías (Cassou, IMV, Francia) Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Recolección de los embriones 63 El sistema de circuito abierto con jeringa no emplea tubuladuras y las jeringas son descartables o de fácil lavado y esterilización, razón por la cual el riesgo de falta de limpieza e insuficiente secado es mínimo. Con este sistema se debe tener siempre la precaución de obturar el catéter a fin de no perder el líquido que pueda quedar en el útero mientras la jeringa con el medio recolectado es descargada en el frasco recolector. Esta maniobra es sencilla y rápida si la donante es un animal manso y/o está bien preparado (anestesia epidural, tranquilizante etc.). Sin embargo debe repetirse entre 14 y 20 veces por animal, de acuerdo al volumen de lavaje empleado. Ello, en una vaca indócil o intranquila puede conducir a complicaciones con pérdida de medio. Los programas de TE ambulantes constituyen una limitante adicional para este método, dado que la infraestructura disponible en condiciones extensivas es muy variable y en muchos casos inadecuada para la recolección de los embriones. El sistema de circuito cerrado con flujo continuo, como ya fue mencionado, facilita el lavaje por que la entrada y salida del medio se realiza en forma automática y continua, disminuyendo el tiempo de lavaje. El riesgo de pérdida de medio como consecuencia de movimientos bruscos de la donante es considerablemente menor. El sistema de circuito cerrado con catéteres rígidos (3 vías) es tan costoso que no se emplea uno por animal sino el mismo para varios lavajes sucesivos. Ello aumenta el riesgo de contaminación bacteriana siendo esa, posiblemente, la razón por la cual su uso no está extendido. Por otra parte el catéter es de acero y permanece en el cuerno uterino durante el lavaje. Su empleo es especialmente riesgoso en animales indóciles o intranquilos por peligro de lesiones de la pared uterina. La vía destinada al retorno del medio posee orificios de reducida dimensión. Para evitar que ésta pueda taparse con el mucus cervical se recomienda inyectar 10-20 ml de medio cuando el catéter atravesó la cérvix. Otra forma que además evita el pasaje del mucus cervical al útero es aspirando el mucus con una pipeta de inseminación por medio de una jeringa antes de introducir el catéter de recolección. La sonda puede también taparse con coágulos de sangre o restos de mucosa, como consecuencia de la laceración del endometrio, lo que impide el retorno del medio. En ese caso se deberá conectar una jeringa a la tubuladura de esa vía para destaparla mediante la inyección del líquido de lavaje. El circuito cerrado con flujo discontinuo tiene menos riesgos de taparse al disponer de una vía común de inyección y recolección. El catéter de doble vía que se emplea para ello dispone además de orificios considerablemente mayores. Si éstos se taparan con mucus o coágulos, la siguiente inyección de medio los liberará. Los catéteres, disponibles en el mercado, constituyen también un tema per se en cuanto a sus precios. El catéter de 3 vías de acero es el más costoso. Su precio pone en duda su empleo si el profesional destina un catéter por donante como lo dispone la Asociación Internacional de Transferencia de Embriones. Los catéteres flexibles de 2 vías, que se ofrecen específicamente para TE (Foto 3), son más accesibles que los primeros, pero constituyen una inversión de importancia de acuerdo a la cantidad que se disponga. El catéter armado a partir de una sonda Foley (Foto 4) reduce los costos sensiblemente sin disminuir el éxito de recolección con respecto a los anteriores. SUBRAMANIAN y DEVARAJAN (1991) presentaron un método "vagino-cornual" de recolección para las vaquillonas donantes cruza Bos indicus x Bos taurus. El mismo tiene como objeto mejorar la recolección de los embriones de donantes que por la edad o la raza (Bos indicus) permiten obtener tasas de éxito menores que vacas adultas y razas europeas. La colocación del catéter se lleva a cabo por medio de un by-pass a través de la pared antero-lateral de la vagina (fornix) a los cuernos uterinos (antes de la bifurcación), con una vaina rígida, que permite atravesar las paredes vaginal y uterina según el método de TERSTARD y GODARD-SIUR. La recolección se lleva a cabo con un catéter flexible. Los autores concluyen en la aplicabilidad de la técnica para el tipo de donantes descrito, acentuando la ausencia de un efecto negativo sobre la fertilidad de las mismas. Sin embargo recomiendan el entrenamiento en la práctica de la técnica antes de aplicarla en animales de valor. Queda por establecer la repetibilidad de la misma teniendo en cuenta las perforaciones de la pared uterina. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 64 Palma Foto 3: Catéter flexible de 2 vías, modelo Minitüb, Alemania Foto 4: Catéter flexible de 2 vías, armado a partir de una sonda Foley (LAMPETER, 1977) Foto 5: Punta metálica (según LAMPETER) de un catéter flexible. Antes del lavaje debe controlarse la integridad del balón Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Recolección de los embriones 65 Preparación de la donante, anestesia epidural La preparación del animal dependerá de varios factores, entre los que se encuentran la infraestructura disponible de acuerdo al tipo de establecimiento ganadero (producción intensiva o extensiva), la docilidad del animal como así también la destreza y experiencia del operador. Antes de la operación de lavaje es necesario vaciar el contenido rectal, precisar la posición y dimensiones del útero y la respuesta ovárica al tratamiento superovulatorio (No de cuerpos lúteos, presencia de folículos). El vaciado del recto y la toilette de la región peri anal son las primeras maniobras. Usualmente se continúa con la tranquilización y anestesia local de la donante (PETERS y BALL, 1986; MAPLETOFT, 1986). A fin de contar con una buena relajación del recto se puede aplicar anestesia epidural baja (HALL, 1974; LUMB y JONES, 1979), administrando 4-6 ml de Lidocaina (2%), en el espacio comprendido entre la primera y segunda vértebra coccígea. La cánula se coloca en una posición de 90o para atravesar la piel. Luego en un ángulo de 45o desde la piel hacia craneoventral. Cuando la aguja ingresa al canal medular circula aire en su interior, que provoca, en algunos casos, un ligero zumbido. Una prueba más segura es la aplicación de unas gotas de anestésico en la entrada de la aguja, que serán aspiradas al interior del canal vertebral, si ésta está bien colocada. Si la aguja llegase a topar una superficie ósea significa que llegó al piso de la 1o vértebra coccígea. En ese caso retirar la aguja aproximadamente 0,5 cm (WESTHUES y FRITSCH, 1960). La inyección debe aplicarse lentamente y sin resistencia alguna. El inicio del bloqueo sensitivo y motor se hace evidente por la flaccidez de la cola, por la falta de respuesta del esfínter anal y de la vulva al pellizco. A pesar que la relajación de la cola es inmediata, la acción anestésica sobre el recto y el esfínter del ano requiere 10 minutos aproximadamente. Por otra parte puede producirse un efecto anestésico incompleto, con una buena anestesia de la cola (flaccidez) pero insuficiente anestesia de los órganos de interés, causado por lo general por una incorrecta administración. En ese caso deberá suplementarse o repetirse la dosis. Es importante destacar que una insuficiente anestesia epidural puede ocasionar el fracaso del lavaje en animales indóciles. Al levantar la cola para inmovilizarla, después de la administración del anestésico, ocurre -en algunos casos- el ingreso de aire al recto. Ello constituye una seria complicación por que el mismo pierde sensibilidad y capacidad de expulsar el aire. Si este fuera el caso se recomienda hacer caminar al animal a fin de que la prensa abdominal ejerza presión sobre el recto y expulse el aire retenido. Otra alternativa es eliminar el aire por medio de aspiración con un tubo flexible (RUBIN, 1991), para lo cual se emplean una bomba aspirante de pequeño poder. Levantar y fijar la cola sólo después que el operador introdujo el brazo en el recto. La vulva y la región que la rodea deberán ser lavadas, desinfectadas (iodo povidona, alcohol 70%) y secadas. Cuando se trabaja con hembras indóciles es conveniente emplear una combinación tranquilizante y relajante de 100-200 mg de clorhidrato de ketamina y 0,5-1,5 ml de xilazina (0,1%) totales, según el peso del animal. También es posible la administración de sólo uno de ambos productos. Después de su aplicación es importante dejar a la vaca tranquila durante 10-20 minutos, a fin de que los ruidos y el contacto con el animal no perjudiquen el efecto de los medicamentos. Por esta razón el tranquilizante se aplica en general después de la rectalización y antes del resto de los preparativos (toilette perianal, anestesia epidural, materiales etc.) Previo a la introducción del catéter de lavaje se puede aspirar el mucus cervical con una pipeta de inseminación y una jeringa de 20 ml y aumentar la luz cervical con ayuda de un dilatador de acero inoxidable (foto 6). Este instrumento es, además, de utilidad para determinar el diámetro de la luz cervical a través del grado de dificultad para atravesar la cérvix. Los operadores, que adecuan diferentes modelos y/o tamaños de catéteres según el diámetro del cuello del útero, podrán determinar Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 66 Palma con ayuda del dilatador cual será el instrumento más adecuado para el lavaje. Si la cérvix presentó resistencia al pasaje, el dilatador se deja colocado en la luz cervical -no en el cuerpo del útero - durante 2-5 minutos. Mientras tanto se puede llevar a cabo la palpación diagnóstica del útero y los ovarios, a fin de determinar dimensión, forma, y respuesta superovulatoria (No de cuerpos lúteos y folículos), datos de importancia para el protocolo de cada donante. Algunos operadores no emplean el dilatador y otros lo hacen cuando el grado de oclusión cervical es tal que no permite la introducción del catéter de lavaje. La desventaja de esta forma de trabajo es la extracción del catéter de la vagina con el riesgo de arrastrar impurezas en el segundo intento. No es necesario esterilizar el dilatador ni el mandril, bastará con un buen lavado y posterior tratamiento con un desinfectante de superficie (alcohol etílico 70%, isopropílico 70%, etc.). Foto 6: Dilatador cervical Colocación del catéter y lavaje del útero Antes de colocar el instrumento, éste debe ser enjuagado con la misma solución destinada el lavaje (PBS + 1% SFB). Ello contribuirá a lubricar y eliminar las impurezas que pudieran haber quedado después de una esterilización con gas (óxido de etileno). El catéter es introducido en el vestíbulo de la vulva, separando sus labios. Los catéteres de goma o silicona, a diferencia de los de acero, requieren para ello un mandril. Para atravesar la cérvix el operador debe fijarlo por delante de la punta del catéter modificando su posición hacia arriba y abajo como así también en forma lateral sucesivamente, empujando suavemente el instrumento hacia craneal simultáneamente. Al llegar al último anillo se deberá presentar el cuerno uterino, ligeramente elevado, frente a la punta del catéter. En este momento es imprescindible tener especial precaución de controlar la fuerza que se ejerce sobre el catéter, a fin de no atravesar bruscamente la cérvix y perforar la pared uterina. Cuando el instrumento alcanzó el cuerno del útero, éste último se endereza levantándolo de su cara ventral mientras se avanza el catéter muy suavemente hasta el 1/3 medio del órgano. No deberá existir resistencia alguna, si así ocurriera se debe retroceder el instrumento, presentar el cuerno uterino (estirarlo suavemente) y avanzar nuevamente. El ligamento intercornual, la curvatura uterina y el extremo anterior del cuerno deben ser puntos de referencia permanente del grado de avance del catéter. Una vez alcanzada la posición próxima a la deseada (por ejemplo borde del ligamento intercornual) se libera el catéter del mandril, se desplaza este último unos centímetros hacia caudal y se deslizan ambos suavemente hacia craneal, unos 5 cm. Repetir la operación un par de veces hasta comprobar una óptima colocación del catéter en el cuerno uterino. De esta forma es posible colocar el catéter sin manipular excesivamente los cuernos. Después de esta maniobra se procede a inyectar con aire el balón del catéter. El volumen de inyección varía en función del diámetro de esa porción del útero y esto depende de la edad y tamaño del animal, como así también de las pariciones previas. En general el volumen varía entre 15 y 20 ml. El operador es el que determinará, por medio de la palpación, el volumen a inyectar. Se debe tener en cuenta que su exceso produce aplastamiento de la mucosa endometrial con hemorragias, y en casos más graves, desgarro de la pared uterina. Con el catéter ya fijado, el operador deberá comprobar la correcta posición del instrumento. Si fuera necesario se retirará el aire del balón de goma y se avanzará más hacia craneal. Suele ocurrir que el operador inexperto cree fijar el catéter en un cuerno y no recolecta medio con las sucesivas inyecciones de medio. Ello ocurre cuando el instrumento fue fijado en el cuerpo del útero y el líquido fluye a ambos cuernos o si el balón desgarró la pared uterina. En ambos casos se podrá comprobar por palpación la Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Recolección de los embriones 67 ubicación del balón de goma o de la punta del catéter (si ésta es de acero, modelo LAMPETER, 1977a y b). Si el balón se encuentra en el extremo anterior del cuerno uterino y éste no se ingurgita al inyectar la solución significa que el exceso de aire del balón desgarró la pared uterina o que ésta fue perforada con la punta del catéter. El medio es expulsado en dirección a la cavidad abdominal, en algunos casos sólo un reducido volumen sanguinolento es recuperado. La presencia de la herida no significa que se deba renunciar al lavaje del cuerno, particularmente si se trata de embriones de gran valor. Resolver este problema requiere, sin embargo, destreza y sobre todo mucha delicadeza para trabajar con el útero perforado y no agravar la lesión. Ello constituye una seria limitante sobre todo si se tiene en cuenta que esos problemas son producto de la inexperiencia. El operador deberá decidir de acuerdo a su criterio cual será la actitud a tomar. El catéter debe ser colocado delante de la lesión, si es que su ubicación lo permite. Ello requiere buena sincronización entre el operador y su asistente. Dado que la lesión sólo puede ser determinada por crepitación en el momento de la inyección del medio de lavaje, junto con la baja o nula recuperación del líquido ya mencionadas, no es posible fijar su posición después que el balón fue desinflado. En consecuencia el operador deberá estar preparado para avanzar con el catéter cuando el asistente vacíe el balón. El instrumento deberá ser colocado por lo menos 5 cm por delante de la lesión (de acuerdo al tipo de catéter), para evitar el aumento de la lesión de la pared del útero al inflar el balón. En los casos en que el catéter no pueda avanzar más (genital muy largo o posición anterior de la lesión provocada por el extremo anterior del catéter) se recomienda renunciar a ese cuerno para evitar complicaciones de gravedad. Si la rápida evaluación indica que el catéter está bien colocado se procede a inyectar el medio de lavaje. El volumen de líquido a inyectar varía de acuerdo a la dimensión del cuerno y en función con la proximidad del catéter a la unión útero-tubárica. En consecuencia, la cantidad de medio debe ser regulada cuidadosamente por el operador, a fin de inyectar la suficiente cantidad para producir en el interior del cuerno uterino, la presión de retorno sin que su exceso provoque dolor, que intranquiliza al animal, o lesiones. El volumen a inyectar varía entonces entre 30-50 ml. El volumen total empleado para cada cuerno uterino variará según el criterio del operador entre 500, 700 (MUNAR y col., 1989) y 1000 ml (KÖNIG y ROMMEL, 1987). Este puede ser recolectado en diferentes tipos de recipientes y filtrado durante o después de la recolección. La recuperación óptima no es inferior al 90% del volumen inyectado. Algunos autores sostienen que la mayor parte de los embriones y ovocitos se obtienen después de haber recuperado 200 ml. La temperatura del medio de lavaje debe ser de 37-39o C, los frascos a tal fin deben mantenerse en baño María (foto 10). Una vez terminado el lavaje se repite la misma operación en el otro cuerno uterino. De acuerdo al grado de flexibilidad del catéter es posible cambiarlo de cuerno uterino sin sacarlo del tracto genital. Para ello es conveniente retirar el catéter flexible hasta la cérvix e introducir lentamente el mandril. El modelo LAMPETER (1977, foto 4 y 7), con punta metálica (foto 5), se adecua muy bien a esta operación, por que cuando el mandril llega a la punta se produce un chasquido (LAMPETER, 1978). Catéteres muy flexibles (goma látex) son deformados por los anillos de la cérvix, lo que impide la colocación del mandril, razón por la cual es necesario sacarlos del tracto genital, al menos hasta el segundo anillo de la cérvix, para introducirles el mandril. Una exitosa maniobra de lavaje no garantiza siempre la recolección del número esperado de embriones/ovocitos en función de la cantidad de CL palpados. Las razones que motivan estas diferencias cuantitativas pueden ser variadas y no se conocen con exactitud. No siempre es posible explicarse este fenómeno a través de un mayor número de ovocitos no fertilizados, embriones retardados o degenerados que pueden quedar atrapados en el oviducto o ser reabsorbidos. La falta de experiencia puede ser una razón válida, como así también problemas de lavaje aún en grupos experimentados. La repetición del lavaje el mismo día (6-12 h después) o al día siguiente (LANDSVERK Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 68 Palma y col., 1991) ha dado, en algunos casos, buenos resultados para aumentar la tasa de recolección, razón por la cual debe tenerse en cuenta un segundo lavado. Foto 7: Catéter de 2 vías con punta metálica según Lampeter, Minitub®, Alemania Formas de obtención y búsqueda de los embriones Luego del lavaje por medio de las técnicas no quirúrgicas, la aislación de los embriones de los grandes volúmenes de medio se puede hacer por medio de sedimentación o filtración del medio recuperado. Para la sedimentación de los embriones se emplean recipientes con forma de embudo y un cierre hermético en su fondo, probetas o frascos de 0,5-1,0 l. Los recipientes deben estar a una temperatura constante de 37 C ó 20 C (baño María, foto 11, o temperatura ambiente) y protegidos de la luz solar directa. La sedimentación de los embriones requiere 20-30 minutos. Cumplido este tiempo se elimina el sobrenadante por medio de un tubo flexible (tipo sondas pediátricas nasogástricas) que, por capilaridad elimina lenta y progresivamente (de arriba hacia abajo) el volumen recolectado, a fin de evitar turbulencias que hagan ascender a los embriones. El tiempo necesario para eliminar el sobrenadante varía, en función de su volumen y del tamaño de la sonda, entre 15-25 minutos. La forma y velocidad de eliminación del medio de lavaje es por goteo rápido. Para acortar el tiempo que demandan las 2 operaciones mencionadas se emplean actualmente filtros estériles con malla de acero inoxidable o plástico de 60-90 m de diámetro de poro. Estos se pueden presentar en recipientes con forma de embudo (foto 8) donde se vuelca el medio recolectado del frasco (después del lavaje) o directamente del catéter (durante el lavaje). Por medio de este último procedimiento el filtro se va vaciando por su parte inferior a medida que se llena con el medio recolectado, ahorrando de esta forma el tiempo de sedimentación, dado que los embriones quedan contenidos en el recipiente filtrante. Otros dispositivos de filtración están unidos a un tubo de silicona, se colocan en el recipiente con el medio recuperado (probetas) y eliminan el sobrenadante por capilaridad (foto 9). Los embriones quedan, de esta forma, retenidos en la probeta por medio de su malla filtrante intercambiable. La firma que los comercializa recomienda sin embargo un tiempo de sedimentación de 20 minutos. Recientemente fue presentado un nuevo filtro (Genetro, México, foto 10) que presenta la particularidad de recolectar el medio de lavaje, la filtración y la búsqueda de los embriones sin pasos intermedios. Su base plana y transparente permite retirar los embriones bajo observación microscópica con el ahorro consecuente de tiempo. El volumen de solución conteniendo los embriones (40-50 ml) se vuelca en 4-5 vidrios de reloj o en 2-3 placas de Petri (de 130 mm de diámetro) con divisiones. Para garantizar una completa observación visual de la superficie total de la placa, la búsqueda deberá hacerse en forma de guarda griega, tanto en el sentido de las abscisas como de las ordenadas (orientándose de acuerdo a la disposición de los Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Recolección de los embriones 69 cuadrados, Fig. 6). Para ello existen en el mercado placas cuadriculadas como la de la figura. El cuadriculado puede trazarse, además, en las placas plásticas con un marcador fino indeleble o una aguja hipodérmica, en la parte externa del piso como también en la tapa, colocando ésta bajo la placa durante la búsqueda. Foto 8: Filtro plástico en forma de embudo, Em-com EE.UU. Los embriones encontrados deberán ser transportados a una placa de Petri más pequeña (3 mm) o a una placa de cuatro celdas Nunc, con medio enriquecido con suero. Esta operación deberá repetirse a fin de "lavar" los embriones antes de la transferencia o de la congelación, según lo establecido en el reglamento de la IETS. Foto 9: Filtro plástico con malla intercambiable (Minitüb, Alemania), combinado con una probeta Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 70 Palma Foto 10: Filtro Malinche I (Genetro, México) Fig. 6: Procedimiento de búsqueda de los embriones El pasaje de los embriones entre las placas se realiza con distintos tipos de tubos v capilares. Algunos microcapilares (50 µl, Unopette®) se emplean con jeringas de 1 ml (Foto 12), otros (5-20 µl) con micropipetas especiales (Transferpettor®, Foto 13) o simplemente tubos de vidrio estirados con el fuego de un mechero Bunsen. En todos los casos se deberá tomar la precaución de redondear, con la llama de un mechero, los bordes del tubo que toman contacto con el embrión, a fin de evitar lesiones de la zona pelúcida o de su masa celular. Una vez que los embriones fueron lavados se puede llevar a cabo la evaluación morfológica de los mismos. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Recolección de los embriones 71 Foto 11: Baño María transportable Foto 12: Capilar hecho con ayuda de un mechero Bunsen (1) y Unopette® (2) combinado con una jeringa de 1 ml Foto 13: Transferpettor® de 5 µl, Brand, Alemania Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 72 Palma Foto 14: La búsqueda y evaluación de los embriones no sólo requiere de microscopios con buenas ópticas sino también con una buena superficie de apoyo, a fin de evitar accidentes con las placas. Microscopio Zeiss con mesa diseñada por Palma y Hoffmann (1992) Material necesario para efectuar un lavado y seis transferencias Lavaje Dilatador cervical Catéter recolección de embriones Mandril Jeringa 60 ml 20 ml Clamps Botella para el medio de recolección Tubo de recolección del medio, con peso y adaptador Filtro Recipiente de vidrio 500 ml Lubricante PBS Suero fetal bovino Toallas de papel Agujas 18 descartables x 11/2 Baño de agua con temperatura controlada portátil Incubadora portátil Procaína al 2% Maleato de acepromacina Clorhidrato de xilaxina 1 2 2 2 2 2 3 2 2 3 1l 2l 6 1 1 10 ml 2 ml 1 ml Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Recolección de los embriones 73 Agua destilada Frasco estéril con tapón de goma, 20 m Prostaglandina F2 Alcohol Algodón Tijera Balde y fuentón de material plástico Etiquetas Marcadores Aislación de los embriones Lupa estereoscópica Pipetas para manipulación de embriones (Capilar, Unopette o Transferpettor®) Filtros 0,22 µm de poro, tamaño: 26 mm Cajas de Petri 130 mm diámetro, 35 mm " o vidrios de reloj Jeringas descartables: 1 ml 5 ml 10 ml Marcadores Etiquetas 20 ml 1 1 dosis 2 6 5 6 2 3 2 Transferencia Catéteres de transferencia Vaina protectora Minipajuelas (pajillas) 0,25 ml Guantes de tacto Procaína al 2% Tijera Lubricante Toallas de papel Desinfectante 6 Bibliografía BRAND, A. und HOOGEKAMP, P. 1982. 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Nomenclatura Después de su liberación, el ovocito es "atrapado" por las fimbrias del infundibulum y dirigido al interior del oviducto a través de la actividad ciliar. El ovocito bovino, fertilizado o no, es una célula de 150-190 m de diámetro (LINDNER y col. 1983), incluyendo a la zona o membrana pelúcida, una capa acelular glicoproteica (NODEN y NAHUNTA, 1985) de 12 a 15 m de espesor producida por el ovocito (DIETL, 1986). En la ampolla del oviducto la fecundación desencadena el comienzo del desarrollo previo a la nidación del embrión. Pocas horas después de la fusión nuclear el cigoto comienza a dividirse. La división nuclear es mitótica y las nuevas células se denominan blastómeros. El desarrollo del embrión hasta los 8 días ocurre dentro de la zona pelúcida. En los primeros 6 días de desarrollo no se manifiesta aumento de tamaño, sólo el incremento del número de blastómeros. La edad del embrión es establecida a partir del día del estro (d0). Al d1 le corresponde la ovulación. De esta forma entre 24 y 36 h después de la fertilización el cigoto de una célula se divide en 2 células ovales (d2, Fig. 1); 24 h más tarde (d3) el embrión cuenta ya con 4 células. La división de los blastómeros puede cumplirse en forma asincrónica, razón por la cual es posible observar en estadios tempranos un número impar de células. El intervalo entre la división más temprana y la más tardía es de alrededor de 4h (PEDERSEN, 1988). Hasta el estadio de 8 células (d4) el cigoto es transportado a través del oviducto. El día 5 -aproximadamente- se produce el ingreso al cuerno uterino en estadio de 16 células, momento a partir del cual es posible obtener el embrión en forma no quirúrgica y evaluarlo de acuerdo a su estadio y calidad. Dentro del 5o dia el cigoto continúa su desarrollo a 32 blastómeros y su forma es similar a la de una mora, razón por la cual se lo denomina mórula temprana (Foto 1), en la cual es posible distinguir individualmente a los blastómeros. Su masa celular ocupa casi todo el espacio perivitelino. Mórula compacta Mc, d 5-6, aprox. 32-64 blastómeros. Sus blastómeros están unidos y constituyen una masa compacta que ocupa sólo el 60-70% del espacio perivitelino (Foto 2). La compactación es considerada como uno de los signos de diferenciación embrionaria (PEDERSEN, 1988), aunque los blastómeros conserven su capacidad totipotente. Blastocisto temprano Bt, d7 100-200 células. Se caracteriza por el comienzo del transporte de fluido en las células trofoectodérmicas y por la formación de una cavidad (blastocele) en el interior del embrión, dando la apariencia de un anillo de sello (LEIBO, 1985). El Bt ocupa 70-80% del espacio perivitelino. Es posible diferenciar el trofoblasto de la masa celular interna (Foto 3). Blastocisto B, d 7-8, 100-200 células. Existe una marcada diferenciación entre las células del trofoblasto, que constituyen una pared -que se adosa a la zona pelúcida- y la masa celular interna (o disco embrionario) más oscura (Foto 4). Blastocisto expandido Be, d 7-8, más de 200 células. El diámetro aumenta considerablemente (1,2 a 1,5x), con el consecuente adelgazamiento de la zona pelúcida a 1/3 de su espesor original (Foto 5). La presión creciente del blastocisto en crecimiento provoca la ruptura de la zona pelúcida, a través de la cual comienza su protrusión (foto 5, 6, y 7). Los embriones recuperados en este estadio se pueden colapsar temporalmente, esto se caracteriza por una pérdida completa o parcial del blastocele. Blastocisto protruido Bp, d 8-9, 200-800 células. Los embriones han abandonado la zona pelúcida. Su forma puede ser esférica, con un blastocele bien definido ("burbuja") o colapsado. La identificación en este estadio puede ser dificultosa para el operador inexperto (Foto 8). Los Bp pueden ser igualmente Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Evaluación morfológica de los embriones 77 transferidos, sin embargo, los embriones desprovistos de la zona pelúcida son extremadamente frágiles y pegajosos, razón por la cual se acostumbra a transferir estadios de Mt a Be. En condiciones naturales, el ovocito liberado y fertilizado sigue el desarrollo mencionado anteriormente. Sin embargo, los ovocitos producidos por hembras superovuladas, en muchos casos, no son liberados simultáneamente sino en un período de varias horas (LINDNER, 1983, ver tabla 3), CALLENSEN y col. (1986) observaron que vacas superovuladas comenzaban a ovular 24h después del pico de LH prolongándose la ovulación aún 33h después del mismo. En consecuencia, los ovocitos liberados no son fertilizados en el mismo momento. También puede ocurrir que el desarrollo de los ovocitos, fertilizados al mismo tiempo, no sea sincrónico. La consecuencia práctica de estos fenómenos es que los embriones obtenidos de una vaca donante se encuentren en diferentes estadios de su desarrollo (mórulas y blastocistos). Estas diferencias pueden ser encontradas en una donante como también entre donantes, son dependientes del tipo de tratamiento hormonal y no son consideradas como anómalas siempre que la asincronía no exceda los valores preestablecidos (ver Tablas 1, 2 y 3). Las donantes difieren en su respuesta superovulatoria por factores que dependen de sus cualidades genéticas, edad, estado fisiológico y salud reproductiva. Todos estos factores se traducen en diferencias cuanti- y cualitativas. Las últimas son importantes de reconocer para determinar qué embriones están en condiciones de desarrollar y concluir en un ternero vivo, qué embriones están degenerados y cuáles presentan anormalidades que permiten tener solo reducidas expectativas de sobrevida (SHEA y col., 1976). Tabla 1: Cronograma normal del desarrollo de los embriones d6-9 después de un tratamiento superovulatorio con PMSG (eCG), KAUFFOLD y col. (1985) Estadios de desarrollo Tipo de desarrollo d6 Mt d7 Mc d8 B Bt Be Mc Bt Retardado (48 h) 8 blastómeros 16 blastómeros Mt d9 Bp Be B B Be Bt Normal Ligeramente retrasado (24 h) 16 blastómeros Mt Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 78 Palma Fig. 1: Desarrollo y tránsito embrionario en el tracto genital Evaluación morfológica Criterios La evaluación morfológica de un embrión considera los siguientes criterios sobre las estructuras y cualidades de un embrión de excelente calidad: Forma esferoide Simetría de los blastómeros Apariencia clara y neta de los blastómeros. Tonalidad oscura y uniforme Uniformidad de la membrana celular Proporcionalidad entre el embrión y el espacio perivitelino. Integridad de la zona pelúcida Ausencia de vacuolas en el embrión y bridas celulares en el espacio perivitelino Ausencia de detritus celulares adheridos a la zona pelúcida Compactación de los blastómeros entre si Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Evaluación morfológica de los embriones 79 Foto 1: Mórula temprana d 5 (Mt GII) Foto 2: Mórulas compactas d 6 (Mc GI-II) Foto 3: Blastocistos tempranos d 7 (Bt G I) Foto 4: Blastocistos d 7 (B GI) Foto 5: Blastocistos expandidos protruyendo d8 Foto 6: Blastocisto expandido protruyendo d 8 (Be (Be GI) GI) Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 80 Palma Foto 7: Blastocistos expandidos d 8-9 (Be GI-II) Foto 8: Blastocisto protruido y zona pelúcida 8-9 (Bp GI) Foto 9: Blastocistos protruido d 8-9 (Bp GI y III), 16x Foto 10: Blastocisto protruido (Bp GI) d 9-10 y embrión degenerado (GIV) Grados de calidad La determinación del grado de calidad del embrión permite caracterizar en términos (más o menos) cuantitativos las posibilidades de desarrollo y posterior nacimiento de un ternero a partir del embrión obtenido (tabla 4). Los diferentes grados de calidad son determinados por medio de la observación microscópica de la morfología con ayuda de una lupa estereoscópica (0,7-6,4x). Existen distintas escalas de calidad embrionaria, desarrolladas por distintos equipos de trabajo. Tanto la observación per se, como la diferenciación entre un grado y otro es subjetiva y depende, en gran parte, de la experiencia del operador. G I: Excelente, el desarrollo corresponde al día de la recolección. No existen defectos visibles. Los blastómeros son claramente visibles, de color y estructura uniformes, simétricos, de forma esferoide y la zona pelúcida está intacta (Fotos 2, 5-8 y 10) G II: Bueno, el embrión tiene muy pocos blastómeros desprendidos de la masa celular y/o posee una pequeña cantidad de detritus celulares. Su forma puede ser ligeramente irregular (Foto 2, 9). G III: Regular, el embrión posee varios defectos: detritus celulares, forma irregular, de color muy oscuro o muy claro y/o ligero agrietamiento de la zona pelúcida (Foto 11). G IV: Malo, el embrión posee muchos defectos: los correspondientes al G III más desarrollo retardado, seria ruptura de la zona pelúcida -el embrión puede encontrarse parcialmente fuera de ella-, forma muy asimétrica, tendencia a la desintegración como granulación o vacuolización de los Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Evaluación morfológica de los embriones 81 blastómeros. Incluye también a los estadios hasta 8 células y la clara degeneración. Esta categoría es considerada como no transferible (Foto 12). Ovocito sin fertilizar (Foto 13) KUZAN (1988) califica a los embriones en 6 categorías. Las primeras 3 coinciden con las del cuadro superior. La 4. caracteriza a los embriones de baja calidad que aún son considerados transferibles, la 5. a los degenerados y la 6. a los ovocitos sin fertilizar o a las zonas pelúcidas vacías. Un bajo número de blastómeros libres no afecta la capacidad de desarrollo del embrión, sin embargo más de 5 blastómeros separados de la masa celular o degenerados disminuyen su capacidad de sobrevivencia (KUZAN, 1988). Foto 11: M G III Foto 12: M G IV Foto 13: Ovocito sin fertilizar Foto 14: Existen, como en este caso embriones, sobre los cuales el criterio y experiencia determinarán si son transferibles. Las necesidades y disponibilidad de receptoras, sin embargo, sí se transferirán El éxito de la TE depende, entre otros factores, de una intensa experiencia en la evaluación y manipulación del embrión. Embriones clasificados como excelentes o buenos tienen una alta probabilidad de alcanzar la preñez (60-70%). Embriones calificados como dudosos pueden ser cultivados durante unas horas (2-4) -para evaluar su desarrollo- o transferidos, según el criterio del operador y los medios disponibles (No de embriones obtenidos, No de receptoras, etc.). No obstante la correcta evaluación de los embriones obtenidos, es importante tener en cuenta que existen casos en los cuales embriones calificados excelentes luego de una perfecta transferencia no concluyen en una Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 82 Palma preñez mientras que embriones de muy baja calidad y transferidos con dificultad, concluyeron en preñeces y nacimientos normales (ELSDEN y SEIDEL, 1990). Tabla 2: Cronograma de desarrollo embrionario (%) en varios momentos después del celo con PMSG (n = 3301 embriones, KAUFFOLD y col., 1985) Estadio 6 2-8 células 16 células Mt Mc 29,9 11,0 42,6 15,8 7 9,8 2,0 8,5 32,9 Dias después del celo 8 8,0 0,7 6,2 9,5 ligeramente subnormal retardado Desarrollo Bt B Be Bp 0,3 26,4 19,1 16,6 45,4 0,8 12,4 normal 0,4 0,9 0,4 Tabla 3: Estadios de desarrollo de embriones recolectados en distintos momentos después del estro (LINDNER y col., 1983). Estadio de desarrollo embrionario (% del total de embriones recuperados) n= 1043 embriones 16 células 10 5 M 55 20 3 Mc 35 67 37 14 Bt 8 30 21 7 B 23 24 22 Be 6 36 4 Bp 1 5 28 total embriones 20 79 274 499 171 Días después del estro 5 6 7 8 9 Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Evaluación morfológica de los embriones 83 Tabla 4: Tasas de preñez (n) obtenidas en 5 estudios diferentes con embriones clasificados morfológicamente en distintas categorías. Revisión de BETTERIDGE y col. (1989) ELSDEN & col., 1978 63 (173/275) 58 (88/152) 31 (13/42) 12 (5/42) SHEA, 1981 71 (5/7) 56 (576/672) 44 (57/130) LINDNER & WRIGTH, 1983 45 (130/292) 44 (128/292) 27 (40/149) 20 (10/50) HASLER & col., 1987 73 (4073/5521) 60 (181/304) 41 (31/76) HASLER & col., 1987 83 (451/542) 75 (307/408) 63 (135/214) 46 (6/13) Calidad* A B C D * Las clasificaciones varían entre autores. A es excelente y D malo La evaluación morfológica de los embriones es uno de los pasos más importantes para el éxito de un programa de transferencia de embriones. Determinar la transferencia de un embrión exclusivamente a través de sus cualidades morfológicas es, sin embargo, una equivocación. Otros factores como el valor del embrión en particular y también la disponibilidad de receptoras son importantes en la decisión. Es conveniente además acentuar que una estricta selección de los embriones por medio de su evaluación morfológica aumenta la tasa de gestaciones por transferencia pero, al mismo tiempo, disminuye la tasa de preñez por cada donante (BETTERIDGE y col., 1989). Bibliografía BETTERIGE, K.J., KING, W.A., RIEGER, D. 1989. Bovine embryo development from conception to collection. En: Proceedings of the 8th annual Convention. American embryo transfer Asociation. 83-97. CALLENSEN, H., GREVE, T. and HYTTEL, P. 1986. Preovulatory endocrinology and oocite maduration in superovulated cattle. Theriogenology 25: 71-76. DIETL, J. 1986. Struktur und Funktion der Zona Pellucida. En: Ferdinand Enke Verlag (ed.), Stuttgart, 1-184. ELSDEN, R.P. and SEIDEL, G.E., Jr. 1990. En: Evaluation of embryos. Procedures for recovery, bisection, freezing and transfer of bovine embryos. Animal Reproduction and Biotechnology Laboratory. Colorado State University, 13-16 GREVE, T. and LEHN-JENSEN, H. 1979. Current Status of embryotransplantation in Denmark. Theriogenology 11: 99. KAUFFOLD, P., THAMM, I., ALM, H., EHRING, F., FALGE, R. und ROMMEL, P. 1985. Die Zustandsbeurteilung von Rinderembryonen. Forschungszentrum für Tierproduktion Dummerstorf-Rostock der Akademie der Landwirtschafts-wissenschaften der DDR. 3-47. KUSTERS, G. 1983. Tiefgefrierversuche mit Rinderembryonen unter besonderer Berücksichtigung der Anwendungsmethoden. Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss. 1-66. KUZAN, F.B. 1988. Classification of embryos prior to freezing. En: Elsden, R.P. and Seidel, G.E., Jr. Procedures for recovery, bisection, freezing and Transfer of bovine embryos. Animal Reproduction and Biotechnology Laboratory. Bulletin No 2. 34-45. LEIBO, S. 1985. The embryology of embryotransfer. En: Embryo transfer in cattle. Lloyd Donaldson (Ed.). 32-53 Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 84 Palma LINDNER, G.M., WRIGHT, R.W. 1983. Bovine embryo morphology and evaluation. Theriogenology 20 (4): 407416. MAPPLETOFT, J.R. 1986. Bovine embryo transfer. En: Morrow, D.A.: Current therapy in Theriogenology 2. W.B. Saunders Company (Ed.). MOST, C. 1981. Embryotransferversuche beim Rind unter Umgehung der Zervix (Parazervikale Embryotransfer). Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss. 1-7. NODEN, D.M. and LAHUNTA, A. 1985. Early stages of development in bird and mammals. En: STAMATHIS (ed). The embryology of domestic animals, Williams & Wilkins, 23-46. PEDERSEN, R.A. 1988. Early mammalian embryogenesis. En: KNOBIL, E. and NEIL y col. (Eds). The physiology of reproduction. Raven Press. Ltd., New York. 187-230. POKORNY, R. 1981. Versuche zur Tiefgefrierkonservierung von Rinderembryonen mit Hilfe der Tiefgefrieranlage Modell Neustadt/Aisch. Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss. 1-89. SHEA, B.F., HINES, D.J., LIGHTFOOT, D.E., OLLIS, G.W. and OLSON, S.M. 1976. The transfer of bovine embryos. En: ROWSON, L.E.A. (Ed.). EEC Publication EUR 5491, Luxemburg, 1976, 145-152. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Transferencia de los embriones 85 TRANSFERENCIA DE LOS EMBRIONES G.A. Palma Introducción El desarrollo de la transferencia de embriones fue paralelo al de la recolección. Cuando los embriones fueron recolectados 5-7 días después del estro por medio de cirugía y bajo anestesia general, las receptoras fueron preparadas para la transferencia bajo las mismas condiciones que las donantes. En un esfuerzo por eliminar los problemas asociados con la anestesia general, sin alterar la eficacia de la recolección quirúrgica, algunos grupos cambiaron hacia el uso de la anestesia local. Esta variante fue aplicada inmediatamente a las receptoras. Su empleo exitoso permitió que se siga utilizando en la práctica. Los resultados obtenidos empleando la transferencia no quirúrgica se aproximan a los obtenidos con el método quirúrgico, razón por la cual esta última técnica tiene actualmente pocos usuarios. Transferencia quirúrgica La primera transferencia quirúrgica con éxito en bovinos fue lograda por WILLET y col. en 1951. Los autores practicaron la cirugía bajo anestesia general, con el animal en posición decúbito dorsal y por la línea media. El cuerno uterino ipsilateral al ovario con cuerpo lúteo era presentado para ser punzado. Una pipeta -conteniendo el embrión- era introducida a través del punto de punción y el embrión era expulsado en la luz uterina en un volumen mínimo de medio (0,2 ml). AVERY y col. (1962) simplificaron la técnica quirúrgica transfiriendo los embriones a la receptora en pie y por el flanco. A fin de determinar a priori qué cuerno era el ipsilateral a la ovulación, se procedió a palpar previamente a las receptoras. La elección del flanco a incidir lo determina el ovario ovulado. Esta laparotomía lateral es adoptada en la actualidad para una parte de las transferencias de embriones. La anestesia local puede ser complementada con una paravertebral (60 ml de Procaina 2% en plano). La transferencia es practicada a través del borde dorsal en el tercio anterior del cuerno. Los problemas de esta técnica lo constituyen: la dificultad de exteriorizar el cuerno uterino sin causar traumas en el tracto genital, especialmente en vaquillonas, vacas muy grandes y gordas (ELSDEN y SEIDEL, 1990) El embrión puede ser transferido con una pipeta Pasteur o pajuela plástica (0,25 -0,50 ml). La sutura se hace según los métodos de rutina. La preñez con esta técnica varía entre 70-80%, con embriones frescos (BAKER y col., 1984; TAKEDA y col. 1986) y aproximadamente 10% menos con embriones congelados. Una variante quirúrgica posible es la extracción del cuerno por el fondo de la vagina. Se practica una incisión con un bisturí oculto en la pared dorsal del fondo de la vagina entre su pared dorsal y la cérvix. Esta zona tiene escasa irrigación. Se debe empujar la cérvix hacia abajo antes de punzar para evitar lesionar el recto. A través de la incisión se extrae el cuerno uterino llevándose a cabo la deposición del embrión. Transferencia no quirúrgica Es la técnica de elección en la actualidad. La primera transferencia no quirúrgica con éxito en bovinos fue lograda por MUTTER y col. en 1964, atravesando la cérvix con una pipeta de inseminación. El éxito fue precedido, sin embargo, de muchos fracasos como consecuencia, aparentemente, de infecciones y contracciones uterinas provocadas en el intento. Los envases para los embriones y los instrumentos Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com 86 Palma empleados en la transferencia son de diverso material y tamaño. En la actualidad los catéteres de transferencia están adaptados a las pajuelas de 0,25 ml (Foto 1), que sirven como envases para los embriones. Los catéteres son metálicos o de material plástico. El catéter metálico es de acero inoxidable (Foto 2), su punta atraumática posee un orificio lateral, por donde es expulsado el embrión. El tubo del catéter está dividido en dos partes unidas a rosca, a fin de introducir la pajuela en su interior. La rigidez de este catéter permite introducirlo más fácilmente a través de la cérvix de vaquillonas que los de plástico. Estos últimos son más finos que los metálicos, debido a su flexibilidad de elección para vacas multíparas, se presentan estériles y son descartables. Foto 1: Pajuelas de 0,25 ml empleadas para la transferencia Foto 2: Cateter de transferencia metálico MT con punta metálica destornillable, Minitüb, Alemania Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com Transferencia de los embriones 87 Foto 3: Cateter metálico con puntas metálicas, plásticas, estériles y descartables. Minitüb, Alemania Al comienzo de la década del '80 se estableció como el lugar óptimo para la transferencia quirúrgica del embrión el tercio anterior del cuerno uterino (NEWCOMB y ROWSON, 1980), basado en que los embriones d7-8 se localizan en el útero a 5-6 cm de la unión útero-tubárica (STRAßBERGER, 1982). Esto no es posible en la transferencia no quirúrgica con un catéter rígido, como consecuencia de la curvatura uterina (NEWCOMB, 1982). Trabajos posteriores no encontraron diferencias en el éxito de la transferencia comparando el tercio anterior con el medio y estimaron que el intento de transferir los embriones por delante del tercio medio con un catéter rígido podía conducir a traumatismos de la mucosa uterina con muerte embrionaria (SREENAN y DISKIN, 1987). El lugar de elección para obtener resultados aceptables es por delante del ligamento intercornual (MITCHELL WEST y DONALDSON, 1984). El procedimiento de la transferencia no quirúrgica tiene la desventaja frente al quirúrgico de requerir destreza, experiencia y particularmente mucho cuidado en la manipulación del catéter en el cuerno y el cuerpo del útero. El trauma provocado, especialmente en el endometrio, puede provocar la liberación de prostaglandinas. Estas pueden causar respuesta inflamatoria, disminución de los niveles de progesterona y aumento de la contractilidad uterina, que interfieren con la vida media del cuerpo lúteo y en consecuencia con la sobrevida del embrión. Con el aumento del tiempo de manipulación también se incrementa el efecto traumático de la transferencia, cuando la maniobra de transferencia dura más de 3 minutos (GORDON, 1976) o si es llevada a cabo con torpeza se provoca irritación del endometrio, que puede conducir a una disminución del éxito de la transferencia (BOLAND, 1976). TERVIT y col. (1980) observaron que la preñez tendió a ser afectada linealmente por el tiempo necesario para la transferencia entre 0.7 a 6.3 minutos con un promedio de 1.8 minutos. La diferencia fue significativa (p< 0,10). Aunque algunos autores sostienen que la cérvix no es susceptible a los efectos traumáticos (CHUPIN, 1988), es conveniente, sin embargo, no subestimar su insensibilidad con una brusca manipulación. Las lesiones pueden provocar la interrupción de la fase luteal con el acortamiento consiguiente del ciclo a menos de 16 días como consecuencia de la liberación de PGf2alfa (TERVIT, 1980). Un trauma mecánico puede provocar, además, ingreso bacteriano en la luz uterina, causando endometritis subclínica -favorecida por el nivel de progesterona de la fase diestral-, que interfiere también con la vida del embrión. La receptora retorna al celo entre 24-39 días después de la transferencia. Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com 88 Palma Para evitar el efecto traumático de la manipulación sobre el endometrio se pusieron a prueba drogas para inducir la relajación de la musculatura lisa del útero (relajantes uterinos) y/o anestésicos locales (anestesia epidural, capítulo V). Los relajantes uterinos se emplearon por primera vez en la estación de inseminación artificial y transferencia de embriones de Neustadt a.d. Aisch, Alemania (HAHN y col. 1975) y son empleados en la actualidad por algunos grupos de trabajo (HAHN, 1990). Los resultados obtenidos por otros grupos de trabajo no apoyan los obtenidos por HAHN y col. (1975) y HAHN (1990). Por el contrario otros autores encontraron que el empleo de Clenbuterol (Planipart®, Bohringer) no incrementó la tasa de preñez de las receptoras (tabla 1). WENKOFF (1986) observó, en un ensayo realizado con 4796 receptoras, una disminución del 10% de preñez cuando aplicó una dosis de 10 ml i.m. de Clenbuterol 60-90 minutos antes de la transferencia. Esa diferencia no fue significativa pero sí fue considerada como una tendencia importante (WENKOFF, 1986). Las posibles causas de la menor tasa de gestación fueron asociadas a la dilatación de la vagina y recto como consecuencia del ingreso de aire y la distención de la vejiga con orina, que dificultaron los procedimientos de la transferencia. Ello estaría apoyado por el efecto positivo del tratamiento, aplicado 30-180 minutos previo a la transferencia quirúrgica (MAPLETOFT y col. 1986). En la actualidad se aplica el relajante uterino aproximadamente 5 minutos antes de la transferencia (LEIDING, 1991), a fin de evitar dichos efectos negativos. Sin embargo ese tiempo es reducido para que la droga tenga efecto. El componente psicológico de éxito o fracaso establece una presión considerable sobre el operador principiante y en consecuencia puede actuar negativamente sobre las posibilidades de éxito. Una medida preventiva es realizar las transferencias sólo si existen buenas condiciones para ello. Particularmente tranquilidad de los animales (uso de tranquilizantes si fuera necesario) y una buena anestesia epidural. Estas medidas son más importantes si se trabaja con animales nerviosos y/o indóciles. Foto 4: Quicklock® ET de acero inoxidable, soporte de las vainas descartables estériles Transfit®. Minutüb, Alemania Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com Transferencia de los embriones 89 Tabla 1: Efecto del Clenbuterol sobre la preñez (%) de receptoras con diferentes dosis y tiempos de efecto en minutos (min) en 5 estudios diferentes P r e ñ e z* clenbuterol control 166/262 87/149 (63) (58) 13/28 12/22 (46) (55) 104/189 99/185 (53) (53) 108/213 150/307 (49) (51) 13/34 15/38 (38) (39) dosis 5 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml *( ) = % min 20 30 5 30 a 180 5 Autor COULTHARD (1982) SREENAN (1983) BARNES y FIRST (1985) MAPLETOF y col. (1986) GREGORY y RODRIGUES (1986) Procedimiento El embrión se carga en la pajuela de 0,25 ml. La pajuela es cargada en primer lugar con medio de cultivo (aprox. 3,5 cm de su longitud), se deja un espacio con aire (1,0 cm) y luego se carga el embrión contenido en el medio. Posteriormente la segunda columna de aire y la última nuevamente con medio. La columna con medio de cultivo (PBSS), ubicada en el extremo abierto de la pajuela, limpia a ésta en el momento de la descarga. La presencia de las columnas con aire impiden el desplazamiento de la columna central que contiene el embrión. La última garantiza la descarga del embrión por efecto de arrastre (Fig. 2). La pajuela es colocada en el catéter de transferencia estéril o conservada en un termo seco con temperatura constante a 20o-37oC. El catéter de transferencia será cubierto por una envoltura plástica (camisa sanitaria), vaina plástica rígida o por su envoltura original. Las dos primeras son adecuadas para la transferencia. La camisa sanitaria (IMV, Francia) permite, dada su finura y elasticidad (foto 5), introducir el catéter en el interior de la cérvix. La vaina plástica rígida (Minitüb, Alemania, foto 6) se puede introducir sólo hasta la porción cervical de la vagina. Ello representa una ventaja para la camisa sanitaria que permite mantener el catéter libre del contacto con las secreciones y exudados vaginales, como es el caso de las receptores tratadas con el espiral PRID®. Hasta la transferencia el catéter puede ser conservado a temperatura ambiente (20ºC). El traslado al lugar de transferencia debe hacerse evitando cambios de temperatura y en posición horizontal. Foto 6: Vaina protectora plástica estéril, Minitüb, Alemania Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com 90 Palma Aire Medio Aire Medio Embrión en medio Figura 2: Cargado de la pajuela Antes de la transferencia deberá ser evaluada la presencia de un cuerpo lúteo. Parece razonable considerar la calidad del CL, a partir de su tamaño y consistencia, como un factor asociado al éxito en la selección de receptoras (DONALSON, 1985; HASLER y col., 1987), cuadro 1. Cuadro 1: Criterios de clasificación de un CL normal de 7 días - Su tamaño equivale a 1/3 a 1/2 del volumen ovárico - Su masa es elástica - Su fijación no es fuerte, son fácilmente enucleables - Si el cuerpo lúteo se encuentra en el interior del ovario: comparar el tamaño del ovario con el contralateral. La diferencia deberá corresponder a la relación mencionada Los criterios de evaluación de la calidad de los cuerpos lúteos son variables, sin embargo los esfuerzos por aumentar de esta manera el éxito de la transferencia no arrojaron los resultados esperados. No fue posible establecer una relación entre la calidad del cuerpo lúteo y la preñez de una recepetora (DONALSON, 1985; HASLER y col., 1987, tabla 2; LIEBRICH, 1991; tabla 3). Foto 4: Camisa sanitaria IMV, Francia Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com Transferencia de los embriones 91 Tabla 2: Efecto de la calidad del CL sobre la tasa de preñez después de la transferencia de embriones (HASLER y col., 1987). Transferencias n 1193 348 58 Preñez n 911 251 46 % 76 72 79 Calidad del CL 1 2 3 Una explicación para ello es que la apariencia del CL a la palpación no indica su capacidad de producir progesterona ni predice su comportamiento futuro. Tabla 3: Relación entre la calidad del cuerpo lúteo y la preñez de las receptoras después de la transferencia de embriones producidos in vitro (LIEBRICH, 1991) Calidad del CL Animales n Muy buena Buena Regular y mala ∑ 155 78 98 331 Preñez (d 35 % 76 40 51 167 n 49 51 52 50 La relación entre los niveles sanguíneos de progesterona y la tasa de sobrevida embrionaria tampoco pudo ser definida con éxito (SREENAN y DISKIN, 1987) por que no pudieron observarse diferencias entre la concentración sérica de progesterona previa a la transferencia de las receptoras que posteriormente permanecían preñadas de las que no lo hacían (HAHN y col., 1977; HASLER y col., 1980; ELLINGTON y col, 1992). LIEBRICH (1991) no pudo establecer relaciones válidas entre la calidad del cuerpo lúteo y los niveles de progesterona (tabla 4). Tabla 4: Relación entre la calidad del cuerpo lúteo y los niveles de progesterona de las receptoras 2 días antes de la transferencia (LIEBRICH, 1991) Receptoras n 150 75 88 Nivel de progesterona ng/ml 1,37 1,30 1,15 1,02 0,85 0,90 Calidad del CL Muy buena Buena Regular a mala n.s Los intentos por establecer una terapia suplementaria de progesterona, como así también incrementar el efecto luteotrófico con HCG (CHRISTIE y col., 1979) como medidas profiláticas no lograron mejorar la probabilidad de gestación. Estudios realizados con HCG indicaron la formación de cuerpos lúteos Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com 92 Palma accesorios, que sin embargo no tuvieron un efecto diferente sobre la tasa de preñez ni sobrevida del embrión (CHRISTIE y col., 1980; DE LOS SANTOS-VALADEZ y col., 1982; GREVE y col., 1982; LOONEY y col., 1984; HEYMAN, 1985). No obstante las reiteradas referencias VESELINOVIC (1990) logró aumentar hasta un 14% la tasa de preñez administrando 1500 UI de HCG después de la transferencia, lo que indica la contradicción de las experiencias realizadas. ELLINGTON y col. (1992) evaluaron el efecto de la Buserelina, un análogo sintético de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH). Los autores no encontraron un efecto luteotrófico de la hormona que mejorara la tasa de preñez del grupo tratado frente al control (tabla 5). De forma similar que con el CL no se conoce aún con exactitud un nivel circulante de progesterona próximo o en el momento de la transferencia (d6-8) que caracterice a una buena receptora (SREENAN y DISKIN, 1987). Tabla 5: Tasa de preñez asociada con la aplicación de Buserelina (Receptal®, Hoechst) en distintos momentos de la transferencia (ELLINGTON y col., 1992) Buserelina Control Receptoras (n) n.s Introducción del catéter de transferencia Una vez realizada la palpación genital y el vaciado del recto un asistente deberá lavar y secar la vulva y la zona perineal. Para los animales indóciles se recomienda la administración de anestesia epidural (Lidocaina 2%, 4-7 ml) para impedir las contracciones rectales y poder manipular el útero eficazmente. Para introducir el catéter en la vagina se deben separar los labios de la vulva a fin de colocar éste directamente en el vestíbulo. A veces es necesario empujar el instrumento en dirección cráneo-dorsal. Si los pliegues de la mucosa vaginal impiden el avance del catéter es posible evitarlos estirando la cérvix hacia craneal. Cuando la punta del catéter está frente a la cérvix (ésto es verificable palpándola con el dedo meñique) es importante que el asistente tome los bordes de la camisa sanitaria y tire ésta hacia atrás para liberar el catéter. Si se emplea la vaina protectora plástica (Minitüb®), el procedimiento es similar, sólo que puede realizarlo el mismo operador. El catéter es introducido en la cérvix, su penetración debe hacerse manipulando el órgano siempre por delante del instrumento. Los movimientos son similares a los de la inseminación artificial, de dorsal a ventral y viceversa y a ambos lados mientras se empuja, simultáneamente, el catéter. La presión debe ser suave y sobre todo controlable. Un exceso puede provocar que, al presentar correctamente el último anillo cervical, el catéter penetre con tanto impulso que perfore el cuerpo del útero. Antes de atravesar el último anillo es importante que el operador incline su atención al útero, estableciendo nuevamente su posición, tamaño y grado de curvatura para determinar con mayor precisión la longitud a recorrer y su grado de complejidad (curvatura). Con los cuernos en la posición adecuada, el operador podrá atravesar el último anillo cervical e ingresar al cuerno uterino ipsilateral a la ovulación. Para ello se deberá tomar suavemente el cuerno y presentarlo frente a la punta del instrumento, algo más levantado que la cérvix. Si la mano que fija la cérvix es la opuesta al cuerno a transferir, el órgano contralateral puede ser usado para facilitar la penetración. Sosteniendo a éste en su segmento medio-ventral se fija el cuerno uterino, estirándolo y empujando ligeramente el catéter hacia craneal. La operación debe repetirse introduciendo el catéter en 68% (175/258) a la transferencia 72% (183/154) 4-7 días después de la transferencia 66% (167/252) Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com Transferencia de los embriones 93 el cuerno lo necesario para superar la línea transversal que establece el ligamento ancho y tan profundamente como sea posible sin resistencia alguna. Si la mano es la del mismo lado que la del cuerno ipsilateral, la fijación se puede realizar también en el ligamento lateral, operando de igual forma que en el caso anterior. Es importante tener en cuenta que la manipulación del cuerno uterino deberá hacerse con cuidado Resultados de la transferencia Existen tantas formas de interpretar los resultados de un Programa de transferencia de embriones como factores que lo afectan. En ese sentido es interesante recordar lo afirmado por ELSDEN y SEIDEL (1990): "El éxito es una manifestación estadística, ésta permite resumir los resultados de un grupo de donantes pero no puede ser extrapolada a una sola vaca. El siguiente ejemplo representa una situación típica de 12 donantes que fueron superovuladas. El lavaje uterino fue llevado a cabo en 10 donantes porque una no tuvo respuesta en un ovario y la segunda no presentó celo. Después de la recolección se obtuvieron embriones de buena calidad de sólo 8 vacas y a la palpación rectal de las recipientes sólo 7 donantes produjeron embriones que terminaron en una preñez. De 30 gestaciones los resultados de la transferencia de embriones pueden ser representados de la siguiente manera: 1) 2,50 preñeces/donante, considerando las 12 donantes; 2) 3,00 preñeces/donante, considerando los 10 lavajes realizados; 3) 3,75 preñeces/donante, considerando las 8 donantes de buenos embriones y finalmente 4) 4,29 preñeces/ donante, considerando las 7 vacas que condujeron a una preñez". Ello conduciría a pensar que los altos resultados presentados por algunas empresas comerciales no necesariamente son mejores que los bajos resultados obtenidos en general por centros de investigación sin fines de lucro. Tasa de preñez Actualmente la tasa de preñez con esta técnica varía entre 60-70% con embriones frescos y de buena calidad (SCHNEIDER y col., 1980; McEVOY y SREENAN, 1990), 50-60% con embriones producidos in vitro (LIEBRICH, 1991) y obtenidos in vivo congelados/descongelados. La diferencia de preñez del 1020%, entre esta técnica y la quirúrgica, podría ser explicada por las infecciones provocadas al introducir el catéter de transferencia, vía vagina, en el útero, particularmente susceptible de infecciones entre el día 6-8 del ciclo (WRIGHT, 1981). El grado de sincronización que se establece entre la donante y las receptoras se sumó a la lista de factores que condicionan el éxito de una transferencia. Cuando el intervalo entre la ovulación y el lavaje de la donante es igual al comprendido entre la ovulación y la transferencia de la receptora, se habla de una transferencia sincrónica. Este se mide en términos positivos (+) o negativos (-). Si, por ejemplo, el intervalo ovulación-transferencia en la receptora es un día mayor que el intervalo ovulación-lavaje de la donante, se habla de un asincronismo de +24 h. Por el contrario -24 h significa que el intervalo de la receptora es un día más corto que el de la donante. Para la transferencia de embriones LINDNER y WRIGHT (1983) toleraron hasta 48 h de asincronismo, actualmente el grado de asincronismo no debe superar las 24 h. Sincronicidad donante/receptora y embrión/receptora La sincronicidad entre el momento del ciclo de la receptora y el estadio en que se encuentra el embrión parece constituir un índice más válido de las posibilidades de éxito de la transferencia (LINDNER y WRIGHT, 1983, Tablas 6 y 7), razón por la cual deberá ser tenido en cuenta al hacer la transferencia. Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com 94 Palma Tabla 6: Código de desarrollo embrionario según LINDNER y WRIGTH (1983) Estadio Mt Mc Bt B Be Bp Código de desarrollo (estimado en días) 5 6 7 7 8 9 Tabla 7: Efecto de la sincronicidad del ciclo de la donante con la receptora y de la receptora con el estadio de desarrollo embrionario sobre la tasa de preñeza (LINDNER y WRIGTH, 1983) Sincronicidad donante/receptora preñeces n n % 27 87 158 l75 137 11 41 64 86 56 (41) (47) (41) (49) (41) Sincronicidad receptora/embrión preñeces n n % 76 148 204 98 58 20 73 107 45 13 (26)c (49)d (52)d (46)d (22)c Sincronicidad días +2 +1 0 -1 -2 a: c,d: Sólo fueron incluidos embriones de excelente y buena calidad Porcentajes en la misma columna con diferente letra difieren estadísticamente (p<0,001) La probabilidad de gestación depende también del estadio en que se encuentra el embrión en el momento de la recolección. La transferencia de mórulas tempranas, por ejemplo, alcanzó una tasa de preñez significativamente inferior (p<0,05) frente a otros estadios más desarrollados (tabla 8, SCHNEIDER y col., 1980). Incluso se observó una tendencia creciente en la tasa de gestación a medida que avanza el desarrollo del embrión. Una posible explicación para ello sería que las mórulas tempranas se encontraron retardadas en su desarrollo de acuerdo al momento de la recolección al 6o8o días de la recolección (ELSDEN y col., 1978; HASLER y col., 1987). Una segunda explicación posible es que los defectos morfológicos son más fáciles de observar en estadios embrionarios avanzados (HALLEY y col., 1979). Tabla 8: Efecto del estadio del embrión sobre la tasa de preñez (SCHNEIDER y col., 1980) Embriones transferidos 586 1178 600 139 Preñez n 359 792 402 99 % 61a 67b 67b 71c Estadio Mt Mc Bt Be a,b tasas de preñez con diferente letra son significativamente diferentes (p<0,05) Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com Transferencia de los embriones 95 Estas observaciones se repiten en el desarrollo de los embriones producidos in vitro. El hecho que un embrión haya alcanzado el estadio de morula temprana no significa que esté en condiciones de alcanzar el estadio inmediato superior. Un estadio más avanzado significa una posibilidad mayor de prosperar en una gestación. La presencia de grandes blastómeros y la falta de otras estructuras diferenciadas en una morula temprana dificultan una evaluación eficaz, comparada con la que se lleva a cabo con los otros estadios superiores, por falta de más puntos de referencia. Los criterios y particularmente las grados de calidad en la evaluación morfológica son subjetivos y varían entre grupos de trabajo. Si bien dichos criterios muestran en muchos casos diferencias significativas en el éxito de la transferencia (HASLER y col., 1987; tabla 9) se ha observado en el cultivo de embriones recolectados in vivo que aproximadamente el 60% de los embriones calificados como aparentemente degenerados continuaban su desarrollo (SREENAN y DISKIN, 1987). Estas observaciones se verifican en el cultivo de los embriones producidos in vitro, clonados o microinyectados con genes, cuya apariencia morfológica está afectada por su origen o los tratamientos. Particularmente en los primeros, con los cuales ya existe experiencia en la práctica, se acentúa la necesidad de adecuar los criterios de evaluación morfológica al tipo de embrión, producto de la fecundación y cultivo in vitro, a fin de no eliminar los embriones que pueden continuar con una gestación. La tasa de preñez de los embriones producidos in vitro es similar a la de los obtenidos in vivo (LIEBRICH, 1991, tabla 10) aunque la apariencia morfológica de los primeros dista de responder a los criterios establecidos para los segundos. La transferencia de un sólo embrión se lleva a cabo en el cuerno ipsilateral de acuerdo a la relación establecida entre el cuerpo lúteo y el cuerno uterino adyacente. La transferencia de más de un embrión es posible llevarla a cabo en forma bilateral. Esto significa que un embrión deber ser colocado siempre en el cuerno ipsilateral a la ovulación. La transferencia de un solo embrión en el cuerno contralateral provoca una alta mortalidad embrionaria dado que las señales luteotróficas y antiluteolíticas del embrión fallan en alcanzar el CL del lado opuesto a la transferencia (SREENAN y DISKIN, 1987). Tabla 9: Efecto del tipo de calificación y calidad del embrión sobre la preñez después de la transferencia (HASLER y col., 1987) Calidad del embrión Años 1980-1983 Buena Regular Mala Años 1985-1986 1 2 3 4 542 408 214 13 451 307 135 6 83a 75b 63c 46c Transferencia n 5521 304 76 Receptoras preñadas n % 4037 73a 181 31 60b 41c a,b,c calidad de los embriones con diferentes letras comprendidas en el mismo grupo de años difieren estadísticamente (p<0,01) Biotecnologia de la Reproduccion www.reprobiotec.com 96 Palma Tabla 10: Preñez obtenida después de la transferencia de embriones de diferentes calidades producidos in vitro (LIEBRICH, 1991) Transferencias n Muy buena Buena Regular y mala 61 41 27 129 a,b diferentes estadísticamente, p<0,05 (t-test) Calidad Preñez (d 35) n 33 21 7 61 % 54a 51 26b 47 El empleo reiterado de receptoras abre el interrogante sobre cuántas veces puede repetirse la transferencia a una misma receptora. LIEBRICH (1991) no encontró diferencias estadísticas entre receptoras que quedaron preñadas después de la primera transferencia de las que lo hicieron después de la tercera (tabla 11) empleando embriones producidos in vitro. La tasa de preñez tendió, sin embargo, a disminuir con el aumento del número de transferencias en la misma receptora. Tabla 11: Tasas de preñez (n) después de la 1o, 2o y 3o transferencia de embriones producidos in vitro a la misma receptora (LIEBRIECH, 1991) Transferencia 1o 2o 3o Receptoras n 183 108 40 Preñez n 102 50 15 % 56 46 37 La transferencia de los embriones obtenidos o producidos constituye el último paso de la técnica, su éxito dependerá del grado de idoneidad y experiencia, requeridos también para el resto de las actividades. La tasa de preñez obtenida no será sólo el producto de la transferencia per se sino de la suma de los actividades realizadas hasta el momento y de los factores dependientes de la donante, el semen, el embrión y la receptora. La competencia profesional en ejecutar con éxito cada uno de los diferentes pasos permitirá alcanzar resultados óptimos y repetibles. Bibliografía BAKER, R.D., EBERHARD, B.K., LEFFEL, R.E., RHODE, R.F. and HENSCHEN, T.J. 1984. Pregnancy rates following surgical transfer of bovine demiembryos. En: 10th international Congress on animal reproduction and artificial insemination. Illinois, U.S.A. 220. BARNES, F. and FIRST, N.L. 1985. The effect of clenbuterol on producing pregnancy from bovine embryo transfer. Theriogenology, 23: 172. BOLAND, M.P., CROSBY, T.T. and GORDON, I. 1976. Unpublished data cited by GORDON, I. Cattle twinning by the egg transfer aproach. In: Egg transfer in cattle, ROWSON, L.E.A. (ed), Commission of the European Communities, Luxemburg 305-319. BRAND, A. y HOOGENKAMP, H. 1982. Embryotransfer. En: Fertilitätsstörungen beim weiblichen Rind. Grunert, E., M. Berchtold (eds.). Paul Parey 463-475. CHUPIN, D. 1988. Comunicación personal. 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Cabodevila Introducción Los embriones bovinos son recolectados en una solución salina buffer fosfato (PBS Dulbecco) suplementada con 1% de suero o 0,1% de albúmina sérica (PBSS). A medida que los embriones son localizados bajo la lupa estereoscópica, se los coloca en PBSS con un porcentaje mayor de suero (10 ó 20%) o albúmina 4%. Permanecen en este medio, a la temperatura del laboratorio 20-25ºC hasta que se realiza la transferencia o se lleva a cabo otra manipulación. La manipulación de los embriones in vitro se lleva a cabo siguiendo las disposiciones establecidas por la Sociedad Internacional de Transferencia Embrionaria (IETS) a fin de prevenir la transmisión de enfermedades (Manual de la Soc. Int. de Transferencia Embrionaria, cap. XVI) Una evaluación morfológica detallada, a mayor aumento, considerando estadios de desarrollo y cualidades estructurales permite determinar que embriones están en condiciones de ser transferidos (LINDNER y col., 1983). La transferencia en fresco debe ser realizada dentro de las 3-4 hs postrecolección (GARCIA y col., 1986). Los embriones pueden ser conservados in vitro para su posterior transferencia mediante: Cultivo a 37o C, refrigeración entre 0o C y 4o C o congelación a -196oC (TROUNSON y col., 1976). A continuación, se analiza en detalle cada una de estas técnicas: Cultivo a 37oC Los embriones bovinos pre-implantados generalmente son recolectados entre el sexto y octavo día de vida, empleando el método no quirúrgico. El cultivo es utilizado para evaluar el resultado de distintas manipulaciones (congelación, micromanipulación, etc.) que se efectúan con los embriones pero no como un paso previo a la transferencia. Esto obedece a dos razones principales: En primer lugar, a que los embriones continúan desarrollando durante el cultivo, por lo tanto, esta técnica no puede ser utilizada para conservar un embrión hasta que una receptora asincrónica alcance el sincronismo óptimo (WRIGHT, 1976). Por otra parte, se ha observado que los porcentajes de preñez disminuyen cuando se transfieren embriones que han sido cultivados (WHITTINGHAM, 1975 y 1976; HEYMAN, 1984). ELSDEN (1984), sostiene que la viabilidad embrionaria se ve seriamente disminuida cuando la extensión del cultivo es mayor de 24 horas. El cultivo de embriones se realiza en medios cuyo pH oscila entre el 7,2 y 7,6 y cuya osmolaridad varía entre 270 y 310 mOsm. El PBSS modificado por WHITTINGHAM (1971) es el medio utilizado comúnmente cuando el cultivo no se extiende por más de 24 horas. Los medios conteniendo bicarbonato, tal es el caso del Ham F-10 y del B2 de Menezo, son más apropiados para el cultivo de embriones pero requieren una atmósfera controlada, con presencia de CO2 para mantener el pH fisiológico. Estos medios son utilizados en cultivos cuya duración es mayor de 24 horas (RAJAMAHENDRAN y col, 1985). Al medio de cultivo, al igual que al de recolección, se le incorpora una fuente de proteínas. Esta se efectúa con la suplementación del medio de cultivo con 10% de suero ó 0,4% de albúmina. La suplementación proteica tiene distintos fines, los más importantes son: Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 100 Cabodevila - Reducir la tensión superficial para favorecer la sedimentación de los embriones y evitar que estos se adhieran a algún elemento utilizado para su manipulación. - Incorporar sustancias promotoras del crecimiento que favorecen el desarrollo embrionario. - Absorber e inhibir metales pesados tóxicos que pueden estar presentes en el medio. El medio de cultivo se esteriliza por medio de filtración a través de membranas de 0,22µm de diámetro de poro. Además, se le adicionan antibióticos, generalmente penicilina, estreptomicina y kanamicina. La temperatura corporal de la especie embrionaria en cuestión es la ideal para el desarrollo de los embriones in vitro. Sin embargo, cuando las condiciones de cultivo dejan de ser ideales -ocurre fácilmente cuando se utilizan soluciones salinas balanceadas- es conveniente que la temperatura del cultivo esté debajo de la corporal (no más de 4ºC). De esta manera, los efectos tóxicos del medio son menos pronunciados y también es menor la evaporación (HEATH, 1990). Refrigeración 0-4oC La refrigeración se efectúa vehiculizando los embriones en PBSS envasados en pajuelas de 0,25 ml y colocadas en un refrigerador (común o portátil) Se utiliza hielo y agua para regular el descenso de la temperatura, de manera similar a como se realiza la estabilización durante la congelación de semen. En los últimos años, con la transferencia no quirúrgica de embriones refrigerados durante uno a tres días, se han obtenido porcentajes de preñez que oscilan entre el 44 y el 50% (Tabla 1). Estos resultados superan claramente a los obtenidos previamente (BON DURANT y col., 1982; BOUYSSOU y CHUPIN, 1982; LIDNER y col., 1982). A partir de los avances registrados, la refrigeración de embriones puede ser considerada como una alternativa interesante cuando no sea posible recurrir a la congelación. Por ejemplo, puede ser utilizada para enviar embriones a ser transferidos en lugares distantes de donde se encuentran las donantes (LEIBO y WINNINGER, 1986, REFSDAL y col., 1988). También puede emplearse esta técnica para conservar embriones hasta que receptoras asincrónicas alcancen la sincronización adecuada. Tabla 1: Resultados obtenidos con la transferencia no quirúrgica de embriones refrigerados. Duración de la refrigeración 24h 48h Embriones transferidos 19 16 Receptoras preñadas 9 (47) 8 (50) Autor/res REFSDAL y col. (1988) BEZUGLY y col. (1988) hasta 72h 222* 98 (44) LINDNER (1985) *De 227 embriones refrigerados, 5 fueron descartados en la evaluación morfológica realizada antes de la transferencia. Congelación a -196ºC Es la técnica de elección para conservar embriones in vitro. Se considera que los embriones pueden ser mantenidos a -196ºC durante doscientos años o más, sin afectar sus viabilidad y sin causarles cambios genéticos (SCHNEIDER y MAZUR, 1986). Este hecho, convierte a la congelación de embriones en una herramienta insustituible para el comercio internacional de reproductores. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Conservación de embriones 101 El empleo de los embriones congelados, entre otras cosas, posibilita: - Utilizar eficientemente donante y receptoras. - Incorporar progreso genético a bajo costo, comparando los valores del embrión y el de su transporte frente a los animales en pie. - Transferir algunos embriones y conservar el resto hasta poder analizar los registros de producción de la descendencia. - Controlar enfermedades exóticas, reemplazando la importación de animales en pie por la de embriones congelados libres de ellas. - Conservar razas en vías de extinción. - Crear bancos de germoplasma de valor pecuario LEIBO (1989) resume la congelación de embriones en cuatro etapas fundamentales comunes a los distintos métodos utilizados. Ellas son: - Exposición de los embriones a agentes crioprotectores. - Enfriamiento desde temperaturas fisiológicas hasta temperaturas lo suficientemente bajas como para causar un virtual cese de todas las reacciones químicas inducidas térmicamente. - Calentamiento desde la temperatura de conservación (-196oC) a temperaturas fisiológicas. Si bien el resultado de la congelación depende fundamentalmente de la forma en que se llevan a cabo estos procedimientos, está condicionado previamente por dos factores. Ellos son: la calidad del embrión y el tiempo que transcurre desde la recolección hasta que comienza la congelación. Cuando se congelan embriones de calidades muy buena y buena (grado I y II) se obtienen mejores resultados que cuando se congelan aquellos de calidad regular (grado III) (KENNEDY y col., 1983; LEIBO, 1984; HUMBLOT y col., 1987). Por su parte, los porcentajes de preñez resultantes de la transferencia de embriones congelados son inversamente proporcionales al tiempo transcurrido desde la recolección hasta el comienzo de la congelación (WRIGHT, 1985). La viabilidad embrionaria disminuye significativamente cuando dicho período es mayor de 3 h (PETIT, 1985). Los embriones pueden ser conservados a -196oC utilizando el método de congelación standard, la vitrificación o el método de congelación rápida. La principal diferencia que tiene el método de congelación standard con respecto a los otros es que en él, el descenso de temperatura se efectúa de manera controlada utilizando equipos programables (fotos 1 y 2). A continuación, se analiza más detalladamente cada uno de estos métodos: Método de congelación standard Este método posibilitó a WILMUT y ROWSON (1973) obtener el primer ternero nacido de la transferencia de un embrión congelado. Al método standard se le han efectuado desde entonces distintas modificaciones tendientes a su simplificación (CABODEVILA y col., 1991). En la actualidad, los embriones son congelados y descongelados de manera rápida. Esto hace necesario deshidratarlos parcialmente antes de la congelación a fin de evitar la formación de cristales que lesionan los blastómeros (MAZUR, 1977). La deshidratación parcial de los embriones se logra incorporando un agente crioprotector al medio de congelación (SCHNEIDER y MAZUR, 1986). En la congelación de embriones se utilizan dos tipos de crioprotectores: 1. Permeables: glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), 1-2 propanodiol, etanol y otros alcoholes. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 102 Cabodevila 2. Impermeables: polivinilpirrolidona (PVP), sucrosa, glucosa, y otros azúcares. El glicerol, en una concentración 1,4M (10%), es el más utilizado en la congelación de embriones bovinos. La exposición de los embriones al medio de congelación (PBSS + glicerol) debe realizarse a la temperatura del laboratorio (25o C), en un sólo paso, de 10 a 30 minutos de duración (CHUPIN y PROCURER, 1984; NIEMANN, 1985). Este período incluye el envasado de los embriones, generalmente en pajuelas plásticas. Las pajuelas o pajillas de 0,25 ml constituyen el envase de elección porque tienen menor tamaño, paredes más delgadas y menor volumen que las ampollas y los tubos. Estas propiedades permiten realizar más rápidamente y con mayor precisión la inducción de la cristalización o "seeding". Es ésta, una maniobra clave para evitar que la viabilidad embrionaria sea afectada durante la congelación (MAURER, 1978). Pueden ser colocadas en el equipo de congelación a la temperatura a la que se efectúa el seeding (aproximadamente -7o C). Es conveniente en este caso que transcurran cinco minutos para que se equilibre la temperatura de las pajuelas con la del equipo de congelación. Algunos equipos de congelación utilizan nitrógeno líquido como agente refrigerante. En otros más económicos, el refrigerante es etanol u otro alcohol enfriado por medio de un compresor (foto 1). NIEMANN (1985) efectuó un estudio comparativo entre ambos sistemas obteniendo porcentaje de preñez similar. Foto 1: Equipo de congelación por medio de baño de alcohol HAAKE Mess-Technik GmbH u. Co., Kalsruhe, Alemania Una vez efectuado el seeding, se mantiene la temperatura estable durante 10 minutos (período de estabilización) y luego se la desciende a una velocidad que oscila entre 0,3 y 0,5o C hasta -30 ó -35o C. En ese momento, las pajuelas pueden ser retiradas del equipo de congelación y sumergidas en nitrógeno líquido (LEHN-JENSEN y GREVE, 1982). Se considera que entre -30 y -35º C se establece un adecuado balance entre deshidratación y formación de hielo intracelular (NIEMANN, 1985). No obstante ello, PETIT (1985) recomendó reducir la velocidad de congelación a 0,1 C/min entre -35 y 38ºC antes de retirar las pajuelas del equipo. WRIGHT (1985) por su parte, prefiere detener la congelación a -30 ó -35º C y mantener la temperatura constante durante quince minutos antes de sumergir las pajuelas en nitrógeno. La descongelación se efectúa de manera rápida, sumergiendo las pajuelas en un baño María a 30-35º C durante 20-30 segundos. RALL y MAYER (1989) informaron que exponiendo las pajuelas al aire a 20º Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Conservación de embriones 103 C durante 10 segundos antes de colocarlas en el baño María, disminuye el número de embriones que sufren rotura de la zona pelúcida. La extracción del glicerol puede efectuarse luego de retirar el embrión de la pajuela o dentro de la misma. En el primer caso, se la lleva a cabo en una sola etapa utilizando sucrosa o en forma escalonada, empleando concentraciones decrecientes de glicerol o una mezcla de glicerol y sucrosa en PBSS (HEATH, 1990). En la elección de una de estas opciones generalmente priva el criterio personal dado que cada una de ellas tiene ventajas relativas. El embrión descongelado es evaluado morfológicamente para eliminar aquellos con daños provocados por los procedimientos utilizados. Con esta técnica de extracción del glicerol se obtienen porcentajes de preñez que generalmente superan el 50% (NIEMANN, 1985). LEIBO (1982) y RENARD y col. (1982) desarrollaron dos técnicas similares que permiten extraer el glicerol dentro de la pajuela. Esta modificación es conocida como método "one step", en realidad no se trata de un método distinto del standard sino de una modificación introducida en la técnica de extracción del crioprotector. Para utilizar esta técnica, es necesario envasar los embriones tal como se indica en la Figura 1. embrión Compartimiento Superior Medio Inferior Extracción del crio-protector fuera de la pajuela 1,4 M glicerol en PBSS 1,4 M glicerol en PBSS 1,4 M glicerol en PBSS Extracción del crio-protector dentro de la pajuela (LEIBO, 1982) 0,24 M sucrosa en PBSS Medio B2 de Menezo 1,4 M glicerol en PBSS 0,25 M sucrosa en PBSS Extracción del crioprotector dentro de la pajuela (RENARD, 1982) 1,4 glicerol en PBSS 0,25 M sucrosa en PBSS Figura 1: Disposición de las distintas soluciones en la pajuela, según la técnica de extracción del crioprotector utilizada Una vez efectuada la descongelación, la pajuela debe ser agitada vigorosamente para desplazar el aire hacia los extremos y permitir que las soluciones se mezclen. La solución de sucrosa isoosmolar con el medio de congelación, provoca que el glicerol salga del embrión. Esta técnica permite transferir embriones congelados a campo sin necesidad de equipos y laboratorios costosos (MUNAR y col., 1988). Se obtienen tasas de preñez que oscilan entre el 30 y el 50% (NIEMANN, 1985). Al prescindirse de la evaluación morfológica, es lógico que los porcentajes de preñez resulten inferiores a los que se obtienen con el método standard convencional. El medio B2 de Menezo es más nutritivo que el PBSS. RENARD y col. (1982, 1983) lo utilizan para extraer algún resto de glicerol que pudiese haber quedado en el embrión, una vez que este se encuentra en el útero de la receptora. A pesar de que las diferencias no fueron significativas, CHUPIN y col. (1984) obtuvieron con esta técnica un mayor porcentaje de preñez que con la propuesta por LEIBO. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 104 Cabodevila Cuando el glicerol es extraído dentro de la pajuela, la viabilidad embrionaria puede ser afectada si no se logra mezclar homogéneamente las distintas soluciones (NIEMANN, 1985). Para evitar tener que realizar esta maniobra, MASSIP y col. (1987) utilizaron como medio de congelación una solución mixta de glicerol y sucrosa en PBSS. A pesar de haberse obtenido porcentajes de preñez aceptables, esta técnica no ha alcanzado difusión aún. Protocolo de congelación y descongelación (según Niemann) Congelación 1. Preparar la solución de glicerol (1,4 M), colocar 3-4 ml de la solución, esterilizada por medio de filtración, en una placa de Petri pequeña (35 mm) y conducir a la misma temperatura de los embriones. 2. Los embriones deben ser clasificados estrictamente y lavados por lo menos 5 veces (para la exportación 10 veces) y finalmente en una solución de tripsina 0,25%. 3. Los embriones son colocados a posteriori directamente en la solución 1,4 molar de glicerol. Se deja un tiempo de equilibración de 20' aproximada-mente sobre una platina térmica. 4. Durante ese tiempo identificar las pajuelas con marcador indeleble. 5. Cargado de los embriones en las pajuelas con la solución de glicerol. 6. Conducir las pajuelas al baño de alcohol a -5 C. Esperar 1-2 minutos. Efectuar luego el seeding e iniciar el programa de congelación a una velocidad de 0,5 C/min hasta -35 C. 7. Colocar las pajuelas en el contenedor con nitrógeno líquido. Descongelación 1. Mezclar partes iguales (p.e. 2 ml + 2 ml) de las soluciones de glicerol (1,4 M) y sucrosa (1,4 M). De ello resulta una concentración de 0,7 M de ambas soluciones. Esterilizar por medio de filtración y conducir a temperatura ambiente. 2. Preparar una solución de sucrosa 0,7 M. 3. Preparar una solución de cultivo con 1% de BSA. 4. Descongelación de las pajuelas a temperatura ambiente (demora aprox. 60-90 segundos). 5. Secar la pajuela, separar el stick y colocar el embrión, con ayuda de una jeringa de tuberculina con unión de goma, en la solución de glicerina y sucrosa (0,7 M). 6. Esperar 5 min y colocar los embriones en la solución de cultivo durante 10 min para su reexpansión. 7. Evaluación morfológica, colocación en el catéter de transferencia y transfe-rencia a una receptora. Sustancias necesarias: PBS + antibióticos (p.e. gentaminicina 80mg/l) y 1% BSA. Glicerol para análisis, puro (98-100%) libre de agua. Sucrosa para análisis Albúmina bovina (BSA), fracción V (96-99% de albúmina) Vitrificación Es un proceso físico de solidificación utilizado para conservar órganos y tejidos y más recientemente embriones (FAHY y col., 1984; RALL y FAHY, 1985). El medio de vitrificación lleva incorporado crioprotectores en alta concentración. Al ser enfriado no cristaliza sino que se torna viscoso y pasa del estado líquido a un estado sólido no estructurado similar a un vidrio, de ahí toma este método la denominación de vitrificación. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Conservación de embriones 105 La solución de vitrificación debe tener alta concentración de uno o más crioprotectores permeables. Para vitrificar embriones bovinos, se ha utilizado una solución mixta de glicerol y 1-2 propanodiol en PBSS. La elección del 1-2 propanodiol se debió fundamentalmente a que es estable y a que tiene poca tendencia a cristalizar durante el enfriamiento (BOUTRON y KAUFMANN, 1979). En primera instancia, los embriones son expuestos al medio de vitrificación intracelular (10% glicerol + 20% 1-2 propanodiol) durante 10 minutos. Luego, se los envasa en el medio de vitrificación extracelular (25% glicerol + 25% 1-2 propanodiol). Si la pajuela se completa con una solución 1M de sucrosa en PBSS, posibilita transferir los embriones a campo de manera similar a lo que ocurre en el denominado método one step. Inmediatamente después de cerrada, la pajuela debe ser introducida lenta y progresivamente en el nitrógeno para que se produzca simultáneamente la vitrificación de los compartimientos extra e intracelular. Utilizando las soluciones anteriormente descriptas, se han vitrificado con éxito mórulas, obteniéndose porcentajes de preñez de alrededor del 50% (MASSIP y col. 1987; DOUCHI y col., 1990). Para vitrificar blastocistos y obtener un porcentaje aceptable de supervivencia fue necesario agregar sucrosa al medio de vitrificación (VAN DER ZWALMEN y col., 1989). Recientemente, KASAI y col. (1990) han utilizado un medio de vitrificación que lleva incorporado ficoll en su formulación. Este medio es menos tóxico que el anterior, si se repiten en otras especies los resultados obtenidos con embriones de ratón, su aplicación resultará de sumo interés. Método de congelación rápida Este método fue desarrollado por CHUPIN en el año 1986. A diferencia de lo que ocurre en la vitrificación, en la congelación rápida se produce la cristalización del agua intra- y extracelular. Los embriones son deshidratados parcialmente tal cual ocurre en el método standard. Luego, se los deshidrata nuevamente colocándolos en una solución mixta de glicerol y sucrosa en PBSS. Esta segunda deshidratación, deja a los embriones en condiciones de ser enfriados rápidamente. Las pajuelas son colocadas en el cuello del contenedor de nitrógeno líquido. Existe un lugar óptimo para colocar la pajuela según el nivel de nitrógeno existente en el contenedor, para que la cristalización ocurra espontáneamente sin producirse la elevación de temperatura relacionada con el cambio de fase. Las pajuelas, luego de permanecer cinco minutos en el cuello del termo, son sumergidas en el nitrógeno. El método de congelación rápida ha sido utilizado con éxito para congelar embriones de animales de laboratorio (TAKAHASHIA y KANAGAWA, 1990; ZUH y col., 1990). En bovinos, se lo ha evaluado únicamente cultivando los embriones descongelados in vitro, los resultados obtenidos fueron dispares según el estadio de desarrollo del embrión congelado (CHUPIN, 1986). Para unificar los resultados, fue necesario modificar el tiempo de exposición a la segunda solución deshidratante o variar la temperatura a la que ésta ocurría (CHUPIN, 1987). Conclusiones Cuando se hace la evaluación morfológica, puede ocurrir que sea difícil definir si algunos embriones son o no transferibles. En ese caso, puede resultar útil cultivarlos por algunas horas para observar su evolución. Es ésta, la única aplicación práctica que tiene el cultivo en los programas de TE que se desarrollan en la actualidad. En algunos países, se han montado recientemente centros de producción de embriones en gran escala, utilizando la fecundación in vitro (GORDON, 1990). El desarrollo de esta técnica, fue acompañado por el de sistemas de cultivo que permiten que el embrión producido por esta vía alcance los estadios de Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 106 Cabodevila mórula o blastocisto in vitro. De esta manera, es posible transferirlos utilizando el método no quirúrgico, que resulta simple y práctico, ver capítulo XI. Teniendo en cuenta que en los centros de TE es difícil poder alojar el lote de receptoras, la refrigeración puede resultar útil para transportar los embriones hasta donde éstas se encuentren, especialmente si se trata de lugares distantes. Antes de refrigerar embriones hasta que receptoras asincrónicas alcancen el sincronismo óptimo, será necesario comparar la pérdida de viabilidad que ocasiona la transferencia asincrónica con respecto a la que causa la refrigeración. Los embriones bovinos, en los estadios de mórula y blastocisto, son congelados exitosamente utilizando el método standard obteniéndose un porcentaje de preñez promedio del 50%. La vitrificación y el método de congelación rápida no han alcanzado aún un grado de desarrollo que permita utilizarlos en programas comerciales de transferencia de embriones. El advenimiento de técnicas tales como: la producción in vitro, el clonado y el diagnóstico del sexo de embriones, la transferencia de genes, etc., hace necesario centralizar esfuerzos para lograr la congelación de estadios tempranos de desarrollo como así también de embriones micromanipulados, con un éxito similar al obtenido con las mórulas y los blastocistos. BIBLIOGRAFIA BEZUGLY, N., OSTASHKO, F., PESOTSKY, V. 1988. Cold shock of mouse and cattle embryos. Proceedings 11th International Congress of Animal Production and artificial Insemination. Vol. 2, 142. BON DURANT, R., ANDERSON, G., BOLAND, M., CUPPS, P., HUGUES, M. 1982. 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El desarrollo biotecnológico posterior, a partir de la manipulación de los embriones recolectados, convirtió a esta técnica en una valiosa herramienta para la producción de una cantidad supernumeraria de embriones y su retorno al ambiente uterino. A partir de la década de 1980 se inició en Cambridge (WILLADSEN, 1981) una nueva fase con el desarrollo de la microcirugía de embriones (MC) con la producción de mellizos idénticos. Esta comprende la micromanipulación de embriones en estadio de mórula o blastocisto, obtenidos por lavajes no quirúrgicos, con la división en 2 partes iguales (hemi-embriones). Sus particularidades la convierten en una técnica interesante no solamente por aumentar la eficiencia reproductiva de un individuo o factor determinado (por ejemplo, ausencia de cuernos en la raza Fleckvieh), sino también por permitir la disponibilidad de animales idénticos en un programa de TE como así también para ser empleados como modelo de investigación (BREM, 1986), cuadro 1, capítulo XX. Esta técnica fue rápidamente adoptada y es aplicada actualmente en los programas convencionales de TE en países con alta disponibilidad tecnológica (GRAY y col., 1991, KIPPAX y col., 1991; LANGE y col., 1991). Existe sin embargo escasa información sobre la aplicabilidad de esta técnica en países bajo condiciones extensivas de producción y con el empleo de receptoras de razas productoras de carne o sus cruzas, cuya rusticidad las hace más adecuadas a esos sistemas de producción que las razas lecheras, pero cuya capacidad de gestar y criar dos individuos constituye un interrogante. En el presente capítulo se presentarán, junto con los resultados obtenidos en la micromanipulación (rendimiento embrionario) y sobrevivencia de las mitades producidas, aquellos logrados a partir de embriones bovinos de raza para producción de carne (Aberdeen Angus): tasa de parición después de una transferencia uni- o bilateral de los hemi-embriones producidos (HE) a receptoras cruza Aberdeen Angus x Criollo como así también el efecto de una gestación doble sobre la supervivencia y desarrollo corporal de los terneros producidos. Cuadro 1: Particularidades de los mellizos homocigotas producidos por medio de microcirugía frente a los mellizos naturales (BREM, 1986). Particularidades según el modelo de aplicación - Disminución de la varianza - Aumento del progreso genético en la línea madre-hija - Aumento de la exactitud del valor genético - Aumento de la eficacia de los núcleos de producción (MOET) - Aumento del número de terneros (30-50%) producidos en un programa de TE - Disminución de los costos de la TE Particularidades metodológicas Ventajas Desventajas - Libre elección de los padres - No requiere estudios diagnósticos - Permite planear el momento de la producción de los mellizos - El éxito de la manipulación no puede ser previsto individualmente - Requiere de personal calificado en micromanipulación y transferencia - La organización es compleja Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 110 Palma & Brem Técnicas microquirúrgicas Existen diversas técnicas para dividir los embriones. La mayoría de ellas emplean micromanipuladores (WILLIAMS y col., 1983; BREM y col., 1983; MASSIP y col., 1985; STEINMEYER, 1986; SEIKE y col., 1989), otras no los requieren (PINTER y col., 1986). Los micromanipuladores se emplean en un número que varía entre 2 (WILLIAMS y col., 1982; 1983) y 4 (BREM y col., 1983; 1987) y se colocan a ambos lados de la lupa estereoscópica o del microscopio, foto 1. Con un manipulador (foto 1, 5) es posible, con ayuda de una micropipeta de vidrio, fijar el embrión por aspiración de la zona pelúcida. El micromanipulador del lado opuesto (foto 1, 3) está provisto del instrumento cortante que puede ser una micropipeta de vidrio, un trozo de hoja de afeitar o un escalpelo para cirugía ocular. Los manipuladores suplementarios (LEITZ, fotos 1, 2) pueden estar equipados con microinstrumentos adicionales que permiten diferentes manipulaciones del embrión y las mitades como así también su desplazamiento en la placa. Una microaguja permite seccionar o separar aquellas mitades que no fueron divididas en su totalidad por el microescalpelo. Un brazo de mortero permite desplazar los embriones denudados sin provocar traumatismos. Una micropipeta, en forma de gancho permite abrir la zona pelúcida para extrar el embrión de su interior, fig. 1. Los instrumentos, con excepción del microescalpelo, deben ser confeccionados a partir de finos tubos de vidrio con ayuda de un estirador de pipetas (foto 5), este instrumento permite producir micropipetas con diámetro interno deseado. La microfragua (foto 6) posibilita el corte exacto como así también las curvaturas de las pipetas puede, además, redondear los bordes de las pipetas (de sostén) a fin de hacerlas atraumáticas. La lijadora (foto 8) permite pulir los bordes de la pipeta en los ángulos deseados. A pesar que la unidad de micromanipulación con un número de 4 micromanipuladores y 5 microinstrumentos (BREM, 1983) simplifica las maniobras operativas, su uso no se ha difundido porque su costo aumenta de la misma forma con el creciente número de micromanipuladores sin mejorar los resultados obtenidos con el empleo de dos micromanipuladores con dos microinstrumentos. Además es más engorroso transportar y armar esta unidad de micromanipulación en un laboratorio ambulante de TE. El éxito de la técnica dependerá fundamentalmente de la pericia del operador, razón por la cual no existe un modelo, número de manipuladores o técnica de elección. División La división de los embriones se lleva a cabo con una lupa estereoscópica (120 x, foto 1) o un microscopio invertido. Los embriones pueden seccionarse fijados con la pipeta de sostén (foto 2) o adheridos al fondo de la placa. Para ello se coloca, en primer lugar, el embrión en un medio conteniendo suero (20% SFB) y luego en el medio de micromanipulación sin suero. La carga eléctrica del embrión, producida por las proteínas séricas, lo fijarán al fondo de la placa. En este caso se requiere de mayor destreza que con la ayuda de una pipeta de sostén. Sin embargo no requiere del uso de micropipetas. La microcirugía del embrión, fijado con la pipeta de sostén, con un microescalpelo de cirugía ocular o un trozo de hoja de afeitar se lleva a cabo conformando un ángulo de 90 entre la pipeta y el microescalpelo. En el caso de dividir el embrión con una micropipeta esta se dipone en el mismo sentido que la pipeta de sostén (foto 3a). Una vez abierta la zona se extrae el embrión con ayuda de la microaguja o del brazo de mortero. De esta forma el embrión puede ser dividido fuera de la zona pelúcida (foto 3b). Una forma más simple es la división del embrión y de la zona pelúcida simultáneamente. Esta variante se practica en aquellos casos en los que el embrión se adhiere al fondo de la placa de Petri. La manipulación de los embriones puede llevarse a cabo en PBS + 20% de SVE. De la misma forma puede emplearse el mismo medio para el posterior cultivo de los embriones durante algunas horas, a fin de evaluar la evolución de los mismos y establecer si son transferibles. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Producción de mellizos idénticos 111 1 2 5 4 3 Figura 1: Tipo y distribución de los microinstrumentos según BREM (1986) 1= pipeta de sujeción, 2= microescalpelo, 3= punta, 4= brazo de mortero, 5= gancho 1. Pipeta de sostén: los bordes de la punta son redondeados con ayuda de la microfragua (Fonbrune), externo 110 µm, interno 25-30 µm 2. Microescalpelo: escalpelo para cirugía ocular o fragmento de hoja de afeitar con la punta afinada por medio de lijado, en la punta 1-2 µm aproximadamente 3. Pipeta tipo estilete: 2 µm 4. Brazo de mortero: varilla de vidrio con una bolilla de vidrio en su extremo. Radio de la bolilla 20 m aproximadamente. 5. Gancho: micropipeta de vidrio doblada, radio de 40 µm Los microinstrumentos se confeccionan con fraguas, piedras de lijar y estiradores ad hoc (fotos 5,6 y 8). Sin embargo es posible también hacerlas a mano (BREM, 1986), aspecto que debe ser considerado particularmente en la aplicación de la técnica en razas cuyo valor agregado no compensen los costos. Foto 1: Unidad de micromanipulación transportable con 4 micromanipuladores. 1: lupa estereoscópica Wild M8, 2 = micromanipulador Leitz, 3: micromanipulador a control remoto AM3M, 4: control remoto ST1, 5: micromanipulador mecánico, 6: jeringa con tubo de goma para la pipeta de sostén (BREM, 1986). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 112 Palma & Brem Foto 2: Mórula fijada con la pipeta de sostén. La zona pelúcida es abierta con un microcapilar recto Foto 3a: División de la mórula fuera de la zona pelúcida Foto 3b: División de la mórula fuera de la zona pelúcida Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Producción de mellizos idénticos 113 Foto 4: Hemi-embriones después de la división. La pérdida de algunos blastómeros es inevitable Factores que afectan el éxito de la división La calidad de los embriones influye sobre el éxito de la división. Embriones de buena y muy buena calidad alcanzan el 80% de sobrevivencia y el 25% de mellizos idénticos. Embriones de calidad media y regular 43% y 15% respectivamente. De la misma forma se observó una sobrevivencia superior de los HE de muy buena y buena calidad frente a los de calidad media y regular (tablas 1 y 2). Foto 5: Estirador automático de pipetas, Bachofer, Alemania Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 114 Palma & Brem Tabla 1: Influencia de la calidad de los embriones de raza Fleckvieh sobre la gestación y producción de mellizos (BREM, 1986) Calidad del embrión muy buena buena mediana regular Σ Embriones (n) 26 78 45 5 154 (n) 23 67 21 2 113 Fetos (%) 88,5 85,9 46,7 40,0 73,4 (n) 5 21 7 33 Pares (%) 19,2 26,9 15,6 21,4 Tabla 2: Influencia de la calidad de hemi-embriones de raza Fleckvieh sobre la taza de preñez (BREM, 1986) Calidad de las mitades muy buena buena mediana regular HE (n) 21 116 98 73 308 Fetos (n) 16 45 34 18 113 (%) 76,2 38,8 34,7 24,7 36,7 Estos resultados indican la necesidad de destinar a la micromanipulación sólo aquellos embriones de buena a excelente calidad. La sección de los embriones provoca una pérdida celular embrionaria de aproximadamente 10%, que segura-mente compromete la sobrevivencia de los embriones de calidad inferior (McEVOY and SREENAN, 1990). El rendimiento de un tratamiento superovulatorio, expresado en la relación de embriones dividibles/recolectados es variable y depende de la calidad de la reacción superovulatoria. En buenas respuestas superovulatorias es posible destinar más de la mitad de los embriones a la micromanipulación (tabla 3). En este caso 64% de los embriones obtenidos fueron calificados como dividibles. Sólo 39% conservó una calidad apropiada para ser transferido (13/33). Es interesante señalar, sin embargo, que la división hubiese permitido aumentar la eficiencia de la TE, realizando 34 transferencias (26 HE + 8 E transferibles pero no divisibles), sin tener en cuenta los HE de calidad III, que por razones experimentales no fueron incluidos en el ensayo. Tabla 3: Número de cuerpos lúteos (CL), Embriones (E) y hemi-embriones (HE) producidos de raza Aberdeen Angus (PALMA y col., 1991) n 5 36 33 29 13 % 100 91,6 80,5 36,1 100 87,9 61,9 % Vacas superovuladas CL palpados E obtenidos E divididos Pares de E producidos Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Producción de mellizos idénticos 115 Las tasas de preñez obtenidas con la transferencia de HE variaron con el desarrollo de la técnica y los autores desde 16,6% (LAMBETH y col., 1983) hasta 79% (WILLADSEN y col., 1981). En general la tasa media de preñez con la transferencia de HE varía entre 50-60% (LEIBO y RALL, 1987; TAKEDA y col., 1987) y es necesario dividir 3-4 embriones para producir un par de mellizos idénticos (BREM, 1986). Es decir que entre 25 y 30% de los pares de h-embriones transferidos darán lugar a mellizos idénticos. La exactitud en la división microquirúrgica se verifica a través de la relación entre el tamaño de las mitades obtenidas. Por esa razón fueron puestos a prueba diferentes microinstrumentos para dividir a los embriones. Los resultados obtenidos con la microaguja no difirieron con los obtenidos con el microescalpelo cuando fueron divididos embriones en estadio de mórula, (BREM, 1986; AGRAWALA, 1987). En el caso particular de los blastocistos no se observaron diferencias significativas entre ambos microinstrumentos, pero si mayor simplicidad en la operación con el uso del microescalpelo y una tendencia a obtener mayores tasas de preñez particularmente con blastocistos tempranos y medianos (BREM, 1986, tabla 4). Las posibles razones serían que en los blastocistos (temprano y mediano) las estructuras celulares (trofoblasto y masa celular) se pueden diferenciar con ayuda del microscopio. La unión celular de las células de los blastocistos, mantiene a las mitades compactas después de la división. Por último el microescalpelo es más filoso que la micropipeta, y permitiría un corte más preciso del botón embrionario de los blastocistos. Cuando la diferencia de tamaño, entre las mitades obtenidas, no existe (relación 50-50%) o ésta es muy pequeña (relación 55-45%) es de esperar una óptima tasa de preñez (80%). Si la relación se desvía en 20% la preñez disminuye consecuente-mente (60-18%). Tabla 4: Resultados obtenidos con la división de embriones por medio de microescalpelo (BREM, 1986) Estadio M Bt B Be Σ Embriones n 102 27 19 6 154 Fetos n 62 28 19 4 113 % 61 104 100 67 73 n 12 13 7 1 33 Pares % 12 48 37 17 21 La ausencia de zona pelúcida de los hemi-embriones no afecta la gestación (tabla 5, Agrawala, 1987). Esta particularidad contribuyó a simplificar la técnica, de forma tal que en la actualidad éstos pueden ser transferidos sin membrana pelúcida. Los 2 h-embriones obtenidos pueden ser transferidos en forma bilateral y no quirúrgica a una receptora o separados: cada mitad al cuerno ipsilateral al ovario c/cuerpo lúteo de una receptora. WILLADSEN y col. (1981) lograron una preñez de 79,0% después de la transferencia bilateral de las 2 mitades de un embrión dividido, BREM (1986) alcanzó 96,3% con la misma técnica. OZIL (1983) y LAMBETH y col. (1983) obtuvieron una marcada diferencia con la transferencia de una mitad (45,4 y 16,6% respectivamente) y 2 mitades (72,7% y 62,5% respectivamente) a una receptora. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 116 Palma & Brem Foto 6: Microfragua de Fonbrune, Alemania Tabla 5: Tasa de preñez obtenida con hemi-embriones transferidos con y sin zona pelúcida Transferencia de las mitades Con zona pelúcida Sin zona pelúcida Sin zona pelúcida Con zona pelúcida 46 Sin zona pelúcida 23 23 57 Embriones divididos n 19 10 21 Receptoras n 36 20 21 23 Receptoras n 18 8 10 13 preñadas % 50 40 48 57 Autor AGRAWALA, 1987 McEVOY y SREENAN, 1990 KIPPAX y col., 1991 Luego de la transferencia de los HE de raza Aberdeen Angus a receptoras Aberdeen Angus x Criolla parieron 9 de 17 receptores (52,9%), de las cuales 7 fueron simples y 2 dobles (tabla 6). No se encontraron diferencias en la parición entre diferentes estadios de los embriones divididos (Mc 7/8, 87,5%; B 4/5, 80.0%) Tabla 6: Preñez después de la transferencia de HE de raza Aberdeen Angus a receptoras Aberdeen Angus x Criolla (PALMA y col., 1991) HE transferidos (pares) 13 Receptoras paridas (n) 9 (52,9%) Nacimientos simples dobles (n) (n) 7 2 (77,9%) (22,2%) (n) 17 Teniendo en cuenta el tipo de transferencia, se observó una mayor tasa de preñez con la transferencia bilateral (66,6%) frente a la unilateral (37,5%) aunque no fueron encontradas diferencias significativas Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Producción de mellizos idénticos 117 (tabla 7). No se registraron nacimientos de mellizos después de la transferencia unilateral, posiblemente debido al reducido número de pares transferidos. De los HE transferidos en forma bilateral el 22,2% fueron mellizos homicigotas. En este trabajo no se alcanzaron los resultados logrados por WILLIAMS y col. (1984); BREM (1986); AGRAWALA (1987); SEIKE (1989); quienes alcanzaron una tasa próxima al 30%. Se determinó, sin embargo, la presencia de 3 gestaciones dobles (33,3%), en la palpación rectal realizada a los 70 días post transferencia. Por razones no determinadas una de ellas no llegó a término, lo que motivó los resultados de parición mencionados. Tabla 7: Tasa de parto con transferencia uni- o bilateral de HE de raza Aberdeen Angus a receptoras Aberdeen Angus x Criollo (PALMA y col., 1991) Tipo de transferencia Unilateral Bilateral Receptoras total paridas (n) 3 (37%) 6 (67%) Pares de mellizos (n) 0 2 (22%) (n) 8 9 El rendimiento de la división microquirúrgica, expresado a través de los terneros nacidos por embrión empleado fue próximo a 1,0 (tabla 8). Tabla 8: Eficacia de la producción de mellizos idénticos de raza Aberdeen Angus con receptoras Aberdeen Angus x Criollo (PALMA y col, 1991) Tipo de transferencia Embriones transferidos (n) 4 9 13 Terneros obtenidos (n) ET/tn1 3 8 11 0,75 0,88 0,86 Unilateral Bilateral Total 1 ET/Tn= relación embrión empleado ternero nacido LAROCCA y col. (1992) observaron un aumento significativo de la muerte embrionaria cuando las dos mitades fueron transferidas en un solo cuerno uterino. Nacimientos simples y dobles No hubo problemas de parto ni retención de placenta en las receptoras AA x Criollo que parieron mellizos (foto 7). El análisis de los pesos fue realizado en los terneros del mismo sexo, para no introducir ese factor de variación en el bajo número de animales estudiados. Se estudió el peso inicial y su evolución en 5 terneras nacidas de gestaciones simples y 4 productos de gestaciones dobles. El peso al nacimiento fue de 26±3,9 Kg para las primeras y de 21±1 Kg para las segundas (p>0,05). La falta de una diferencia estadística significativa entre los pesos medidos pudo estar dada por la variación observada en los pesos de los animales nacidos de gestaciones simples. Por el contrario, la ganancia de peso observada durante los primeros 5 meses de vida fue diferente (0,758±0,07 kg y 0,637 ± 0,025 kg/día para los nacimientos simples y dobles respectivamente, (p<0,01). Los pesos a una edad próxima Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 118 Palma & Brem al destete tendieron a ser diferentes (135±12,5 kg los simples y 118 ± 3,3 Kg los dobles) a favor de las gestaciones simples, sin embargo se obtuvo una mayor cantidad total de Kg de ternero destetado (236 Kg. vs. 135) con las receptoras melliceras. Por otra parte, con respecto al peso individual, es de esperar una recuperación del peso de los mellizos después del destete suficiente como para alcanzar a los simples antes del año de edad (MAULEON y col., 1970). Foto 7: Dos pares de mellizos idénticos de la raza Aberdeen Angus producidos por medio de microcirugía (PALMA y col. 1991) Foto 8: Piedra de lijar micropipetas y microescalpelos Conclusiones La producción de mellizos idénticos por medio de micromanipulación permite aumentar de 0,6-0,7 a 1,01,1 terneros por embrión obtenido, incrementando la eficacia de un programa de TE entre 30-40%, disminuyendo sus costos y posibilitando la obtención de mellizos idénticos. En la actualidad, la transferencia doble de embriones se efectúa en receptoras de gran tamaño (razas lecheras y de doble propósito) que cuentan con mayor capacidad uterina para albergar dos gestaciones. Las receptoras Aberdeen Angus x Criollo no respondieron de la misma forma a las características mencionadas, pudiendo este hecho haber afectado los resultados obtenidos. Es necesario, en consecuencia, realizar más estudios para aclarar la importancia de la receptora en el éxito de esta técnica. Las receptoras para producción de carne, por otra parte, no incorporan problemas adicionales al no presentarse dificultades de parto ni alterarse la crianza de los terneros. Bibliografía Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Producción de mellizos idénticos 119 AGRAWALA, P.L. 1987. Untersuchung zur Teilung von Mäuse- und Rinderembryonen und zur Tiefgefrierkonservierung geteilter Rinderembryonen. Institut für Tierzucht und Haustier-genetik der GeorgAugust-Universität Göttingen. Tierärztliche Hochschule Hannover Diss. 1-120. BREM, G., KRÄUSSLICH, H., SZILVASSY, KRUFF, B., LAMPETER, W.W., GRAF, F. 1983. Zur Erzeugung eineiiger Rinderzwillinge durch Embryo-Mikrochirurgie. Berl. Münch. Tierärztl. Wschr. 96: 153-157. BREM, G., NIEMANN, H., SACHER, B. und SMIDT, D. 1987. Zum Tiefgefrieren mikrochirurgich geteilter Rinderembryonen und der Erstellung zeitungleich geborener monozygoter zwillingspaare. Deutsche. Tierärztl. Wschr. 94: 195-197. BREM, G. 1986a. 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El cultivo in vitro de los ovocitos fecundados constituyó un problema metodológico, con los medios de cultivo habituales se desarrollan los cigotos hasta un determinado "block", que varía según las especies. En la especie bovina el desarrollo se interrumpía en el estadio de 8-16 células. Para superar el desarrollo temprano insuficiente se emplearon medios de cultivo in vivo, en los cuales los cigotos o embriones de 2 células fueron cultivados en oviductos de oveja (CRISTER y col., 1986; EYESTONE y col., 1987; LU y col., 1988a), de coneja (BOLAND, 1984; SIRARD y col., 1985; FUKUI y ONO, 1988) o de vaquillona (XU y col., 1987) durante 4-6 días. La desventaja de ese método, además de la complejidad de la técnica, es la pérdida de hasta un tercio de los embriones transferidos. Un nuevo camino para superar la interrupción del desarrollo embrionario fue encontrado con el empleo de cultivos celulares. A través del co-cultivo con determinadas células somáticas es posible alcanzar las condiciones adecuadas para lograr un desarrollo embrionario normal. La producción in vitro de embriones comprende 3 etapas: - Maduración in vitro de los ovocitos obtenidos de ovarios por medio de punción folicular - Fecundación in vitro de los ovocitos madurados - Cultivo in vitro de los embriones Recolección de los ovarios y maduración in vitro de los ovocitos Los ovocitos son en general obtenidos en el matadero a partir de ovarios de vacas y vaquillonas no preñadas aunque hasta el momento no existe evidencia que la producción de ovocitos a partir de ovarios con un CL de gestación sea diferente. Los ovarios contienen un gran número de ovocitos en diferentes estadios de desarrollo. El transporte hasta el laboratorio se lleva a cabo en una solución PBS a temperatura ambiente. YANG y col. (1990) señalaron la posibilidad de conservar los ovarios a 24-25o C durante 11 h sin disminuir la capacidad fecundante o el desarrollo posterior de los embriones. Ello significa para su aplicación práctica, que un prolongado tiempo de transporte desde el matadero hasta el laboratorio no afecta negativamente los resultados esperados. Temperaturas de 37o y 4o C son, sin embargo, inadecuadas para una larga conservación de los ovarios. Después de lavar los ovarios 3 veces en medio de transporte se procede a la obtención de los ovocitos por medio de un aparato de punción, que opera con una presión negativa de 100mm Hg. En caso de no contar con un aparato de estas características es posible también aspirar los ovocitos con una jeringa. La aguja en ambos casos es de 0,9 mm Ø. Se puncionan todos los folículos terciarios visibles que posean un tamaño comprendido entre 2-6 mm de Ø. El líquido folicular con los ovocitos se deja sedimentar aproximadamente 15 minutos antes de aislar los complejos cumulus-ovocito. Luego de lavarlos 2 veces es posible clasificar a los ovocitos morfológicamente en 3 categorías. Se destinan a la maduración aquellos ovocitos que posean un cumulus oophorus denso que cubra la totalidad del ovocito y un citoplasma uniformente granulado y oscuro (SÜSS y STRANZINGER, 1987; foto 2). El Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Producción in vitro de embriones 121 segundo grupo lo constituyen los ovocitos cubiertos sólo parcialmente con el cúmulus algo distendido (foto 2) y el tercero carece de células del cúmulus. La presencia de un cúmulus completo con un mínimo de 5 capas tiene importancia en el desarrollo de los ovocitos inmaduros, que se contactan con las células somáticas por medio de prolongaciones citoplasmáticas de las células de la granulosa o "gap junctions" (foto 1). Esas uniones le permiten al ovocito ingresar aminoácidos y otros nutrientes, que en forma pasiva no atraviesan la zona pelúcida (MOOR, 1983). Los resultados obtenidos por varios grupos de trabajo indican que sólo los ovocitos que cuentan con un cumulus completo y compacto poseen la capacidad de completar la maduración in vitro (LEIBFRIED y FIRST, 1979; SÜSS y MADISON, 1983) y alcanzar el completo desarrollo esperado (STAIGMILLER y MOOR, 1984). Foto 1: Zona pelúcida atravesada por largas prolongaciones citoplasmáticas (ZA) de las células de la granulosa (Gap-junctions), en íntimo contacto con la membrana ovocitaria, corte semi fino Con el aumento del tamaño folicular disminuye el número de complejos cumulus-ovocitos. Al mismo tiempo aumentan los signos de degeneración en el ovocito como así también cambios en la estructura del cumulus, que se asemejan a los observados in vivo, provienen en su mayoría de folículos terciarios atrésicos (SÜSS, 1990). Por animal se obtienen en promedio entre 15 (PALMA y col., 1993) y 18 ovocitos, de los cuales entre 57% (BERG y col., 1991a) y 70% (PALMA y col., 1993) responden a los criterios morfológicos para una exitosa maduración in vitro. Un medio de maduración adecuado es el medio de cultivo celular 199, el cual fue modificado (PAVLOK, 1988, comunicación personal) a través del agregado de piruvato de sodio (2 mM), lactato de calcio (2,92), FSH (10 g/ml; Burns Biotec), gentamicina (50 g/ml) y una combinación de buffers Hepescarbonato (33,9mM carbonato de sodio, 4,43mM Hepes). Como fuente proteica se emplea suero de vaca en celo inactivado por medio de calor. En comparación con otros sueros éste posee altas concentraciones de LH y prolactina (YOUNIS y col., 1989). El efecto de las gonadotrofinas durante la maduración de los ovocitos es variado. Bajo su influencia se produce la expansión de las células del cumulus tanto in vivo como in vitro (foto 4) cuyo significado en la especie bovina podría ser interpretado como la mayor facilidad con que las fimbrias de la ampolla del oviducto pueden atrapar el ovocito cuyo cumulus se encuentra expandido y adherente (EYESTONE y FIRST, 1990). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 122 Berg & Reichenbach Foto 2: Ovocito con un cumulus oophorus Foto 3: Ovocito con cumulus oophorus incompleto denso y compacto Foto 4: Ovocito con cumulus oophorus expandido después de 24h de la maduración Un cumulus no expandido constituye una barrera impenetrable para los espermatozoides durante la fecundación. La FSH y LH posibilitan al mismo tiempo una caída del AMPc en el ovocito y con ello cambios en la síntesis proteica completando la meiosis. Las gonadotrofinas participan paralelamente en la maduración del citoplasma, que desempeña un rol de importancia en la fecundidad del ovocito. De esta forma, la presencia de cumulus expandidos y pegajosos, permite estimar la presencia de un citoplasma maduro. La maduración se lleva a cabo a 39oC con 5% CO2 durante 24h con máxima humedad ambiente. Alrededor del 80% de los ovocitos que se encontraban en el momento de la punción folicular en estadio vesicular, reinician la meiosis y alcanzan el estadio de metafase II al cabo de 24h, lo que corresponde al momento de la ovulación (fig 1). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Producción in vitro de embriones 123 AG CG 0h M REL ≅21-22 h ≅ 9-12 h REL ≅ 19 h ≅ 15 h Fig 2: Esquema de las fases de maduración nuclear y citoplásmica de ovocitos bovinos, según HYTTEL y col. (1989): Los eventos se describen cronológicamente a partir del comienzo del cultivo: 0 h ovocito inmaduro antes del cultivo: células del cumulus oophorus compactadas, el núcleo redondeado con condensaciones dispersas de la cromatina, mitocondrias (M), aparatos de Golgi (G) y los cumulos de gránulos corticales (GC) localizados en la periferia. ~9-12 h El contacto entre las proyecciones citoplasmáticas de las células de la granulosa y el ovocito se encuentra casi totalmente interrumpido. El núcleo del ovocito adopta una forma convolutada y la cubierta nuclear se diferencia en retículo endoplásmico liso (REL). En el núcleo la cromatina está condensada y adyacente al mismo aparecen densas áreas y microtúbulos. ~15 h El cumulus está expandido y sus proyecciones citoplasmáticas están completamente interrumpidas. En el ovocito se inicia la metafase de la primera división meiótica en una densa área del ooplasma. Las mitocondrias migraron en todo el citoplasma con una distribución más o menos uniforme. ~19 El primer cuerpo polar es expulsado y se inicia la segunda división meiótica en forma similar a lo descrito. ~21-22 h Los gránulos corticales migraron a la periferia a lo largo del Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 124 Berg & Reichenbach oolema. Los aparatos de Golgi se encuentran dispersos en todo el ooplasma y el REL forma conglomerados. En este momento el ovocito maduró e ingresa en un estado de quiescencia. Selección y capacitación espermática (swim-up) De la misma forma que el ovocito, los espermatozoides llevan a cabo con la capacitación su maduración, que in vivo se desencadena a través de las secreciones del tracto genital femenino. Aunque el mecanismo exacto de la capacitación no es claro aún, se conoce que conduce a cambios en la composición lipoproteica de la membrana espermática, a un aumento del metabolismo y de la motilidad del espermatozoide (hipermotilidad). La unión de los espermatozoides a los receptores de la membrana pelúcida ocurre gracias a la presencia de proteínas de unión, que permiten una fecundación específica para cada especie. Antes y después que la célula espermática toma contacto con la membrana pelúcida se desencadena la reacción acrosómica (fig. 3). Durante la reacción se funden dos tercios de la membrana plasmática con la membrana externa del acrosoma formando vesículas, de esta forma se liberan las enzimas acrosomales. Esas enzimas líticas abren el camino al espermatozoide a través de la zona pelúcida (WASSARMAN, 1990). Fig 3: Esquema de la reacción acrosómica según HYTTEL y col. (1989): 1. cabeza espermática antes de la reacción acrosómica (N) núcleo, (A) acrosoma, (MAI) membrana acrosómica interna, (MAE) membrana acrosómica externa y (MP) membrana plasmática. Nótese la posición del segmento ecuatorial (SE). 2. cabeza espermática durante la reacción acrosómica sobre la membrana pelúcida (MP). La fusión de la membrana plasmática con la membrana acrosómica externa resulta en la formación de vesículas. El segmento ecuatorial no fue afectado por la reacción acrosómica. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Producción in vitro de embriones 125 La importancia de una completa capacitación para la reacción acrosómica y la fecundación se observó en los primeros ensayos de fecundación in vitro, que condujeron a muy bajas tasas de penetración. Recién después del descubrimiento y aplicación de glicosaminoglicano, cuyo más activo representante es la heparina, se lograron mejoras en los resultados. El origen cervical y uterino de la heparina fue el primer punto de partida para concluir que su presencia juega un rol de importancia en la preparación de los espermatozoides para la fecundación. Hoy se sabe que la heparina a través de la reacción acrosómica permite el ingreso del espermatozoide en el ovocito (PARRISH y col., 1986). De forma similar ocurre con la catecolamina adrenalina (1 µM) y el aminoácido hipotaurina (10 µM), los cuales a través de la activación de la capacitación conducen a una mayor tasa de penetración (BALL y col., 1983; GREVE y col., 1987; LEIBFRIED-RUTLEDGE y col., 1987). La fecundación in vitro en la especie bovina se puede llevar a cabo con semen fresco o congelado/descongelado después que es llevado a cabo el swim-up (PARRISH y col., 1986). Este tratamiento permite establecer condiciones similares a las fisiológicas. El semen a tratar es colocado en el fondo de un tubo cónico conteniendo 1 ml de medio de capacitación y sometido a baño María a 39oC durante 1h. En la actualidad se conoce que durante este tiempo la capacitación sólo se inicia. El proceso concluye en el medio de fecundación durante el co-cultivo de los espermatozoides con los ovocitos. Durante el swim-up los espermatozoides mótiles migran en el medio de capacitación, liberándose del plasma seminal que queda en el fondo del tubo cónico. Después de 60 minutos de incubación son retirados 850µl del medio de capacitación sobrenadante con los espermatozoides mótiles y centrifugado a 200 g durante 10 minutos. Después de la centrifugación el sobrenadante es retirado y el "pellet" resuspendido. Después de una segunda centrifugación se retira el sobrenadante hasta un volumen de 100µl y se evalúa la concentración espermática a fin de colocar una concentración de 1 millón de espermatozoides por ml de medio donde se encuentran los ovocitos. Fecundación in vitro La fecundación comprende una serie de procesos cuyo punto final está representado por la fusión de los núcleos de ambas gametas y la formación del genoma del nuevo individuo. El medio de fecundación es un medio Tirodes-Lactato modificado, al que se le agregan heparina (30 µl de la solución final), adrenalina e hipotaurina, 15 µl de la solución final, (BALL y col., 1983). El tiempo de fecundación es de 20-24h bajo las mismas condiciones de cultivo que durante la maduración de los ovocitos. La penetración del espermatozoide (fig 4) desencadena la segunda parte de la división meiótica con la expulsión del segundo corpúsculo polar. Simultáneamente se cumple la descondensación de la cabeza espermática y la formación del pronúcleo masculino. Este proceso es dependiente de la presencia de factores de crecimiento del pronúcleo masculino en el citoplasma del ovocito (BALL y col., 1984). Para la síntesis de esos factores de crecimiento es necesaria la presencia de esteroides y catecolaminas durante la maduración del ovocito. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 126 Berg & Reichenbach 1 2 3 4 Fig 4: Esquema de la penetración del espermatozoide en el ovocito según HYTTEL y col. (1989): 1) espermatozoide después de la reacción acrosómica, (N) núcleo, (MAI) membrana acrosómica interna, (MA) membrana acrosómica externa y la membrana nuclear (MN) en el espacio perivitelino sobre la superficie del ovocito. Las microvellosidades contactan el segmento ecuatorial, que no es afectado por la reacción acrosómica. Obsérvese la distribución de los gránulos corticales localizados a lo largo del oolema. 2) La fusión de las membranas ocurre entre las microvellosidades y el segmento ecuatorial. 3) La zona ecuatorial está extendida abarcando la totalidad del segmento ecuatorial y parte de la región acrosómica posterior. Los gránulos corticales comienzan a liberarse. 4) El espermatozoide comenzó a penetrar en el ooplasma. Para evaluar la fecundación los ovocitos pueden ser fijados y coloreados con una solución de orceína. La fecundación es considerada por la presencia de los dos pronúcleos y, en estadios tempranos, la cola del espermatozoide. La tasa de penetración y la tasa de polispermia también pueden ser determinadas en el marco de la evaluación de la fecundación. En estudios propios la tasa de fecundación con un toro seleccionado para la PIV fue 68% y 74% de penetración, esto es, 6% de los ovocitos sufrieron polispermia (BERG y BREM, 1989). Este último valor, alto comparado con las tasas de polispermia observadas in vivo, podría ser explicado a través de una incompleta o demorada reacción de la zona de los ovocitos madurados in vitro. En condiciones normales después que el espermatozoide penetró en el ovocito se unen los gránulos corticales con la membrana y vuelcan el material enzimático en el espacio perivitelino. En los ovocitos madurados y fertilizados in vitro la secreción de los gránulos corticales se observa frecuentemente como estructuras no dispersas en invaginaciones del oolema, posiblemente como consecuencia de una demorada migración a la periferia (HYTTEL y col., 1989; fig. 6). Los cambios posteriores del lado interno de la membrana pelúcida actúan como bloque a la polispermia (WASSARMAN y col., 1990). Una concentración espermática elevada, por encima de los valores establecidos puede conducir igualmente a los mismos problemas de polispermia. El éxito de un programa de PIV depende además de la calidad de los ovocitos del toro empleado (LEIBFIED- Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Producción in vitro de embriones 127 RUTLEDGE y col., 1989) y no tiene relación conocida con los resultados obtenidos con el mismo toro in vivo, como por ejemplo el índice de no retorno. Fig 6: Esquema de los fenómenos asociados con la migración periférica y liberación de los gránulos corticales in vivo e in vitro según HYTTEL y col. (1989) Cultivo in vitro. Tasas de desarrollo Después que el desarrollo de los embriones cultivados en los medios convencionales se detenían en estadios específicos según las especies, se intentó aproximar el cultivo in vitro a las condiciones fisiológicas con el empleo de células denominadas "colaboradoras". Los co-cultivos celulares más empleados son aquellos con células del oviducto (FUKUI y ONO, 1988; LU y col., 1988b; EYESTONE y FIRST, 1989), células granulosas (GOTO y col., 1988; BERG y BREM, 1989) y fibroblastos uterinos (VOEKEL y col., 1985; WIEMER y col., 1987) como así también el co-cultivo con vesículas trofoblásticas (CAMOUS y col., 1984; HEYMAN y col., 1987). En ensayos propios se empleó el método de co-cultivo con células del oviducto, con el cual se habían logrado buenos resultados en el cultivo in vitro de embriones ovinos (GANDOLFI y MOOR, 1987; REXROAD y POWELL, 1988). Para ello se lavan oviductos con PBSS. Las células que forman el sedimento se resuspenden en el medio Ham's F 10 con el agregado de 10% de suero de vaca o en el medio 199 modificado que se empleó para la maduración de los ovocitos. Después de un corto tiempo se forma una capa de células que cubren al cabo de 10-14 días, el fondo de la placa. Una alternativa para el co-cultivo con células somáticas lo constituye el empleo de las células granulosas a partir del cumulus de los ovocitos fecundados. Como medio de cultivo se emplea el medio 199 modificado con el agregado de 20% de suero de vaca (BERG y BREM, 1989). A través de la disminución de la concentración de O2 a un 5% se observa una mayor tasa de desarrollo y una mejor calidad de los embriones producidos. La explicación para ello sería que una atmósfera reducida de oxígeno impediría la formación de peróxido que afecta negativamente al embrión en desarrollo. Resultados comparativos indicaron que la presencia de células granulosas ofrece mejores condiciones para el desarrollo de los embriones frente al co-cultivo con células del oviducto. El desarrollo de mórulas y blastocistos empleando las células del cumulus es el doble. Aproximadamente un tercio de los ovocitos cultivados pueden transformarse en embriones transferibles (BERG y BREM, 1990a; tablas 1 y 4; PALMA y col., 1992, tabla 2 y figura 9). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 128 Berg & Reichenbach Tabla 1: Tasas de desarrollo de ovocitos madurados y fertilizados in vitro en 3 sistemas de cultivo diferentes (BERG y BREM, 1990a) Co-cultivo con: Medio de cultivo Condiciones Desarrollo 162 h después de FIV Mórulas Blastocistos Σ a:b = p <0,01 ( Test de χ2) células del oviducto Ham's F10 + 10% FKS 5% CO2/aire n 112a 10 (8,9%) 3 (2,7%) 13 (11,6%) células del oviducto MPM + 20% SVE 5%CO2/5%O2/ 90%N2 n 157a 21 (13,4%) 6 (3,8%) 27 (17,2%) células de la granulosa MPM + 20% SVE 5%CO2/5%O2/90% N2 n 160b 35 (21,9%) 16 (10,0%) 51 (31,9%) La primera evaluación morfológica puede llevarse a cabo 90h después de la FIV, coincidiendo con la liberación de los embriones del exceso de células del cumulus. En ese momento se encuentran 43% de los embriones en estadio de 6-12 células (foto 5). Comparando esa tasa de división con el desarrollo posterior de los embriones se puede comprobar que 3/4 del total de ovocitos fertilizados pueden superar el "block" de 8-16 células (foto 6). Otra alternativa exitosa para el cultivo de los embriones es la aplicación de medios condicionados. El empleo de medios libres de células cobra importancia en el cultivo de embriones, cuya zona pelúcida fue abierta por medio de manipulación. En nuestros ensayos fue evaluado un medio, producido a partir de células del cumulus obtenidas de ovocitos fecundados después de 7 días de cultivo en medio 199 modificado. En ensayos conducidos a evaluar la congelabilidad del medio, como un aspecto de implementación práctica, no se observaron diferencias en las tasas de desarrollo. Aparentemente la actividad embriotrofa del medio condicionado permanece estable después de la congelación/descongelación (BERG y BREM, 1990b). Estos resultados coinciden con los obtenidos por EYESTONE y FIRST (1989) con medio condicionado a partir de células del oviducto. Foto 4: Embriones en estadio de 6-12 células 90h Foto 5: Mórulas y blastocistos 7 días después de después de la FIV la FIV Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Producción in vitro de embriones 129 Foto 6: Blastocistos expandido y protruido 9 días después de la FIV En la mayoría de los trabajos experimentales descriptos en la producción in vitro de embriones bovinos se trabajó con ovarios de numerosas vacas en forma de pool. Para el empleo de esta técnica con determinados objetivos productivos, es de interés producir embriones de reproductoras en forma individual. Dado que es conocido que el éxito de la fecundación depende del semen que se emplee (LEIBFRIED-RUTLEDGE y col., 1989) quedaba por responder en que medida es posible prever la producción de embriones transferibles a partir de los ovocitos de un animal. Los resultados indican que la tasa de desarrollo varía ampliamente entre animales (tabla 3). En 22 casos se produjeron un promedio de 2 (±1,9) mórulas y 1,9 (± 2,6) blastocistos, esto es, 28% (± 21%) de los ovocitos empleados se desarrollaron hasta estadios viables para la transferencia. Los valores extremos en las tasas de desarrollo se encontraron entre 0% y 75%. El mayor número de embriones obtenidos de un animal fueron 12 mórulas y blastocistos. Tabla 2: Desarrollo de embriones producidos in vitro en dos sistemas de cultivo (PALMA y col., 1992b) Ovocitos Co-cultivos CO CG n 135 190 Mórulas 12,5 (17) 5,2 (10) % de embriones producidos (n) Blastocistos 0,7a (1) 17,8b (34) Total 13,2 (18) 23,0 (44) CO: Células del oviducto, CG: células de la capa granulosa, a,b: p<0,05 Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 130 Berg & Reichenbach Tabla 3: Tasas de desarrollo (TD) de ovocitos inmaduros a los estadios de mórula (M) y blastocisto (B) 162h después de la fecundación in vitro (BERG y BREM, 1991) Animal No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Σ x ± DS Ovocitos n 13 16 25 19 10 20 10 11 12 12 11 15 9 15 8 16 15 13 24 14 9 12 309 14±5 M n 2 2 3 5 1 5 0 1 0 0 0 2 1 5 0 6 0 3 2 4 1 2 45 2±2 B n 4 10 0 0 0 0 1 4 5 6 0 2 2 1 0 1 0 2 0 4 0 0 42 2±2 M+B/ animal 6 12 0 5 1 5 1 5 5 6 0 4 3 6 o 7 0 5 2 8 1 2 87 4+/-3 TD 46 75 12 26 10 25 10 45 42 50 0 27 33 40 0 44 0 38 8 57 11 17 28±21 El co-cultivo con células del oviducto proporcionó una tasa desarrollo de blastocistos significativamente menor que con células de la granulosa. PALMA y col. (1992) concluyeron que el efecto positivo del cocultivo con las células del oviducto de vaca con los embriones clonados no se verifica en el cultivo de embriones producidos in vitro y que ello podría estar provocado por el mayor número de embriones cultivados por microgota comparado al número reducido de embriones clonados cultivados en el mismo Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Producción in vitro de embriones 131 volumen y/o requerimientos diferentes de ambos tipos de embriones. Por otra parte los autores son de la opinión que la obtención y producción de suspensiones de células del oviducto requiere de destreza, a fin de obtener un cultivo estéril con alto porcentaje de células vivas. Ello convierte al cultivo en CO en una técnica engorrosa en su desarrollo. La producción de embriones en forma individual comparada con aquella en pool no fue diferente estadísticamente (tabla 4). Tabla 4: Producción in vitro individual y en pool de mórulas (M) y blastocistos (B), BERG y BREM, 1991b Producción Individual Pool (control) Pool (total) Ovocitos 309 332 1702 M 45 47 295 B 42 66 262 % M+B 28 34 33 Trabajos realizados por otros autores señalaron una sensible disminución en la producción de embriones cuando los ovocitos empleados eran madurados, fecundados y cultivados en pequeños grupos (n= 5, SÜSS y col., 1990). Para evaluar el efecto del cultivo en pequeños grupos sobre la producción y el desarrollo de embriones bovinos, se dividieron los ovocitos madurados y fecundados (n = 710) en grupos de 30 COCsf/400 µl para su cultivo en 3 grupos con un número decreciente de embriones por gota (PALMA y col., 1992). Al 7o día de cumplida la fecundación la tasa de blastocistos y mórulas producidos se redujo significativamente con la disminución del número de COCsf cultivados (p<0,01) como consecuencia de una significativa disminución del número de blastocistos producidos (p<0,01). El desarrollo hasta el estadio de mórula no mostró diferencias significativas. Los resultados obtenidos en nuestro laboratorio coinciden con los obtenidos por SÜSS y col. (1990) y FERRY y col. (1992) y explicarían la tendencia a obtener menos embriones cuando el número de complejos cumulus-ovocitos fecundados cultivados, varía entre 10-25 (tablas 2 y 3). Los mismos indicarían además que el número de embriones cultivados tiene un efecto per se sobre el desarrollo de los ovocitos fertilizados. Aspecto que deberá tenerse en cuenta en los programas individuales de PIV, clonado o embriones transgénicos, en los cuales el número de embriones a cultivar excepcionalmente alcanza el óptimo. FERRY y col. (1992) recomiendan una relación de 1 embrión/µl de medio de cultivo, como una vía adecuada para adaptar el medio de cultivo al número de COCsf cultivados. Sin embargo sus resultados óptimos no superan aquellos que se obtienen en nuestro laboratorio (26-32% de blastocistos, PALMA y col. (resultados no publicados) con una relación 1 embrión/1µl de medio de cultivo. Tasas de desarrollo embrionario empleando ovocitos de hembras impúberes No existe suficiente información que describa el grado de éxito de la producción in vitro de embriones empleando ovocitos de hembras impúberes. Sin embargo este aspecto gana particular importancia debido a su trascendencia en el mejoramiento genético (ver capítulo XIX). KAJIHARA y col. (1991) obtuvieron ovocitos de terneras Holstein de 4 meses de edad (n= 509), después de la faena o quirúrgica-mente luego de una tratamiento con FSH, con el objeto de evaluar el efecto del tiempo de maduración sobre el desarrollo de los embriones producidos. Los autores obtuvieron 8-12% de blastocistos (Bt, B y Be) y 1-4% de blastocistos protruidos, concluyendo en la factibilidad de producir mórulas y blastocistos in vitro con ovarios de terneras. Lamentablemente los autores no contaron con Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 132 Berg & Reichenbach un grupo control de ovocitos de animales púberes a fin de comparar sus resultados. Coincidentemente con ello se observó en nuestro laboratorio una marcada disminución de las tasas de recolección, maduración y desarrollo embrionario con el empleo de estos ovocitos comparado con los obtenidos de hembras púberes (PALMA y col., 1993). Los resultados obtenidos fueron ineficaces (tabla 5) pero superiores a los alcanzados por KAJIHARA y col., hecho que despertaría expectativas en el uso de esta categoría de animales. PALMA y col. suponen que los ovocitos obtenidos de los animales impúberes estudiados (raza Fleckvieh, 90-130 Kg p.v) requieren otras condiciones para su obtención y especialmente maduración. El uso de 20 µg/ml de FSH logró mejorar significativa-mente la tasa de producción de blastocistos protruidos frente al grupo control tratado con la mitad de la concentración (PALMA y col., 1993 resultados no publicados). Será necesario llevar a cabo más estudios para optimizar los resultados de un programa de PIV con material de animales impúberes. Tabla 5: Rendimiento individual de terneras y vacas en un programa de PIV de embriones (PALMA y col., 1993) Categoría de animal Terneras (42) Vacas (202) Recolecció n Oo./anim. 13 15 aptos para IVF Oo./anim. 8 (63)a 10 (67)b Maduración Oo./anim. 3 (37)c 6 (65)d Embriones* /animal 2 (16)e 3 (34)f B/animal 1 (16)g 2 (22)h χ2; *Embriones = mórulas y blastocistos; ( ) = % a, b p< 0,05; c, d p< 0,001; e,f p< 0,001; g, h p< 0,001 Sistemas, medios y condiciones de cultivo Frente a los numerosos sistemas, medios y condiciones de cultivo - algunos de ellos presentados en este punto- se hace dificultosa una comparación de los resultados de los diferentes grupos de trabajo. Nosotros consideramos, en función de los resultados presentados, al sistema de co-cultivo con células de la capa granulosa como el más simple y exitoso en la producción in vitro de embriones. El nacimiento de 120 terneros y una tasa de preñez similar a la obtenida con la transferencia de embriones, producto de la superovulación, son considerados como una prueba de la calidad de los embriones producidos con este sistema. Tasas de preñez El objetivo de nuestro trabajo fue determinar qué tasas de preñez son esperables con la transferencia de embriones producidos in vitro, como así también evaluar el grado de sincronicidad más adecuado para obtener óptimas tasas de gestación. Las transferencias se llevaron a cabo a vacas sincronizadas con una sola aplicación de 500µg de cloprostenol (Estrumate®, Coopers), en presencia de un CL, o inducido con un dispositivo intravaginal impregnado con progesterona (PRID®, Ceva) durante 12 días. Los embriones fueron transferidos entre los días 5 y 8 de desarrollo (estro = día 0). La tasa de preñez obtenida con una asincronía embrión/receptora de -1 día fue significativamente mayor a la obtenida con una relación de +1 (REICHENBACH y col., 1991, tabla 6). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Producción in vitro de embriones 133 Tabla 6: Tasas de preñez con transferencia sincrónica y asincrónica de embriones producidos in vitro (REICHENBACH y col., 1992) Sincronicidad Embrión/Recipiente +1 0 -1 -2 Σ Transferencias n 30 47 52 4 133 Preñeces n 9 22 31 2 64 Preñez % 30a 47 60b 50 48 Valores con distintas letras difieren significativamente (p< 0,01) Los resultados obtenidos combinando el grado de sincronicidad embrión/receptora con la calidad del embrión transferido indican que la preñez esperable con embriones de calidad inferior es significativamente más baja (REICHENBACH y col., 1992; tabla 7). Estos resultados son similares a los que se encuentran con la transferencia de embriones obtenidos in vivo. Tabla 7: Tasa de preñez con embriones producidos in vitro según su calidad y sincronicidad con la receptora (REICHENBACH y col., 1992) Sincronicidad embrión/receptora Calidad del Embrión Muy buena Media Mala χ2, a,b: p< 0,05 Con el objeto de producir gestaciones melliceras se compararon las tasas de preñez obtenidas con la transferencia de 2 embriones en forma uni- y bilateral (BERG y col., 1991b). El celo de las receptoras (vaquillonas) fue sincronizado con una sola aplicación de 500µg de cloprostenol (Estrumate®, Coopers) en presencia de un CL o inducido con un dispositivo intravaginal impregnado con progesterona (PRID®, Ceva) durante 12 días. Mórulas y blastocistos fueron transferidos el día 6 ó 7 no quirúrgicamente en forma unilateral (n = 55) o bilateral (n = 94). No fueron encontradas diferencias entre las dos formas de transferencia posiblemente por que uno de los dos embriones empleados para la transferencia doble fue siempre de inferior calidad, con la intención de mejorar sus posibilidades de gestación (Tabla 8). En el grupo transferido en forma unilateral se observó una mayor tasa de aborto (p<0,05). Tabla 8: Tasas de preñez después de la doble transferencia uni- y bilateral de embriones producidos in vitro (BERG y col., 1991b) -1 % 63 (19/30) 65 (11/17) 20 (1/5) 0 % 47 (9/19) 50 (7/14) 38 (3/8) +1 % 38 (3/8) 30 (3/10) 25 (3/12) Σ 53 (33/61)a 51 (21/41) 26 (7/27)b Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 134 Berg & Reichenbach Transferencias n Unilateral Bilateral 55 94 P4>1,4ng/ml D21 % 55 (33)* 62 (58) Preñeces D35 % 49 (27) 53 (50) Abortos D36-250 % 33 (9) 14 (7) Gestaciones dobles % 33 (9) 42 (21) *( ) = número de animales Congelación de los embriones producidos in vitro. Tasas de preñez La congelación de los embriones producidos in vitro no parece arrojar los mismos resultados de preñez que cuando se emplean embriones producidos in vivo (LIEBRICH, 1991; tabla 9). Tabla 9: Preñez obtenida después de la transferencia de embriones congelados/descongelados con dos métodos (LIEBRICH, 1991) Embriones descongelados d6-7 n 109 139 transferidos d7 n % 36 29 52 33 21 producidos in vitro Receptoras preñadas (d35) n 16 12 31 % 44 41 60 Tratamiento A B Embriones frescos El grupo A fue sometido directamente a una solución de PBS, suplementada con 0,4% de BSA y conteniendo 1,37M de glicerina. Después de 20 minutos de equilibración a temperatura ambiente los embriones fueron envasados en pajuelas (0,25 ml) y éstas colocadas en un baño de alcohol a -7o C, momento en que se llevó a cabo el seeding. La curva de congelación se describió a 0,3o/min. hasta 32o C. La descongelación se llevó a cabo por medio de exposición de la pajuela al aire durante 5 seg., ésta fue sumergida posteriormente en baño María a 25o C durante 10 seg. más. En el grupo B la adición del crioprotector se hizo en 3 pasos: 0,34M, 0,69M y 1,37M de glicerina en PBS-BSA. Los procedimientos de congelación y descongelación fueron los mismos que para el grupo A con la diferencia que la glicerina fue extraída en 3 pasos: 0,90M glicerina + 0,30M sucrosa, 0,45M glicerina + 0,30M sucrosa y 0,30M sucrosa en PBS-BSA. La viabilidad obtenida en ambos grupos fue baja (2030%), sin embargo con los embriones descongelados, que fueron seleccionados para la transferencia, se alcanzaron tasas de preñez satisfactorias (40-44%). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Producción in vitro de embriones 135 Conclusiones El método descrito de producción in vitro de embriones permite disponer de un gran número de embriones bovinos en diferentes estadios de desarrollo, como lo indican los resultados en gran escala publicados actualmente (PALMA y col., 1993b). Los embriones producidos pueden ser destinados a la investigación, comercialización o ser sometidos a modernas técnicas de interés productivo como la producción de animales transgénicos y/o clonados. Frente a la obtención de embriones bovinos in vivo, por medio de superovulación, el método in vitro permite la estandarización de la producción, disminuyendo sensiblemente las variaciones en la producción de embriones. Posibilita la reducción del número de animales de experimentación y una permanente observación del proceso de desarrollo embrionario. El método abre además la posibilidad de producir embriones de vacas de alto valor genético, que por diversas razones son enviadas al matadero. En combinación con las exitosas técnicas de congelación se presentan nuevos aspectos en la conservación de reservas genéticas de razas de alto valor genético o en vías de extinción (capítulo XIX). Los primeros ensayos llevados a cabo por ARMSTRONG y col. (1991) y en nuestro laboratorio indican que es posible obtener ovocitos de vacas y terneras con ayuda de laparoscopia y producir a partir de ellos embriones transferibles. De esta forma es posible acortar el intervalo generacional considerablemente. La técnica de punción de los folículos con ayuda de sonografía o endoscopía transvaginal permite, desde hace poco tiempo, obtener ovocitos inmaduros de vacas con ciclos normales con intervalos de varios días. PIETERSE y col. (1991) lograron llevar a cabo hasta 3 punciones durante un ciclo estral. Ello indicaría la posibilidad de reducir el intervalo de obtención de embriones de manera considerable. REICHENBACH y col., (1993) reportaron la recolección de ovocitos por medio de aspiración folicular endoscópica. Los autores obtuvieron un promedio de 5-6 ovocitos por vaca y 3-4 por vaquillona semanalmente y una eficacia en el éxito de la recolección de 60-70% y 50-65% para vacas y vaquillonas respectivamente. De los ovocitos recolectados se obtuvo 20% de mórulas y blastocistos (PALMA y col., 1993, resultados no publicados), una tasa considerablemente menor comparada a la obtenida con ovocitos obtenidos de ovarios de vacas faenadas. La diferencia radica en que los ovocitos obtenidos in vivo no son seleccionados de acuerdo a su apariencia morfológica como en los programas convencionales de PIV. La repetibilidad con éxito y eficacia de la técnica de punción como así también una eficaz producción de embriones con los ovocitos recolectados aumentaría el número de embriones producidos (van der SCHANS y col. 1991) y se constituiría en un interesante complemento de los programas convencionales de núcleos de producción. Bibliografía AOYAGI, Y., FUKUI, Y. IWAZUMI, Y. URAKAWA, M., MINEGISHI, Y. and ONO, H. 1989. Effects of culture system on development of in-vitro fertilized bovine ova into blastocysts. Theriogenology, 31: 168. AOYAGI, Y., FUKUI, Y. IWAZUMI, Y. URAKAWA, M. and ONO, H. 1990. Effects of culture systems on development of in-vitro fertilized bovine ova into blastocysts. Theriogenology , 34: 749-759. ARMSTRONG, D.T., HOLM, P., IRVINE, B., PETERSEN, B.A., STUBBINGS, R.B., McLEAN, D., STEVENS, G.F. and SEAMARK, R.F. 1991. Laparoscopic aspiration and in vitro maturation of oocytes from calves. Theriogenology, 35: 182. 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Particularmente en el reino vegetal los clones son un fenómeno difundido, la papa es un ejemplo actual de una población clon. En el campo de la zoología se encuentran clones en forma natural tanto en organismos inferiores como en especies altamente desarrolladas como los mamíferos, aunque con limitaciones, dado que el número de individuos idénticos en estos casos es en general relativamente pequeño (mellizos o trillizos monocigotas, entre otros). En las especies vegetales los clones se originan a través de reproducción vegetativa. En las plantas, p. e. a través de los tallos, las yemas o regeneración de sus partes. En los mamíferos no existe esa via, sólo estadios embrionarios pueden constituir el punto de partida de los individuos monocigotas. De acuerdo a lo definido para el término clon se entiende el concepto clonar como: - En biología celular la unificación de las células con la posterior producción de cultivos celulares a partir de una sola célula. - En ingeniería genética la incorporación de un fragmento de ADN (gen) en un vector-clon y su reproducción clonada en una célula receptora adecuada. - En embriología la producción de embriones con idéntico genotipo. En el último caso y para los métodos empleados en los animales domésticos es preciso diferenciar entre: - División microquirúrgica de estadios embrionarios tempranos y el posterior desarrollo de las mitades obtenidas en fetos o individuos. - Combinación por medio de micromanipulación de estadios embrionarios asincrónicos, con el objeto de respaldar el desarrollo de blastómeros de estadios más avanzados con blastómeros de estadios más tempranos. A través de esta vía se pretende aumentar la producción de cuatrillizos hasta 5-8 individuos idénticos (quimera-clon). - Transferencia de núcleos y células embrionarias nucleadas (blastómeros) en células enucleadas para producir con un reclonado exitoso, en teoría, un número ilimitado de embriones e individuos idénticos (clonado embrionario). Experimentos en el campo del clonado se realizan hace más de 35 a os. La motivación en desarrollar esta línea de investigación básica resulta de la fascinación ante la posibilidad de lograr la llave de los conocimientos sobre la totipotencia celular y los procesos de desarrollo embrionario como así también el significado de esos factores sobre los efectos recíprocos entre el genotipo y el ambiente. Junto con ese interrogante básico de las ciencias genéticas y biológicas se encuentra también, desde la década del 80, el creciente interés de la genética animal en aquellos métodos y aplicaciones del clonado en los animales. Una de las razones del por qué los genetistas incluyen el clonado en sus proyectos se apoya en el problema que la evaluación genética, especialmente en rodeos bovinos, se Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Clonado de embriones 141 lleva a cabo con varios años de intervalo generacional y un número relativamente reducido de descendientes hembras. La variabilidad de la descendencia, a través de la recombinación génica, como producto de la reproducción sexuada, conduce en muchos casos a un potencial de selección heterogéneo y útil. La reproducción clonada permitiría sin embargo, variar los genotipos seleccionados como sobresalientes en forma directa y sin modificaciones. Técnicas de clonado División de los embriones Cuando estadios embrionarios tempranos son divididos, se desarrollan las mitades producidas con un determinado porcentaje de nacimientos. Las mitades que se desarrollan presentan, sin embargo, en estadio de blastocisto claramente menos células que aquellos embriones no divididos. Ello significa que la pérdida de masa celular no puede ser compensada, dado que no se continúa con un crecimiento compensatorio. La razón para ello es que a partir del momento de la fertilización de un ovocito se establece el plan de desarrollo, en el cual el número de divisiones celulares es establecido hasta alcanzar el estadio de blastocisto. Un embrión dividido tendrá en consecuencia tantas divisiones como las que hubiese tenido en su estado original. Si h-embriones son divididos para producir 4 embriones idénticos, el posterior desarrollo embrionario hasta el nacimiento se verificará sólo en casos excepcionales como consecuencia de la pérdida de masa celular. Parece evidente la existencia, en desarrollos embrionarios tempranos, de la conocida como masa celular crítica y que ésta no debe ser superada. Un blastocisto funcional puede continuar su desarrollo cuando esa característica está presente en su masa celular. Si esto no es así se originan vesículas trofoblásticas que se asemejan a los blastocistos, pero que carecen de la capacidad de desarrollarse, como consecuencia de una falla en la MCI. A través de la división de los embriones se logró producir en muchos casos descendencias con éxito. Sin embargo el número de individuos idénticos, a partir de un embrión, se mantiene limitado por las razones ya mencionadas, a 2 y en casos aislados a 4 como máximo. Por esa razón el método de división de embriones no es adecuado para producir un mayor número de embriones (BREM, 1986). El aislamiento y cultivo de blastómeros obtenidos de embriones en estadios tempranos puede también conducir al desarrollo de individuos idénticos. La tasa de desarrollo es sin embargo menor cuanto más avanzado es el estadio del embrión utilizado (MOORE y col., 1968), dado que el número de células del embrión producido es muy reducido. Clonado quimérico Para contrarrestar la reducción de la masa celular en el clonado se llevaron a cabo ensayos experimentales en las especies murina y ovina agregando un blastómero temprano a uno en estadio avanzado de desarrollo (blastómeros asincrónicos). Los blastómeros se desarrollan juntos en un blastocisto normal. Con la asincronía se pretendió formar el embrioblasto a partir del blastómero más desarrollado. Los blastocistos producidos de esa forma implantaron y se desarrollaron en forma normal (STERN y WILSON, 1972; FEHILLY y col., 1984; WILLADSEN, 1985). WILLADSEN y FEHILLY (1983) lograron producir quintillizos con ayuda del clonado quimérico en la especie ovina. Transferencia de núcleos en embriones La transferencia de núcleos celulares a partir de un embrión multicelular, a varias células receptoras posibilita la producción de embriones unicelulares que poseen el mismo genoma. Una condición para ello es que esa información genética sea empleada en la célula receptora (activación) y la división se inicie como en un ovocito fertilizado. Esta fase se denomina reprogramación. De esta forma, la división Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 142 Clement-Sengewald celular no continúa en el punto en que se detuvo el embrión donante sino nuevamente en el mismo nivel de un ovocito fertilizado. Núcleos de embriones tetraploides fusionados fueron obtenidos para producir embriones diploides y luego transferirlos a células receptoras. Los resultados mostraron una capacidad de desarrollo inferior de los embriones producidos, caracterizando ese tipo de clonado como ineficiente (CLEMENT-SENGEWALD y BREM, 1990). BRIGGS y KING llevaron a cabo en 1952 los primeros experimentos de transferencia nuclear en organismos multicelulares (anfibios) y observaron que una reprogramación de núcleos celulares de blástula, a través de ovocitos, es posible. Estudios posteriores indicaron que por medio de procesos de diferenciación avanzados del núcleo celular la reprogramación se pierde (GURDON y col., 1975). Como células receptoras de los núcleos celulares embrionarias en los mamíferos se adecuan ovocitos sin fertilizar -madurados in vivo o in vitro- que hayan alcanzado la metafase II de la 2. división meiótica separando el cúmulus que los rodea. En esas células, contrariamente a lo que ocurre con ovocitos fertilizados, pueden ser reprogramados núcleos indiferenciados de estadios embrionarios más tardíos. Para los trabajos experimentales en clonado de embriones bovinos se adecuan tanto los ovocitos madurados in vivo como in vitro. Por otra parte el empleo de ovocitos madurados in vitro es técnicamente más simple y económico, dado que los mismos son obtenidos de ovarios de matadero. La aplicación de diferentes clases de ovocitos madurados in vitro, uniformemente oscuros o uniformemente claros resultó en las mismas tasas de fusión y desarrollo embrionario (CLEMENTSENGEWALD y col., 1992a, tabla 1). Tabla 1: Resultados de fusión, activación y cultivo en 3 clases de ovocitos (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1992a) clase 1 2 3 pulsados 262 63 89 fusionados n % 194 546 76 74,0 73,0 85,3 cultivados n 187 45 74 activados n % 74 22 33 39,5 a 48,8 b 44,5 m.+b. 14 4 4 %/C 7,4 8,8 5,4 %/A 18,9 18,1 12,1 C: cultivados; A: activados; m. + b.: mórulas y blastocistos; a,b p<0,05 Dado que el ovocito no fertilizado cuenta con un número haploide de cromosomas, éste podría conducir, en interacción con el número diploide de cromosomas del núcleo, a la formación de embriones triploides. En consecuencia el genoma del ovocito debe ser separado del plasma celular. El mismo puede ser conducido junto con una mitad de la masa citoplásmica al interior de una zona pelúcida vacía (WILLADSEN, 1986). Los ovocitos resultantes, con o sin el ADN se emplean como células receptoras. Con este método se pueden desarrollar, sin embargo, sólo la mitad de los ovocitos como máximo, como consecuencia de la imposibilidad del desarrollo posterior del embrión triploide. Por otra parte la gran pérdida de citoplasma puede tener un efecto negativo sobre la continuidad del desarrollo del embrión producido (BONDIOLI y col., 1990). La particularidad que el ADN del ovocito madurado se encuentra próximo al corpúsculo polar, permite a través de un método de extracción mecánico, eliminar el genoma citoplásmico. El mismo se lleva a cabo aumentando, en primero lugar, la elasticidad celular con citocalasina B y aspirando el corpúsculo polar y el citoplasma contiguo (fotos 2 y 3) con una micropipeta. A través de esta operación es eliminado el ADN endógeno en la mayor parte de los ovocitos (92%, STICE y ROBL, 1988). La tabla 2 presenta los resultados obtenidos con la transferencia nuclear por medio de micromanipulación con ovocitos madurados in vitro. Tabla 2: Resultados de la manipulación de los ovocitos (CLEMENT-SENGEWALD y col. 1991) Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Clonado de embriones 143 Ovocitos metafase II n (%) 597 100 Enucleación Intactos Degenerados 585 98,0 12 2,0 Transferencia nuclear Intactos Degenerados 582 99,5 3 0,5 A través de la coloración del ovocito con el colorante para ADN (HOECHST 33342) es posible, bajo observación visual, controlar la enucleación y lograr una eficacia del 100% (PRATHER, 1989). Como donantes de blastómeros se emplean embriones con estadios de 4 células hasta mórulas. Junto con el empleo de embriones ex-vivo (obtenidos de un lavaje uterino) se emplean también ovocitos madurados in vitro (MI) en forma creciente como donantes de blastómeros (CLEMENT-SENGEWALD y col. 1990; SIMS y col., 1991). Hasta el momento se obtienen tasas similares de fusión y activación empleando ovocitos obtenidos in vivo o madurados in vitro. Sin embargo las tasas de desarrollo de los embriones clonados con ovocitos madurados in vitro es aún inferior a los ex vivo (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1992b, tabla 3). En los ensayos de WHITESELL y col. (1992) fue posible producir embriones in vitro de dos vacas sacrificadas. Los embriones producidos fueron empleados como donantes de blastómeros. Los autores pudieron producir 8 embriones de una vaca y de esos, 8 preñeces después de la transferencia nuclear. El clonado de 9 embriones de la segunda vaca resultó en 21 preñeces. Tabla 3: Comparación entre ovocitos madurados in vitro y obtenidos in vivo para su empleo en el clonado (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1992b) Embrión donante in vitro in vivo COBs a 182 112 fusionados b b/a 130 (71) 81 (72) cultivados c 102 81 divididos d d/c 60 (59) 37 (46) Σm+b e e/c 10 (10) 16 (20) c/d (16,6)a (43,2)b a,b p<0,01 COBs: complejos ovocitos/blastómeros, m+b: mórulas y blastocistos La aislación de los blastómeros, conteniendo un núcleo cada uno, puede llevarse a cabo por medio de disgregación del embrión con un medio libre de Ca2+y Mg2+ (STICE y ROBL, 1988), con la previa separación de la zona pelúcida por medios químicos o mecánicos. La aislación de los blastómeros se realiza sin dificultades por medio de aspiración con una pipeta. Además es posible aspirar el núcleo de un blastómero sin lesionar la membrana celular. De esta forma se obtiene una vesícula, rodeada por una membrana celular (carioplasto), conteniendo un núcleo (Mc GRATH y SOLTER, 1983a). En la actualidad el método de obtención del núcleo más empleado es la aspiración de un blastómero completo de un embrión multicelular (fotos 4 y 5). Para ello se emplea una pipeta con punta afilada a fin de atravesar la zona pelúcida (PRATHER y col., 1987). El empleo de pipetas de punta roma es posible si se practica una incisión en la zona a fin de facilitar el paso de la pipeta en el interior del espacio perivitelino hasta el blastómero (TSUNODA y col., 1986). La pipeta conteniendo el carioplasto es introducida en el espacio perivitelino de un ovocito previamente enucleado (fotos 6-7). Con ayuda de una ligera presión positiva se deposita el blastómero. En nuestros ensayos la transferencia de núcleos fue exitosa en 582 de 585 casos (99,5%). Después de la transferencia se provoca la fusión de las membranas. A través de la fusión se induce la formación de poros en las membranas celulares, de tal forma que se establecen pequeños canales entre el ovocito y el blastómero. A través de éstos puede circular el contenido de ambas células. Luego de la fusión de ambas membranas en contacto se incorpora el núcleo transferido en el citoplasma del ovocito receptor (fotos 10-12). La fusión puede ser Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 144 Clement-Sengewald provocada también por el virus Sendai inactivado (OKADA y col., 1957), que se inyecta en el espacio perivitelino junto con el blastómero. Este método fue utilizado hasta el momento en experimentos de transferencia de núcleos celulares en ratón (Mc GRATH y SOLTER, 1983b), ovino (WILLADSEN, 1986) y bovino (ROBL y col., 1987). La tasa de fusión en animales domésticos fue muy reducida. Otro método de fusión del blastómero con el ovocito es la electrofusión. Con pulsos eléctricos muy cortos e idénticos se provoca la desintegración de pequeñas porciones de la membrana celular en la zona de contacto entre el ovocito y el blastómero y en consecuencia la fusión de ambas membranas (ZIMMERMANN y VIENKEN, 1982; CLEMENT-SENGEWALD y BREM, 1989). En comparación con el método de fusión con el virus Sendai, la electrofusión se presenta como un método más efectivo, con una tasa de fusión de 90% frente a 50% en la especie ovina y 80% frente a 8% en la bovina. Nuestros ensayos de electrofusión indicaron que las tasas de fusión de los blastómeros obtenidos de embriones producidos in vitro son iguales a las obtenidas con blastómeros de embriones obtenidos in vivo (tabla 4). Tabla 4: Resultados de la fusión de blastómeros con ovocitos receptores por medio de pulsos eléctricos (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1991) Donantes de núcleos In vitro In vivo Suma COB n 312 249 561 Fusionados n % 230 189 419 73,7 75,9 74,6 No fusionados n % 38 38 76 12,2 15,3 13,6 Degenerados 44 22 66 14,1 8,8 11,8 Otra ventaja de la electrofusión es la activación del ovocito, mediante la cual se inicia la división celular. El mecanismo de esa activación es hasta el momento desconocido. Se supone, sin embargo, que la despolarización de la membrana del ovocito es similar a la que ocurre durante la fertilización normal y que la concentración intracelular de calcio es alterada como consecuencia de la formación de poros en las membranas plasmáticas (COLLAS y col., 1989). La tasa de activación es altamente dependiente de la edad del ovocito y del número, intensidad y duración del pulso eléctrico empleado, como así también del intervalo entre pulsos (COLLAS y col., 1989; KONO y col., 1989; WARE y col., 1989). Los embriones producidos luego de la micromanipulación son cultivados in vitro o in vivo hasta el estadio de M o B, para ser transferidos a hembras receptoras. El cultivo in vitro permite controlar el desarrollo del embrión. Para el cultivo in vivo se emplean hembras de la misma o diferente especie (conejo, ovino). Para el cultivo de embriones ovinos se emplean con frecuencia hembras de la misma especie. Los embriones recubiertos con agar son colocados en el oviducto (ROBL y col., 1987) y después de 5-6 d de cultivo son recuperados. Con el cultivo de los embriones bovinos en oviducto de coneja se obtienen los mismos resultados (WESTHUSIN y col., 1989). Dado que ese método es engorroso y caro los esfuerzos se concentran en el cultivo exclusivamente in vitro de los embriones producidos (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1990; SIMS y col., 1991). Para el cultivo in vitro se emplean sistemas de co-cultivo con células del oviducto (CO, CLEMENT-SENGEWALD y col., 1990; SIMS y col., 1991), células de la granulosa (CG) o medios condicionados con células de la granulosa (MCCG, CLEMENTSENGEWALD y col., 1991; tabla 5). Los resultados indican que hasta el momento, el co-cultivo con células del oviducto parece ser el más adecuado. De los embriones cultivados 7% alcanzaron los estadios de mórula y blastocisto, cuando embriones producidos in vitro fueron empleados como Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Clonado de embriones 145 donantes de blastómeros. Cuando fueron empleados blastocistos de embriones obtenidos in vivo se alcanzaron tasas de 16%. Tabla 5: Resultados del cultivo de embriones producto de la electrofusión con diferentes medios (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1991) Donante de blastómeros In vitro Sistema de cultivo CCO CCG MCCG In vivo CCO CCG Cultivados n 149 73 298 113 79 Activados n % 70a 28 99b 51c 19d 46,9 38,3 33,2 45,1 24,0 M+B n % 11e 2 19 18f 5g 7,3 2,7 6,3 15,9 6,3 McLAUGHLIN y col,. (1992) alcanzaron 20% de mórulas y blastocistos (28/128) cultivando los embriones clonados en un medio sintético (SOFM) sin sistema de co-cultivo. Después de la transferencia nació un ternero. Coincidentemente informaron NORTHEY y col., (1992) similares tasas de desarrollo de embriones clonados a las obtenidas con el co-cultivo con células de oviducto (20% y 28% respectivamente). El desarrollo de los embriones después de la transferencia nuclear permite emplearlos como donantes estableciendo un reclonado. A través del reclonado es posible en consecuencia, disponer teóricamente de un número ilimitado de núcleos celulares idénticos, si los embriones obtenidos son siempre empleados como donantes. En la práctica debe considerarse, sin embargo, que la tasa de desarrollo de los embriones producidos disminuye con el aumento creciente del reclonado (BONDIOLI y col., 1990; STICE y col., 1991). La razón de esto es desconocida, aunque posiblemente el motivo sea la falta de una óptima manipulación y de adecuadas condiciones en los cultivos. Fotos 1: pipetas de sostén (PS) y de inyección (PI) Foto 2: fijación del ovocito Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 146 Clement-Sengewald Foto 3: Extracción del corpúsculo polar y del Foto 4: Aspiración del blastómero citoplasma adyacente Foto 5: Aspiración del blastómero Foto 6: Colocación de blastómero en el ovocito receptor Foto 7: Colocación de blastómero en el ovocito Foto 8: Bastómero del embrión donante en el receptor esapacio perivitelino Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Clonado de embriones 147 Experimentos de clonado en animales de interés zootécnico Conejo BROMHALL informó en el año 1975 por primera vez sobre los ensayos de transferencia nuclear llevados a cabo en embriones de conejo. El genoma de los ovocitos receptores no fue extraído, produciendo embriones triploides. Los embriones donantes fueron mórulas. Sólo el 2,6% de los embriones producidos continuaron su desarrollo hasta el estadio de mórula. STICE y ROBL (1988) informaron el nacimiento de 6 conejos a partir de la transferencia de núcleos de embriones de 8 células a 164 ovocitos receptores enucleados. La tasa de sobrevivencia de los embriones logrados fue de 3,7%. Los 6 animales fueron gestados en 6 diferentes hembras. HEYMANN y col. (1990) informaron el nacimiento de 6 clones, en ese ensayo la tasa de sobevivencia fue de 3,9%, comparable con los resultados de STICE y ROBL (1988). Un año después COLLAS y ROBL lograron producir un clon séxtuplo con una tasa de sobrevivencia de los embriones de 7,2%. Porcino PRATHER y col. (1988) informaron sobre la primera gestación después de la transferencia de embriones producidos por medio de transferencia nuclear. A pesar que la gestación fue comprobada, hasta el día 59 no hubo nacimientos en ese ensayo. Un año después fue publicado el nacimiento de un lechón a partir de un embrión donante de 4 células (PRATHER y col. 1989) La tasa de sobrevivencia de los embriones manipulados fue muy baja (1,1%), 1 lechón vivo de 88 embriones transferidos. PROCHAZKA y col. (1990) emplearon ovocitos de cerdo madurados in vivo como receptores de blastómeros de embriones de 2 a 8 células. Los autores comprobaron que una parte de los ovocitos tuvo una buena capacidad de regular el normal desarrollo de los núcleos transferidos, la otra careció de esa capacidad. En las primeras 24 a 30h de cultivo in vitro se dividieron 12 de 16 embriones producidos, 1 embrión se dividió hasta el estadio de blastocisto (d 7). Recientes investigaciones indicaron que ovocitos porcinos madurados in vitro pueden ser utilizados como receptores de blastómeros (NAGASHIMA y col., 1992). Después del cultivo in vitro pudieron desarrollarse 11,9% de mórulas y blastocistos (TERLOUW y col., 1992). Ovino y caprino WILLADSEN informó en el año 1986 el nacimiento de 3 corderos, producto de la fusión de blastómeros de embriones de 8 células con ovocitos enucleados. Dos de 3 animales se originaron del mismo embrión (mellizos homocigotas). Ello llamó la atención en el mundo científico y desencadenó numerosos ensayos que sirvieron para el posterior desarrollo y transferencia de la técnica a otras especies domésticas. SMITH y WILMUT (1989) informaron el nacimiento de 4 corderos, producto de la transferencia de blastómeros de 16 células y de la MCI de un blastocisto en mitades de ovocitos enucleados. A través de este experimento los autores comprobaron que los núcleos pueden reprogramar una célula y regular el desarrollo normal del embrión producido. McLAUGHLIN y col. (1990) lograron comprobar el desarrollo de 4 hermanos clones el día 45 de la preñez a través de la técnica de ultrasonido. Los mismos fueron producidos transfiriendo blastómeros de embriones de 8 y 16 células. Actualmente es posible cultivar los embriones clonados hasta el estadio de mórula (PUGH y col., 1992). YONG y col. (1991) produjeron 2 cabras idénticas después de la transferencia de los blastómeros de un embrión de 32 células. La tasa de sobrevivencia en ese experimento fue de 21%. Bovino Las primeras transferencias de núcleos en esta especie fueron descriptas por ROBL y col. (1987). Los autores utilizaron ovocitos fertilizados como células receptoras, a las cuales se les extrajeron los pronúcleos con ayuda de centrifugación. Después de la transferencia de los blastómeros extraños en Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 148 Clement-Sengewald las células receptoras se desarrollaron 5 de los 38 embriones recuperados (17%) del oviducto de oveja hasta el estadio de M y B. Después de la transferencia de 2 blastocistos a hembras receptores se produjo el nacimiento de 2 terneros. La transferencia de núcleos de blastómeros de embriones de 2, 4 y 8 células a ovocitos receptores, fertilizados y enucleados resultó en la división hasta 2 y 4 células. Ese año el mismo grupo de investigación (PRATHER y col., 1987) informó el nacimiento de 2 terneros, resultado de la transferencia de núcleos de mórulas en ovocitos fertilizados y enucleados. En total fueron transferidos 19 M y B a 13 receptoras después de un cultivo previo en oviducto de oveja durante 4-5 días. En este trabajo llamó la atención que los ovocitos madurados in vitro mostraron un desarrollo significativamente menor hasta M y B que los ovocitos receptores obtenidos frescos 36h después del celo (BARNES y col., 1987). El cultivo in vivo de los embriones producidos a partir de la transferencia nuclear, en oviducto de oveja fue superior al cultivo in vitro en medio Tyrode con 3mg/ml de BSA, en el cual se obtuvieron como máximo estadios de 6 células después de un cultivo de 3 días. MAREK y col. (1990) observaron que el estadio del embrión donante de blastómeros (d 5, 5,5 y 6) no afecta la tasa de electrofusión. Sin embargo, después de la transferencia de los blastómeros de embriones de 6 días se desarrollaron más embriones a estadios de M y B (34,5%, después de un cultivo in vivo) que con embriones donantes de 5 días. STICE y col. (1991) observaron que con el reclonado tanto las tasas de fusión (66%, 60%, 52% y 54%) como las tasas de desarrollo hasta los estadios de mórula y blastocisto (20, 10, 19 y 12%) disminuían con el aumento del reciclaje desde el primer clonado al tercer reclonado respectivamente. Mientras se llevaban a cabo los ensayos con embriones donantes de blastómeros, obtenidos in vivo, de los cuales los embriones clonados eran cultivados en oviducto de oveja, CLEMENT-SENGEWALD y col. (1990) y SIMS y col. (1991) describían el empleo de embriones producidos in vitro como donantes de blastómeros y el cultivo in vitro de los embriones clonados. Con el empleo simultáneo de ovocitos receptores madurados in vitro, por ambos grupos de trabajo, se comprobó la posibilidad de producir embriones clonados hasta estadios transferibles in vitro. El grupo de trabajo de BONDIOLI (1990) informó sobre numerosos ensayos de transferencia de núcleos. Para ello fueron empleados sólo ovocitos obtenidos in vivo después de la extracción y lavaje del oviducto de vacas superovuladas. Los embriones donantes fueron obtenidos entre el dia 5 y 6,5 por medios no quirúrgicos (estadio de 16-64 células). Después de la transferencia nuclear, los embriones producidos fueron cultivados transitoriamente en oviducto de oveja y transferidos a vacas receptores (sincrónicas) en estadios de M y B. Después de la transferencia de 337 embriones fueron diagnosticadas, el día 42, 79 gestaciones (23,4%). Después de la transferencia de 62 M y B, producidos con blastómeros de embriones descongelados, se diagnosticaron (d 42) 10 animales preñados (16,1%). Cuando los embriones fueron congelados/descongelados y empleados para el reclonado se lograron sólo 3 (13,0%) gestaciones de 23 embriones (d 42). En promedio se obtuvieron 22,5% de gestaciones (106 preñeces de 463 embriones). De esas gestaciones se obtuvieron 92 terneros vivos. De un embrión donante se pudieron lograr como máximo 8 gestaciones (d 42). Siete toros fueron idénticos. Cuando los embriones producidos no fueron cultivados en oviducto de oveja sino in vitro se dividieron 13% de los embriones hasta M y B. Después de la transferencia de esos 11 embriones se obtuvieron 3 terneros vivos. WILLADSEN y col. (1991) alcanzaron 42% de preñez (d35) y 38-33% de nacimientos (100 terneros). Llamó la atención en un número importante de terneros el elevado peso y los problemas de parto como consecuencia de ello. Se requirió asistencia en 84% de los partos. WILLADSEN y col. (1991) produjeron 13 clones de un par de mellizos idénticos cada uno, 10 clones trillizos y 5 clones con 4 hermanos idénticos. El mayor clon bovino lo constituyen 7 toros vivos (BONDIOLI y col., 1990). Hasta el momento nacieron terneros del primer clonado y tercer reclonado (STICE y col., 1991). Se describó también la gestación de clones de embriones donantes congelados/descongelados y con subsiguiente reclonaje (BONDIOLI y col., 1990). Los resultados más importantes de los experimentos de clonaje en el bovino se resumen en la tabla 6. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Clonado de embriones 149 Tabla 6: Resultados obtenidos en los experimentos de clonado in vivo in vivo 72 in vivo 24 463 92 19 7 in vivo in vivo S.r in vivo S.r. (302 transferencias) 100 (33) 4 11 33 28 in vitro in vitro 66 in vitro in vitro in vitro 80 in vitro in vitro in vitro in vitro Origen del embrión donante Origen de los ovocitos Tasa máxima de fusión (%) Cultivo m & b obtenidos (%) Embriones transferibles (n) Terneros nacidos (n) Sobrevivencia embrionaria (%) Tamaño máximo del clon Estadio del embrión donante de núcleos Fuente 16-64bl. BONDIOLI y col. (1990) 8-64bl. WILLADSEN y col. (1986) CLEMENTSENGEWALD y col. (1990) SIMS y col. (1991) NORTHEY y col. (1992) S.r = Sin referencias; m & b: mórulas y blastocistos Perspectivas No obstante que en conejos la tasa de ovocitos/blastómeros fusionados en los experimentos de HEYMAN y col. (1990) fue de 91,5%, es necesario mejorar la tasa de fusión en las otras especies, como por ejemplo en el bovino. BONDIOLI y col. (1990) informaron la fusión de cerca de 70% de los ovocitos/blastómeros sometidos a pulsos eléctricos. Las tasas de fusión parecen ser más altas empleando estadios embrionarios tempranos como donantes de blastómeros (SMITH y WILMUT, 1989). Ello puede ser consecuencia de la diferencia de tamaño de los blastómeros. Un blastómero grande inyectado bajo la zona pelúcida será presionado con fuerza contra la membrana celular y la superficie de contacto será mayor, estos aspectos facilitan el proceso de fusión después de aplicados los pulsos eléctricos. A partir de un determinado estadio del embrión donante de blastómeros parece que la diferencia de tamaño no juega un rol de importancia. Las tasas de fusión de embriones de 5, 5,5 y 6 días obtenidas por MAREK y col. (1990) no presentan diferencias. El agregado de citocalasina B en el medio en el cual son colocados los complejos ovocito/blastómero después del pulso eléctrico, puede aumentar la tasa de fusión en embriones ovinos (SMITH y WILMUT, 1989). En el bovino no ha podido ser comprobado ese efecto (LEVANDUSKI y WESTHUSIN, 1990). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 150 Clement-Sengewald Tasa de activación La división de los ovocitos sin fertilizar puede provocarse por medio de diferentes estímulos. Este proceso se define como activación partenogenética. Como estímulos pueden servir: etanol, Ca2+, Mg2+-ionóforo o pulsos eléctricos. La activación partenogenética de los complejos ovocitos/ blastómeros después de la transferencia nuclear es necesaria, porque la activación natural del ovocito a través del espermatozoide falta. Dado que los procesos intracelulares que se originan a través de la activación no son conocidos, deben establecerse estudios futuros para esclarecer estos fenómenos. Solo entonces será posible determinar en qué momento la mayor parte de los ovocitos responderá al estímulo partenogenético y de que manera deberá ser modificado el estímulo para lograr mayores tasas de activación. Estadios del embrión donante de blastómeros Para los trabajos de clonado se destinan embriones donantes en un estadio avanzado, con el fin de obtener un mayor número de núcleos idénticos. A partir de un estadio embrionario determinado no es posible reprogramar los núcleos. Su diferenciación celular es irreversible. En el futuro deberá precisarse el momento exacto de la diferenciación nuclear. Los estadios más avanzados con los cuales se pudieron lograr animales vivos se describen en la tabla 7. Los resultados de WILLADSEN en ovinos fueron superados por SMITH y WILMUT (1989) a través de la transferencia de blastómeros de la MCI de blastocistos en ovocitos ovinos con el nacimiento de corderos. No puede ser descartado el empleo con éxito de estos estadios en todas las especies animales. Cuando se aclare el mecanismo exacto de la diferenciación nuclear existirá la posibilidad de trabajar para invertirlo o diferirlo. Estadio de los blastómeros Llama la atención en la transferencia de núcleos, que una parte de los blastómeros del mismo embrión puede ser reprogramada por el ovocito. La otra parte no sigue ese proceso. Como consecuencia de ese comportamiento heterogéneo puede concluirse que sólo blastómeros de un estadio determinado son adecuados para la transferencia. Estudios futuros deberán determinar cuál es ese estadio, como pueden sincronizarse y mantenerse en el mismo. Tabla 7: Eficacia de los pasos metodológicos, sobrevivencia de los embriones y tamaño de los clones (número de animales vivos) de trabajos experimentales con embriones de animales de interés zootécnico ESPECIE leporina porcina ovina caprina Enucleación (%) 100 74 75 s.i. Fusión (%) 91,5 82 90 51,1 E transferidos 207 88 4 48 Animales nacidos 8 1 3 10 (n) Sobrevivencia (%) 3,9 1,1 75 20,8 número de células del donante 32 4 8 2-32 Fuente s.i. = sin información HEYMAN y col (1990) PRATHER y col. (1989) WILLADSEN (1986) YONG y col. (1990) Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Clonado de embriones 151 Cultivo de los embriones clonados A través de mejores condiciones in vitro es posible obtener una mayor tasa de M y B. Con la transferencia de estos estados avanzados es posible mejorar considerablemente las tasas de preñez y con ello la eficacia de un programa de clonado. Ello permitiría excluir aquellos embriones que se ven intactos después de las primeras divisiones pero que no alcanzan los estadios de mórula o blastocisto. Con el reemplazo del cultivo temporal in vivo de los embriones clonados en receptoras intra- o ínter específicas a través del cultivo in vitro pueden evitarse las pérdidas en la recolección de los embriones. Con la modificación de las condiciones del cultivo toman importancia los cultivos "monolayer" (monocapa de células granulosas y de oviducto) o cultivos de suspensiones (células de oviducto) y la aplicación de medios condicionados de células de granulosa u oviducto. Después del mejoramiento de los pasos metodológicos del clonado y del aumento del número de animales idénticos puede estudiarse el efecto de la unión del plasma celular del blastómero con el ovocito (Cybrid). Ello puede ser importante porque no sólo existe ADN en el núcleo sino también en el citoplasma (mitocondrias). Ello puede hacer necesario que para la producción de individuos matroclin homocigotas deban emplearse, junto con los blastómeros de un mismo embrión también ovocitos de una misma vaca. Existe la posibilidad que los blastómeros posean diferente información genética como consecuencia de mutaciones numéricas o estructurales de los cromosomas durante la división celular. El desarrollo del clonado de embriones dependerá en el futuro del desarrollo de los biométodos asociados como la congelación o vitrificación de los embriones, la producción de embriones como donantes potenciales de blastómeros, el desarrollo de medios de cultivo in vitro como así también de la transferencia de los embriones. Sólo la asociación del reclonado, congelado y transferencia no quirúrgica de los embriones hace posible la intensificación del aprovechamiento de animales de alto valor genético. Resumen de los pasos metodológicos del clonado de embriones 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Maduración in vitro de los ovocitos, obtenidos de ovarios de matadero, en MPM + 20 % de SVC + FSH durante un mínimo de 20 h. Eliminación de las células del cumulus con Tripsina/EDTA (0,1/0,2%) y una pipeta fina (170 µm). Montaje de la unidad de micromanipulación. El medio de micromani-pulación debe contener Citocalasina B (5 g/ml). Pretratamiento de 10 a 15 de los ovocitos denudados durante 10 min. en medio conteniendo Citocalasina B (5 g/ml). Transporte de los ovocitos tratados a las gotas de manipulación. Enucleación del ovocito, eliminando el corpúsculo polar y el citoplasma adyacente. Enucleación del primer grupo de ovocitos. Colocación del embrión donante de núcleos en la gota de manipulación. Después de 5-10 min., comenzar entonces con la recolección de los blastómeros. Fijar el embrión donante y aspirar un blastómero con la pipeta de enucleación. Fijar un ovocito enucleado e inyectar el blastómero en el espacio perivitelino (emplear el mismo orificio de la zona pelúcida). Repetir el procedimiento con los otros ovocitos enucleados. Transportar el complejo ovocito-blastómero en medio sin Cito B. Recomenzar con un nuevo grupo a partir del punto 4. Montaje de la unidad de electrofusión. Trasladar un máximo de 10 a 15 complejos ovocitos-blastómeros al medio Zimmerman de fusión celular, esperar por lo menos 5 minutos. Colocar un máximo de 2 complejos en la cámara de fusión. Orientación manual de los complejos (superficies de contacto blastómero/ ovocito paralelas a los electrodos). www.reprobiotec.com Biotecnología de la Reproducción 152 Clement-Sengewald 19. 20. 21. 22. Descarga de los pulsos de fusión. Colocación de los complejos tratados en MPM + 20% SVC o TL Hepes. Evaluación del resultado de la fusión después de 30 a 60 minutos. Cultivo de los complejos fusionados en medio condicionado o en cultivos celulares (cultivo de células de la granulosa u oviducto). Bibliografia BARNES, F.L., R.S. PRATHER, J.M. ROBL y FIRST, N.L. 1987. Multiplication of bovine embryos. Theriogenology, 27: 209. BONDIOLI, K.R., M.E. WESTHUSIN y LOONEY, C.R. 1990. Production of identical bovine offspring by nuclear transfer. Theriogenology 33, 165-174 BREM, G. 1986 y 1990. 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Sin embargo es posible pronosticar que el futuro de la producción animal será afectado directamente y que los métodos de la producción animal convencional serán complementados y posiblemente también parcialmente reemplazados (ver capítulo XIX). Transferencia de genes significa transferencia e integración del ADN recombinado in vitro y su estructura acoplada al genoma del receptor. Si la estructura de ADN se integra en el genoma del receptor, éste se denomina transgénico. El producto de ese transgen, una proteína codificada por el ADN transferido, es el producto transgénico. Con la ayuda de la transferencia de genes se pretende lograr que una determinada cualidad en el organismo receptor sea modificada o una nueva sea incorporada. Además se espera que el transgen integrado en el genoma sea transmitido a la herencia a fin de establecer una línea transgénica. En la extensa definición original sólo se habla de animales transgénicos cuando se comprueba que el transgen se hereda en forma estable y se exprime. Pero en la actualidad se ha establecido en el lenguaje cotidiano emplear el término: animal transgénico a partir del momento en el cual se puede comprobar la presencia del nuevo gen en un individuo, al cual se ha practicado la transferencia génica. Por otra parte en producción animal la transferencia de genes es sólo interesante cuando la estructura génica es transmitida a la descendencia, de forma tal de establecer líneas transgénicas en la población. El ADN recombinado en las estructuras génicas puede tener origen en los más variados organismos donantes, debido a la uniformidad en la estructura básica de la doble cadena de ADN. Junto con el ADN procariótico de origen viral o bacteriano el ADN de los organismos eucarióticos representa una fuente inagotable para la transferencia génica. No debe olvidarse, sin embargo, que especialmente para la expresión de transgénicos pueden establecerse fuertes interacciones dependientes del origen y del receptor del ADN. Fue observado, por ejemplo, que la expresión de las estructuras génicas que contienen aún componentes procarióticos, puede ser reducida o incluso suprimida en animales mamíferos. Además se ha observado que es de gran importancia para la expresión si los componentes estructurales del gen son de origen genómico o provienen del ADNc. De esa forma puede observarse que de los trangenes que contienen intrones se produce en promedio 10-100 veces más ARNm que de transgenes que contienen solamente ADNc (BRINSTER y col., 1988). A continuación se hará referencia exclusivamente a la producción de bovinos y otros animales transgénicos de interés productivo y no a la transformación genética de células procarióticas o eucarióticas. Con la producción de un organismo transgénico se pretende que el transgen esté presente en todas las células somáticas y sobre todo también en las células reproductivas del animal. Dado que no existe hasta el momento método alguno que permita transformar en forma completa un organismo ya formado genéticamente, se practica la transferencia génica tan temprano en el desarrollo del animal como es posible. El momento más apropiado es el estado embrionario temprano, es decir el estadio unicelular (ovocito fecundado = cigoto), con poco número de células (blastómeros) o en los estadios de mórula o blastocisto como máximo. Ello significa que los métodos de obtención, manipulación y Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 156 Brem & col. transferencia de esos estadios tempranos deben estar establecidos y disponibles en las especies mamíferas. Se disponen en la actualidad de varios métodos prometedores de transferencia génica. Los tres más importantes son: - La microinyección de ADN en el pronúcleo del cigoto - La transferencia de ADN a través de vectores retrovirales - Producción de quimeras transgénicas a partir de células y embriones transformadas genéticamente. La técnica más empleada en la actualidad es sin dudas la microinyección de ADN. a pesar de que las otras dos cuentan, junto a algunas limitaciones, con una serie de ventajas no despreciables. Lamentablemente la técnica que emplea células embrionales primordiales no fue desarrollada aún y la aplicación de vectores retrovirales lo es en forma muy incompleta como para ser utilizadas en los animales domésticos. El camino más próximo para la transferencia de ADN en el núcleo celular es la microinyección directa de una solución de ADN en el citoplasma del núcleo o en el pronúcleo (foto 1). GORDON y col. (1980) indicaron por primera vez que la microinyección de una solución de ADN en el pronúcleo es un camino practicable para la transferencia génica en mamíferos. Después de la microinyección de ADN clonado en el pronúcleo de ovocitos fertilizados de ratón fue posible encontrar esas secuencias virales en partes desarrolladas de los fetos. Poco tiempo después se indicó, en otros trabajos, que genes eucarióticos intactos podían incorporarse a los fetos. Fue posible establecer también la presencia del transgen en animales adultos como así también la transmisión a la descendencia. En la actualidad la técnica de producción de ratones transgénicos fue introducida con éxito en muchos laboratorios y se pusieron en práctica estudios para determinar la regulación de la expresión génica y el efecto biológico del gen. Como ya fue mencionado, la microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos o en los núcleos de embriones bicelulares es el método de elección para la transferencia génica en los animales domésticos. La amplia experiencia obtenida en experimentos con ratones constituyó sin duda una base adecuada para el desarrollo de la técnica en los animales de interés zootécnico. Debe aclararse, sin embargo, que debido al desigual desarrollo embrionario temprano y especialmente a la diferente morfología de los embriones de animales domésticos se produjeron algunos problemas. Por ejemplo, las estructuras nucleares de las especies bovina, porcina y hasta cierto grado de la ovina y caprina no pueden ser observadas con el microscopio o sólo con dificultad debido a los gránulos citoplasmáticos oscuros. Para la observación del núcleo los embriones ovinos requieren un microscopio de interferencia según NOMARSKI, los embriones bovinos y porcinos deben ser centrifugados para exponer el núcleo. Tampoco se contaba con suficientes conocimientos prácticos sobre como se debía establecer el tiempo óptimo para la obtención, microinyección y transferencia de los embriones para contar con las mejores posibilidades en el éxito de la transferencia génica. La producción de mamíferos transgénicos puede dividirse básicamente en 6 fases: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Clonado de las estructuras génicas y producción de la solución inyectable de ADN. Preparación de los animales donantes y obtención de los ovocitos o embriones. Exposición de los pronúcleos y microinyección del ADN. Transferencia de los embriones inyectados al oviducto o, después de un cultivo temporal, al útero de receptoras. Comprobación de la integración en los animales nacidos y, si es posible, primeras evaluaciones de la expresión del transgen en los niveles de trascripción (ARN) y translación (proteína). Producción de descendencia transgénica por medio de métodos convencionales y evaluación de eventuales mutaciones presentes a través de la formación de líneas homocigotas (test de homocigosis). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Animales transgénicos 157 Hasta el momento se sabe que, en principio, toda molécula de ADN puede microinyectarse en el genoma de un mamífero. El largo del fragmento de ADN a introducir por medio de los vectores de clonado no debe superar el límite máximo de 50 kb (clones cosmidios). En otros numerosos experimentos de transferencia génica se demostró que es posible alcanzar fragmentos mucho más largos. De esta forma no es raro observar, en animales transgénicos, fragmentos de varios 100 kb o aún más de 1 000 kb de largo, como consecuencia de la concatemerización de los fragmentos inyectados. Evidentemente la inyección de ADN lineal conduce a tasas superiores de integración. En cambio moléculas con forma de espiral o "supercoiled" parecen integrarse con una frecuencia significativamente menor (BRINSTER y col., 1985). También es mejor cuando los fragmentos de ADN no son cortados romos ("blunt") sino cuando conservan terminales sobresalientes. Las soluciones de ADN para microinyección deben estar absolutamente libre de partículas contaminantes, para evitar el taponado de la pipeta de microinyección o la lesión de los cigotos inyectados. Ello establece que todas las soluciones deben ser filtradas (filtros de 0,2 µm) y que todos los recipientes, con los cuales el ADN toma contacto deben ser enjuagados previamente con agua filtrada. Sólo en casos aislados se inyecta la totalidad del vector, dado que ADN procariótico puede provocar problemas de expresión. Después de la restricción el vector y el ADN de inserción son separados, en la regla, por medio de electroforesis. El fragmento deseado es aislado del gel, lavado y colocado en una solución buffer. Inmediatamente después se establece la concentración de ADN de tal manera que por cada pl (10-12) estén contenidos, según la aplicación, varios cientos de copias de la estructura génica. En fragmentos de ADN un largo de 5-8 kb corresponde a una concentración de 1-2 µg de ADN/ml. No fue encontrada una correlación entre cantidad del ADN inyectado y el número de copias integradas. La solución preparada de ADN se fracciona y conserva por medio de congelación (BRENIG, 1987). La frecuencia de integración en la producción de mamíferos transgénicos es influenciada por: la pureza, la forma, el tipo de terminales, la concentración y la solución buffer del ADN. De ello se concluye que ya durante la preparación de la solución de inyección del gen, se establecen importantes condiciones para el éxito de la transferencia génica. Recolección de los embriones Los animales donantes son tratados con gonadotrofinas, con diferentes programas de superovulación según la especie, inseminados o servidos dos veces. La obtención de los cigotos se lleva a cabo a través del lavaje del oviducto en un lapso de 12-24h después de la inseminación. El lavaje de oviducto puede llevarse a cabo mediante cirugía con el animal en narcosis o después del sacrificio. Debe tenerse especial cuidado, que el oviducto sea seccionado del cuerpo del animal dentro de los 15 min de desangrado. Los oviductos son lavados con una solución de PBS. Con ayuda de una lupa estereoscópica se aíslan los ovocitos o embriones de la solución obtenida del lavaje y se colocan en medio fresco. Las células del cumulus, que eventualmente pudiesen quedar adheridas, pueden eliminarse con un tratamiento de hialuronidasa o por medio de pipeteo. Los embriones son cultivados in vitro hasta el momento de la inyección. La eficacia de los programas de transferencia génica con animales domésticos es, en promedio, claramente menor que con el ratón. Como se puede observar en la tabla 1 ello se debe al bajo número de cigotos que pueden inyectarse por donante, a las bajas tasas de preñez y sobrevivencia embrionaria y a la menor frecuencia de integración. Para la producción de un animal transgénico se deben emplear, en general, más donantes y receptoras de animales de interés zootécnico que con ratones o conejos. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 158 Brem & col. Microinyección de ADN Para la microinyección es necesario contar con una mesa de trabajo estable. El lugar de trabajo comprende un microscopio invertido, dos micromanipuladores para las pipetas de sostén y de inyección y un aparato de inyección. La presión de inyección puede ser regulada con ayuda del aparato de inyección accionado por medio de un pedal. Sobre la platina del microscopio se encuentra una cámara de inyección que contiene el medio y los embriones a tratar. Los embriones bovinos y porcinos son centrifugados 3 min a 15 000 g (WALL y col., 1985). A través de la centrifugación se desplazan los gránulos citoplasmáticos oscuros hacia un polo, los núcleos y pronúcleos se hacen visibles en el medio del embrión. Tabla 1: tasas de éxito en programas de transferencia génica en diferentes animales de experimentación e interés productivo Especie Embriones inyectados por donante (S) Número de receptoras por cada donante (E) % Preñez % Animales nacidos/ embriones inyectados % de integración (animales transgénicos/ animales nacidos) % Animales transgénicos/embriones inyecta-dos y transferidos Número de animales necesarios (S+E) por c/animal transgénico murina 15 leporina 20 porcina 20 ovina 4 bovina 7 2 60 10-20 2 50 10 2 50 5-8 1,5 40 15 1 30 10 15 10 10-15 5-10 5-10 2 1 0,5 0,5-1 0,5 10 15 20 40 40 A pesar de ese tratamiento la inyección de esos embriones es más difícil que la de embriones de ratón o conejo. Para la inyección se fija el embrión mediante vacío a la pipeta de sostén de tal forma que el (pro-) núcleo se haga bien visible. La pipeta de inyección tiene un diámetro de 1 a 2 µm y es llenada con la solución de ADN. Para la inyección, la pipeta es introducida por medio del micromanipulador a través de la zona pelúcida, la membrana celular y (pro-) nuclear. La inyección con un volumen de 1-2 pl de la solución de ADN aumenta el volumen del núcleo más del 50%. Transferencia de los embriones Después de un cultivo temporal, los embriones inyectados son transferidos mediante cirugía a oviductos de receptoras sincronizadas. La sincronización de las receptoras se lleva a cabo a través de un Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Animales transgénicos 159 tratamiento hormonal específico de especie. Antes de la transferencia de los embriones tratados se controla la reacción ovárica de la hembra receptora. Sólo son empleadas aquellas receptoras que respondieron al tratamiento hormonal con el número adecuado de folículos, que depende de la especie tratada. En la especie bovina se procede a cultivar los embriones in vivo o in vitro durante varios días, a fin de evitar la trabajosa intervención de la transferencia al oviducto (BERG y BREM, 1989). La finalidad es cultivar los embriones de una o dos células hasta el estadio de mórula y transferir éstas directamente en el útero de las receptoras. Para el conejo, cerdo, oveja y cabra el cultivo intermedio no es necesario, dado que en esas especies incluso la transferencia uterina se lleva a cabo mediante cirugía. Comprobación de la integración y la expresión Después de la transferencia génica sólo es posible en casos aislados determinar la integración del gen a través de cambios de fenotipo en los animales nacidos. Incluso aún cuando la estructura génica empleada permita esperar algún efecto, debe llevarse a cabo la comprobación de la integración del gen presente independientemente del fenotipo. Ello se debe a que la estructura génica integrada no siempre se exprime en los animales positivos. Para la comprobación de la integración génica se disponen de varios métodos. El material de evaluación lo constituyen células con núcleo, que se toman de los órganos o fluidos corporales. Normalmente se toman las pruebas del tejido de la punta de la cola o de la sangre. De ellas se aisla el ADN, que no requiere que sea especialmente de alto peso molecular, como lo es en el caso de los bancos de reservas genómicas. La lisis completa del tejido se logra a través de un tratamiento con proteinasa K-buffer a 55 C. La extracción se logra con cloroformo fenolado. Con acetato de Na y etanol se provoca la precipitación que aumenta con la centrifugación. Inmediatamente después se determina la concentración con ayuda de un espectrofotómetro, a partir de alícuotas diluidas. La exacta y más segura comprobación de la integración de las estructuras génicas se puede llevar a cabo por medio del método Southern-Blot. Aproximadamente 20-30 µg de ADN genómico de alto peso molecular es hidrolizado completamente con enzimas de restricción adecuadas. Después de la división, la mezcla de fragmentos de ADN es separada electroforéticamente en gel-agarosa horizontal. Un marcador aplicado al mismo tiempo permitirá la determinación del tamaño de los diferentes fragmentos de ADN. Los fragmentos separados son transportados a filtros de celulosa o a membranas de Nylon según el método de SOUTHERN (1975). El ADN, separado en el gel de agarosa, es transportado después de la desnaturalización alcalina- a la nitrocelulosa o membrana de nylon que se encuentran directamente sobre agar por medio de capilaridad con ayuda de un buffer de transferencia. Con ADN genómico, el Blot puede terminar al cabo de 10-16 h. El tiempo de transferencia de ADN puede reducirse a menos de una hora con aparatos de vacío o de electro-Blotting. En un método rápido de evaluación de un número grande de pruebas de ADN se transporta una alícuota de ADN desnaturalizado y lavado en forma grosera, a una membrana soporte bajo presión negativa e inmediatamente después se híbrida con una prueba marcada radioactivamente. Con el método descrito por BRENIG y col. (1989) puede comprobarse la estructura génica en el ADN del animal hospedador en 25-30 h. Con el reemplazo de la marcación radioactiva por un método de luminiscencia química puede ahorrarse más tiempo. Después de la desnaturalización y neutralización se continúa la transferencia de los fragmentos separados del gel al filtro de nitrocelulosa. Los fragmentos de ADN utilizados en la prueba son marcados radioactivamente. Ello puede llevarse a cabo mediante translación "nick" u oligopriming. Los filtros de nitrocelulosa son pre-hibridizados con ADN no específico e hibridizados posteriormente con ADN radioactivo. Después de un lavado astringente abundante, los filtros son expuestos a un film Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 160 Brem & col. radiográfico con una película reforzadora durante un tiempo determinado a 80o C. Una alternativa al uso de sustancias radioactivas es la aplicación de dUTP biotinilado (LANGER y col., 1981) para el marcado de fragmentos. Biotina tiene una fuerte afinidad a la avidina, la cual por su parte puede acoplarse a indicadores adecuados (anticuerpos, enzimas, colorantes). De esta forma se pueden identificar también las cantidades más pequeñas de complejos biotina/ADN. En el método Southern-Blot la elección de la o las enzimas y de las pruebas de hibridación tiene una importancia definitiva. En los casos más adecuados hay una enzima cuyos dos lugares de división en la estructura génica están separados entre si en forma suficiente para usar el fragmento ubicado entre medio como grupo de hibridación. Si para la división del ADN se emplean los lugares de corte marginales, en los cuales el fragmento fue separado del vector, aparecen en el análisis Southern-Blot, junto con el o los fragmentos esperados con el tamaño correspondiente a la estructura génica, dos fragmentos en lo general más largos. El análisis de patrones ("pattern") de tal naturaleza permite sacar algunas conclusiones sobre la integración. Se sabe que, en muchos animales transgénicos, no sólo se integra una copia de la estructura génica inyectada. Varias copias son frecuentes en dependencia de los lugares marginales, concatómeros unidos al genoma en forma de "head to tail", "head to head" o "tail to tail". De la misma forma no es un fenómeno extraño que se pierdan algunas bases en terminales sobresalientes de los fragmentos, durante la integración. De esta forma desaparecen los lugares de división en los terminales 5'-3'- en los fragmentos integrados de ADN. Si se divide el ADN genómico con enzimas de restricción, que cortan al final de la estructura génica, se separan los concatómeros del interior del fragmento de ADN en forma precisa y esperada. Sin embargo, dado que los lugares de corte en las terminales se pierden, se originan en las posiciones 5'-3'- fragmentos más grandes. Ello es así porque en ambas copias marginales del genoma se encuentran aún las secuencias hasta los próximos lugares de fragmentación en la cadena de ADN, apropiados para las enzimas de restricción. El largo de esas copias génicas marginales es casual y depende de la presencia de lugares de división adecuados en la zona de integración del ADN genómico. En casos relativamente escasos la integración de la estructura génica se produce no solamente en un lugar sino en dos o más. En casos favorables puede comprobarse su existencia por medio de análisis Southern-Blot. Con frecuencia esto no se logra en el primer animal receptor, pero sí después de la segregación del transgen en la descendencia. Se supone que para la expresión de las estructuras génicas la pérdida de bases marginales en general no tiene importancia. Si se emplean en la transferencia génica secuencias homólogas, es decir fragmentos de ADN provenientes de la misma especie, el análisis Southern-Blot debe planearse cuidadosamente. En esos casos la comprobación específica de la integración génica sólo es posible mediante la correcta selección de adecuadas enzimas de restricción, de lo contrario la diferenciación entre el ADN endógeno y el transferido es difícil. Dado que, sin embargo, sólo en casos excepcionales se elige el mismo orden de regiones no trasladadas promotoras y estructurales del gen y del genoma, se adecuan especialmente los lugares entre ambos genes como pruebas de hibridación. A pesar de ello ocurren también en esos casos señales a través de la hibridación cruzada de las pruebas con secuencias genómicas, que deben ser consideradas en el análisis. De vez en cuando se observan en las pruebas de integración patrones de integración inesperados. En esos casos el complejo patrón de restricción, que no responde al original, se puede determinar mediante un análisis de restricción y Southern. El número de estructuras génicas integradas en el genoma se determina por medio del análisis Dot-blot. El mismo no es una técnica de transferencia capilar, dado que el ADN es aplicado a la membrana de soporte mediante una máscara perforada. La electroforesis no es necesaria y la calidad del ADN no necesita ser tan buena como para el análisis de Southern-Blot. El ADN desnaturalizado es aplicado, lavado, horneado e hidrolizado. A través de la cuantificación densimétrica se calcula aproximadamente el número de copias del transgen (tamaño del genoma haploide = 3 . 109 pb). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Animales transgénicos 161 Una técnica desarrollada hace pocos años, la reacción PCR (Polymerase Chain Reaction, capítulo XV), puede emplearse para evaluar si un animal es transgénico en un tiempo relativamente corto y con poco material celular. Cuando se pretende localizar el lugar de integración en el cromosoma se puede llevar a cabo una hibridación in situ de los cromosomas en metafase. El término hibridación in situ se emplea también para la comprobación directa de ADN y ARN en muestras de tejidos congelados. La especificidad para la expresión de un gen o estructura génica en un tejido se establece, entre otros, a través de su promotor. Por esa razón, para la evaluación de la transcripción correcta de una estructura génica inyectada se aisla el ARN de los tejidos en los cuales se espera la mayor expresión. La preparación del ARN se lleva a cabo según los protocolos de CHIRGWIN y col. (1979) y GLISIN y col. (1974), los cuales se basan en la lisis celular y desnaturalización proteica con isotiocianato de guanidina. El ARN es transferido a filtros de nitrocelulosa o de nylon (THOMAS, 1980) como para el análisis Southern-Blot o a geles desnaturalizados de agarosa/formaldehido, después de su desnaturalización con glioxal o dimetilsulfóxido (DMSO). Para recabar información sobre cantidad, estructura o porcentaje de síntesis se llevan a cabo tests con nucleasa S1 y ribonucleasa o ensayos de extensión del iniciador ("primer"). En el análisis S1 (SHARP y col., 1980) o el test de la protección de la ribonucleasa (CHAMBERLIN y RYAN, 1982) se emplean pruebas de cadenas simples, complementarias con el ARN que se pretende evaluar. Con ese método se pueden estudiar los puntos terminales 5'- y 3'- como así también la cantidad específica de ARN. Después que se pudo comprobar que la estructura génica microinyectada se transcribe correctamente, se debe evaluar la translación. Se analiza en primer lugar si la proteína correspondiente se sintetiza y, de ser así, en que cantidad. Para ello se disponen de métodos colorimétricos o electroforéticos en gel con coloración posterior (Comassie-Blue, plata) del gel o transporte a filtros de nitrocelulosa o membranas de nylon (Western-Blot). Además pueden emplearse métodos clínicos de diagnóstico (radioinmunoensayo, ELISA), los cuales están disponibles en parte en forma de kit. Para más información sobre esos métodos consultar la literatura siguiente: LOWRY y col., 1951; BRADFORD, 1976; PETERSON, 1977; PETERSON, 1979; OAKLEY y col., 1980 HAMES & RICKWOOD, 1981; MOEREMANS y col, 1985; DARBRE, 1986; MOEREMANS y col., 1986; SALINOVICH & MONTELARO, 1986. Herencia del transgen Un requisito indispensable para la aplicación de la transferencia génica en producción animal es que el gen transferido se transmita a la descendencia. Para ello es necesario que el animal receptor del gen (microinyectado) posea en todas o, al menos, en parte de sus células reproductivas el transgen. Lamentablemente se conoce poco sobre los caminos moleculares y biológicos que se suceden en la integración de un ADN inyectado. Por ejemplo, no se conoce exactamente cuando se lleva a cabo la integración y si ésta permanece estable en todas las células durante el desarrollo posterior del embrión. En ensayos de evaluación de animales nacidos transgénicos y especialmente en aquellos de producción de descendencia transgénica se ha observado que a pesar de la inyección del ADN, en el pronúcleo embrionario pueden originarse mosaicos. Mosaicos son animales originados por diferentes líneas, que provienen de un cigoto pero que poseen diferentes genotipos. Mosaicos transgénicos poseen células que contienen el transgen y otras que no lo tienen. Ello puede conducir a problemas en la formación de descendencia transgénica cuando en las células gonadales de los progenitores no está presente el transgen. Según las experiencias obtenidas se puede esperar que aproximadamente 30% de los animales receptores primarios del gen (por medio de microinyección) son mosaicos y que no transmitirán el transgen a su descendencia en la frecuencia esperada de 50%. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 162 Brem & col. La herencia de animales transgénicos, en los cuales la estructura génica inyectada se integró en forma estable y se transmite a la descendencia, responde a las leyes mendelianas, dado que en general la integración del gen se produce en un solo lugar en un cromosoma. De acuerdo a la definición se describe a este tipo de animales como transgénicos heterocigotas. Sin embargo este término no es el adecuado, dado que falta el alelo correspondiente al transgénico en el cromosoma homólogo. Como es de esperar, 50% de la descendencia debe poseer el transgen. Sin embargo, si las gónadas son mosaicos de líneas transgénicas y no transgénicas, el porcentaje de descendencia transgénica variará entre 0-50% de acuerdo a la participación cuantitativa de ambas líneas celulares. Los mosaicos se originan sólo en la generación F0. Los animales transgénicos de la generación F1 y posteriores poseen, si son positivos, la estructura génica en todas las partes del cuerpo y células de la hilera germinal. Se ha observado, no obstante, que la integración no siempre permanece estable a través de las generaciones. La observación de que un transgen no permanece estable sino que puede perderse no fue aclarada en forma suficiente. Aún más frecuente que la inestabilidad de la integración es la gran variabilidad de la expresión del transgen, de forma tal, que en el curso de las generaciones, se presentan todas las formas posibles de variación: aumento, disminución o ausencia de expresión. Aún dentro de grupos de hermanos enteros se observó variabilidad de la expresión del transgen entre animales positivos. Las razones para ello no han sido aclaradas, seguramente desempeña el fenómeno conocido como "imprinting" un rol de importancia. A través de la diferente metilación, la expresión de un gen depende de su origen materno o paterno. La comprobación de varios lugares de integración en el genoma de animales transgénicos ocurre con relativa poca frecuencia. Si los lugares de integración están tan alejados entre sí, que pueden conducir a recombinaciones al azar, pueden originarse más de 50% de descendencia transgénica. De un animal transgénico con dos tipos de integración independientes puede esperarse que el 75% de la descendencia hereden el transgen, 25% recibirá uno de ambos transgenes y otro 25% ambos tipos en su genoma. El 25% restante no será transgénico. A través del apareamiento de animales transgénicos heterocigotas se obtiene, en casos normales, 50% de transgenes heterocigotas, 25% de homocigotas y 25% de negativos. El azar de la integración génica en los animales transgénicos primarios (F0) puede conducir a la integración en el sector de un gen de importancia para el desarrollo del feto. Mientras un alelo intacto en el cromosoma homólogo de animales heterocigotas esté presente, no se producen problemas como consecuencia de esa mutación por inserción. Una excepción la constituyen posiblemente los efectos génico-aditivos, cuya integración en un lugar génico determinado tienen como consecuencia una reducida expresión de la característica endógena aditiva. Del apareamiento de animales heterocigotas que tienen una mutación de inserción no es posible obtener descendencia transgénica homocigota. Si el gen afectado por la mutación de inserción es esencial para el desarrollo del feto no nacerán animales transgénicos homocigotas. Antes de la reproducción de animales transgénicos debe evaluarse si los animales son libres de mutaciones de inserción, a fin de evitar un aumento de la carga letal. Dichas mutaciones de inserción pueden ser interesantes en investigación básica. Para la producción animal la aparición de mosaicos y mutantes de inserción tiene como consecuencia que para la introducción de un gen determinado en una población, un solo animal transgénico no es suficiente. Independientemente de la alta tasa de consanguinidad que se pueda generar, las posibilidades de producir una línea transgénica con un solo animal son reducidas. Para que una línea transgénica pueda tener éxito y aplicación en la práctica deberían cumplir las siguientes condiciones: - Transmisión estable del transgen a la descendencia. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Animales transgénicos 163 - Ausencia de mutaciones de inserción y la posibilidad de producir animales transgénicos homocigotas. - Expresión estable del transgen y efecto biológico positivo sobre la característica deseada. De ello se desprende que se deben producir como mínimo 5-10 animales transgénicos primarios (F0) para producir, con una probabilidad suficientemente alta, líneas que respondan a las exigencias establecidas. Programa de transferencia génica en el bovino Después que se informó por primera vez, en el año 1985 (HAMMER y col., 1985; BREM y col., 1985), sobre la exitosa aplicación de la transferencia génica en los animales domésticos (cerdo, oveja, conejo) se intensificaron los esfuerzos en los años siguientes para mejorar la metodología y los genes. Mientras que la tasa de integración no aumentó sensiblemente, en algunos ensayos se pudo mejorar la expresión a través del empleo de genes optimizados. La eficacia de un programa de transferencia génica depende de una serie de factores, como la habilidad en la manipulación embrionaria, el tipo y duración del cultivo in vitro, la calidad de la transferencia de los embriones, la edad de las receptoras empleadas y la sincronicidad entre donantes y receptoras. El esquema de desarrollo de un programa de transferencia génica se inicia con la selección, estimulación e inseminación (natural o artificial) de las donantes (fig. 1). La obtención de los cigotos se lleva a cabo por medio de la matanza o cirugía de las donantes, 75-97 h después del celo. Los embriones son centrifugados para exponer los pronúcleos (WALL, 1985). Junto con embriones de una célula se emplean para la inyección también embriones con 2 blastómeros. Una forma alternativa para la obtención de embriones para la microinyección de ADN en el bovino es la producción in vitro de embriones (ver capítulo XI). En la actualidad este método biotecnológico desplaza a la obtención in vivo de los embriones. La producción y el cultivo in vitro presentan las ventajas de ser más económicos, se evita la intervención quirúrgica de las donantes y receptoras como así también de los animales empleados para el cultivo temporal. Otra ventaja de la producción in vitro es la posibilidad de determinar el estadio del pronúcleo con mayor precisión. Ello permite la inyección de un mayor número de embriones. Después de la microinyección los embriones se cultivan in vitro o in vivo en el oviducto de receptoras temporales. La desventaja del último método se basa en las reducidas tasas de recuperación de los embriones como así también en su trabajosa ejecución. Los problemas de falta de desarrollo de los embriones producidos in vitro, a partir de los estadios de 8 y 12 células, pudieron resolverse con la aplicación del cocultivo de los embriones con células de la granulosa y del oviducto. Los embriones microinyectados son transferidos en los días 6-7 de desarrollo, momento en que alcanzan los estadios de mórula o blastocisto, en forma no quirúrgica a receptoras sincronizadas. LOHSE y col. (1985) informaron sobre el primer ensayo de transferencia génica en el bovino. Los autores inyectaron en ovocitos fertilizados una estructura génica TQ (timidin quinasa) y demostraron que 30% de los embriones indicaban una actividad TQ de 2 desviaciones estándar por encima de los controles. LOSKUTOFF y col. (1986) lograron 3 preñeces de la transferencia de 43 cigotos y 17 embriones de dos blastómeros inyectados. En otro estudio McEVOY y col. (1990) obtuvieron 569 ovocitos de 52 vaquillonas superovuladas (5,1 embriones de una y dos células por cada donante) por medio de laparotomía en la línea media. Los pronúcleos fueron observados en 71% de los casos después de 3 min y 81% después de 5 min de centrifugación a 13000 g, 62 y 60% de ellos se desarrollaron 24h después del cultivo. Como consecuencia de la microinyección degeneraron 20% de los cigotos. Embriones de una y dos células (n = 108) fueron transferidos a 46 receptoras. Al día 55 fueron detectadas 20 hembras (43%) con 32 fetos, 17 de las cuales parieron (37%). Uno de los 27 terneros nacidos fue transgénico. La tasa de sobrevivencia de los embriones de uno y dos blastómeros Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 164 Brem & col. fue de 22 a 36%. CHURCH y col. (1986) informaron que se desarrollaron 111 embriones de 852 cigotos bovinos inyectados con el gen de la fetoproteína alfa, de los cuales se identificaron 4 que integraron el gen. Después de la inyección de 1161 cigotos con 3 diferentes estructuras génicas y la transferencia de 641 (55%) la tasa de nacimiento fue de 10,5% (126) frente a 43% del grupo control. De los 126 embriones inyectados y transferidos integraron el ADN 7 terneros. BIERY y col. (1988) informaron sobre la tasa de detección de los pronúcleos después de la centrifugación de 1325 cigotos a 15000 g durante 4 min. Después de la microinyección y el cultivo in vivo en oviducto de oveja durante 6 días, se recuperaron 84% de los embriones, de los cuales 21% se desarrollaron hasta los estadios de mórula y blastocisto. La integración del ADN se registró en 4 fetos. ROSCHLAU y col. (1988) obtuvieron, luego de la castración de las donantes, 513 cigotos de oviductos que fueron inyectados con 3 diferentes estructuras génicas virales. En 14 de 44 embriones, de dos semanas de edad, fue posible comprobar la presencia del ADN; 5 embriones exprimieron el gen. De la transferencia de 43 embriones a 23 receptoras resultaron 14 preñeces y nacimientos. La integración del ADN bGH inyectado se comprobó en 1 ternero. En ensayos propios (REICHENBACH, 1989) se compararon diferentes sistemas de cultivo in vivo con cultivos in vitro. Las tasas de desarrollo obtenidas se detallan en la tabla 2. De ello se concluye que de las 3 especies obtenidas, el cerdo fue menos y el conejo fue el más adecuado para el cultivo de los cigotos. Lo destacable de este estudio fue que los sistemas de cultivo in vitro empleados (BERG y BREM, 1989) fueron comparables a los mejores resultados obtenidos in vitro, considerando los embriones cultivados y los transferidos. Tabla 2: Tasas de recuperación y desarrollo de los cigotos y embriones cultivados in vivo e in vitro después de la inyección génica (REICHENBACH, 1989) Embriones transferidos de 1 y 2 células (a) n 183 66 79 29 82 41 123 71 Embriones desarrollados Embriones Recuperados (b) n 93 48 22 12 46 31 123 71 (b/a) % 51 73 28 41 56 76 100 100 >1 división (c) n 24 27 7 5 28 21 63 43 (c/b) % 26 56 7 5 28 21 63 43 mórulas/blastocistos celular (d) n 17 14 3 2 13 14 18 21 (d/b) % 18 29 14 17 28 45 15 30 (d/a) % 9 21 4 7 16 34 15 30 Cultivo temporal in vivo vaca in vivo cerda in vivo coneja in vitro 8 Mi 3K 3 Mi 1K 4 Mi 2K 5 Mi 4K Mi = Microinyectados K = no microinyectados (controles) Tres grupos de trabajo: en Texas (U.S.A, MASSEY, 1990), en Leiden (Holanda, KRIMPENFORT y col., 1990) y en Munich (República Federal de Alemania) publicaron el empleo exitoso de los embriones bovinos producidos in vitro hasta el nacimiento de terneros (tabla 3). Los primeros terneros transgénicos, producidos con el empleo de embriones producidos in vitro, nacieron en 1991 (KRIMPENFORT y col., 1991). Como se señala en la tabla 3, 1% de los ovocitos recolectados culmina en terneros después de la fertilización, microinyección, cultivo y transferencia de los embriones tratados. A pesar de ello las ventajas de la producción in vitro de embriones superan al sistema de producción in Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Animales transgénicos 165 vivo. En el futuro la producción de animales transgénicos se desarrollará, con seguridad, apoyada en la producción in vitro de los embriones, porque se considera que la eficacia de las diferentes etapas mejorará en los próximos años. Tabla 3: Microinyección de ADN en embriones producidos in vitro según diferentes autores Texas, USA MASSEY, 1990 Pasos Maduración de los ovocitos Microinyección de los ovocitos Embriones transferidos Gestaciones/ Terneros * 2 terneros transgénicos n 2408 858 49 12 % 36 6 24 Leiden, Holanda KIMPENFORT y col., 1991 n % 2297 1154 129 21* 50 11 21 Munich, Alemania resultados propios, 1989, 1991/92 n % 686 496 60 12 72 12 26 Dado que las receptoras significan el mayor costo de un programa de transferencia génica, empleando la producción in vitro de embriones, se trabaja intensamente en el diagnóstico de la integración del gen ya sea durante la gestación (a través de la recolección y análisis de las células embrionarias) o, mejor aún, en los embriones de 6-7 días de edad, por medio del diagnóstico de PCR (capítulo XV). Foto 1: Microinyección de ADN en el pronúcleo de un cigoto de ratón Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 166 Brem & col. Bibliografía BERG, U. 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Otros objetivos en la investigación de células primordiales embrionarias comprende su empleo como donantes de núcleos en experimentos de clonado como también la conservación ex situ de información genética. El presente capítulo presenta un resumen de los resultados en la investigación. Estos documentan el estado actual de la puesta a punto y empleo de las células embrionarias primordiales en animales de experimentación y de interés productivo. Definición y características Las células embrionarias primordiales son líneas celulares continuas de origen embrionario y totipotentes, a partir de las cuales se pueden desarrollar todos los órganos, incluyendo la hilera germinal. Las células pluripotentes de origen embrionario pueden obtenerse mediante diferentes métodos (ROBERTSON, 1987). Un camino posible lo constituye el aislamiento de células pluripotentes de teratocarcinomas espontáneos como también su producción a partir de localizaciones embrionarias ectópicas (DAMJANOV y col., 1987). Junto con esas alternativas existe actualmente la posibilidad de aislar células pluripotentes directamente de los embriones. Las células pluripotentes aisladas de teratocarcinomas se denominan células-EC, las obtenidas de embriones EK (BRANDLEY y col., 1984) o más comúnmente ES. Las células EC no pueden diferenciarse de las morfológicamente ES, en su comportamiento antigénico de superficie como tampoco en su diferenciación in vivo o in vitro (EVANS y KAUFMAN, 1981; MARTIN, 1981). No obstante las células totipotentes embrionarias cuentan con algunas ventajas frente a las del carcinoma embrionario: - Directa aislación a través de marcadores genéticos como determinadas isoenzimas (BRADLEY y col., 1984) o mutaciones (MARTIN y col., 1987) - La conservación de un número diploide de cromosomas en el cual se hayan establecido las líneas femenina (XX) y masculina (XY, NICHOLS y col., 1990) - Un porcentaje relativamente alto de quimeras después de la inyección de células ES en blastocistos con la posibilidad de formar quimeras de la hilera germinal (BRADLEY y col., 1984) - Permite la posibilidad de obtener células ES de embriones partenogenéticos que cuentan con una constitución genética homocigota diploide (ROBERTSON, 1987). Formación y cultivo La aislación de líneas totipotentes de embriones se basa en las siguientes condiciones (BRADLEY, 1990): - Las células deben estar presentes en el estadio del embrión - Las células deben ser protegidas de señales que desencadenen su diferenciación - Deben se capaces de reproducirse in vitro Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Células embrionarias primordiales 169 Dos grupos de investigación lograron por primera vez el aislamiento de líneas celulares totipotentes de ratón al comienzo de la década del 80. EVANS y col. (1981) cultivaron blastocistos de la cepa consanguínea 129, cuya implantación fue impedida a través de una ovariectomía del animal donante en el día 2,5 después del estro y un tratamiento simultáneo con progesterona (implante). Las células ES se obtuvieron los días 6-8 de comenzado el estro, fueron cultivadas durante 4 días, momento en el cual los blastocistos producidos eclosionan y las células trofoectodérmicas se diferencian en trofoblastos gigantes (grandes). La masa celular interna (MCI), estructura con forma oval-cilíndrica, ubicada en el centro del blastocisto fue aislada con un capilar de vidrio y tripsinada. Las células obtenidas fueron cultivadas en un medio DMDM (Dulbecco's modified Eagles medium) modificado, individualmente o en pequeños grupos sobre una línea continua de fibroblastos de ratón (STO) inactivados con mitomicina. Las colonias con una morfología típica ES (colonias claras, continuas, sin limites celulares visibles, foto 1) fueron recolectadas y colocadas sobre una capa de células nutrientes (feederlayer). Foto 1: Célula embrionaria primordial totipotente (ES) MARTIN (1981) aisló MCIs de blastocistos expandidos a través de cirugía inmunológica (foto 2). A través de un tratamiento con Pronase (0,5%) en M2 (37o C, 3-10 min) se eliminó la zona pelúcida (foto 2a). Las MCIs fueron cultivadas en DMEM modificado con fibroblastos STO inactivados en su mitosis. El medio DMEM fue previamente condicionado con células de carcinoma de la línea PSA-1. Una información más exacta sobre el protocolo de trabajo se encuentra en el trabajo de ROBERTSON (1987). La aislación y cultivo de células ES se logró originalmente sólo con el empleo de células nutrientes (fibroblastos STO inactivados en su mitosis o fibroblastos embrionales primarios), cuyas funciones como la desintoxicación del medio en general, la fijación de las células y la inhibición de la diferenciación en particular fueron descriptas (ROBERTSON, 1987). La presencia de células nutrientes complica, sin embargo, la manipulación genética de las células ES como así también la caracterización de los factores de crecimiento y diferenciación. SMITH y HOOPER (1987) descubrieron un factor soluble en un medio condicionado con células BRL (buffalo Rat liver), que podía inhibir la diferenciación en forma reversible (differentiation inhibiting activity = DIA) aún cuando es cultivado sin células nutrientes. En forma pura DIA es una glicoproteína con un peso molecular de 43000 e idéntico al factor inhibidor de la leucemia (LIF = Leukeaemia inhibitory factor, SMITH y col., 1988; WILLIAMS y col., 1988). LIF está actualmente disponible biotecnológicamente (GEARING y col., 1989) y se ofrece en el mercado bajo la denominación ESGRO (Amrad, Australia). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 170 Wolf & Brem Foto 2: Aislación inmunológica de las MCIs de un blastocisto (ratón): a) eliminación de la zona pelúcida; b) Cultivo de los embriones (37oC, 20-30 min) en suero de conejo anti ratón, inactivado por medio de calor y lavado en M2; c) colocación de los embriones en gotas con complemento de cobayo (1:10) para destruir las células trofoectodérmicas; d) eliminación de las células lisadas con una pipeta. La flecha indica la MCI Con el agregado en el medio de cultivo de LIF se logró la formación de líneas celulares ES diploides con o sin el empleo de células nutrientes (HENDYSIDE y col., 1989; NICHOLS y col., 1990). WELLS y col. (1991) pudieron establecer líneas celulares ES de embriones sometidos a un shock térmico (42o C durante 10 min) y a un tratamiento con Puromicina, con una eficiencia significativamente mayor que con embriones no tratados. Mientras que en la mayor parte de los ensayos para el desarrollo de células ES se emplearon embriones de la línea consanguínea 129 LEDERMAN y BURKI (1991) lograron establecer una quimera de la hilera germinal a partir de embriones de la línea C57BL/6. En ese trabajo, el aislamiento de las células ES se logró por medio de células con mitosis inactivada de la linea 5637 (carcinoma humano), con mayor frecuencia que con los fibroblastos embrionarios murinos. El trabajo de SMITH (1991) presenta una lista completa de los métodos disponibles y materiales necesarios para el cultivo de células ES. Diferenciación in vivo e in vitro de células embrionales totipotentes Cuando las células ES alcanzan una alta concentración en el cultivo tienden a diferenciarse espontáneamente, observándose en primer lugar células epiteloides como endodermo primitivo. Si las células ES son mantenidas sin células nutrientes, en cultivos de suspensión sobre sustratos no adhesivos se presenta un fenómeno de diferenciación aún más complejo (DOETSCHMAN y col., 1985). Como primer estadio se forman agregados de células ectodérmicas, rodeadas por una capa simple de células endodérmicas (= "Embryoid bodies" = cuerpos embrioides simples; foto 3a). Con un cultivo progresivo se forman estructuras quísticas que contienen también estructuras mesodérmicas (cuerpos embrioides complejos; foto 3b). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Células embrionarias primordiales 171 Foto 3: Cuerpos embrioides simples (A) y complejos (B) Bajo las condiciones establecidas por DOETSCHMAN y col. (1985) se formaron "islas de sangre" y células miocárdicas en 30% de los cuerpos embrioides complejos. Si los cuerpos embrioides son colocados nuevamente sobre un substrato adhesivo se produce una amplia diferenciación en derivados de las tres capas dérmicas (por ejemplo, células nerviosas, musculares, pigmentarias, condrocitos, etc). Tabla 1: Producción de quimeras por medio de la inyección de células primordiales embrionarias * en blastocistos (resultados no publicados) Blastocistos Blastocistos inyectados y transferidos Número de transferencias Blastocistos/transferencia Preñeces Nacimientos Animales destetados Número de quimeras de pelaje Manifestación del quimerismo de pelaje Quimeras apareadas Quimeras infértiles Quimeras con más de 10 descendientes Quimeras de la hilera germinal NMRI 225 24 9.4 10 (42%)a 33 (15%)b 28 (85%)c 9 (32%)d < 20% 9 0 9 0 C57Bl/6 520 48 10.8 25 (52%)a 87 (17%)b 54 (62%)c 24 (44%)d bis 95 % 22 7 11 6 Balb/c 56 6 9.3 3 (50%)a 6 (11%)b 4 (66%)c 4 (100%)d bis 50% 4 1 3 1 *D3 y diferentes clones homólogos recombinados (gene disruption); Valores promedio de atransferencias, bembriones transferidos, canimales nacidos y danimales destetados El potencial de diferenciación in vivo de las células ES puede ser evaluado a través de un transplante sucutáneo en ratones singénicos. EVANS y KAUFMAN (1981) observaron en ese ensayo una alta Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 172 Wolf & Brem incidencia de tumores de rápido crecimiento. En la evaluación histopatológica de los mismos se observó la participación de varios tejidos que fueron identificados como teratocarcinomas. Sin embargo el test definitivo de la totipotencia de las células embrionarias se lleva a cabo a través de la inyección de las células ES en blastocistos o mórulas de otra especie con el fin de producir quimeras (fig. 1). Inyección de células ES en los blastocistos y transferencia de los embriones a receptoras seudográvidas Nacimiento de las quimeras Test para comprobar el quimerismo de la hilera germinal a través del cruzamiento de las quimeras con marcadores genéticos (marcadores de color de pelaje) Nacimiento de la descendencia, proveniente de células ES Fig 1: Evaluación in vivo de la pluripotencia de las células ES a través de la inyección en blastocistos Una amplia exposición de los materiales necesarios y de los diferentes pasos metodológicos se encuentran en el trabajo de BRADLEY (1987). Por esa razón nos referiremos a los puntos más importantes de acuerdo a nuestra experiencia. Las células ES se inyectan en blastocistos (d 3) recolectados de ratonas donantes superovuladas. Alternativamente se pueden utilizar mórulas (d 2). Estas deben ser tratadas, sin embargo, con citocalasina B en un medo libre de Ca++ y Mg++ para lograr un reversible aflojamiento del citoesqueleto. BRADLEY (1987) recomienda para la inyección una cámara enfriada (10o C), que de acuerdo a nuestra experiencia no es necesaria. De importancia es la calidad de las micropipetas de inyección y sujeción. Su construcción se presenta en las figuras 2 y 3. Los aparatos necesarios para ello en el capítulo X (fotos 5, 6 y 8). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Células embrionarias primordiales 173 Fig 2: Elaboración de las pipetas para inyección de lás células ES en blastocistos o mórulas. Los capilares de borosilicato son estirados con un estirador de pipetas y cortados en diagonal en un diámetro de 18 a 22 m con un escalpelo sobre goma siliconada. Con cierta experiencia se obtiene el 50% de los capilares con la forma ideal (a). Pipetas muy largas (b), muy cortas (c) y con irregularidades (d) son inadecuadas para la inyección Ambas pipetas se manipulan a través de micromanipuladores. El sistema de sostén es llenado con aire y controlado con la boca o una jeringa de 10 ml. El sistema de microinyección que contiene silicona líquida es accionado por medio de una jeringa Hamilton (fig. 4). La inyección se lleva a cabo como se indica en la fig. 8, siendo la mejor posición el límite entre 2 células trofoectodérmicas. Después de la inyección de 8-15 células ES en cada blastocisto ó 3-4 células ES en cada mórula, los embriones son cultivados 30 a 60 min y posteriormente transferidos en el útero de receptoras seudográvidas (d 2). Fig 3: Elaboración de una pipeta de sostén. El capilar es estirado a mano hasta un diámetro de 80-120 m y apoyado sobre la esfera de vidrio de la microfragua (a). La esfera es calentada hasta que la pared del capilar y la esfera se funden ligera-mente (b). Se interrumpe a continuación la corriente eléctrica de forma tal que el filamento que calienta la esfera se contrae y el capilar se quiebra (c). A continuación se redondea y reduce el borde de la pipeta con ayuda de la esfera candente (d, e, f) a un diámetro final de 20 a 30 m. La eficacia de la producción de quimeras como así también el porcentaje de células ES en los tejidos somático y reproductivo dependen esencialmente de la calidad de las líneas celulares ES pero también del origen genético de los embriones receptores. De esta forma los blastocistos de la línea C57BI/6 se Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 174 Wolf & Brem adecuan muy bien para la inyección de células ES de la línea 129 (SCHARTZ-BERG y col., 1989; resultados propios no publicados; foto 5, tabla 1). NAGY y col. (1990) pudieron producir quimeras a partir de células ES y embriones tetraploides. En las quimeras se pudo comprobar su completo origen de células ES. Los animales murieron, sin embargo, poco después del nacimiento por razones no establecidas. La colonización de la hilera germinal a través de células ES fue observada por primera vez por BRADLEY y col. (1984). Un factor de importancia en ese sentido es el cariotipo de las células ES (BRADLEY, 1990). Mientras las traslocaciones y trisomías sólo tienen un efecto reducido sobre el porcentaje de células ES en tejidos somáticos, la participación en los tejidos de la hilera germinal es muy improbable. Células embrionarias totipotentes de la hilera germinal A partir de las experiencias descriptas en el ratón, diferentes grupos de trabajo intentaron establecer líneas celulares totipotentes a partir de embriones bovinos, porcinos, caprinos y ovinos. Las primeras publicaciones sobre la aislación de líneas celulares contínuas de embriones bovinos y ovinos datan del año 1987. Foto 4: Inyección de células primordiales embrionarias en un blastocisto, a) antes de la inyección; b) colocación de la pipeta en el límite entre dos células trofoectodérmicas; c) inyección de 8-10 células ES; d) el blastocisto se colapsa luego de retirar la pipeta STRINGFELLOW y col. (1987) cultivaron un embrión bovino de 11 dias, obtenido en forma no quirúrgica, en medio Ham's F-20 (100 ml suplementado con 10 ml de suero fetal bovino, 11 mg Piruvato de Na, 0,5 mg insulina y 10 l EGF). Después de 13 días se estableció una monocapa (monolayer), que fue separada con 0,4% de Tripsina en medio PBS libre de Ca2+ y Mg2+ y nuevamente cultivada. Nueve días después 50% de las células mostraron confluencia. Esa línea celular pudo ser mantenida en el medio de cultivo hasta el pasaje 38 (1:2 respectivamente). Las células mono- y binucleares fueron consideradas morfológicamente similares a las trofoblásticas. Los mismos autores lograron, poco después, establecer una línea celular totipotente (BE12-6) bajo las mismas condiciones y con Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Células embrionarias primordiales 175 morfología comparable a la anterior que ha podido mantenerse en cultivo más de 200 pasajes y que actualmente es considerada inmortal (STRINGFELLOW y col., 1991). Foto 5: Quimeras en la hilera germinal, producto de la inyección de células ES D3 (agutí) en blastocistos Balb/c (albino) HANDYSIDE y col. (1987) trataron de establecer células ES de ovino. Los autores aislaron masas celulares internas (MCIs) de embriones de 6 y 8 días de la raza Welsh Mountain a través de inmunocirugía y las cultivaron intactas o desmenuza-das (3-5 min en 0,25% de Tripsina, 1 mM EDTA Na2, 1% suero de pollo en PBS libre de Ca2+ y Mg2+) con células fibroblásticas de la línea STO o de la piel de ovino (TGskin) inactivadas con mitomicina en 60% de medio CMß condicionado con BRL (microgotas de 20 l bajo parafina, a 37o C, 5% CO2/95% aire). Los autores emplearon en total 60 embriones (16 mórulas o blastocistos tempranos, 30 expandidos y 14 protruidos). Una evaluación morfológica de los embriones (cortes semifinos, microscopia electrónica) mostró diferencias entre las células de la MCI adyacentes al blastocele del resto de sus células. En las primeras los autores observaron estadios tempranos de diferenciación endodérmica en los blastocistos con zonas intactas, mientras que en los blastocistos protruidos fue posible reconocer un endodermo claramente diferenciado. Una aislación de la MCI a través de cirugía inmunológica fue más simple de llevar a cabo en blastocistos expandidos con zona intacta. Después de la adhesión de las células de la MCI (comprendiendo cerca de 43 células) se produce un aplanamiento de la colonia celular y no un cilindro oval como en el ratón. La división celular fue reducida en extremo comparada con el ratón. Algunos grupos de células, semejantes en un inicio a las células ES de ratón fueron cubiertas enteramente por células de apariencia endodérmica que formaron estructuras quísticas. Después del primer pasaje no se encontraron colonias semejantes a las células ES presentes. REXROAD (1990) cultivó embriones ovinos (d 7-9) y MCIs, obtenidas a través de cirugía inmunológica sobre fibroblastos STO o fibroblastos embrionarios ovinos. A partir de las MCIs se originaron con mayor eficacia colonias primarias que a partir de embriones intactos, independientemente de la edad de los embriones y del tipo de células nutrientes que se emplearon. PIEDRAHITA y col. (1988) llevaron a cabo ensayos orientados a aislar del cerdo células semejantes a las ES. Los autores cultivaron embriones de 7 a 8 dias (dia 0 = primer día del celo) en DMEM sobre fibroblastos STO inactivados por medio de rayos x. El medio fue suplementado con 10% SFB, 0,1 mmol/l 2-mercapto-etanol, 2mml/l L-glutamina y antibióticos. Colonias similares morfológicamente a las colonias ES fueron cambiadas de medio cada 7-10 días. De 118 MCIs 84 sobrevivieron las manipulaciones y 3 líneas pudieron ser mantenidas hasta el 10o pasaje. Una de las 3 líneas tenía morfología de las células ES, las otras 2 estaban compuestas de células similares a las ES y epiteliales. De 25 embriones cultivados se establecieron 8. Se pudieron establecer 2 líneas que sobrevivieron 10 Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 176 Wolf & Brem pasajes. Ambas líneas contenían células trofoblásticas como así también una pequeña parte de células similares a las ES. STROJEK y col. (1990) evaluaron el efecto de la edad de los embriones y diferentes medio de cultivo sobre la formación de células ES. Mientras que con embriones de 9 días no se obtuvieron resultados positivos se desarrollaron 14 colonias a partir de 69 embriones de 10 días de edad. Estas colonias provenían, según los autores, de la MCI. El cultivo de los embriones y su adherencia se lograron sobre fibroblastos de útero de cerdo y no sobre fibroblastos STO. Los autores sospecharon en una interacción química no definida aún como la razón de ese fenómeno. Los pasajes posteriores pudieron llevarse a cabo, sin embargo, sobre fibroblastos STO. El medio de cultivo más adecuado fue el DMEM suplementado con 10% de SFB, 10% de suero de cerdo, 0,2 mg/ml de insulina bovina y 0,1 mM 2-mercaptoetanol. En total se pudieron expandir 7 colonias mediante 3 a 5 pasajes y las líneas resultantes pudieron ser congeladas. EVANS y col. (1990) y NOTARIANNI y col (1991) emplearon blastocistos expandidos de la raza Large British White para producir células embrionarias totipotentes. Fueron cultivados los embriones intactos o las MCIs después de su aislación mecánica en medio DMEM modificado (+ 10% de suero de ternero + 5% de SFB + 10-4 mol/l 2-mercaptoetanol + antibióticos) sobre fibroblastos STO inactivados con mitomicina. Los autores observaron el crecimiento de los embriones y de las MCIs aisladas sobre las células nutrientes (fibroblastos STO), contrariamente a lo encontado por STROJEK y col. (1990). Al principio se observó el desarrollo de células epiteloides (grandes, aplanadas, translúcidas), mientras que después del primer pasaje (7-14 dias después del comienzo del cultivo) se observaron colonias de dos tipos. El primer grupo, formado por pequeñas colonias, se caracterizó por células grandes indiferenciadas de las cuales surgían células gigantes similares a las trofoblásticas. Las células del segundo grupo fueron caracterizadas de acuerdo a los criterios morfológicos (células con un núcleo translúcido claro, nucléolo visible y poco citoplasma) como células similares a las ES. Estas formaron grandes colonias. Como criterio bioquímico del estatus indiferenciado de esas células se demostró la falta del filamento intermediario Vimentin a través de una prueba de fluorescencia. Esas células pudieron ser mantenidas en cultivo cerca de un año, sin alteraciones morfológicas, con pasajes semanales. Los ensayos de diferenciación in vitro indicaron diferencias claras con respecto a la morfología de las cuerpos embrioides en relación con el ratón. Sin embargo las células se diferenciaron en las 3 capas embrionarias (epitelio, endotelio, células musculares y nerviosas) sobre un substrato adhesivo. La comprobación de la totipotencia in vivo de las células similares a las ES, a través de la producción de quimeras, no fue publicada hasta el momento. NOTARIANNI y col. (1990) lograron establecer, en la especie ovina, una línea similar a la ES empleando las mismas condiciones de cultivo. PIEDRAHITA y col. (1990a) estudiaron el efecto de diferentes células nutrientes sobre la eficiencia de la producción de líneas celulares embrionarias de cerdo. En ese experimento se emplearon fibroblastos STO, células BRL, combinación de esos cultivos (9:1 y 1:1), fibroblastos embrionarios primarios de cerdo (PEF) y ratón (MEF), PEF en combinación con células BRL, células epiteliales uterinas de cerdo y células epiteloides aisladas de embriones porcinos. Los fibroblastos STO fueron evaluados en combinación con medio condicionado con células BRL. La aislación de células epiteloides como también de líneas celulares similares a la ES se logró exclusivamente sobre células fibroblásticas STO con y sin medio condicionado con células BRL. Los autores no pudieron mejorar las condiciones de cultivo establecidas por EVANS y col. (1990). Mientras PIEDRAHITA y col. (1990a) confirmaban la aparición de diferentes tipos celulares después de la desagregación de MCIs proliferadas y adheridas, resultaron divergencias en el potencial de diferenciación de las líneas celulares de tipo epitelial y similares a ES. En las primeras se formaron estructuras en cultivos de suspensión que fueron consideradas análogas de los cuerpos embrioides de ratón. Las líneas celulares similares a la ES, por el contrario, no mostraron diferenciación in vitro alguna. En un estudio posterior PIEDRAHITA y col. (1990b) pudieron comprobar el status indiferenciado de las células similares a las ES dado que éstas no exprimieron Vimentina ni Citoqueratina 18. El intento de establecer paralelamente en el mismo trabajo líneas celulares ovinas fue menos exitoso, las células Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Células embrionarias primordiales 177 pudieron mantenerse vivas sólo 3 pasajes como máximo. El estudio de MEINECKE-TILLMAN y MEINECKE (1991) con el objeto de establecer líneas celulares pluripotentes a partir de embriones ovinos, caprinos y porcinos comparó diferentes células nutritivas (fibroblastos de hígado, riñón y testículo fetales de bovino; células granulosas de porcino y bovino; células epiteliales de útero y oviducto de oveja, cabra y cerda como así también fibroblastos STO). Principalmente con el empleo de fibroblastos embrionarios de hígado de bovino los autores pudieron establecer líneas embrionarias totipotentes de las tres especies estudiadas e incluso mantenerlas por varios meses en cultivo. El trabajo no contiene, sin embargo, información más detallada de la caracterización de esas líneas celulares. STROJEK y col. (1991) emplearon embriones obtenidos el día 7 in vivo o producidos in vitro para la producción de células totipotentes. Los autores evaluaron el efecto de diferentes medios (DMEM y BME/Ham's F 10 (1:1), cada uno suplementado con 5 y 20% de SFB, 10% de suero de ternero neonato y 10-4 mol/l 2-mercaptoetanol), células nutrientes (fibroblastos embrionarios primarios de ratón y células primarias de la granulosa de vaca) y diferentes presiones de oxígeno (5 y 20%) sobre la protrusión, fijación y diferenciación de los blastocistos. Los mejores resultados de protrusión se obtuvieron sin células nutrientes en BME/Ham's F 10 con 5% de CO2 en atmósfera de aire a una temperatura de 39o C. Por otro lado el empleo de células nutrientes tuvo un efecto positivo sobre la fijación de los blastocistos protruidos. En ese sentido los autores diferencian 2 tipos de fijaciones: el tipo A caracterizado por un crecimiento radial de las células trofoectodérmicas (fig. 10), el tipo B mostró la fijación de la MCI con degeneración de las células trofoectodérmicas. Aunque bajo particulares condiciones de cultivo se produjo una fuerte proliferación de las células trofoectodérmicas, en ningún caso se observó una proliferación de la MCI. No se observaron diferencias entre los embriones producidos in vivo o in vitro. La falta de proliferación de las masas celulares internas de embriones bovinos fue publicada anteriormente por SCHELLANDER y col. (1989), quienes trabajaron bajo condiciones similares. En un ensayo posterior los autores observaron el efecto positivo de LIF sobre la proliferación de MCIs de blastocistos bovinos cuando éstos fueron cultivados sin células nutrientes en medio DMEM modificado. Sin embargo, el intento de establecer líneas celulares no tuvo éxito (HASSAN-HAUSER y col., 1990). Foto 6: Blastocisto bovino después de 10 días de cultivo (tipo de fijación A: células trofoectodérmicas de crecimiento radial, MCI en posición central) STRELCHENKO y colaboradores lograron, por otra parte, aislar líneas celulares similares a las ES a partir de MCI de embriones bovinos (SRELCHENKO y col., 1991; SAITO y col., 1992). Los autores cultivaron 11 hemi-embriones, resultado de la división de 6 embriones de 7 días obtenidos por medios no quirúrgicos, en TCM 199 suplementado con 10% de suero de ternero neonato sobre fibroblastos embrionarios primarios de ratón, inactivados con mitomicina. Tres embriones se fijaron de acuerdo al tipo A, en los cuales no sólo se observó la proliferación de las células del trofoectodermo sino también un crecimiento de la MCI. Esta fue disociada con tripsina a los 7 días y colocada sobre células Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 178 Wolf & Brem nutrientes frescas. Los autores emplearon, a partir de ese momento, medio MEM modificado con 10% SFB, 10-4 mol/l 2-mercaptoetanol como también 4,5 g/l de glucosa. Un 30% del volumen de ese medio fue condicionado sobre células LIF de la línea 5637 en proliferación. Después de 5 días las primeras colonias similares a las ES fueron visibles. A partir de ellas se pudieron producir 2 líneas que sobrevivieron 4 pasajes. Una serie tóxica de SFB eliminó las células producidas sin que se pudiese comprobar su totipotencia in vitro e in vivo. En la tabla 2 se presentan los diferentes medios de cultivo empleados exitosamente en la producción de líneas celulares similares a las ES a partir de embriones de animales de interés productivo. Es importante destacar, sin embargo, que los resultados alcanzados en la especie murina aún no han podido ser alcanzados por las especies domésticas. Como razón de esa diferencia se discute el diferente desarrollo después de la implantación entre el ratón y los ungulados. Mientras en el embrión de ratón ocurre una rápida proliferación de la MCI después de la implantación, el disco embrionario de las especies unguladas se mantiene inicialmente en inactividad mitótica (NOTARIANNI y col., 1990). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Células primordiales 179 Tabla 2: Ensayos exitosos para producir líneas celulares similares a la ES de animales domésticos Autor Especie Material empleado Células nutrientes Medios de cultivo Medio base L-Gln [mmol/l] 2-ME [mmol/l] Antibiótico Otros agregados Temperatura [ C] CO2 [%] O2 [%] 0,1 Si S. i. S. i. S. i. 2 0,1 Si Medio cond. BRL S. i. S. i. S. i. 0,1 Si 0,2 g/l Insulina, Nucleótidos, aminoáci-dos no esenciales S. i. S. i. S. i. EVANS Y COL. (1990) NOTARIANI Y COL. (1990/1991) PIEDRAHITA y col. (1990a,b) STROJEK Y COL.(1990) STRECHELKO y col. (1991) Porcina, ovina, bovina Blastocistos y MCIs d 7-9 Fibroblastos STO DMEM Porcina MCIs de embriones d 7-8 Fibroblastos STO DMEM Porcina Embriones d 10 Fibroblastos de útero porcino (FUP) DMEM Bovina Embriones divididos d 7 Fibroblastos embrionarios murinos (FEM) TCM 199 (Para el cultivo inicial MEM-Alfa (Cultivos posteriores) 0,1 S. i. 4,5 g/l Glucosa Medio 5673-condionado S. i. S. i. S. i. S.i.: sin información; L-Gln= L=-Glutamina; 2-ME= 2-Mercaptoetanol; SF = suero de ternero; SFB = suero fetal bovino; SP = suero porcino Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 180 Wolf & Brem Aplicaciones de las células embrionarias totipotentes Las células ES del ratón se emplean en la actualidad casi en forma de rutina como vectores en la transferencia de genes para la producción de modelos animales con modificaciones génicas determinadas. Dado que la integración del gen en las células de los mamíferos se produce al azar, la tasa de recombinación homóloga/integración al azar es de alrededor de 13-3 (FROHMAN y MARTIN, 1989; MELTON, 1990). Esa frecuencia de recombinaciones homólogas es muy baja para llevar a cabo la alteración del genoma a través de la microinyección del gen en el pronúcleo. Por esa razón se opta por el empleo de las células embrionarias totipotentes, a las que se les ha transfeccionado el gen deseado y se evalúa la integración en el lugar adecuado. En esos ensayos se emplearon, en la mayoría de los casos, líneas ES con cariotipo masculino (por ejemplo: B. E14TG2a, CCE, D3, CC1.2). Para lo cual existe una serie de razones (MANSUR, 1990): - Las líneas celulares masculinas ES parecen ser más estables en cultivo que las femeninas. - Solamente a partir de células ES masculinas pueden originarse espermatozoides funcionales. Dado que la descendencia es más numerosa es más fácil detectar quimeras masculinas que femeninas, respecto a la presencia de células ES en la hilera germinal. - Cuando células ES masculinas son inyectadas en un blastocisto femenino y las células totipotentes forman una parte importante del organismo se produce una conversión del sexo. Esto significa que se produce un macho. En ese caso la hilera germinal es formada en un 100% por células ES. La electroporación es el método de elección para la transfección de células ES, dado que en condiciones experimentales óptimas se integra sólo una copia del vector de ADN (THOMAS y CAPECCHI, 1987). Los vectores deben estar acompañados de un gen marcador, dada la baja frecuencia de integraciones estables (10-5-10-2), a partir de la cual puedan ser seleccionadas las células. En la mayoría de los casos se emplea el gen bacteriano de la Neomicina fosfotransferasa (neo®). El medio de selección contiene G418. Como forma alternativa a la electroporación se empleó la microinyección de ADN (ZIMMER y GRUSS, 1989). Ese método permite producir un alto porcentaje de células transformadas estables (10-20%), sin embargo la ejecución es muy complicada. THOMAS y CAPECCHI (1987) desarrollaron 2 diferentes tipos de vectores, que emplearon para la disrupción del gen HPRT (fig. 5). A 6 Neo B 6 9 7 9 Neo 1 2 3 4 5 hprt 6 78 9 1 2 3 hprt 4 5 6 78 9 reemplazo de secuencia 1 2 3 4 5 hprt- G 4 1 6 7 Neo 9 1 2 3 inserción de secuencia 4 5 6 7 8Neo 9 6 78 9 hprt- G 4 1 Fig 5: Vector para un transferencia génica con un objetivo determinado (según CAPECCHI, 1989) Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Células embrionarias primordiales 181 Los denominados genes de inserción tienen una fractura en la doble hélice en el lugar correspondiente a la secuencia homóloga del gen endógeno. Si se produce cross over en el momento de la yuxtaposición del gen endógeno, se integrará todo el vector en el gen endógeno y las secuencias de ambos se presentan en forma doble. Por otra parte existen vectores complementarios, co-lineales a la secuencia endógena, que contienen una determinada mutación y que reemplazan al gen endógeno a través de un cross-over doble. La frecuencia de clones homólogos recombinados puede ser aumentada en genes que ya son exprimidos en las células ES si se renuncia a las secuencias promotoras tanto en zona homóloga del vector como también del Gen neo®. Si se produce la recombinación las secuencias en el vector entran bajo el control del promotor del gen endógeno el gen neo® se exprimirá. De otra forma se logra la expresión con una integración al azar y gran parte de las células mueren durante la selección con G418 (MASOUR, 1990). Con genes que no se exprimen en las células ES se emplea otra estrategia conocida como selección positiva-negativa (SPN). Ese método propuesto por MASOUR y col. (1988) se basa en dos supuestos: la integración al azar de un una estructura génica lineal ocurre al final de la estructura, mientras la recombinación homóloga tiene lugar dentro de la zona homóloga a través de cross-over. Estructuras génicas lineales que no contienen al final secuencias homólogas están en condiciones de recombinarse en forma homóloga eficientemente Un vector SPN contiene además del gen neo® como secuencia selectiva positiva dentro de la zona homóloga, un marcador contra el cual se puede seleccionar en forma negativa. Un ejemplo de ello es el gen de la Timidinquinasa (VHS-tq) del virus Herpes simplex que está ubicado distal a la región homóloga (fig. 6). Si se lleva a cabo la recombinación se pierde la zona que incluye el gen VHS-tq. En el caso de una integración al azar permanece esa región y las células que expresan el gen VHS-tq mueren mediante selección con Ganciclovir. Con ese método se pudo aumentar los clones recombinantes por el factor 10 hasta 12500 (MASOUR, 1990). Clones positivos se identifican con ayuda de la sonda de ADN (polimerase-chain reaction, PCR) como así también por medio del análisis Southern-Blot. Luego se reproducen para ser inyectados a blastocistos y producir quimeras transgénicas. Si las células embrionarias totipotentes en esos animales colonizan también la hilera germinal se produce descendencia heterocigota, después del apareamiento con animales no transgénicos. Esta puede ser empleada para producir animales y líneas transgénicas homocigotas. Cambios fenotípicos en portadores homocigotas de cambios genéticos inducidos permiten hacer deducciones sobre la función del gen en estudio y sus productos. Con ese método fueron inactivados y caracteriza-dos interesantes genes de importancia biológica y evolutiva en el ratón (tabla 3). Células ES fueron empleadas también para buscar importantes genes o secuencias regulatorias de ADN, hasta el momento desconocidos, para la diferenciación durante la ontogénesis (GOSSER y col., 1989; FIEDRICH y SORIANO, 1991). Con ese objetivo se transfeccionaron células ES con construcciones (estructuras) génicas, las cuales junto a un marcador selectivo positivo (en el mayor de los casos neo®) contienen el gen de la -galactosidasa bacteriana (lacZ) con una zona promotora mínima (enhacer trap) o bien sin promotor (promotor trap, fig 13). Los clones que integran esa estructura génica se emplean en la producción de quimeras. La expresión del gen lac Z puede hacerse visible por medio del cronogen X-gal, cuyo fraccionamiento provoca una coloración azul. De esta forma el gen puede ser determinado en diferentes estadios embrionarios. En el caso que se establezca un modelo de expresión interesante, es posible clonar las zonas responsables a partir del gen lac Z. En las estructuras del promotor Trap se produce la expresión del gen lac Z sólo si éstas se integran en la zona Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 182 Wolf & Brem de influencia del promotor endógeno y con ello interrumpen el gen endógeno correspondiente. Si se logran producir quimeras de la hilera germinal con esa línea puede caracterizarse, entonces, el gen endógeno interrumpido a través de la reproducción y evaluación del fenotipo de los portadores hetero- y homocigotas, no sólo estructural sino funcionalmente. Gene targeting neor Pint-2-N/TK HSV-tk int-2+ neor Int-2- neor HSV - tk- (G4 1 8r, GANCr ) Integración al azar neor HSV-tk neor HSV-tk Int - 2+ neor HSV - tk+ (G4 1 8r, GANCS) Fig 6: Vector para una CAPECCHI, 1989) selección positiva-negativa (según Las aplicaciones descriptas de las células embrionarias totipotentes pueden llevarse a cabo en principio en las especies animales de interés zootécnico, si se logran establecer líneas celulares funcionales. La fig 8 describe un modelo de producción de bovinos transgénicos aplicando líneas celulares pluripotentes (BREM, 1986). Además surge la interesante posibilidad de evaluar la expresión de transgenes integrados al azar en las células ES o en sus derivados diferenciados para emplear sólo clones adecuados para producir quimeras transgénicas. Este es el punto decisivo considerando la baja eficiencia de la producción de individuos transgénicos a través de la microinyección de ADN en el pronúcleo de los animales de interés productivo frente a los ratones (BREM, 1988). Contrariamente a la obtención de embriones uni- o bicelulares, los embriones requeridos para obtener células totipotentes para la transferencia génica pueden ser obtenidos en la especie bovina en forma no quirúrgica. EVANS y col. (1990) además someten a discusión a las células ES frente a la posibilidad de llevar a cabo intervenciones complejas en el genoma con el fin de variar características controladas por varios genes. Tabla 3: Ejemplos de la producción de ratones con cambios genéticos establecidos con el empleo de células ES como vectores para la transferencia génica Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Células embrionarias primordiales 183 Gen Linea celular ES D3 CC1.2 D3 D3 Donante de blastocistos C57Bl/6 C57Bl/6 C57Bl/6 CD1 C57Bl/6 Quimera de la hilera germinal Literatura Hox-1.1 Hox-1.5 Hox-1.6 En-2 ZIMMER & GRUSS, 1989 3 3 6 ZIJLSTRA y col., 1989/90 CHISAKA & CAPECCHI, 1991 LUFKIN Y col., 1991 JOYNER Y col., 1989 ß2-microglobulina N-myc HPRT HPRT HPRT- D3 C57Bl/6 D3 E14TG2a CCE E14TG2a C57Bl/6 C57Bl/6JLac x CBA/CaLac MF1 C57Bl/6/Ola x CBA/Ca/Ola C57Bl/6 C57Bl/6 4 19 11 1 STANTON y col., 1990 HOOPER y col., 1987 KUEHN y col., 1987 THOMPSON y col., 1989 HPRTWnt-1 (int-1) IGF II ES98-12 AB-1 2 19 KOLLER y col., 1989 McMAHON & BRADLEY, 1990 CCE.33 CD-1 MF1 C57Bl/6 3 4 si 0 0 6 1 3 14 DeCHIARA y col., 1990/91 MHC Class II c-abl D3 CCE C57Bl/6 CD-1 MF1 C57Bl/6 COSGROVE y col., 1991 SCHWARTZBERG y col., 1989/91 c-abl IL-2 c-src CCE E14 AB2.1 C57Bl/6 C57Bl/6 C57Bl/6 TYBULEWICZ y col., 1991 SCHORLE y col., 1991 SORIANO y col., 1991 Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 184 Wolf & Brem Enhancer trap neo E neo Transcripción P gene x Lac Z protein neo protein Translación Promotor trap S P neo Integración en el interior del gen x en la orientación y marco de lectura correctas ATG E P gene x S P neo Lac Z fusion protein neo protein Fig 7: Vectores "Enhacer trap" y "promoter trap" según ROSSANT y JOYNER (1989). Los mismos contienen como marcador de selección el gen neo y un gen lacz (zona negra) para el reconocimiento de las regiones inductoras de trascripción con una zona promotora mínima o reducida El primer paso es la producción de células pluripotentes. Como donantes de embriones se eligen madres de toros (MT), apareadas con padres de toros (PT) para alcanzar un nivel genético equivalente al de los toros de prueba. Las células plirupotentes son transfeccionadas in vitro, la integración y expresión analizadas y finalmente son empleadas para la producción de quimeras. Las mórulas y blastocistos receptores se obtienen de las madres de madres apareadas con padres de madres. Los Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Células embrionarias primordiales 185 terneros nacidos son evaluados en su capacidad de transmitir las nuevas cualidades genéticas. La descendencia de la línea celular son medio hermanos paternos, que poseen la mitad de los genes del apareamiento programado y heterocigotas con respecto al gen transferido. Plasmidio BB KB ADN clonante (homólogo-heterólogo) Bacteria transforma Implantación ectópica Transferencia de genes en cultivos celulares ADN clonado Líneas celulares (♂) Teratoma BK Quimera KK Población Quimera Medio-hermanos paternos transgénicos Fig 8: Modelo para la producción de animales transgénicos a través de la producción de quimeras a partir de embriones y células de teratocarcinoma (BREM, 1986): SIMS y FIRST (1993) informaron por primera vez sobre gestaciones producidas con células germinales totipotentes. De 12 líneas celulares (tabla 4), los autores obtuvieron 10 por medio de cirugía inmunológica de la masa celular interna de 3 blastocistos producidos in vitro. Se logró establecer 3050% de líneas celulares, no fueron observadas diferencias en la habilidad de las MCIs en establecer esas líneas. Después del cultivo de los complejos fusionados en medio CRaa+selenio, insulina y transferrina + 5% de SFB se obtuvieron 109 (24%) blastocistos. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 186 Wolf & Brem Tabla 4: Blastocistos (d7) producidos con la transferencia nuclear de células germinales totipotentes (ES) Días después de la inmunocirugía No. de líneas celulares Blastocistos/ complejos fusionados Blastocistos % 0-14 15-28 29-42 42-56 57-70 71-84 99-112 4a,b,c, 5a,b,c 2a,b,c 1* 1* 1 1a 26/102 47/213 14/55 6/21 8/36 4/18 4/15 26 22 25 29 22 22 27 1 dias después de la inmunocirugía a partir de la transferencia nuclear * de un blastocisto a,b,c, líneas celulares con (a) transferencia de embriones, (b) preñeces, (c) fetos de 220 dias Bibliografía BRADLEY, A. 1987. Production and analysis of chimaeric mice. En:Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells. A Practical Approach (Robertson, E.J., ed.), Oxford, Washington DC: IRL Press, pp. 113-151 BRADLEY, A. 1990. 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Nature 338: 150-153 Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 190 Dovc LA REACCION EN CADENA DE POLIMERASA (PCR, Polimerase Chain Reaction) APLICADA EN PROGRAMAS DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES P. Dovc Introducción En los programas de transferencia de embriones es deseable contar, antes de la transferencia, con información confiable sobre el genotipo del embrión. Sobre todo sería importante diagnosticar su sexo. De la misma forma sería interesante obtener información sobre la eventual presencia de predisposiciones a enfermedades hereditarias y la constitución génica en algunos loci, importantes para las características de valor productivo. La reacción en cadena de polimerasa brinda la oportunidad de amplificar específicamente un reducido número de copias de ADN genómico para fines analíticos. La ejecución de estos tests, aunque sensible a perturbaciones, es relativamente simple y puede brindar la información deseada al cabo de pocas horas. Por ello el diagnóstico génico mediante la reacción PCR es un método de elección para los programas de TE. La historia de la biología molecular muestra que a menudo el desarrollo y la puesta a punto de nuevas técnicas tienen una marcada influencia sobre el modus procedere para resolver problemas básicos y aplicativos. De esta forma la reacción de PCR marcó un importante cambio en la estrategia para resolver problemas en un amplio campo de la biología molecular. La reacción PCR en la forma actual fue establecida por MULLIS y FALOONA en 1987 y fue intensamente automatizada mediante la aplicación de modernos instrumentos. Por un lado la reacción PCR puede reemplazar parcialmente algunos métodos antiguos y complicados (determinación del genotipo de loci individuales). Por otro lado permite el desarrollo de nuevas estrategias (p.e. "gen linkage", análisis a nivel molecular, caracterización del genotipo de determinadas células en forma individual). La reacción PCR representa una eficiente técnica para la replicación de segmentos específicos de ADN in vitro e impulsa el desarrollo del área de análisis de ADN y ARN. La idéntica duplicación del material hereditario y su transmisión a la próxima generación es una característica de todo ser vivo. La reproducción de la masa hereditaria (replicación del ADN) sucede en forma semi conservadora: en la doble hélice de ADN una es la cadena original, mientras que la otra es su homólogo sintetizado posteriormente. In vivo la replicación de ADN es un proceso complejo que requiere la acción coordinada de una gran cantidad de enzimas. En primer lugar las largas moléculas de ADN genómico deben ser desespiralizadas, estabilizadas en ese estado, replicadas y luego la nueva cadena doble, recién sintetizada, debe ser transformada nuevamente en la cadena de doble hélice original. Estos procesos ocurren a una velocidad de unas miles de bases por minuto con una frecuencia de error de 1x10-9. Las polimerasas de ADN juegan un rol preponderante en la replicación in vivo de ADN como matriz (template), un final 3'OH de un fragmento corto de una cadena doble de ADN libre como oligonucleótido iniciador (primer) y nucleótidos trifosfato desoxigenados (dNTPD, N corresponde a adenosina, citosina, guanidina o timidina) como bases para la cadena complementaria. Normalmente las polimerasas de ADN necesitan para su actividad, la presencia de iones metálicos como cofactores. Estos componentes -matriz, oligonucleótido iniciador con final 3'OH libre, dNTPs y polimerasasrepresentan también los elementos para la replicación de ADN in vitro. En la concepción de la reacción PCR se unieron varios pasos de la síntesis, logrando una amplificación específica de una región limitada por oligonucleótidos iniciadores (MULLIS y col., 1987). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Reacción en cadena de polimerasa 191 Principios de la reacción PCR La idea de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se basa en la repetida síntesis de una región de ADN que es limitada por dos moléculas iniciadoras. Para la selección y la síntesis del iniciador es necesario tener por lo menos la información sobre la secuencia en los extremos del ADN que se desean amplificar. Esto posibilita la ubicación de dos oligoelementos iniciadores complementarios a la cadena matriz, de tal manera que demarcan la secuencia blanco. La matriz de ADN es desnaturalizada en primer lugar mediante calentamiento de 94 a 96o C, la reasociación se impide luego por medio de un enfriamiento rápido. En presencia de iniciadores adecuados, dNTPs y polimerasas de ADN, se logra un acoplamiento de las moléculas iniciadoras a la parte homóloga de la matriz (primer annealing), posteriormente la polimerasa puede sintetizar la segunda cadena. De esta manera se obtienen dos cadenas dobles a partir de una. Estas pueden ser a continuación utilizadas nuevamente como matriz. Una repetida desnaturalización por medio de calor conduce a la liberación esta vez de cuatro matrices que pueden ser complementadas a continuación formando cuatro cadenas dobles de ADN. De esta forma se puede duplicar el número de copias de cada ciclo y después de n ciclos concentrar una región específica a un valor 2n. Es necesario destacar que durante la amplificación se forman dos distintas amplificaciones: cortas, limitadas en ambos extremos por la del iniciador y copias largas que sobrepasan la secuencia homóloga al iniciador en el final 3'OH. La amplificación de los fragmentos cortos sucede en forma exponencial, mientras que el incremento de las copias largas se manifiesta en forma lineal. Después de n ciclos el número de fragmentos cortos aumentó a 2n (n + 1). Una sola molécula puede ser modificada de esta manera en 20 ciclos por el millonésimo factor (220). La idea ya fue descripta en los años '70 (KLEPPE y col., 1971). En un comienzo se utilizó una polimerasa de ADN termolábil (fragmento Klenow de la polimerasa I de E. Coli). Luego de cada desnaturalización fue necesario agregar la polimerasa nuevamente, lo que complicaba y encarecía el procedimiento. La aplicación de la polimerasa de ADN termoestable de thermus aquaticus, cuya actividad se mantiene durante un alto número de ciclos, permite incorporar la polimerasa una sola vez al comienzo de la reacción. Diferentes pasos de la reacción PCR (desnaturalización, alineamiento del iniciador-primer annealing- y extensión del iniciador) requieren cambios de temperatura relativamente rápidos. Una solución sencilla es la instalación de 3 baños María. Uno con temperatura de desnaturalización (94-96o C), el segundo con la temperatura adecuada para el alineamiento del iniciador a la matriz (primer annealing, 50-70oC) y el tercero con la temperatura apta para la síntesis (72o C). Dado que es muy trabajoso cambiar manualmente los tubos de ensayo se recurrió rápidamente a la ayuda de brazos robots. El siguiente paso fue el desarrollo de los hoy muy comunes termocicladores, capaces de repetir cíclicamente los cambios de temperatura deseados gracias a microprocesadores. Los programas de estos aparatos permiten variar sus funciones. Esto significa que es posible prolongar el tiempo de desnaturalización en el primer ciclo, extender la duración de la fase de síntesis en el ciclo final y enfriar el tubo de ensayo a 4o y hasta 8o C al concluir la reacción. La mayoría de las máquinas pueden ser programadas libremente siendo posible le elección de temperaturas dentro del margen de 50-96o C. El cambio de temperatura al calentar o enfriar sucede a una velocidad de 1 a 2oC/min-1. Según el equipamiento técnico se distinguen termocicladores con un bloque metálico termorregulado para los tubos y otros con baño fluyente. Componentes de la reacción Los componentes de la reacción PCR pueden ser comprados en forma de set completo ("gen-Amp.Kit", Perkn-Elmer/Cetus). Diversas firmas ofrecen también los componentes en forma separada. El empleo de un set es recomendable para el principiante y para los laboratorios que tienen dificultades en conseguir los reactivos de alta calidad. La combinación individual de los componentes para la reacción Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 192 Dovc PCR requiere la adquisición de polimerasa ADN, dNTPs, MgCl2, KCl, Tris, detergente no iónico, gelatina o albúmina de suero de vaca, iniciadores y matriz de ADN. En la mayoría de los casos se utiliza la polimerasa de ADN termoestable, aislada de la bacteria termófila thermus aquaticus (polimerasa ADN-Taq). La termoestabilidad y la alta temperatura óptima hacen que esta enzima sea de elección para múltiples aplicaciones. La misma es ofrecida ya por varias firmas. Aparte de la polimerasa ADN-Taq hay otras polimerasas termoestables en el mercado (polimerasa ADN-Tth de thermus thermophilus, polimerasa ADN-Bst de Bacillus stereo-thermophilus, polimerasa ADN-Vent der thermococcus litoralis). La mayoría de las polimerasas de ADN termoestables tienen una actividad óptima a temperaturas entre 70-78o C y sintetizan la cadena homóloga a una velocidad de más de 1000 bases por minuto. Para esa actividad óptima se requiere un pH de 8,2 a 9,5 en 10mM de solución tampón Tris. Los nucleótidos trifosfáticos desoxigenados (dNTP) son ofrecidos liofilizados o en soluciones acuosas de 100 mM. Es conveniente preparar soluciones de 2mM de cada dNTP y congelarlas en pequeñas porciones (100 a 200 µl). Bajo estas condiciones son estables durante varias semanas. Las soluciones tampón son usualmente producidas y almacenadas en forma décupla concentrada. La composición común es de 10 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% gelatina, 0,01% NPO4 y 0,01 Tween 20 (SAIKI y col., 1988). Detergentes no iónicos pueden ser reemplazados por Tritón x-100 aunque la presencia de un detergente es decisiva para el procesamiento de la enzima. Se debe recordar que altas concentraciones de dNTPs forman complejos MgCl2, lo que reduce la disponibilidad del mismo. Por ello es necesario aumentar la concentración de MgCl2 en dicho caso. Los oligonucleótidos iniciadores sintéticos con 18 a 30 nucleótidos mostraron ser adecuados para la amplia gama de aplicaciones. Iniciadores cortos de 18 nucleótidos son suficientes para la ampificaciones de matriz-ADN poco complejas (p.e. plasmidios). Los iniciadores universales con lectura hacia adelante y atrás (Forward y Reverse-Primer) son adecuados para la amplificación de sectores clonados. A menudo la calidad y pureza de los iniciadores sintéticos es satisfactoria y pueden ser utilizados sin purificación accesoria. En caso contrario se ofrece la purificación HPLC en una columna cromatográfica o la limpieza a través de poliacrilamida. Al diseñar un iniciador se debe tener en cuenta que los iniciadores tengan semejante cantidad de guanidina y citosina, que no formen estructuras secundarias estables y que tengan poca homología entre sí. Sobre todo es importante que no exista homología en la región 3'- entre los iniciadores. Ya se ofrecen a la venta programas de computación que facilitan decisivamente la selección de los iniciadores. Como matriz (template) puede ser utilizado ADN del más variado origen. Para una amplificación exitosa es de decisiva importancia que la preparación del ADN no contenga impurezas que puedan interferir la misma negativamente. Sobre todo la presencia de fenol, detergentes y EDTA tiene un efecto perturbador. Dado que el largo de las amplificaciones excede en raros casos 1-2 Kb, el ADN-matriz no requiere tener alto peso molecular. Sectores cortos pueden ser amplificados exitosa-mente aún a partir de matrices ADN degradadas como por ejemplo en material arqueológico (PÄÄBO y col., 1988). Para la amplificación es importante una buena desnaturalización de la matriz-ADN. Se recomienda una desnaturalización de por lo menos 5 min antes de la aplicación de la enzima. Las condiciones de reacción dependen sobre todo de la temperatura de fusión del iniciador (temperatura de alineamiento, "annealing temperature") y del largo de la amplificación (tiempo de síntesis). Es necesario establecer experimentalmente el tiempo de reacción óptima para cada par de iniciadores. El volumen de reacción varía de 25 a 100µl dependiendo de la cantidad de amplificaciones que se requiere para los estudios posteriores. Por razones económicas es propicio reducir al mínimo el volumen de reacción en análisis de rutina. La concentración del iniciador oscila entre 25 y 100 pmol. Para la mayoría de las amplificaciones son suficientes 25 a 30 ciclos de amplificación. Se requieren más ciclos si la matriz-ADN que se quiere copiar se presenta en un reducido número de muestras (p. e. ADN de células aisladas). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Reacción en cadena de polimerasa 193 Análisis de los productos de la reacción PCR La concentración específica de la secuencia entre los iniciadores permite amplificar una cantidad suficiente de ADN para un análisis electroforético a partir de un grupo pequeño de copias de la matrizADN. En la mayoría de los casos es posible separar las amplificaciones en gel de agarosa de 0,8 a 2,0% y observarlas bajo luz ultravioleta después de una coloración con etidio bromado (Ethidium Bromid). Si se trabaja con fragmentos muy cortos, que deben ser divididos con enzimas de restricción después de la amplificación (fragmentos más cortos que 50 pB), algunas veces es necesario utilizar geles de poliacrilamida (PAA) para alcanzar una separación suficiente. Para los geles PAA se puede utilizar la coloración con etidio bromado o la coloración con plata. Esta última, a pesar de ser más complicada, es más apropiada para fragmentos muy cortos y cantidades pequeñas de ADN debido a su sensibilidad. Particularmente exigente es la separación electroforética de las amplificaciones de las llamadas regiones "microsatélites". Microsatélites son regiones repetidas en el genoma que se componen de muchas copias de una secuencia corta (por lo general son dinucleótidos). Estas regiones se diferencian a menudo en el largo solamente por dos nucleótidos. Para el análisis de dichas amplificaciones es importante un sistema electroforético de alto poder resolutivo. En estos casos se utilizan productos de la reacción PCR marcados radioactivamante o de otra manera. Estos son separados sobre geles finos PAA (estos geles se utilizan también para determinar la secuencia del ADN). Para detectar mutaciones puntuales se aprovecha la distinta forma de fusión de las amplificaciones que surgen a partir de las mutaciones. Para ese fin se preparan geles con gradientes lineares del desnaturalizante ("Denaturing Gradient Gel Electrophoresis - DGGE, MYERS y col., 1987). En la migración a través del gradiente las moléculas de ADN se desnaturalizan en forma paulatina en función del número de dominios de fusión (región topográfica de la hélice de ADN). Esto determina el diferente modo de fluir. En este sistema no es necesario buscar lugares de restricción polimorfos para la separación específica del alelo. Una sola mutación puntual altera la temperatura de fusión de un dominio determinado (25 a varios cientos de nucleótidos) hasta 1,5o C. La migración de los fragmentos parcialmente desnaturalizados en el DGGE es más lenta que el flujo de los fragmentos correspondientes no desnaturalizados. La separación electroforética de los fragmentos de cadenas simples en geles-PAA nativos brinda un método alternativo para la detección de mutaciones puntuales en amplificaciones obtenidas mediante la reacción PCR. Las amplificaciones desnaturalizadas con anticipación forman estructuras secundarias en el gel PAA nativo dependientes de la secuencia. Las diferentes mutaciones puntuales influyen de manera difícilmente pronosticable sobre las estructuras secundarias de los fragmentos. No obstante lo hacen de forma tan marcada que es posible identificar mutantes que difieren por una mutación puntual debido a la diferente movilidad entre dos amplificaciones. Reacción PCR múltiple (PCR Multiplex) Junto con la amplificación específica de una región flanqueada por un par de iniciadores que pertenecen a una matriz compleja, la elección de otros pares de iniciadores posibilita la amplificación de varios fragmentos específicos de ADN en una sola reacción PCR. Para ello se deben cumplir algunas condiciones: cada par de iniciadores debe responder a la exigencia general para los iniciadores descripta en el punto "componentes para la reacción", no debe existir alta homología entre los iniciadores de una reacción y finalmente todos deben tener similar temperatura de fusión (Tm). Reacciones PCR múltiples son reacciones concebidas con el fin de estudiar simultáneamente varias localizaciones (loci) del genotipo (p.e. diagnóstico génico de enfermedades hereditarias con un amplio espectro de diferentes mutaciones, exámenes de identidad, etc.). A veces se utiliza la reacción PCR Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 194 Dovc múltiple como reacción interna de control para comprobar la región haploide existente en el genoma (región específica para el cromosoma Y, PEURA y col., 1991). La importancia de la reacción PCR múltiple como reacción de control es cuestionable sobre todo en los casos en los cuales se amplifican muy pocas matrices y especialmente se supone que las amplificaciones en las diferentes localizaciones son sucesos independientes. Tipificación del genotipo de espermatozoides (Single Sperm Typing) La construcción de mapas génicos exigió hasta el momento el apareamiento selectivo, el estudio de la descendencia o la determinación de las combinaciones génicas en base a los datos obtenidos por el estudio del pedigree. La primera posibilidad fue aprovechada a menudo para animales. Para el estudio del genotipo humano sólo es considerada la segunda estrategia. La introducción de los marcadores RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) posibilitó dividir el genoma humano en sectores mas o menos regulares de 10 cM. El análisis del pedigree permite determinar las distancias génicas en sectores de 1 cM (en el hombre cerca de 100 kb) en forma estadísticamente asegurada. Para la estimación de distancias más cortas el número de datos requeridos sería demasiado grande por lo que este método parece ser inadecuado para estos objetivos. A partir de la introducción de la reacción PCR es posible amplificar el ADN de una célula en lugares específicos en forma tan abundante que las ampliaciones obtenidas son suficientes para fines analíticos. Durante la meiosis el ADN de las gametas puede ser afectado por crossing-over lo que genera nuevas recombinaciones además de las de origen materno y paterno. La frecuencia de éstas es un índice para la posibilidad de un crossing-over y la distancia entre loci investigados. Para estos estudios se adecuan individuos que son heterocigotas en ambas localizaciones examinadas. La amplificación simultánea de ambas regiones obtenidas de espermatozoides individuales y la posterior determinación del alelo para ambos loci permite identificar la variante de los padres como así también la recombinante (LI y col., 1988). En los ciclos iniciales se lleva a cabo una amplificación simultánea de ambos loci con dos pares de iniciadores (reacción PCR múltiple), luego se dividen los componentes para amplificar cada región separadamente. La detección de las variantes del alelo se lleva a cabo mediante la hibridación de las amplificaciones con aligonucleótidos específicos para el alelo marcado radiactivamente (OEA) o no. Los resultados de la tipificación de espermatozoides individuales demuestran que en 20% de los mismos no se produce amplificación. Para obtener resultados confiables estadísticamente se requiere evaluar una cantidad abundante de espermatozoides. A pesar que el trabajo con las células espermáticas individuales es relativamente complicado, este método es de gran valor para la obtención de cartas génicas, porque brinda resultados rápidos independientes del intervalo generacional. Determinación del sexo El sexado confiable de los embriones en estadios preimplantatorios es un problema actual en programas de TE. Existieron diferentes intentos para determinar el sexo: métodos inmunológicos o citogenéticos y otros mediante técnicas de ADN. Cabe destacar que se probó intensamente como alternativa de clasificar los espermatozoides antes de la fertilización. Los métodos que se fundaban en el diferente peso específico de los cromosomas X e Y demostraron no ser adecuados por la alta variabilidad del contenido citoplasmático. Igualmente el intento de seleccionar los espermatozoides X e Y según su motilidad en función del pH produjo resultados insatisfactorios. La detección inmunológica depende del reconocimiento específico del antigen HY propio del sexo masculino (BOOMAN, 1989). Este método dio resultados no confiables y mostró ser inadecuado para la aplicación práctica. La representación citogénica de los cromosomas sexuales es relativamente exigente y requiere para la determinación confiable del sexo un número alto de blastómeros. El problema principal de la determinación del sexo mediante sondas específicas para el ADN del cromosoma Y es el largo procesamiento y la baja sensibilidad de los sistemas de hibridación. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Reacción en cadena de polimerasa 195 También en este campo de diagnóstico del sexo la aplicación de la reacción PCR promovió una nueva estrategia en la búsqueda de una solución. En principio una sola copia del ADN-matriz es suficiente para amplificar una región. Como fue mencionado al tratar la amplificación del ADN de los espermatozoides, en algunos casos, el ADN de una célula no es suficiente para una amplificación exitosa. Por ello, para diagnosticar el sexo es conveniente disponer de 2 a 3 blastómeros para amplificar el ADN. Luego de aislar los blastómeros por medio de microcirugía, las células deben ser lisadas con el propósito de liberar el ADN genómico para su posterior amplificación. Para la amplificación de las secuencias del sexo se dispone de diferentes pares de iniciadores (p.e. BRY4a, REED y col., 1989). A menudo se eligen secuencias repetidas de los cromosomas sexuales para la amplificación. De esta forma se dispone desde un principio de un número mayor de copias, facilitando notablemente la obtención de la cantidad necesaria de amplificaciones para el análisis. En consecuencia se necesitan menos ciclos de amplificación (20 a 25), obteniéndose resultados más rápidos. Al amplificar secuencias específicas del cromosoma Y se obtienen amplificaciones sólo en embriones masculinos (HERR y col., 1990a, b). Para excluir errores durante la reacción es conveniente amplificar una región autosomal (GROBET y col., 1992). Esto hace necesario una reacción PCR múltiple con 2 pares de iniciadores por lo menos. La cuestionable relevancia del control de la reacción fue mencionada anteriormente. Una posibilidad alternativa para la amplificación de las secuencias específicas del sexo es la amplificación de las secuencias presentes tanto en el cromosoma X como en el Y. Estas secuencias, sin embargo, se diferencian por medio de mutaciones propias del tipo de cromosoma. Un ejemplo para dichas secuencias son los genes ZFX y ZFY (Zinc, MARDON y PAGE, 1989). Se trata de genes con una sola copia (Single Copy Gene) que existen tanto en el cromosoma Y como en el X. Ambos se diferencian, sin embargo, en un corto fragmento de la secuencia. Uno tiene un lugar de corte para la endonucleasa, el otro no. Esto conduce a un polimorfismo del largo de los fragmentos después de la restricción de las amplificaciones (REEP) con dicha enzima. Los iniciadores para las amplificaciones específicas de los genes ZFX y ZFY son aptos para un amplio espectro de especies. Ambos iniciadores son 25-meros, el iniciador 5-'P1-5EZ tiene la secuencia: 5'ATAATCACATGGAGAGCCACAACT-3. El iniciador 3'- tiene la secuencia: 5'GCATTTCTTTTGGTTATCTGACAAAGT-3' Los RFLPs de las ampliaciones fueron observados en las especies humana, bovina, ovina y caprina (AASEN y MEDRANO, 1990). La tabla 1 presenta los RFLPs observados en las esas especies. Tabla 1: Largo de los fragmentos y enzimas de restricción para la demostración del RFLP de los genes ZFX (445pb) y ZFY (447 pb) Largo de fragmento (pb) ZFX ZFY 400+45 445 272+173 272+173 317+84+46 344+103 447 447 Especie Humana Bovina Ovina Caprina Enzima HaeIII PstI SacI SacI Las amplificaciones tratadas con la correspondiente enzima de restricción o las amplificaciones específicas del cromosoma Y con sus correspondientes pruebas de control son separadas en gel de agarosa y coloreadas con bromuro de etidio. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 196 Dovc Foto 1: Amplificación de la secuencia específica repetida del cromosoma Y y RFLP de las amplificaciones específicas de los cromosomas X e Y. Las columnas 1 y 8: 100 pb marcador, columna 2: amplificación del ADN femenino con un iniciador específico del cromosoma Y. Columna 4 y 5: amplificación de los ADN masculino y femenino con iniciador P1-5EZ/P2-3EZ. Columna 6 y 7: división enzimática de los amplificadores de los ADN masculinos y femeninos con los iniciadores P1-5EZ/P2-3EZ Caracterización del genotipo Las características cuantitativas son de importancia para la zootecnia práctica. Estas son determinadas en forma poligénica y hasta el momento poco accesibles a los análisis de genética molecular. Pero hay algunos ejemplos que ilustran la importancia de algunos genes individuales para la producción animal. Las proteínas de la leche representan una familia de genes sumamente polimorfa. Las distintas variantes se distinguen en mutaciones puntuales y pequeñas pérdidas en el genoma. Existe especial interés en caracterizar la caseina y la lactoglobulina ß. Ambas enzimas tienen influencia sobre las cualidades de la leche (GRAML y col., 1987). Con la elección de iniciadores adecuados se pueden amplificar regiones polimorfas e identificar mutaciones puntuales mediante el RFLP. La principal ventaja de este método es la independencia de la expresión génica (el sistema es aplicable también en animales machos) y su rapidez (LIN y col., 1992). Control de la descendencia Para el control de la descendencia se aplican comúnmente secuencias altamente polimorfas y repetidas las cuales forman, en combinación con diferentes sondas, un sistema de alto poder de resolución. Con éste se pueden hacer afirmaciones estadísticamente seguras sobre la descendencia. Frecuentemente se utilizan regiones microsatélites (denominadas también VNTR, variable number of tandem repeat). Algunos alelos se distinguen en el largo de las repeticiones tándem (tandem repeat). Después de la amplificación con iniciadores que flanquean estas regiones se puede, luego de separar las amplificaciones en gel secuencial, identificar los polimorfismos. Con la combinación de varios loci aumenta el poder resolutivo de este método (GEORGES y col., 1991). Con fines forenses se emplean regiones con repeticiones de Tri- o Tetranucleótidos junto con los VNTRs. Para la aclaración de la descendencia materna se dispone del análisis de la secuencia de la región hipervariable (D-loop). En las especies mamíferas el ADNmt es de herencia materna y está presente en numerosas copias por célula. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Reacción en cadena de polimerasa 197 Diagnóstico de enfermedades hereditarias Las enfermedades hereditarias dependientes de un solo gen, con mutaciones bien definidas y que causan el desarrollo de los síntomas clínicos, son apropiadas para el diagnóstico por medio de la reacción PCR. El método se basa en la ampliación de la región que puede estar afectada por la mutación. En principio puede tratarse de mutaciones puntuales o pérdidas (deletions) en el genoma. Para el diagnóstico se disponen básicamente de 3 alternativas: hibridación de las amplificaciones con oligonucleótidos específicos para el alelo (OEA), análisis de restricción de las amplificaciones y determinación directa de la secuencia de la región amplificada. Con el surtido de endonucleasas disponibles actualmente en el mercado, es posible encontrar para casi todas las secuencias una enzima apropiada. Para la determinación directa de la secuencia de los productos de la reacción PCR se ofrecen varias alternativas. Una posibilidad es la concepción de una reacción PCR en la cual solo en los primeros ciclos ambas cadenas son sintetizadas. A continuación predomina la síntesis de una cadena. El incremento del producto de la reacción PCR es lineal en lugar de exponencial). Finalmente el producto es una cadena simple de ADN, la cual puede ser utilizada directamente como matriz para la secuencia a determinar. Otra posibilidad es la determinación directa de la secuencia del producto de cadena doble de la reacción PCR. Esto, sin embargo, parece ser difícil sobre todo con amplificaciones cortas. Una última posibilidad la presenta, por supuesto, el clonado de las amplificaciones y el posterior análisis de los clones recombinantes. Un ejemplo para el análisis de restricción de las amplificaciones es la detección de la anemia falciforme del hombre (SAIKI y col., 1985). Para ese fin se amplifica una región con un largo de 725 pb del gen de la -globulina y luego se divide la amplificación mediante la enzima CvnI. Con ello se obtienen dos fragmentos constantes (256 y 88 pb) y un fragmento de 381 pb de largo. Este puede ser dividido en dos subfragmentos (201 y 180 pb) si proviene de un individuo sano. En cambio en individuos con anemia falciforme una mutación puntual causa la pérdida del lugar de reconocimiento para la enzima (KAZAZZIAN, 1989). La identificación directa de la mutación es posible después del análisis electroforético de las ampliaciones tratadas enzimaticamente. La citrulinemia es una enfermedad hereditaria del bovino provocada por una mutación puntual en el gen de la enzima argininasuccinato sintetasa. En los animales que padecen esta enfermedad, el codón 86, que normalmente codifica para arginina, se transforma en un codón stop. La consecuencia es un producto génico corto en el locus que impide el normal desenvolvimiento del ciclo metabólico de la urea provocando un aumento de la concentración de citrulina con alteraciones patológicas. La mutación modifica también el lugar de reconocimiento de la endonucleasa AvaII, presente en animales sanos, de forma tal que en los animales con esa deficiencia genética el lugar con AvaII no se puede separar. Con la elección de una iniciador adecuado es posible amplificar una fragmento de 176 pb de largo, que produce dos fragmentos (98 bp + 78 pb) cuando los animales sanos son tratados con AvaII. En los animales enfermos falta el lugar de reconocimiento para AvaII (FÖRSTER, 1991). Diagnósticos de rutina para la talasemia- se basan en la hibridación específica del ADN amplificado con oligonucleótidos específicos para el alelo en combinación con el análisis de restricción. Aproximadamente la mitad de los más de 60 mutantes de la talasemia son identificables mediante el análisis de restricción. Las mutantes restantes son diagnosticables mediante el análisis de restricción. El resto de las mutantes es diagnosticable por medio de la hibridación Dot-blot con oligonucleótidos específicos para el alelo. La precisión del lavado debe ser establecida de tal manera que la diferencia entre las fuerzas de la señal de hibridación entre homocigotas y heterocigotas sea detectable con claridad. La secuenciación de las regiones amplificadas cobra particular importancia en la identificación de nuevas mutantes (WONG y col., 1987). Defectos ocasionados por pérdidas pequeñas pueden ser diagnosticados mediante la selección de iniciadores apropiados para ambos lados del lugar presumible de la pérdida. Un ejemplo de ello es el Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 198 Dovc diagnóstico de la distrofia muscular Duchenne. En una reacción PCR se emplean 18 iniciadores, que limitan 9 regiones más comúnmente afectadas por pérdidas del gen distrofin. La falta de las amplificaciones de la región determinada indica la mutación. En general este método es limitado por el largo de la amplificación en individuos sin pérdidas, dado que la amplificación de regiones que superan 2 kB es problemática y poco adecuada para el diagnóstico de rutina. Comprobación del transgen Como ocurrió en otras áreas de la genética molecular, la reacción PCR encontró rápidamente su aplicación en el diagnóstico de transgénesis. En la concepción del sistema de comprobación se hace uso, sobre todo, de las particularidades de la secuencia transferida. Se intenta amplificar los fragmentos del transgen no presentes en el ADN genómico endógeno o aquellos diferentes de la secuencia endógena (p.e. mutaciones puntuales que modifican las secuencias de reconocimiento para las endonucleasas, pérdidas, inserciones, etc.). En algunos casos el transgen se diferencia de la secuencia endógena por la falta de secuencias vectores o por las regiones promotoras. En ambos casos la presencia de elementos heterólogos puede ser utilizada para el diseño de iniciadores. Mediante la evaluación cuantitativa de la reacción PCR se puede deducir el número de copias del transgen. Con ese fin se lleva a cabo a menudo una co-amplificación en un locus endógeno para estimar la cantidad de la amplificación del transgen en función de la producción estandarizada de amplificaciones del locus de referencia. De singular importancia es la evaluación de la reacción PCR en la fase logarítmica dado que las diferencias causadas por la distinta cantidad original de ADN matriz son evidentes sobre todo en ese momento. El mejoramiento de la cuantificación significa una marcación estandarizada, covalente de las amplificaciones (iniciadores marcados en forma fluorescente). Diagnóstico de enfermedades infecciosas La reacción de PCR se ofrece como método diagnóstico para detectar infecciones, sobre todo las subclínicas porque su sensibilidad permite la detección de cantidades mínimas de ADN (teóricamente una sola copia de la molécula matriz es suficiente). Es posible comprobar secuencias integradas en el genoma (p.e. infecciones retrovirales) como también la presencia de secuencias episomales y extracelulares propias de las infecciones. La reacción de PCR facilitó un progreso importante en la investigación HIV. Se posibilitó el diagnóstico de secuencias provirales HIV-I de las células mononucleares de la sangre periférica, obtenida de pacientes sero-positivos; a pesar que no fue posible confirmar la infección a través del cultivo del virus (OU y col., 1988). De especial importancia es la aplicación de la PCR en el diagnóstico de infecciones subclínicas provocadas por agentes difícilmente cultivables in vitro. La elección del iniciador específico de especie garantiza la identificación del agente infeccioso. El polimorfismo en las regiones específicas de especie permite la identificación de las distintos tipos (DOVC y col., 1992). De esta forma se dispone, en el estudio etiológico de las infecciones, de un método eficaz que puede aclarar también los interrogantes forenses. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Reacción en cadena de polimerasa 199 Apéndice Protocolo de laboratorio para la amplificación de la región ZFX y ZFY de blastómeros. 1. Los blastómeros obtenidos por medio de microcirugía son suspendidos en 5µl de medio y transferidos a un tubo de ensayo Eppendorf. Se añaden 20 µl de agua bidestilada a fin de alcanzar un volumen final de 25µl. Posteriormente los blastómeros (3-5) son congelados cíclicamente 10 veces en hielo seco y descongelados a 96o C en un termociclador. En el último ciclo el tratamiento térmico es prolongado a 10 minutos. Luego las pruebas son mantenidas en hielo. Para la reacción PCR se prepara la siguiente solución "Master-mix" (expresada en µl): H2O 8,5 10 x buffer 5,0 dNTPs 5,0 Iniciador 3,0 + 3,0 Polimerasa Taq 0,5 25µl de Master-mix son incorporados a la solución con los blastómeros lisados. Todo se cubre con 60µl de parafina. La reacción de PCR se lleva a cabo en el termociclador: 1 min: 94o C 1 min: 60o C 1 min: 72o C 25 ciclos En el primer ciclo se prolonga el primer paso a 5 min y en el último ciclo el último paso a 4 min. 6. 7. Después de 25 ciclos se añade 0,5 ml de polimerasa Taq, posteriormente se sigue con otros 25 ciclos. Después de 50 ciclos se produce la división enzimática de las amplificaciones. Luego la electroforesis en gel. 2. 3. 4. 5. Bibliografía AASEN, E. and MEDRANO, J.F. 1990. Amplification of the ZFY and ZFX genes for sex identification in humans, cattle, sheep and goats. Bio/technology, 8: 1279-1281 BOOMAN, P. 1988. Sexing of bovine preimplantation embryos. 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Por otro parte, el embrión constituye un genotipo por sí mismo lo cual representa otra ventaja (genética) con respecto al semen que sólo representa una parte del genotipo deseado. La transmisión de enfermedades por el embrión puede deberse a agentes patógenos presentes en el embrión o en el líquido en que es vehiculizado. Teniendo en cuenta ambas posibilidades, existen 6 tipos de riesgo de contaminación vía embrionaria (THIBIER, 1990). 1) En primer lugar se debe tener presente la posibilidad de la contaminación intracelular. Si bien este es un riesgo potencial para ambas gametas (ovocito o espermatozoide) y algunos ejemplos han sido puestos en evidencia en el ratón (JAENISCH y BERNS, 1977 y MIMMS, 1966), ninguna evidencia ha sido hasta el presente demostrada en los animales domésticos de granja. 2) La penetración de un agente patógeno en el embrión puede ocurrir tanto en el momento de la fecundación como por acción propia del agente. En el primer caso se ha observado que al menos en dos enfermedades a virus (lengua azul y BHV-1) los espermatozoides presentaban adheridos al agente cuando se obtuvieron de toros infectados (FOSTER y col., 1980; ELHAZHARY y col., 1980). Estos tendrían capacidad infectante en caso de fecundar. Sin embargo, las precauciones descriptas previamente para la aceptación de un toro dador, hacen esto poco menos que imposible. Para el segundo caso, son sólo excepciones descriptas en el ratón (GWATKIN, 1967) en que se ha mostrado capacidad de atravesar la membrana pelúcida. Hasta el momento no ha sido descrito ningún agente infeccioso capaz de atravesar la membrana pelúcida en los animales domésticos. 3) Un riesgo de tercer nivel es el de la presencia de agentes patógenos en el ambiente uterino. Si bien en condiciones naturales es prácticamente imposible una fecundación o el desarrollo normal de un embrión temprano en presencia de agentes patógenos en trompas o útero, algunos de estos agentes han sido encontrados en trabajos experimentales con virus de la IBR/IPV o de la FA (SINGH y col., 1983; McVICAR y col., 1986). En el mismo sentido se sabe que algunos virus, en algunas especies, pueden estar protegidos y/o adheridos a la superficie de la membrana pelúcida sin que se puedan eliminar por el lavado, como es el caso del virus IBR/IPV (SINGH y col., 1982). 4) Riesgo de contacto con agentes patógenos en el momento de la recolección, debido a infecciones del tracto genital externo o a maniobras inapropiadas durante el lavaje. 5) Riesgo de contaminación durante las manipulaciones in vitro. Además de las manipulaciones corrientes (búsqueda, evaluación, lavado, acondicionamiento) debe recordarse que también pueden llevarse a cabo otras que implican una ruptura de la membrana pelúcida (congelación, bisección, biopsiado para sexaje). Estas últimas deberán llevarse a cabo en medios controlados y esterilizados previamente. 6) Existe por último el riesgo de trasmitir agentes patógenos en el momento o en las maniobras destinadas a su transferencia. Medidas elementales de manejo en esta maniobra hacen de este riesgo uno de los más improbables. Los riesgos de la transmisión de agentes patógenos Los embriones bovinos son transferidos entre los días 6-8 de desarrollo. Este corto período de vida intrauterina reduce sensiblemente las posibilidades de que los embriones puedan ser contaminados, Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 202 Alberio tanto más por el hecho que sólo estarán expuestos a aquellos agentes liberados al tracto reproductivo. El período de recolección mencionado garantiza la existencia de la membrana pelúcida que como se dijo antes, es impermeable a la mayoría de los agentes infecciosos. Los parásitos, bacterias y hongos son fácilmente descartados en su capacidad de penetrar, por su gran tamaño. Sólo los virus podrían cuestionarse aunque no se han determinado penetraciones virales en el bovino. En el caso eventual de agentes patógenos en el tracto genital, el hecho de utilizar grandes volúmenes de medio para la recolección de los embriones provoca automáticamente una gran dilución de dicho agente. El lavado del embrión así como el agregado de enzimas y/o antibióticos, reducen la posible presencia de agentes patógenos. Por último, la congelación misma ha demostrado ser eficaz en la inactivación de muchos virus que se pueden adherir al embrión (SINGH, 1987). Numerosas investigaciones dejaron en claro, en los últimos años, los pocas posibilidades de transmitir agentes patógenos por vía del embrión correctamente tratado Agentes patógenos a considerar En principio, todos los tipos de microorganismos deben ser tenidos en cuenta. Sin embargo, prácticamente, sólo los virus pueden constituirse en agentes de verdadero peligro, debido a sus características biológicas. Las bacterias y otros microorganismos representan un riesgo de segundo orden. Alrededor de unos 50 agentes han sido o son investigados para determinar los riesgos que su transmisión podría tener a través del embrión. En este estudio, realizado recientemente por el Subcomité de Investigación de la IETS, se concluyó también que no es posible hacer extrapolaciones entre especies para un mismo agente ni entre agentes dentro de la misma especie. Una de las razones principales es la característica específica de la membrana pelúcida (CHEN SHI SONG y WRATHALL, 1989) que la haría reaccionar de forma diferente ante un mismo agente patógeno. En una reciente revisión sobre el tema realizada por SINGH (1988) se presentan resultados concernientes a embriones obtenidos de animales seropositivos o infectados con diferentes bacterias y virus y su efecto o determinación tanto sobre los embriones (Cuadro 1) como sobre las receptoras o los productos nacidos de la transferencia. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Sanidad de la TE 203 Cuadro 1: Determinación de presencia de agentes patógenos sobre embriones de vacas seropositivas o infectadas (SINGH, 1988) Estado de la donante BLV sero+ BVDV sero+ BTV infectada FMDV infectada IBR sero+ IBR infectada Peste bovina infecciosa B. Abortus infecciosa C. psitaci inf. M. paratub. inf. No de ovocitos y embriones colectados 60 (26) 2 (21) 51 (14) 302 (21) 13 (18) 63* 107 160 5 7 MEBUS y col., 1987 VOEKEL y col., 1978 BOWEN y col., 1978 JORGENSEN y RASBACH (no publicado) Agentes sobre el embrión - Referencias BOULLANT y col. 1981 SINGH y col. 1982 BOWEN y col. 1983 McVICAR y col., 1987 MEBUS Y Col., 1987 SINGH y col., 1982 * tratados con tripsina Abreviaturas ver glosario al final del capítulo En ningún caso fue detectada su presencia en el embrión, seroconvertibilidad o enfermedad en receptoras o terneros nacidos (Cuadro 2). Cuadro 2: Transferencia de embriones provenientes de donantes sero-positivas o infectadas (SINGH, 1988) Estado de la donante BLV sero+ BTV sero+ BTV infectada 334 IBR infectada IBR sero+ B. Abortus sero+ 64* 1500 39 THOMAS y col., 1983 SINGH y col., 1987 THIBIER y NIBART, 1987 del CAMPO y col., 1987 No de embriones transferidos 596 1500 Serologia de donantes o hijos Referencias EAGLESOME y col., 1982 THIBIER y NIBART, 1987 *tratadas con Tripsina Abreviaturas, ver Glosario al final del capítulo. En todos los casos señalados se utilizaron o estudiaron embriones después de sucesivos lavados tal como se describirá mas adelante. Tales lavados no garantizan "la limpieza" de la totalidad de los Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 204 Alberio agentes como fuera demostrado en el caso de embriones expuestos a IBR y a VSV (SINGH, 1987). La adherencia de los virus a la membrana pelúcida no pudo ser anulada por los simples lavados y fue necesaria una corta exposición a la tripsina para eliminarlos (Cuadro 3). Cuadro 3: Efecto de la tripsina sobre la adherencia de virus de IBR y VS en embriones previamente expuestos a ellos (SINGH, 1987) No de embriones expuestos 80 96 % de embriones con virus 70 30 Referencias Tratamiento Sin tripsina IBR VS Con tripsina IBR VS SINGH y col., 1982 SINGH y THOMAS (no publicado) SINGH y col., 1982 SINGH y THOMAS (no publicado) 32 23 0 0 Sobre esto último, el tratamiento con tripsina no parece necesario ya que THIBIER y NIBART (1987) transfirieron más de 1500 embriones provenientes de vacas IBR seropositivas sin modificar la serología negativa de las vacas receptoras. Tal vez esto se deba a que si hubiese habido presencia de virus en útero, no hubiese habido fecundación o desarrollo de los embriones en dicho medio (THIBIER, 1990). Con respecto a la fiebre aftosa, enfermedad endémica y de gran trascendencia en los países de América del Sur, en un reciente trabajo realizado en Argentina y supervisado por los Departamentos de Agricultura de EE.UU. y Canadá, se demostró que los sucesivos lavados de los embriones son suficientes para eliminar el virus al que fueron expuestos. En el mismo trabajo se demostró que los embriones provenientes de vacas y toros que sufrieron la enfermedad y transferidos a vacas seronegativas, no modificaban tal estado en las receptoras. También se verificó esto en los terneros nacidos así como la ausencia de signos clínicos de la enfermedad en éstos y en sus madres (VILLAR y col., 1991). En trabajos de exposición de embriones a diferentes agentes virales se demostró que ninguno afectaba la viabilidad de los mismos. Por el contrario, la exposición a B. abortus producía una disminución de la viabilidad embrionaria (SINGH, 1987). En la mayoría de los animales infectados o seropositivos a varios virus (BLV, BTV, FMDV, IBR) y a B. abortus, se obtuvo presencia de los agentes patógenos en los fluidos de lavajes (SINGH, 1987). De ésto se puede concluir, que frente a varios agentes que pueden estar presentes en el útero los embriones desarrollan pero las manipulaciones in vitro (lavajes, tripsinado) son suficientes para corregir su infección. Fuera de lo mencionado, también algunas bacterias pueden adherirse o adsorberse a la membrana pelúcida tales como el Haemophilus sommus (THOMSON y col., 1988), los ureaplasmas (BRITTON y col., 1988) y los mycoplasmas (BIELANSKY y col. 1990). Sin embargo, su sensibilidad ante los antibióticos resta importancia a estas adherencias bacterianas. Como conclusión es posible afirmar que: - Hasta el presente no se ha detectado en el bovino ningún agente patógeno capaz de atravesar la membrana pelúcida por sí solo. La integridad de la misma es entonces una condición sine qua non para garantizar la salud del embrión. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Sanidad de la TE 205 - Para todos los agentes patógenos que se encuentran en el medio de colecta o en las inmediaciones del embrión pero que no se adsorben al mismo, el correcto lavaje del embrión es suficiente para su eliminación. El correcto lavaje significa: realización de diez baños sucesivos con una dilución de 1/100 en cada pasaje cambiando la pipeta en cada baño. Al final de este proceso el medio deberá permanecer estéril. -En el caso de embriones con virus adsorbidos (VSV, IBR) deben complementarse los baños normales con un tratamiento adecuado con tripsina. -Debe tenerse en cuenta la posible presencia de agentes patógenos en sueros fetales o albúminas bovinas utilizadas en los medios De acuerdo con lo descrito anteriormente y según el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas (Anexo I) por medio de la transferencia de embriones, la IETS ha categorizado en el año 1989 a las enfermedades en cuatro grupos (Anexo II). Tal categorización es incluida posteriormente por la OIE en sus recomendaciones generales sobre el tema. Condiciones Generales de las precauciones sanitarias en la transferencia de embriones De acuerdo con lo analizado hasta este momento es posible definir claramente los dos puntos centrales donde a través del uso de la transferencia de embriones se puede transmitir una enfermedad. Estos dos puntos son respectivamente la fase in vivo y la fase in vitro. - Fase in vivo: concierne a los animales dadores (toros y vacas) involucrados en el proceso. Es claro que los mismos pueden ser vectores de agentes patógenos hacia el embrión, pero hemos visto que existen las metodologías de laboratorio para contrarrestar la mayor parte de las situaciones estudiadas. - Fase in vitro: involucra fundamentalmente al hombre y al entorno en que se realizan las manipulaciones. La corrección en el desarrollo de estas últimas de acuerdo con las normas actualmente existentes dan la garantía de máxima confiabilidad en la técnica de transferencia de embriones. Cabría agregar por último una tercera fase de vigilancia (nuevamente in vivo) que es la que se puede establecer a nivel de las receptoras elegidas como sanas y mantenidas luego de la TE en cuarentena el tiempo necesario para determinar que no hay seroconversión o signos clínicos. De todas formas surge como trascendente la segunda fase, ya que poniendo énfasis en la misma es posible una cierta flexibilidad en la primera, posibilitando así una mayor facilidad en la realización de intercambio de genotipos. A pesar de esto, la profilaxis basada en el estado sanitario de las donantes sigue siendo la norma más corrientemente aceptada. Se parte así de la premisa que si el animal donante está sano, también lo estarán sus embriones. Aplicando estos criterios generales, las exigencias reglamentarias de los países difieren desde aquéllas que van de la no importación de embriones desde países donde existe determinada enfermedad hasta otros que sólo exigen que la donante se encuentre libre de enfermedades específicas. Los niveles o criterios establecidos para la manipulación de semen (condiciones sanitarias del país o territorio; condiciones sanitarias del rebaño o rodeo y condiciones sanitarias del animal) son entonces adoptados para los embriones. Sin embargo, las características propias del embrión en cuanto al manejo del semen así como los costos y limitaciones que se le impondrían a la transferencia de embriones han provocado una evolución inteligente de las exigencias y reglamentaciones recomendadas actualmente. Pasos dados en tal sentido por países que marcan rumbos en esta temática (EE.UU., CEE), permiten esperar una evolución favorable en las normas actuales. A su vez las investigaciones sobre este tema continúan por lo que también esto contribuirá a la dinámica de tales reglamentaciones. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 206 Alberio Normas propuestas para el control sanitario en el intercambio internacional de embriones Como para el caso del semen, existen normas generales a seguir en cada uno de los pasos de la transferencia de embriones, destinadas al intercambio internacional de los mismos. Estas normas generales tienen luego variantes en su aplicación por los países y se refieren a los siguientes aspectos: 1. Características de la Unidad de Transferencia de Embriones 2. Condiciones del equipo humano y de los materiales utilizados 3. Requisitos de la donante 4. Manipulación sanitaria de los embriones 5. Infraestructura y personal 5.1. Unidad de Transferencia de Embriones Estas unidades se encontrarán debidamente inscriptas en los Servicios Sanitarios correspondientes, estarán bajo la supervisión de un Profesional Veterinario también inscripto para la realización de estas tareas y deberá contemplar las siguientes subunidades o sectores: 5.1.1. Sector de alojamiento y servicio de los animales. Será un área destinada a los animales incluidos en todo el programa de transferencia de embriones. Puede encontrarse en una unidad de transferencia de embriones o en una explotación. En ambos casos estos animales estarán aislados de todo animal que no esté comprendido en el programa. 5.1.2. Sector de colecta. El mismo puede ser un lugar cerrado o abierto pero en ambos casos deberá contar con instalaciones apropiadas para el correcto manejo de los animales y deberá permitir una buena limpieza y desinfección previas a cada manipulación. Asimismo deberá asegurar que las intervenciones sobre las hembras se hagan en buenas condiciones higiénico-sanitarias. 5.1.3. Sector de procesamiento de embriones. Deberá ser un ambiente cerrado, fijo o móvil. En él se llevarán a cabo la totalidad de las manipulaciones a que son sometidos los embriones (búsqueda, evaluación, lavaje, acondicionamiento, congelación, etc.). El sector deberá contar con materiales (piso, paredes y techos) impermeables y que soporten los lavajes y desinfecciones repetidas. Deberá tener mesada/s anticorrosivas, desagües, agua fría y caliente y estar protegida de la presencia de roedores e insectos. En ella estará el material utilizado para las manipulaciones entre las cuales una lupa con aumento x 50 y equipo de congelación. Será lavado y desinfectado previo a cada uso. 5.1.4. Sector de almacenamiento de embriones. Se trata de un local sólo destinado a almacenar embriones, con características semejantes a las descriptas en 1.3. Especialmente: que permita la limpieza y desinfección repetidas, protegida de roedores e insectos y lavada y desinfectada antes de ser usada para conservar embriones. Contendrá los termos de nitrógeno líquido necesarios. 5.1.5. Sector de lavado, desinfección y esterilización. Será un ambiente cerrado con características similares al descrito en 1.3 y destinado únicamente a su uso específico. Se anexan las normas propuestas por la OIE (1986) correspondientes a las Unidades de Recolección (Anexo III). 5.2. Personal que participa en el programa y materiales utilizados. 5.2.1. El personal que realiza y supervisa el desarrollo del programa constituye el eje sobre el cual deberá garantizarse el éxito técnico y sanitario de un programa de transferencia de embriones. Un equipo oficialmente inscripto debiera poseer las cuatro condiciones siguientes (THIBIER, 1990): Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Sanidad de la TE 207 - estar compuesto por personal competente tanto en lo técnico como en lo higiénico-sanitario y comprenderá al menos un profesional veterinario. - poseer un equipamiento adecuado y trabajar en instalaciones de acuerdo con lo descrito en el punto 5.1. - aceptar seguir rigurosamente todas las recomendaciones exigidas para la manipulación de embriones, en los textos correspondientes (Normas OIE, IETS, etc.). - aceptar someterse con regularidad a un control de calidad destinado especial-mente a asegurar la ausencia de agentes infecciosos en muestras de líquidos de colecta, lavaje, y ovocitos o embriones degenerados. Condiciones como las descriptas e impuestas en muchos países (CEE) dan a los servicios sanitarios oficiales las garantías necesarias para otorgar las correspondientes autorizaciones. 5.2.2. Los materiales utilizados en la colecta y manipulación de embriones estarán correctamente lavados y esterilizados (Ver Anexo IV). 5.3. Requisitos de la donante Los requisitos generales exigidos para la donante son los descriptos en el Sector IV, Capítulo I del Manual de la IETS. Es conveniente sin embargo discriminar algunos requisitos específicos que son los que actualmente posibilitan el intercambio internacional de embriones entre países con determinadas enfermedades y otros libres de ellas. Al respecto parece interesante mencionar la reglamentación actualmente propuesta por la APHIS (Animal and Plant Health Inspection Service) para regular la importación de embriones desde países donde existe actualmente la fiebre aftosa o la peste bovina (Federal Register, 1990). Hasta el presente era imposible este tipo de intercambio y las pautas propuestas aquí, producto de los continuos avances en las investigaciones en el tema, abren nuevas y excelentes perspectivas para países infectados con enfermedades como FA. Las normas propuestas en tal documento con respecto a las donantes incluyen: 5.3.1. Durante el año previo a la colecta de embriones ningún caso de FA, PB, CBP, RVF, VS, BSE o cualquier enfermedad transmisible de los rumiantes deberá haber ocurrido en la Unidad de Transferencia de Embriones o en el rodeo de donde proviene la donante. 5.3.2. Durante el año previo a la colecta, ningún caso de las enfermedades mencionadas en 3.1 habrá ocurrido dentro de un radio de 5 km de la Unidad de Transferencia de Embriones o del rodeo donde estuvo la donante. 5.3.3. Durante los 60 días previos a la colecta, la donante no ha sido vacunada contra FA o PB. 5.3.4. Durante los 60 días previos al ingreso a la Unidad de Transferencia de Embriones (al menos 24 horas antes a la realización del servicio que dará lugar a los embriones) las donantes permanecerán en un mismo rodeo y ningún animal se incorporará al mismo. 5.3.5. En el día de la colecta de embriones y entre 30 y 120 días después se tomarán muestras de suero (10 ml) que serán congeladas y enviadas al Foreign Animal Dissease Diagnostic Laboratory para su análisis. Si alguna de las siguientes enfermedades existe en el país de origen (FA, CBP, RVF, VS, PB) la donante será evaluada para certificar que está libre de tales enfermedades, a partir de las muestras tomadas. También podrá evaluarse presencia o ausencia de brucelosis en estas muestras si la donante no proviene de un rodeo certificado como libre de la enfermedad. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 208 Alberio 5.3.6. Si la donante no proviene de un establecimiento certificado libre de tuberculosis, se deberá realizar un test de tuberculina intradérmica entre 30 y 120 días después de la recolección de los embriones y después de 60 días de cualquier aplicación intradérmica para detectar tuberculosis previa. 5.3.7. Entre 30 y 60 días después de la colecta la donante debe ser revisada por el veterinario oficial y estar libre de las enfermedades descriptas en 3.1, brucelosis y tuberculosis. 5.3.8. Embriones producidos por una donante que muere antes de realizados los tests dentro de los tiempos requeridos, no podrán ser aceptados. 5.3.9. Desde el momento de la colecta de embriones hasta terminar los tests mencionados, ningún animal en la unidad de transferencia de embriones ni en el rodeo de origen de la donante exhibirá evidencias clínicas de algunas de las enfermedades descriptas en 3.1. En lo concerniente a la CEE y en particular con respecto a la FA, sus reglamentaciones indican que un embrión fresco proveniente de un animal que se encuentra en un país donde se vacuna contra FA no puede entrar a otro país donde no se vacuna. Sin embargo, un embrión congelado sí puede hacerlo a condición que no haya habido vacunación en los 30 días previos a la colecta y que haya pasado un mínimo de 30 días entre la colecta y la expedición del embrión. Sobre estos ejemplos se pueden encontrar versiones diversas para cada país. Es paradojal a veces que países de América Latina donde existen la mayoría de las enfermedades mencionadas, tengan en sus reglamentaciones cláusulas más estrictas que en EE.UU. y la CEE donde muchas de ellas han sido erradicadas. En la versión de 1986 del Código Zoosanitario Internacional de la OIE, las normas simplificadas para el manejo de las donantes (referidas como ejemplo a FA) son las siguientes: Si la importación es a partir de países libres de FA, los Servicios Veterinarios deberán solicitar la presentación de un certificado internacional de salud que indique: - Las donantes estarán en un rodeo sin cambios en los 30 días previos a su partida a la Unidad de Transferencia de Embriones. - Ni la donante ni otro animal del rodeo presentará signos clínicos de FA durante las 24 horas previas a su partida a la unidad de transferencia de embriones y por los siguientes 30 días. - Las donantes serán inseminadas con semen de acuerdo a lo descrito en los capítulos correspondientes. - La unidad de transferencia de embriones será libre de FA en los 30 días siguientes a la colecta. Si la importación es a partir de países considerados infectados con FA, el certificado de salud exigido por los Servicios Sanitarios oficiales deberá indicar: - La donante y todo otro animal en el rodeo de origen no mostrará signos clínicos de FA durante las 24 horas previas a su partida a la Unidad de Transferencia de Embriones ni en los 30 días posteriores. - La donante estuvo aislada en el establecimiento de origen por los 30 días previos a su partida a la Unidad de Transferencia de Embriones y mostró signos negativos a los tests diagnósticos de FA. - No ha sido vacunada contra FA o, - fue vacunada con vacuna cumpliendo los estándares de la OIE (el tipo y línea de virus también deberá consignarse en el certificado). - Fue inseminada con semen proveniente de toros de acuerdo a lo descrito en los capítulos correspondientes. - Fue transportada a la Unidad de Transferencia de Embriones sin pasar a través de una zona infectada y la Unidad de Transferencia de Embriones se mantuvo libre de FA hasta 30 días después de la colecta. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Sanidad de la TE 209 De los tests habitualmente realizados sobre las muestras de sangre tomadas se pueden mencionar los siguientes: a) para FA: test VIA. También y como complemento para FA se puede solicitar el test de aislamiento viral a partir de hisopado faríngeo (Probang Test). b) para IBR: seroneutralización o test de ELISA. c) para VS: fijación de complemento o seroneutralización. d) para lengua azul: inmunodifusión en agar gel. e) para brucelosis: prueba de seroaglutinación lenta en tubo (WRIGHT). Se aceptará negativa la dilución 1/50. A las precauciones descriptas al comienzo de este capítulo y propuestas por los EE.UU. en el Federal Register (1990) se deberán agregar las siguientes: 5.3.1. Al menos 24 horas antes de realizar el servicio para producción de embriones, la donante deberá ser alojada en la unidad de transferencia de embriones. 5.3.1.1. La donante quedará en la unidad de transferencia de embriones hasta la colecta de embriones y durante los 30 días posteriores a la misma. 5.3.1.2. Durante el período en que la donante permanezca en la Unidad de Transferencia de embriones ningún animal puede estar en contacto con ella a menos que: - haya seguido los mismos pasos ya descriptos para la donante. - sea parte del rodeo de origen de la donante. - sirva como toro donante en cuyo caso habrá sido evaluado como se describió previamente. 5.4. Manipulación sanitaria de los embriones. Todo lo concerniente a los medios de colecta y lavaje, procedimiento de lavaje y/o tripsinado de los embriones y evaluación de la integridad de la membrana pelúcida de los mismos es descrito en detalle en la Seccción IV, Capítulo II del Manual de la IETS. Como medida precautoria suplementaria, en estas etapas de laboratorio también serán tomadas muestras que permitan determinar la inexistencia de microorganismos en el embrión antes de su transferencia. Como los procedimientos a realizar destruirían al embrión si se llevaran a cabo en él, se procede a realizar pruebas indirectas tomando muestras de los fluidos de colecta y de los cuatro últimos lavados de embriones y todos los ovocitos sin fertilizar y embriones anormales. Los procedimientos para las tomas de estas muestras se encuentran en la Sección IV, Capítulo II, del Manual de la IETS (Anexo IV). Asimismo y como complemento de lo antes descrito, se anexan las normas propuestas por la OIE (Código Zoosanitario Internacional, 1986) para las elaboraciones de los correspondientes Certificados Zoosanitarios Internacionales que deberán tener en cuenta las Administraciones Veterinarias. Los ejemplos que se adjuntan son los descriptos por la OIE en 1986. Conclusiones A partir del material aquí presentado se puede concluir que gracias al desarrollo de biotecnologías como la obtención y procesamiento de semen y embriones, el intercambio internacional de genotipos es actualmente factible con muy buenas garantías de no ser al mismo tiempo vectores de enfermedades contagiosas. Si bien hasta el presente ninguna de las alternativas mencionadas da una seguridad absoluta de la no transmisibilidad de enfermedades por estas vías, las normas y reglamentaciones existentes, basadas en trabajos de investigación intensos llevados a cabo en los últimos años, dan márgenes de seguridad suficientes como para que la mayoría de los países utilicen estas metodologías. Una observación importante es que muchas de estas normas de prevención han ido haciéndose menos rígidas a medida que nuevos trabajos demostraban que eran innecesarias. De esta manera, y para el caso particular de los embriones, las condiciones de seguridad que brinda el producto final, asociado Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 210 Alberio con la disminución de algunas de las trabas sanitarias han hecho que sea actualmente el material de elección para el intercambio de genotipos. De la misma manera, el uso de esta metodología como base para la conservación de genotipos (Banco de Germoplasma) dará garantías suficientes para el uso futuro de este material sin riesgos sanitarios. BIBLIOGRAFIA BIELANSKI, A., EAGLESOME, M., RUHNKE, H. y HARE, W. 1990. Isolation of Mycoplasma bovis from intact and microinjected preimplantation bovine embryos washed or treated with trypsin or antibiotics. J. in vitro Fert, Emb. Trans. (en prensa). BOWEN, R., SPEARS, P., STORZ, J. y SEIDEL, G.Jr. 1978. Embryo Mechanism of infertility in genital tract infections due to Chlamydia psittaci transmitted through contaminates semen. J. Infect. Dis. 138: 95-98. 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LISTA DE ENFERMEDADES SEGUN SU PELIGROSIDAD E IMPACTO ECONOMICO LISTA A A 010 A011 A012 A013 A014 A015 A016 A017 A020 A021 A022 A030 A040 A050 A060 A070 A080 A090 Fiebre aftosa (FA) FA - Virus O FA - Virus A FA - Virus C FA - Virus SAT 1 FA - Virus SAT 2 FA - Virus SAT 3 FA - Virus Asia 1 Estomatitis vesicular (EV) EV - Virus Indiana EV - Virus New Jersey Enfermedad vesicular del cerdo Peste Bovina Peste de los pequeños rumiantes Perineumonía contagiosa bovina Dermatosis nodular contagiosa Fiebre del Valle de Rift Lengua Azul Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 212 Alberio LISTA B Enfermedades comunes a varias especies B051 B052 B053 B055 B056 B057 B058 B059 Carbunco bacteridiano Enfermedad de Aujeszky Equinococosis/Hidatidosis Cowdriosis (heartwater) Leptospirosis Fiebre O Rabia Paratuberculosis Enfermedades de los bovinos B101 B102 B103 B104 B105 B106 B017 B018 B019 B110 B111 B112 B113 B114 Anaplasmosis Babesiasis Brucelosis bovina (B.abortus) Campilobacteriosis genital bovina Tuberculosis bovina (Mycobacterium bovis) Cisticercosis (C.bovis) Dermatofilosis Leucosis bovina enzoótica Septicemia hemorrágica Rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR/IPV) Theileriasis Tricomonosis Tripanosomosis Fiebre catarral maligna LISTA C Enfermedades comunes a varias especies C611 C612 C613 C614 C615 C616 C617 C618 C619 C620 C621 C622 Listerelosis Toxoplasmosis Melioidosis Carbunco sintomático Botulismo Otras infecciones clostridiales Otras pasteurelosis Actinomicosis Salmonelosis intestinales Coccidiosis Distomatosis hepática Filariasis Enfermedades de los bovinos C652 C653 C654 Enfermedad de los mucosas/Diarrea viral bovina Disenteria vibriónica Barros Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Sanidad de la TE 213 CATEGORIZACION DE LAS ENFERMEDADES DE ACUERDO CON EL RIESGO DE SU TRANSMISION POR LOS EMBRIONES SEGUN LA IETS Conclusiones de la Sociedad Internacional de Transferencia de embriones (IETS) Comité de importación/exportación Subcomisión de investigaciones San Diego (Estados Unidos), 15-17 de enero de 1989. Luego de la revisión, efectuada en 1988 por la Subcomisión de Investigaciones, Comité de Importación/Exportación de la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones (IETS) y de las informaciones en el terreno con relación a las enfermedades infecciosas, estudiadas desde el punto de vista del riesgo de su transmisión por la transferencia de embriones, la IETS clasificó estas enfermedades en las siguientes categorías: Categoría 1 Enfermedades o agentes de enfermedades para los que se han reunido pruebas suficientes como para afirmar que el riesgo de transmisión es despreciable, a condición de que los embriones se manipulan correctamente1 entre la recolección y la transferencia: -Leucosis bovina enzoótica -Fiebre aftosa (bovinos) -Brucella abortus (bovinos) Categoría 2 Enfermedades para las que se han reunido pruebas que indican que el riesgo de transmisión es despreciable, a condición de que los embriones se manipulen correctamente* entre la recolección y la transferencia, pero para las que hay que verificar los datos existentes mediante nuevas transferencias: - Rinotraqueítis infecciosa bovina - Lengua Azul (bovinos) - Enfermedad de Aujeszky (cerdos) - Peste porcina clásica Categoría 3 Enfermedades o agentes de enfermedades para los que los resultados preliminares indican que el riesgo de transmisión es despreciable, a condición de que los embriones se manipulen correctamente** entre la recolección y la transferencia pero para los que dichas comprobaciones preliminares deben corroborarse con datos experimentales complementarios, in vitro e in vivo: - Peste bovina (bovinos) 1 * Manual de la IETS (Recomendaciones para la manipulación higiénica de los embriones) **Manual de la IETS (Recomendaciones para la manipulación higiénica de los embriones). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 214 Alberio - Enfermedad de la mucosa (DVB) - Lengua Azul (ovinos) - Campylobacter fetus (ovinos) - Fiebre aftosa (cerdos) - Enfermedad vesicular del cerdo - Peste porcina africana - Temblor epidérmico del carnero - Haemophilus somnus Categoría 4 Enfermedades o agentes de enfermedades que han sido o son objeto de trabajos preliminares: -Virus Akabane (bovinos) -Estomatitis vesicular (bovinos y cerdos) -Chlamydia psittaci (bovinos) -Ureaplasmas/micoplasmas (bovinos) -Maedi-visna (ovinos) -Adenomatosis pulmonar (ovinos) -Temblor epidérmico (caprinos) -Lengua Azul (caprinos) -Artritis y encefalitis caprina -Parvovirus (cerdos) -Enterovirus (cerdos) -Leptospirosis (cerdos) Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Sanidad de la TE 215 NORMAS PROPUESTAS POR LA OIE PARA LAS UNIDADES DE RECOLECCION DE EMBRIONES (Código 1986) 5.2.3.: UNIDADES DE RECOLECCION Autorización sanitaria con miras a la exportación Anexo 5.2.3.1. OVOCITOS/EMBRIONES BOVINOS A. Objetivos del control El objetivo del control sanitario oficial de los óvulos/embriones de bovinos destinados a los intercambios internacionales es garantizar la ausencia de gérmenes patógenos específicos eventualmente asociados a los óvulos/ embriones y evitar todo riesgo de infección de las hembras receptoras y de su descendencia. Puede haber o no similitud de situación sanitaria entre el país exportador y el país importador; los programas nacionales de control pueden variar considerablemente, al igual que las condiciones exigidas para las vacunaciones y las pruebas diagnósticas. Por ellos, las condiciones de autorización de las Unidades de recolección y de los laboratorios de tratamiento asociados a ellas, pueden ser diferentes en el país exportador y en el país importador. Por tales motivos, entre otros, el presente Anexo no abarca más que los principales requisitos sanitarios aplicables a la recolección, al tratamiento y al transporte de los óvulos/embriones. B. Condiciones generales La Administración Veterinaria debe procurar que las medidas zoosanitarias enunciadas en los párrafos siguientes sean respetadas en los intercambios internacionales de óvulos/embriones. 1. Unidad de recolección La Unidad de recolección es el establecimiento donde están alojadas y son tratadas las hembras donantes con vistas a la recolección. Es en general, una parte definida de la explotación donde se mantiene el rodeo de origen de las hembras donantes, o bien, una parte específicamente definida de un establecimiento hacia el que se trasladan las hembras donantes para proceder a la recolección y a los exámenes de control. En ambos casos deben aplicarse las siguientes condiciones: a) La Unidad de recolección debe ser autorizada por un veterinario oficial y puesta bajo vigilancia veterinaria directa. b) La instalación y el equipo de la unidad deben permitir que las intervenciones sobre las hembras donantes se hagan en buenas condiciones de higiene; deben asimismo permitir el primer procesamiento de los óvulos/embriones. c) El personal que trabaja en la unidad debe tener una perfecta formación, tanto en los aspectos técnicos como en los fundamentos de profilaxis de las enfermedades y aplicar las más estrictas normas de higiene, con objeto de evitar la introducción de enfermedades en la unidad. Debe trabajar provisto de ropa y calzado de protección. d) El acceso a la unidad estará prohibido a toda persona no autorizada. e) La unidad no debe estar situada en una zona infectada (de peste bovina o fiebre aftosa) durante las recolecciones. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 216 Alberio 2. Laboratorios de manipulación de óvulos/embriones El laboratorio, que puede ser móvil o fijo, se define como un sitio en donde los óvulos/embriones son recogidos en el medio de recolección, examinados, lavados y sometidos a todos los tratamientos necesarios antes de ser congelados y puestos en cuarentena. El laboratorio fijo puede ser una parte de una Unidad de recolección y procesamiento específicamente definida, o bien una parte debidamente acondicionada de un establecimiento existente. Puede estar situado en el lugar de mantenimiento del rebaño o de las hembras donantes. En ambos casos, las condiciones generales de autorización de las Unidades de recolección deben ser cumplidas y aplicarse además las siguientes condiciones: a) El laboratorio debe estar bajo vigilancia directa de un veterinario oficial. b) Cuando se manipulan los óvulos/embriones destinados a la exportación y antes de su conservación en ampollas/pajuelas, ninguna operación deber ser efectuada sobre los óvulos/embriones de nivel sanitario inferior. c) El laboratorio debe estar protegido contra roedores e insectos. d) El laboratorio móvil debe ser perfectamente desinfectado cada vez que se utiliza en las diferentes Unidades de recolección. e) El laboratorio no debe situarse en una zona infectada (de peste bovina) durante las recolecciones. 3. Hembras donantes a) En las 24 horas anteriores a la recolección, todos los bovinos, ovinos, caprinos y porcinos del rebaño de origen deben ser objeto de un examen clínico realizado por un veterinario oficial y declarados libres de cualquier enfermedad contagiosa transmisible a los bovinos. b) El rebaño debe estar libre de fiebre aftosa, peste bovina y perineumonía contagiosa bovina, y no debe encontrarse en una zona infectada (de peste bovina o fiebre aftosa) durante los 30 días antes y después de la recolección. c) El rodeo de origen de las hembras donantes debe de preferencia formar parte de los rebaños que son objeto de un programa nacional de profilaxis; debe por lo menos estar "libre" de tuberculosis y brucelosis bovina. No debe haberse producido durante los 12 meses anteriores ninguna evidencia clínica ni antecedente de infección de Trichomonas fetus o de Campylobacter fetus. d) Las hembras donantes deben cumplir con todos los requisitos fijados por la Administración Veterinaria del país exportador. e) Las hembras donantes no deben haber sido importadas de otro país durante los 6 meses anteriores y deben haber permanecido durante por lo menos 30 días en el rebaño de origen. f) Las hembras donantes y el rodeo de origen deben ser objeto de un nuevo examen clínico efectuado por un veterinario oficial por los menos 30 días después de la recolección, y ser declarados libres de toda enfermedad contagiosa transmisible a los bovinos. g) El propietario de las hembras donantes debe certificar que, a su conocimiento, dichos animales no son portadores de taras genéticas conocidas, ni están emparentados con portadores de taras genéticas. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Sanidad de la TE 217 4. Examen a efectuar de las hembras donantes y los óvulos/embriones Existen dos métodos principales para asegurar que los óvulos/embriones están libres de gérmenes patógenos. El método tradicional consiste en exámenes realiza-dos sobre las hembras donantes; estos exámenes exigen mucho tiempo. Puede ser necesario controlar los sueros apareados y reiterar otras pruebas después del período normal de incubación de una enfermedad para determinar el estado sanitario de las hembras donantes. El otro método se basa en trabajos recientes bien documentados que permiten reconocer con gran fiabilidad que los óvulos/embriones están libres de bacterias y virus especificados*** cuando han sido procesados de conformidad con el Manual de la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones (I.E.T.S.)****. Dicho método evita los largos períodos de aislamiento y los reiterados exámenes de las hembras donantes, a condición de que éstas respondan a los criterios de base enunciados en el párrafo 3 del presente Anexo. a) Método tradicional i) Exámenes realizados sobre las hembras donantes en aplicación de un acuerdo bilateral. Conservación de los óvulos/embriones en nitrógeno líquido durante un período de tiempo superior a la duración normal del período de incubación de las enfermedades de las que el país importador se quiere proteger. Esto permite someter a las hembras donantes a exámenes serológicos en el momento de la recolección, o antes de ésta, y nuevamente después de la recolección. Los resultados negativos de dichos exámenes, asociados a las nuevas técnicas de lavado, dan un grado de seguridad superior al que se alcanzaba anteriormente. ii) Utilización de semen para la inseminación de las hembras donantes y fecundación de los óvulos que respondan a las condiciones sanitarias y a las normas enunciadas en el Anexo 5.2.1.1. Cuando el semen congelado utilizado para inseminar a las hembras donantes procede de toros que ya han muerto, o cuando el estado sanitario de los toros respecto a una o varias enfermedades infecciosas concretas no se conocía en el momento de la recolección, podrán exigirse exámenes complementarios de las hembras donantes inseminadas, después de la recolección de los óvulos/embriones, para verificar que dichas enfermedades no les fueron transmitidas. Los exámenes del semen pueden constituir otra alternativa de control. En caso de monta natural o de utilización de semen fresco, los sementales deben cumplir con las mismas condiciones sanitarias que las hembras donantes. b) Nuevo método: lavado de óvulos/embriones La zona pelúcida de cada óvulo/embrión debe ser examinada en toda su superficie bajo un aumento de por lo menos 50x, y debe ser garantizada intacta y exenta de cualquier material adherente. Los óvulos/embriones deber ser lavados de conformidad con las recomendaciones del Manual de la I.E.T.S.; su zona pelúcida debe estar intacta antes y después del lavado. Sólo deben ser lavados conjuntamente los óvulos/embriones procedentes de una misma hembra donante. (Toda expedición de trabajos realizados sugieren que las técnicas de lavado descriptas en el Manual de la IETS ofrecen un alto grado de seguridad frente a los siguientes agentes patógenos: Brucella y virus de la lengua azul, de la leucosis bovina enzoótica (LBE), de la enfermedad de las mucosas (BVD) y de Akabane. Las técnicas de lavado con tripsina parecen necesarias para eliminar los virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR) y de la estomatitis vesicular (Manual de la IETS, 4.16) **** Manual of the International Embryo Society 1986 ***Los Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 218 Alberio óvulos/embriones deberá ser acompañada de una atestación firmada por el veterinario responsable del laboratorio de manipulación certificando que dichos exámenes fueron realizados). 5. Recolección y conservación de ovocitos/embriones a) Medio Todo producto biológico de origen animal utilizado para la recolección, procesado, lavado o conservación debe estar exento de microorganismos vivos. Los medios y las soluciones utilizados para la recolección, congelación y conservación de ovocitos/embriones deben ser esterilizados según métodos reconocidos, conformes a las recomendaciones del Manual de la I.E.T.S. y manipulados de forma que permanezcan estériles. Se deben agregar antibióticos en el momento de la recolección, lavado y conservación, de conformidad con las recomendaciones del Manual de la I.E.T.S. b) Material Todo el material utilizado para la recolección, manipulación, lavado, congelación y conservación de los óvulos/embriones debe ser esterilizado antes de su utilización, de conformidad con las recomendaciones del Manual de la IETS. 6. Exámenes y tratamientos facultativos1 a) Un país importador puede pedir el examen de los ovocitos/embriones y de los líquidos de recolección o de lavado. En ese caso, los exámenes serán realizados en un laboratorio autorizado y deberán confirmar, en la medida de lo posible, la ausencia de gérmenes patógenos. i) Ovocitos/embriones Cuando los embriones son recolectados exclusivamente para la exportación, los óvulos no fecundados y los embriones que presentan anomalías genéticas, procedentes de una misma hembra donante, deberán ser lavados de conformidad con las recomendaciones del Manual de la IETS. ii) Líquidos del lavaje uterino El líquido de lavaje debe colocarse en un recipiente estéril, por ejemplo una probeta graduada, y dejarse en reposo durante una hora. El líquido sobrenadante deber ser retirado a continuación y los 100 ml del fondo que contienen los residuos acumulados, decantados en un frasco estéril. Si se utiliza un filtro deben ser agregados a los 100 ml del líquido conservado mediante enjuague. iii) Líquido del lavado de los embriones Los cuatro últimos líquidos de lavado de los óvulos/embriones (lavados 7, 8, 9 y 10) deben ser agrupados (manual de la I.E.T.S.). iv) Muestras Las muestras arriba descriptas deben ser conservadas a 4ºC y examinadas dentro de las 24 horas. De no ser posible, deben ser conservadas a una temperatura igual o inferior a -70ºC. b) Puede ser solicitado un tratamiento de óvulos/embriones mediante la tripsina. Este tratamiento debe ser realizado de conformidad con las recomendaciones del manual de la I.E.T.S. c) Sólo deben ser procesados al mismo tiempo los óvulos/embriones procedentes de una misma hembra donante. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Sanidad de la TE 219 7. Conservación, cuarentena y transporte a) Los ovocitos/embriones deben ser conservados en ampollas/pajuelas esterilizadas y éstas, a su vez, en contenedores esterilizados con nitrógeno líquido, respetando condiciones de estricta higiene, en un lugar de almacenamiento autorizado por la Administración Veterinaria del país exportador y que no presente ningún riesgo de contaminación para los ovocitos/embriones. b) Sólo deben colocarse en la misma ampolla/pajuela los óvulos/embriones procedentes de una misma hembra donante. c) Las ampollas/pajuelas deben ser precintadas en el momento de la congelación y etiquetadas de conformidad con las recomendaciones del Manual de la IETS. El contenedor con nitrógeno líquido debe ser precintado antes de su envío. d) Los ovocitos/embriones deben congelarse en alcohol "fresco" o en nitrógeno líquido, y conservarse en nitrógeno líquido "fresco" en contenedores esterilizados. e) Los ovocitos/embriones conservados no deben ser exportados antes de haber finalizado las operaciones objeto del certificado sanitario 1 Se prevé el estudio de un anexo sobre los métodos recomendados para las pruebas de investigación de agentes patógenos en los líquidos de irrigación y de lavaje, cuando el país importador solicite esos exámenes particulares. Dados los conocimientos actuales, se puede afirmar que las técnicas existentes para el aislamiento de bacterias y virus parecen ser eficaces. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 238 Alberio CONSIDERACIONES PRACTICAS Y ASPECTOS COMERCIALES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES R.H. Alberio Introducción Se trata ésta de una tecnología reciente donde no sólo se han tenido que desarrollar sus aspectos técnicos sino también los sistemas de aplicación en forma comercial. La biología de la transferencia de embriones es muy compleja y por ello las técnicas que componen un programa de TE tienen diferentes grados de imperfección lo que debe ser tenido en cuenta al desarrollar su aplicación práctica desde el punto de vista comercial. Desde otro punto de vista, en esta era de la tecnología, los productores no quieren quedar fuera de los cambios que se producen en su medio. Una de las nuevas adquisiciones tecnológicas para reproducir los genotipos superiores es la TE. El potencial está indicado por su uso en programas de mejora genética, por lo que la pregunta es cómo hacer para que la técnica tenga su mejor aprovechamiento. La demanda de los productores ya no sólo es por los animales registrados sino por aquellos que producen más en las evaluaciones con parámetros objetivos de calidad, o simplemente con el tipo de animal que aún sin evaluaciones objetivas de producción tiene en un momento dado mayor demanda en el mercado. Las características de la técnica permiten una adaptación rápida a las necesidades del mercado, objetiva o subjetivamente determinado. La TE ha modificado en buena medida el comercio tradicional de los reproductores. En lugar de elegir solamente al mejor toro, la atención está dirigida también a la obtención de las mejores vacas. De esta manera, ciertas reproductoras comienzan a ser valoradas actualmente tanto como lo es el toro. Así, algunos cabañeros comienzan a producir vacas donantes como antes producían toros para IA. Algunos programas alternativos a considerar en la TE -La vaca permanece como donante permanente Esto tiene sentido cuando el propietario puede vender con provecho más embriones o terneros de esa vaca de los que se pueden producir. Los embriones pueden ser transferidos frescos o congelados para abastecer la demanda fuera de la temporada de producción de terneros. La congelación ha abierto enormes perspectivas en los programas genéticos y comerciales ya que los embriones pueden ser mantenidos indefinidamente en el termo, a un bajo costo y pueden ser vendidos en cualquier momento y lugar. Una de las formas de venta es sobre preñez confirmada lo que en general es deseable para el comprador. Una variante es congelar embriones todo el año y luego transferirlos durante la temporada de servicios. De esta manera, si bien la tasa de éxito es algo menor con embriones congelados, es posible reducir los costos totales al no tener que disponer permanentemente de receptoras lo que suele ser uno de los aspectos más costosos del proceso. Si se adopta la variante de congelar los embriones, es conveniente recordar que aproximadamente un 25% de ellos no son congelables pero si transferibles en fresco por lo que siempre hay que prever para ello un número de receptoras. -La donante es superovulada sólo una vez y vuelve al servicio Esta variante permite al productor realizar una superovulación y recolección entre parición y nuevo servicio, multiplicando así por 2 ó 3 el número de terneros a obtener en un año. Si bien ésta no es la modalidad más aconsejada, muchos productores desean comenzar de esta forma no sólo para ver el grado de éxito de la misma sino para aproximarse a la técnica de una forma no muy complicada ni costosa. En este caso se considera recomendable no trabajar con menos de 3 a 4 vacas para disminuir así la posibilidad de caer sobre un animal que no produce embriones. Biotecnología de la reproducción www.reprobiotec.com Consideraciones prácticas y aspectos comerciales 239 -Donantes en el Centro de TE Los embriones se producen, transfieren, gestan y los terneros se crían hasta el destete en el Centro de TE. En ese momento son entregados al propietario. Una alternativa más económica y más frecuente es entregar la receptora al propietario cuando se hizo el diagnóstico de gestación (2 a 3 meses). Estos sistemas tienen la ventaja de liberar al propietario de todos los problemas y responsabilidades inherentes al programa y también benefician al técnico, ya que de esa manera tendrá el conjunto del problema en sus manos, pudiendo controlar más estrechamente y con mayores recursos cada una de las etapas. Por otra parte, el centro en general estará dotado de una infraestructura destinada específicamente a esta actividad. -Programa en el establecimiento de origen de las donantes Ello exige de manejos, cuidados y procedimientos más intensos a los que, en general, se acostumbra en el campo. En consecuencia se requiere de personal entrenado y de la supervisión del propietario y/o encargado. La parte más compleja y costosa de este sistema lo constituye la provisión de receptoras en el número necesario, y de buena calidad en el momento apropiado. También requiere la atención permanente de los partos a lo largo de todo el año. -Venta de receptoras preñadas Esta ha sido una de las formas comerciales más importantes en TE que tiende actualmente a ser reemplazada por la venta de embriones congelados. -Venta de la producción de un tratamiento superovulatorio Es otra de las formas contractuales que ha adquirido cierta popularidad en nuestro país a partir de hembras compradas en concursos o exposiciones y con ellas se procede a la comercialización de uno o varios lavajes en forma equivalente a lo que ocurre con el semen congelado de toros. Algunos aspectos del negocio de la TE La TE es clasificada en general en el área de negocios conocidos como biotecnológicos. La biotecnología ha atraído en los últimos años la atención de capitales de riesgo interesados en invertir en la misma. Sin embargo, a menudo la gente experimentada en biotecnología no lo es en los negocios y a menudo es difícil unir un negocio seguro con un sistema biológico como la TE. En consecuencia ha tomado mucho tiempo, trabajo y comisión de errores desarrollar el negocio de la TE. La demanda de la TE ya está establecida por lo que, como en todo negocio de riesgo, el profesional que entra en el mismo deberá poner un precio en el servicio que proveerá. Esto se logra por diferentes vías pero en todos los casos se deberán considerar los costos fijos y los variables. Como en general los costos son altos y frecuentemente el negocio financiero es muy rentable, se deberá tener en cuenta cuál puede ser el futuro del negocio antes de introducir a alguien en el mismo con expectativas irreales. Los costos fijos, básicamente la infraestructura y equipos, suelen ser altos y por lo tanto requieren una gran inversión inicial. Un centro de TE debe tener buena presentación, estar ubicado en un lugar con clima favorable y de fácil acceso. Un laboratorio móvil es más versátil pero sus costos de mantenimiento suelen ser muy altos. El rodeo de receptoras es una gran inversión con alto costo de mantenimiento y manejo así como un importante capital con gran proporción de lucro cesante. Biotecnología de la reproducción www.reprobiotec.comr 240 Alberio También el costo de mantenimiento de las donantes es alto y si bien su número es bajo, hay que considerar que el mantenimiento de vacas no recolectadas aumenta los costos por donante. El equipamiento mínimo necesario suele no ser de gran magnitud pero sí de costo alto. Por el contrario, el material de consumo es importante en los costos tanto por su cantidad como por su precio ya que en gran parte es importado. Una vez establecidos los costos fijos y variables, el precio final del producto a vender será determinado en función de su competitividad. La TE es un negocio donde cada día hay más competencia y donde la calidad y precio del trabajo son elementos fundamentales para el logro de nuevos clientes. Estructura de costos y algunas formas de cobro del trabajo de TE (en dólares americanos) Costos 1 vaca (2 gestaciones) 10 70 20 70 30 200 4 vacas (8 gestaciones) 40 280 80 70 120 590 Prostaglandinas FSH Medios y material descartable Suplemento a personal y gastos de transporte Transferencia (4/donante) TOTAL Estimando que en día de trabajo se pueden recolectar y congelar o transferir lo producido por 4 vacas, el costo por vaca recolectada variará entre 200 dólares (si se recolecta una) a alrededor de 74 dólares si se recolectan 4. Lo descrito es el costo de funcionamiento, pero no tiene en cuenta amortización de entrenamiento, equipos, etc. Esto deberá evaluarlo el profesional. Cuál es el precio de este servicio? Existen múltiples formas de arreglo para cobrar este tipo de trabajo, uno de los más corrientes es el siguiente: 1 vaca 4 vacas Prima/gestación* (2 gestaciones) (8 gestaciones) (100/gestación) 200 800 * Esta prima en algunos casos puede elevarse hasta 200 o 300 dólares por gestación. Sin embargo, el actual incremento de la oferta de profesionales capacitados en TE y la menor demanda pueden inducir acuerdos que bajan el nivel de la prima original. De acuerdo con esto, el lavaje de 4 donantes y la obtención de 8 gestaciones se cobraría alrededor de 1400 dólares con un costo de 600 dólares. El resto (800 dólares) será destinado a amortización, ganancia neta, etc. Una recolección con dos gestaciones obtenidas se cobrarían 400 dólares con un costo de 200 dólares. Como se puede apreciar, se deberá adecuar el tipo de cobro a cada situación. Biotecnología de la reproducción www.reprobiotec.com Aplicaciones de la transferencia de embriones 241 APLICACIONES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES G. Brem Introducción Debido a las limitaciones biológicas, los métodos biotecnológicos aplicados actualmente para incrementar la tasa reproductiva de la hembra no tienen el efecto multiplicador conocido en los animales machos. Mientras que es posible incrementar el número de la descendencia de un toro por el factor 1000 o aún mayor a través de la inseminación artificial, en la hembra no siempre es posible aumentar siquiera por el factor 10 el número de terneros nacidos a través de la transferencia de embriones. No obstante ello existe una serie interesante de aplicaciones de esta técnica en la producción e investigación. Los aspectos más importantes del aumento de la tasa reproductiva de la hembra bovina son los siguientes (BREM, 1986, 1990): 1. Aumento del progreso genético en la producción de leche y carne a través del aumento de la intensidad de selección de las madres de toros. 2. Aumento del progreso genético en rodeos cerrados de producción de leche y carne. 3. Aumento de la eficiencia de los programas de núcleos de producción (capítulo XXII). 4. Rápida multiplicación de razas o mutaciones exóticas de valor productivo. 5. Aumento de la tasa de mellizos. 6. Rápidas y mejores posibilidades para llevar a cabo programas de cruzamiento con razas lecheras y carniceras. 7. Posibilidad de llevar a cabo la prueba de la descendencia de vacas y la prueba de hermanas enteras en las familias de las vacas. 8. Acortamiento del intervalo generacional. 9. Determinación y control del sexo. 10. Estimación del efecto materno. 11. Facilidad de la importación y exportación de material genético. 12 Desarrollo de las condiciones adecuadas para otras técnicas reproductivas en marco de la micromanipulación de embriones. Particularmente el aspecto mencionado en el último punto (12) ha ganado en los últimos años particular importancia. La división microquirúrgica (capítulo X), la producción in vitro y el clonado de embriones (capítulo XII) como así también la producción de animales transgénicos le han dado a la transferencia de embriones una nueva dinámica. Por ello, en las siguientes descripciones de las diferentes aplicaciones de la TE convencional, no es siempre posible evitar algunas superposiciones con los capítulos siguientes. Se presentarán además algunas áreas que, a través de la manipulación de los embriones, aumentan la eficiencia de la TE. Aumento del progreso genético en la producción de leche y carne a través del aumento de la intensidad de selección de las madres de toros Para la mayor parte de las razas bovinas productoras de leche existen programas de mejoramiento genético por medio de la inseminación artificial. En ellos, como p.e. en el programa de mejoramiento en Bavaria, los toros obtenidos de cruzas programadas son seleccionados a través de 6 niveles. Posteriormente los reproductores probados, con una edad de 5 a 6 años, están disponibles para la inseminación artificial (ver capítulo XXII). En principio se puede afirmar que el éxito adicional de la TE aplicada en programas de IA es más reducido cuanto más eficiente sea este último, es decir cuanto mayor sea la intensidad de selección de las madres de toros. Por otro lado el empleo de la TE sólo es recomendado en un estricto programa de selección. En programas de mejoramiento subóptimos es Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 242 Brem conveniente aumentar el progreso genético, en primer lugar a través de una mejora de los programas convencionales de IA. La TE requiere altos capitales de inversión y tecnología lo que la convierten en una técnica más costosa que un programa de mejoramiento por medio de IA. De la misma forma un programa de TE tendrá éxito sólo si se establece un trabajo conjunto entre un equipo altamente calificado y productores informados e interesados en el progreso genético del ganado. SKJERWOLD (1974) disminuyó la tasa de reposición de las madres de toros de 2% al 0,4% en un cálculo modelo. A través de la reducción del número de madres de toros se incrementó 20% el éxito de la selección sobre la línea madre-hijo. Dado que la línea madre-hijo participa en sólo 1/4 del progreso genético (G) total, el incremento de G es de sólo 5%. En otro cálculo LAND y HILL (1975) seleccionaron 1-1,3% de las vacas como madres de toros, en lugar del 2% original. De esta forma aumenta el progreso genético sobre la línea madre-hijo en una relación 100:110:125, lo que representa un incremento del éxito de la selección de 2,5 a 6%. Partiendo de una tasa de reposición de 3% y aumentando la tasa de reproducción por el valor 10, se incrementa 9% el G (CUNNINGHAM, 1976). En un modelo empleado en el estudio del efecto de la TE sobre el progreso genético en un rodeo lechero PIRCHNER y DEMPFLE (1977) evaluaron entre otros factores las siguientes variantes: 1. Aumento anual de la tasa reproductiva a 4 y 80 veces por medio de TE. 2. Aplicación de TE solamente en madres de toros o en la población total. Los resultados de ese modelo de cálculo se resumen en la tabla 1. A través de la aplicación de la línea madre-hijo es posible incrementar el progreso genético entre 5 y 10%, con la producción complementaria de 4 a 8 terneros más por año y vaca. con la transferencia de 80 embriones por vaca donante aumentaría 17% la eficiencia de la selección. La experiencia práctica indica, sin embargo, que no es posible alcanzar un aumento de la tasa reproductiva de esa magnitud. Tabla 1: Progreso genético de la producción de leche (PIRCHNER y DEMPFLE, 1977) h2= 0,25 Edad a la primera parición = 2,5 años N de hijas/toro = 50 1/3 de las vacas se insemina con toros en prueba Toros: Toros de toros reposición Vacas de toros " Re % 80 A1 A2 B1 B2 80 80 20 1 i 0,35 0,35 0,35 1,4 2,66 φ 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 t 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 5%; i= 2,06; φ = 0,88; t= 7 años 20%; i= 0,93; φ = 0,88; t= 5,3 años Re % 3 0,75 0,04 0,75 0,04 i 2,27 2,76 3,61 2,76 3,61 φ 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 t 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 ∆G ∆t σA 0,185 0,196 0,196 0,221 0,271 aumento % 6 17 19 46 A1 = Aplicación en núcleos de producción, 4 embriones transferidos con éxito. A2 = " " " , 80 embriones transferidos con éxito. B1 = " en la población, 4 embriones transferidos con éxito. B1 = " " , 80 embriones transferidos con éxito. Re% = tasa de reposición i = intensidad de la selección σ = exactitud de la estimación del valor genético. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Aplicaciones de la transferencia de embriones 243 t = intervalo generacional φA= desviación standard genética aditiva ∆G= progreso genético El incremento del progreso genético por año depende de la tasa reproductiva y de la exactitud de la estimación del valor genético. Para los modelos de cálculo en las tablas 2 y 3 (BREM, 1979) se establecieron los siguientes valores iniciales: VIA PT MT PV MV 0,88 0,5 0,88 0,5 i 2,06 2,27 0,93 0,35 t 7,0 5,0 5,3 4,0 PT: padres de toros; MT: madres de toros; PV: padres de vacas; MV: madres de vacas En la tabla 2 se resumen los valores absolutos y relativos para el incremento del progreso genético por año y desviación estándar. Se observa que la influencia del aumento de la tasa reproductiva es mayor cuanto mayor sea la tasa de reposición en la población inicial. Si se selecciona 2% de las vacas como madres de toros y se aumenta 8 veces la tasa reproductiva el aumento del progreso genético, para una exactitud de la estimación del valor genético de 0,5, será de 9%. Si por el contrario se seleccionan 15% de las vacas, la aplicación de TE permitirá un aumento de 12%. Si la exactitud original de la estimación del valor genético es de 0,3 el aumento oscilará en ambos casos entre 6 y 8%. El intervalo generacional puede ser acortado mediante el empleo de la TE, porque de las madres de toros seleccionadas será posible obtener con seguridad un ternero macho por año. Con una tasa de reposición de 2% y una reproducción aumentada 8 veces (con rIA= 0,5) el progreso genético puede ser mayor de 14% a través de la reducción del intervalo generacional de las madres de toros de 5 a 4 años (tabla 3). A través de la aplicación de la transferencia de embriones en rodeos aislados se influye la línea madre-hija. CUNNINGHAM (1976) comparó la superioridad genética de la descendencia en sistemas convencionales y de transferencia de embriones. Si se emplea 59% de las vacas para la producción de hembras reproductoras la descendencia alcanzará una superioridad de 2,2% después de la selección por producción de leche. Con un número de la descendencia de 2 a 10 veces superior por vaca puede aumentar la superioridad genética a 3,8 y 6,1%. Si se llevara a cabo TE en toda la población (tabla 1) el progreso genético aumentaría 20% con un incremento de la tasa reproductiva por el factor 4. Con una descendencia de 80 animales por vaca el progreso genético podría aumentar 46% (PIRCHNER y DEMPFLE, 1977). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 244 Brem Tabla 2: Aumento del progreso genético a través del incremento de la tasa reproductiva de la línea madre-hijo aplicando la TE en dependencia de la exactitud de la estimación del valor genético (rIA) y de la tasa de reposición de la población inicial (TR) Ternero / vaca / año TR % 1 rIA 0,3 0,4 0,5 0,4 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,5 abs. 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,16 0,17 0,15 0,16 0,17 0,15 0,17 0,17 0,15 0,15 0,16 1 abs. 0,17 0,19 0,20 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,16 0,18 0,19 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,17 0,16 0,16 0,17 % 2 2 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 4 3 3 4 3 3 4 3 4 5 3 4 5 4 5 6 abs. 0,17 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,18 0,21 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,16 0,18 0,19 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 2 % 4 4 5 4 5 6 4 5 6 4 6 7 4 5 6 5 6 7 5 7 8 6 7 9 6 8 9 7 9 11 abs. 0,18 0,19 0,21 0,17 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,18 0,20 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,16 0,18 0,19 0,16 0,17 0,18 4 % 5 7 8 6 7 8 6 8 9 6 8 9 7 8 10 7 9 10 7 9 11 8 10 12 9 11 13 10 12 15 2 3 4 5 7 10 15 20 30 Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Aplicaciones de la transferencia de embriones 245 Tabla 3: Aumento del progreso genético a través del incremento de la tasa reproductiva y disminución del intervalo generacional en la línea madres de toros de 5 a 4 años Terneros / vaca / año TR % 1 rIA 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,5 abs. 0,18 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,17 0,15 0,16 0,17 % 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 abs. 0,18 0,19 0,21 0,18 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,18 0,20 0,17 0,18 0,20 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,17 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 1 % 7 7 8 7 8 8 7 8 8 7 8 8 7 8 9 8 8 9 8 9 9 8 9 10 8 9 10 9 10 11 abs. 0,18 0,20 0,21 0,18 0,19 0,21 0,18 0,19 0,20 0,18 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,18 0,20 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,17 0,17 0,18 2 % 9 10 10 9 10 11 9 10 11 10 11 12 9 10 11 10 11 13 10 12 13 11 13 14 11 13 15 12 14 16 abs. 0,19 0,20 0,22 0,18 0,20 0,21 0,18 0,20 0,21 0,18 0,19 0,21 0,18 0,19 0,21 0,18 0,19 0,20 0,18 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,18 0,20 0,17 0,18 0,19 4 % 10 12 13 11 12 14 11 13 14 12 13 15 12 14 15 12 14 16 13 15 17 13 16 18 14 17 19 15 18 21 2 3 4 5 7 10 15 20 30 KRÄUßLICH (1978) caracterizó la futura aplicación técnico-productiva de la TE en un rodeo de 100 vacas, bajo las premisas que la tasa de preñez de la transferencia no quirúrgica sea de 50%, que se transfieran 4 embriones/donante y se practique el sexado. Las 20 donantes serán inseminadas con toros elite de la misma raza, 2/3 de de las restantes inseminaciones se hará con toros de razas productoras de carne. La relación del sexo será 1:0,89, nacerán 18% más de terneros. Como progreso genético adicional se espera una producción de 40-50 kg de leche. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 246 Brem Mejoramiento del rendimiento lechero y de producción de carne La razas de doble propósito son seleccionadas según sus características productoras para leche y carne. El éxito de la selección por cada característica es menor que en los casos de selección de razas de un solo propósito productivo. KRÄUßLICH (1976) estimó el progreso genético anual para un programa convencional de TE. El porcentaje de reposición de las madres de toros en los sistemas convencionales es de 1,3%, en el modelo de TE 0,2%. En el cálculo son tenidos en cuenta los siguientes valores: h2 leche= 0,25; h2 pdf= 0,40; P leche= 700 kg; pc= 45 kg. En un esquema de selección, en el cual se selecciona mediante la prueba de producción propia en una relación 1:5, el programa de TE permite un progreso genético adicional de 5,5 kg/año de leche y 0,23 kg/año en peso de faena (pdf). El mejoramiento relativo es de aproximadamente 14% frente a un programa convencional. PIRCHNER y DEMPFLE (1977) estimaron que sería posible alcanzar aumentos del 5%, considerando una característica para leche y una para carne de igual significado. El cálculo de las tablas 2 y 3 se basa en los mismos parámetros de una población. La transferencia se aplicará sólo en las madres de toros y por lavaje se transferirán 4 embriones. Con la extensión a la población total se esperan aumentos del 20%. Mejoramiento del rendimiento de producción de carne SKJERVOLD (1974) estudió la aplicación de la prueba de la descendencia en razas productoras de carne. Las terneras deben ser seleccionadas después de la prueba de campo, de manera tal que se incorporará 1/3 de las donantes al programa. La calidad de la res se estimará a través de la faena de la descendencia. Dado que la descendencia se faenará al año de edad, el intervalo generacional de los padres se prolongará sólo un poco. De esta forma es posible un incremento del éxito de la selección entre 20 y 25%. Los efectos de la selección, en un programa de TE, según el rendimiento propio antes de la edad reproductiva fueron destacados por HILL y LAND (1975). Al año de edad las terneras serán seleccionadas, superovuladas, inseminadas con toros jóvenes y los embriones obtenidos serán transferidos a receptoras. El intervalo generacional es de 2-2,5 años. El progreso genético estimado en peso a los 400 días aumentará de 9 a 16 kg/año. PIRCHNER y DEMPFLE (1977) estimaron el progreso genético en un rodeo bovino productor de carne de 2 000 cabezas, cuando toda la descendencia es evaluada en su crecimiento (test de rendimiento propio). Con una heredabilidad de 0,36, la primera parición a los 2 años y un porcentaje de reposición de toros del 0,5% se obtendrá un aumento del progreso genético en producción de carne del 33%, disminuyendo el porcentaje de reposición al 66% por medio de TE. Aumento de la tasa de mellizos Transferencia de dos embriones La transferencia de 2 embriones en un cuerno uterino permite alcanzar una elevada tasa de preñez pero un reducido porcentaje de mellizos. ROWSON y col. (1971) compararon los resultados obtenidos después de la transferencia de 2 embriones en uno o ambos cuernos uterinos. Los grupos contaban con 11 vaquillonas. Después de la transferencia de 2 embriones en un cuerno uterino la tasa de preñez, determinada a la faena (60 dias), fue de 73% pero sólo 45% de los animales tenían mellizos. La tasa de gestación de los animales faenados a los 90 días, fue de 72% cuando los 2 embriones fueron transferidos en ambos cuernos y la de preñeces melliceras 73%. SREENAN y col. (1975) informa-ron sobre una tasa de preñez de 82% en Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Aplicaciones de la transferencia de embriones 247 un grupo de 72 receptoras luego de la transferencia quirúrgica y bilateral de 2 embriones. De las receptoras preñadas se detectó 74% de gestaciones melliceras. La sobrevivencia de los embriones transferidos fue de 71%. En promedio se obtienen 77% de preñez, de las vacas preñadas 67% presentan gestaciones melliceras y 65% de los embriones transferidos sobreviven. Con la transferencia de 2 embriones en un cuerno uterino se observan menores tasas de gestaciones dobles (ROWSON y col., 1971). Aumento de la frecuencia de partos melliceros de origen genético La tasa de partos melliceros tiene una heredabilidad muy baja de 4% y una repetibilidad de 6%. A través de laparoscopia deben ser observadas las ovulaciones espontáneas de aquellos animales que parieron mellizos. Los animales con varias ovulaciones dobles son incorporados al programa de TE. Si la tasa de mellizos en la población es de 4%, es posible, según las estimaciones de LAND y HILL (1975), aumentar ese valor en 0,5% anualmente por medio de la TE. Si se alcanza en la población una tasa de mellizos de 16%, aumentará la frecuencia en algo más de 1% aplicando la TE. Resumiendo es posible afirmar, desde el punto de vista de la intensidad de selección como así también de otras consideraciones productivas, que la transferencia de embriones ofrece una buena posibilidad de alcanzar objetivos productivos determinados con mayor rapidez que con la inseminación artificial. Una condición para ello es que se lleven a cabo estudios para la optimización de la producción y estructura de la población, a fin de establecer una base sólida para la aplicación de la TE. De la misma forma debe garantizarse un exitoso programa técnico de TE, a fin de llevar a cabo los objetivos genéticos propuestos. Rápida reproducción de individuos y razas exóticos Muchas poblaciones bovinas no son originarias de las zonas que actualmente habitan. La migración es un factor de gran importancia en los cambios de la composición genética de las poblaciones. Ello se refleja con claridad en el siguiente ejemplo: En el siglo pasado se exportaron animales de las razas Schwarzbunte y Braunvieh de Europa a Estados Unidos, donde fueron sometidos a una intensa selección para producción de leche. Durante los últimos 20 años animales de las razas HolsteinFriesian y Brown-Swiss fueron reimportados a Europa e incorporados a las poblaciones. Mientras en el siglo pasado la exportación se llevó a cabo con animales, la reimportación del material genético se cumplió al principio y en gran medida con semen congelado. Hace algunos años se importan también embriones congelados. Las razas, denominadas exóticas en EE.UU., Simmental y Charolais fueron consideradas interesantes en Norteamérica para la producción de carne en las décadas del 60 y 70. La reducida cantidad de animales disponibles y las serias limitaciones sanitarias para la importación de más animales condujo a la reproducción de los mismos por medio de la transferencia de embriones. La aplicación de la TE en esa área obviamente contribuyó con el surgimiento biotecnológico de esta técnica. Su uso con fines productivos se cumplió recién en una segunda fase de su aplicación, después que la reproducción de las razas exóticas había alcanzado dimensiones poblacionales suficientes como para desistir de la TE. El costo de la comercialización internacional de reproductores es en general muy elevado y con frecuencia difícil de llevar a cabo como consecuencia de las estrictas medidas sanitarias de importación. En ese sentido la transferencia de embriones cobra particular importancia al aumentar el número de la descendencia de animales de alto valor genético ya existentes. De esta forma es posible, según CUNNINGHAM (1976) incrementar 500% la tasa reproductiva de un animal importado. Otra área interesante para la aplicación de la TE la constituyen individuos de importancia genética particular, como por ejemplo los animales sin cuernos. HAUSSMANN (1978) desarrolló una ecuación, con la cual es posible calcular el número de descendientes a obtener de una donante con la aplicación de la superovulación (tabla 4). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 248 Brem Nj = a (v . g . q)j/T Nj = donantes por año j a = número de donantes hembras v = terneros/donante g = relación de sexos (normalmente 50:50) j = años desde el comienzo del programa T = intervalo generacional Considerando que actualmente la exportación de material genético se lleva a cabo en gran medida con embriones congelados y no exclusivamente con semen, se presenta la excelente posibilidad de reproducir los animales importados como embriones, renunciando así a una permanente importación. Como la experiencia lo demuestra esta alternativa constituye una importante aplicación de la transferencia de embriones. Reproducción de una hembra por medio de la transferencia de embriones en función del número de descendientes hembra por donante (HAUSMAN, 1978) Embriones ♀/donante Años 4 8 12 4 16 64 2 3 Animales/donante 25 625 15 625 100 10 000 1 000 000 10 Tabla 4: Bibliografía BREM, G. 1986. Mikromanipulation an Rinderembryonen und deren Anwendungs-möglichkeiten in der Tierzucht, 1-208. Ferdinand Enke Verlag Stuttgart. BREM, G. 1990. Micromanipulación en embriones bovinos y sus posibles aplicaciones en producción animal, 1181. Editorial Hemisferio Sur, Buenos Aires, Argentina. CUNNINGHAM, E.P. 1976. The use of egg transfer techniques in genetic improvement. Agricultural Research Seminar: Egg transfer in cattle, 345-353. Jansen, EUR 5491, Luxembourg. HAUSSMANN, H. 1978. Verbreitung seltener Anlagen oder seltener Populationen mit Hilfe des Embryotransfers. DGfZ-Ausschuß f. genet.-statist. Methoden in der Tierzucht, Husum, Polykopie. HILL, W.G. and LAND, R.B. 1976. Superovulation and egg transplantation in A.I breeding programmes for dual purpose cattle. Agricultural Research Seminar: Egg transfer in cattle, 333-342. Jonsson, EUR 5491, Luxembourg. KRÄUßLICH, H. 1978. Produktionstechnische Auswirkungen des Embryotransfers. DGfZ-Ausschuß für genet.statist. Methoden in der Tierzucht, Aachen, Polykopie. LAND, R.B. and HILL, W.G. 1975. The possible use of superovulation and embryotransfer in cattle to increase response to selection. Anim. Prod. 21:1-12. PIRCHNER, F. und DEMPFLE, L. 1977. Züchterische Auswirkungen des Embryotransfers. DGfZ-Ausschuß für genet.-statist.Methoden in der Tierzucht, Aachen, Polykopie. ROWSON, L.E.A., R.A.S. LAWSON and MOOR, R.M. 1971. Production of twins in cattle by egg transfer. J. Repr. Fert., 25: 261-268. SKJERVOLD, H. 1974. Breeding aspects in case of practical application of egg transplantation. Report No. 75 des SHS, Aallsta, 87-102. Sweden. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Aplicaciones de la transferencia de embriones 249 SCREENAN, J.M., D. BEEHAN and MULVEHILL, P. 1975. Egg bilateral transfer in the cow: Factors affecting pregnancy and twinning rates following bilateal transfers. J. Reprod. Fert., 44: 77-85. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 250 Brem Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 250 Brem APLICACIONES DE LA PRODUCCION IN VITRO DE EMBRIONES G. Brem Introducción Para la producción in vitro de embriones (PIV) existe una serie de aplicaciones que corresponden en parte a aquellas de la transferencia de embriones, como por ejemplo su empleo en la reproducción de razas en peligro de extinción, de genotipos exóticos o en el aumento del número de terneros en un rodeo. Por otra parte la PIV tiene aplicaciones que son particulares de ese método biotecnológico. Un ejemplo de ello es la producción de terneros a partir de animales faenados y sometidos a pruebas de rendimiento propio. En el presente capítulo se presentará un panorama de las principales aplicaciones de la PIV de embriones bovinos desde el punto de vista productivo y técnico. Generalmente los programas de PIV pueden dividirse en proyectos de acuerdo al origen de los ovarios y de los ovocitos. En ellos se pueden desarrollar los trabajos con un pool de ovarios de terneras o vacas. En otros casos se pueden seleccionar determinadas hembras, las cuales en forma individual o en determinados grupos son consideradas para un programa de PIV después de la faena. Producción in vitro de embriones en programas de investigación y como técnicas reproductivas Para el estudio de los fenómenos vinculados con el desarrollo de estadios embrionarios tempranos es necesario en la regla un gran número (p.e.: el desarrollo de una biblioteca de ADN) de embriones desarrollados en forma sincrónica. Para cumplir con esos objetivos se presentan, particularmente en la especie bovina, dos problemas: es extremadamente dificultoso (en promedio sólo 8 embriones/ donante) recolectar esos estadios (a través del lavaje de oviducto o después de la matanza) de la donante. En segundo lugar debe esperarse una divergencia del estadio de los embriones de hasta 24h, en función del momento de la fecundación. La PIV tiene la ventaja de producir embriones en un número suficientemente grande y sincrónico en el desarrollo. Es posible, además, llevar a cabo estudios con los ovocitos recolectados durante la maduración y la fertilización. Para llevar a cabo los métodos de clonado y la transferencia de genes en el bovino se requiere de un gran número de ovocitos, cigotos y en parte también embriones. Su realización con embriones recolectados in vivo sería dificultosa e imposible de continuar a largo plazo. La PIV constituye el método de elección, demostrado en las primeras experiencias en la producción de animales clonados y transgénicos. Los resultados obtenidos con esos programas son aún insatisfactorios, sin embargo constituyen una buena alternativa, comparada con la aplicación de embriones obtenidos in vivo. En los programas de investigación y manipulación mencionados se puede emplear en la regla un pool no seleccionado de ovarios. Los embriones, donantes de blastómeros, requeridos para un programa de clonado constituyen una excepción. De la misma forma puede ser necesario en un programa de transferencia génica, dependiendo de la estructura génica a transferir (capítulo XIII), emplear animales de razas lecheras o con una constelación genética especial. Vacas de interés productivo como donantes de ovocitos Al contrario de la recolección de ovocitos de un pool de ovarios para diversos programas, obtener ovocitos de una vaca es interesante desde el punto de vista productivo. Particularmente animales con una larga y eficiente vida productiva constituyen un potencial prometedor para la PIV. A pesar que esas vacas tienen más descendencia que la media de la población, persiste aún una gran demanda por sus descendientes. Esas vacas, de acuerdo a la experiencia, no responden satisfactoriamente a un programa de superovulación como los animales jóvenes, de forma tal que un programa de TE no brinda Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Aplicaciones de la producción in vitro de embriones 251 el éxito esperado. En el momento de la faena o la matanza de esos animales la PIV ofrece la última posibilidad de aprovechar su potencial genético. Como demostración del significado que puede tener ese programa es interesante el ejemplo de la raza Holstein-Friesian alemana (HFa). De las 23 000 vacas elite hay más de 120 que tienen un rendimiento en su vida de 100 000 kg de leche. En promedio se faenan alrededor de 5000 vacas por año. Con un empleo consecuente de la PIV podrían producirse anualmente 10 000 terneros adicionales con muy buenos valores productivos estimados. Ello sería especialmente interesante por que además se necesitaría menos semen por embrión producido comparado al requerido en el servicio con IA. Las porciones de semen de toros HFa se disponen en general en cantidades insuficientes y son además caras. En muchos casos el uso eficiente del semen cubre los costos del programa de PIV e incluso posiblemente de la transferencia de los embriones producidos. En una segunda etapa se podría extender la PIV a toda la población Herdbook (HB). Si se eligen para el programa de PIV 50 000 vacas HB, lo que constituye 30% de las vacas faenadas, se podrían producir alrededor de 100 000 terneros. Esos terneros podrían reemplazar a los animales descendientes de animales de bajo valor productivo y aumentar de esa forma el progreso genético de la población. Desde el punto de vista reproductivo la consecuencia sería que alrededor de 10% de las inseminaciones serían reemplazadas con la transferencia de embriones producidos in vitro. Genéticamente el empleo de las vacas HB en la PIV significaría una mejora del progreso genético sobre la línea madre-hija (capítulo XXI). Convencional: tasa de reposición madre de vaca= 80% => i= 0,35 rIA = 0,5 ∆G = .35. .5 sA = .175 sA madre de vaca= 60% => i = 0,64 rIA = 0,5 ∆G = .64 . .5 . sA = .32 sA PIV: tasa de reposición Según ello el aumento del progreso genético sobre la línea madre-hija sería del 83%. A pesar que la línea madre-hija contribuye solamente en un 10% del progreso genético total, la casi duplicación del ∆G sobre esa línea es ventajosa porque aumentaría el significado de la línea más débil en el mejoramiento genético. A través del empleo más intensivo de las vacas del Herdbook es de esperar, además, ventajas adicionales en los componentes maternos. Producción in vitro de embriones de razas bovinas en peligro de extinción La formación de reservas genéticas de razas en peligro de extinción gana creciente significado. Existen estimaciones que de las 500 razas que existen en la actualidad sólo 20 mantendrán significado en la producción a fines de este siglo. Sin embargo existen esfuerzos por evitar la pérdida total del potencial genético de esas razas a través de la congelación y conservación de semen y embriones. En ese sentido la PIV de embriones es particularmente interesante porque las pocas hembras aún existentes son relativamente viejas y no pueden ser incluidas en un programa de transferencia de embriones o lo son sin éxito. Nosotros hemos observado en vacas viejas que los ovarios carecían de folículos, lo que hacía imposible el programa de PIV. En la mayoría de las vacas es posible obtener los ovocitos, producir embriones, congelarlos y conservarlos en nitrógeno líquido durante décadas. En el momento de reestablecer la raza en peligro de extinción o para superar las depresiones consanguíneas los embriones producidos pueden ser descongelados e incorporados en la pequeña población existente. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 252 Brem Terneras o fetos como donantes de ovocitos También de los ovarios de terneras y fetos pueden obtenerse ovocitos para la PIV. A pesar que el número de folículos existentes es mayor que en ovarios de vacas adultas, la producción de embriones de terneras es menor, como consecuencia de la menor tasa de desarrollo de los ovocitos (ver capítulo XI). A pesar de ello la PIV es posible y encuentra aplicación en algunas áreas específicas. Un aspecto de importancia es el acortamiento del intervalo generacional. Ello sería interesante cuando la obtención de los ovocitos de esas terneras sea repetible. Hasta el momento existe información insuficiente sobre ese aspecto. La PIV de embriones de terneras, después del sacrificio en el matadero, puede ser interesante también bajo determinadas condiciones. Por ejemplo cuando es necesaria una determinada constelación genética, diagnosticable genéticamente y que puede ser producida a través de la recombinación de la meiosis. Como ejemplo se encuentran haplotipos MHC o individuos homocigotas sin cuernos. Si la ternera no representa el genotipo deseado, puede provocarse 4 meses después la siguiente ronda recombinante por medio de la PIV. El intervalo generacional puede acortarse de esta manera de 3 a 1,1 años. Ello aumentará las posibilidades de seleccionar el genotipo deseado. Los animales producidos serán recriados, destinados a otras pruebas o a la producción. Otra alternativa de aplicación es la de terneros de engorde. En Bavaria la carne de ternero se produce a partir de las terneras, dado que los machos son engordados como toros. Las terneras alcanzan 170 kg a los 4 meses. Si se logra producir 4 embriones y con ello 2 terneros con la aplicación de la PIV, sería posible alcanzar un 50% de reposición. La selección posibilitada de esta forma (tabla 1) podría concentrarse en parámetros de rendimiento cárneo como engorde diario o cualidades a la faena (p.e.: componente cárneo, partes de valor carnicero, etc.). Como ejemplo de la ganancia diaria el progreso genético podría corresponder a 25 g por año (∆G= 0,8 . 0,7 . 50 g/1.1 = 25 g). Producción de razas productoras de carne en rodeos lecheros La producción in vitro y la transferencia de embriones de razas productoras de carne o de doble propósito a vacas lecheras, no afectadas a la reposición, es una alternativa más de la aplicación de la PIV. Esa alternativa es interesante económicamente cuando existe una mayor diferencia entre el valor de los terneros de las donantes y las receptoras frente a los costos producidos por la PIV y la transferencia. Una condición importante es que la obtención se lleve a cabo sin problemas, esto es, que se disponga en el matadero de un número suficiente de hembras. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Aplicaciones de la producción in vitro de embriones 253 Tabla 1: Intensidad de selección en función del número de animales seleccionados Animales seleccionados (%) 80 60 40 20 10 5 3 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0,1 0,01 G = rAI . i . sA ∆G= Progreso genético rIA= Exactitud de la estimación del valor genético i = Intensidad de selección SA = Desviación estándar genética aditiva Un efecto positivo de la producción de embriones de razas cárneas en vientres de vacas lecheras se produce cuando se emplea semen de toros seleccionados por sus atributos en su rendimiento cárneo, ganancia de peso o facilidad de parto. Con ello se posibilita también obtener rendimientos óptimos con toros puros o con embriones cruzas, como consecuencia del efecto de heterosis. A través de la transferencia bilateral de los embriones a una receptora se posibilita además aumentar hasta 40% el número de terneros por vaca. Ello podría ser otra razón para aplicar la PIV en razas cárneas. Además de la transferencia bilateral es posible aumentar la tasa de mellizos hasta 50% mediante la transferencia contra lateral de embriones a vacas servidas o inseminadas. La aplicación de la PIV es simple y económicamente aceptable si la transferencia de embriones congelados/descongelados tiene valores de sobrevivencia de 50% aproximadamente. De esta forma será posible conservar los embriones en el contenedor de nitrógeno líquido y transferirlos dentro de los programas de rutina sobre celo inducido o natural. Los costos del ternero producido corresponderían al 20% del precio de venta. La PIV de embriones constituye un método biotecnológico prometedor en el aumento de la eficiencia de la producción bovina intensiva. Intensidad de selección i 0,35 0,64 0,97 1,4 1,76 2,06 2,27 2,67 2,74 2,83 3,96 3,17 3,37 3,96 Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 254 Brem Prueba de rendimiento a la faena y de los parámetros de calidad de carne Un aspecto especialmente innovador de la PIV de embriones lo constituye la particularidad de la obtención de ovocitos que los animales pueden ser selecciona-dos después de la faena según sus particularidades cárneas. En programas convencionales de selección esas características pueden evaluarse mediante engorrosas pruebas de progenie. Esas pruebas de la descendencia pueden llevarse a cabo sólo en una parte de los toros. Para un programa de IVP es posible emplear semen de toros que cuenten con buenos valores en esas particularidades. En los toros jóvenes es posible llevar a cabo una prueba de rendimiento a la faena después del período de recolección de semen. La condición para una consecuente prueba de rendimiento propio de las vacas faenadas es que se puedan tomar datos fehacientes a la faena como también identificar los ovarios en forma individual. A partir de los datos del matadero deberá ser posible la toma de una decisión selectiva y llevar a cabo la PIV. A partir de algunos cálculos se demostrará qué progreso genético anual es posible alcanzar (desviaciones estándar) con este método en función del porcentaje de animales seleccionados y de la heredabilidad (tabla 2). Los valores de la tabla 2 tienen validez sólo si toda la descendencia en el rodeo es producida de esa forma. Si sólo se incluye una parte de la población, el progreso genético corresponderá sólo a esa parte de la población o a los terneros originarios de ese programa. Para determinar el progreso genético en toda la población se deberá considerar qué porcentaje de la descendencia total tiene origen en ese programa y el progreso genético de los parámetros correspondientes en la descendencia originaria de un programa convencional. Tabla 2: Progreso genético anual (en desviaciones estándar sA) en función del porcentaje de las vacas seleccionadas mediante prueba de rendimiento propio y de la heredabilidad (h2) Vacas faenadas seleccionadas (%) Intensidad de selección ik h2 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 .14 .17 .20 .22 .25 .27 .28 .30 .17 .20 .23 .26 .29 .31 .33 .35 .18 .22 .25 .28 .31 .33 .36 .38 .19 .24 .27 .30 .33 .36 .39 .41 .23 .28 .32 .36 .39 .43 .46 .48 .26 .31 .36 .41 .45 .48 .51 .55 .28 .34 .40 .44 .49 .53 .56 .60 80 .35 60 .64 50 .8 40 .97 20 1.4 10 2.06 5 2.06 TB = 2,5 años; TK = 3 años; iB = 1.4; Fertilidad 100% (iB + iK) . h ∆G -------------------. sA = T b + TK Biotecnología de la Reproducción (1,4 + iK) . h -------------------------- . sA 5,5 www.reprobiotec.com Aplicaciones de la producción in vitro de embriones 255 Dado que las características corporales a la faena tienen una heredabilidad e importancia económica altas, es de esperar que este programa pueda llevarse a cabo exitosamente. Las características de calidad de la carne que generalmente también encuentran consideración tienen la dificultad que hasta el momento no se dispone en el lugar de métodos simples, rápidos y valederos de evaluación. En la elección de las características a seleccionar debe evaluarse detalladamente qué parámetros serán considerados. La consideración simultánea de varias características determina, por un lado, un trabajo más complejo en la selección de las vacas en el matadero. Por el otro, naturalmente un reducido progreso genético de las características individuales. Cuando las correlaciones entre las características son suficientemente positivas y altas, se llegará a un considerable mejoramiento correlacionado con la selección de una característica. Por último debe acentuarse una vez más que a través de la combinación de la selección de vacas faenadas y posterior producción in vitro de embriones, se cuenta por primera vez con un método aplicable en la práctica para alcanzar el mejoramiento genético de las características a la faena de la hembra bovina. Ello cobra particular importancia en los tiempos actuales, en los que se le atribuye a la calidad de los productos una importancia creciente. Un significativo progreso, alcanzable a través de la aplicación de nuevas biotecnologías. Obtención de los ovocitos de animales vivos La punción de ovarios de animales vivos constituye una continuación prometedora del desarrollo y aplicación de la PIV. A través de las técnicas de ultrasonido es posible puncionar los folículos y obtener los ovocitos en forma repetida, lo que posibilita aumentar el número de ovocitos recolectados. En el caso de que esa forma de recolección de ovocitos continuada se pueda llevar a cabo y que se puedan producir embriones con la misma eficiencia que con ovarios de animales sacrificados, podría esperarse en teoría la producción de 100 embriones transferibles por vaca y año. Ello aportaría una considerable mejora de la aplicación de la TE porque aumentaría el número de la descendencia y disminuiría la tasa de descarte de los animales seleccionados. La aplicación consecuente de la PIV de embriones con los ovocitos obtenidos de animales vivos puede constituir una alternativa de los programas de superovulación en el mediano y largo plazo. La ventaja de esa técnica es que permitiría obtener ovocitos de vacas de alto valor genético, que no responden a los tratamientos hormonales de los programas de TE. El número de embriones por donante y año puede aumentar e incluso sería posible continuar el programa de PIV en animales preñados sin peligro de afectar la continuidad de la gestación. Condiciones para ello son la optimización de la eficiencia de las técnicas de recolección, un número suficiente de ovocitos vitales en condiciones de madurar y ser fertilizados con una metodología económica. Bibliografía BREM, G. 1989. Aspects of the application of gene transfer as a breeding technique for farm animals. Biol. Zent. Bl. 108, 1-8. BREMEL, R.D., YOM, H.Ch., BLECH, G.T. 1989. Alteration of milk composition using molecular genetics. J. Dairy Sci. 72, 2826-2833. ERNST, L.K., ZAKKO, V.I., SURAEVA, N.M., PONOMAREVA, T.I., MIROSHNICHENKO, O.I., PROKOFEV, M.I., TIKCHONENKO, T.I. 1991. Transgenic rabbits with antisense RNA 1 gene targeted at adenovirus H5. Theriogenology 35, 1257-1271. HAMMER, R.E., PURSEL, V.G., REXROAD, C.E., WALL, R.J., BOLT, D.J., PALMITER, R.D. and BRINSTER, R.L. 1986. Genetic engineering of mammalian embryos. J. Anim. Sci. 63, 269-278. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 256 Brem HAMMOND, J.A. 1952. 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Los embriones en estadio unicelular demandan el cultivo temporal antes de su transferencia definitiva, ya sea in vivo o in vitro. Por esas razones el clonado de embriones se lleva a cabo en pocos laboratorios especializa-dos y equipados para ello. En este capítulo se describirán las consecuencias genéticas que tiene el espectro de aplicaciones de la producción de mellizos homocigotas (cuadro 1) y de terneros a partir de embriones clonados (cuadro 2). Cuadro 1: Aplicaciones de la división de embriones Investigación básica: Estudio del efecto materno durante la gestación Estudio de los efectos genéticos y ambientales sobre el fenotipo Producción animal: Aumento del número de terneros por vaca donante Disminución de los costos en un programa de TE Reducción del número de toros en espera Aumento de la eficacia en la formación de reservas genómicas Aumento del progreso genético Cuadro 2: Aplicaciones del clonado en producción animal Investigación básica: Estudio de la interacción núcleo-citoplasma Delimitación de la (de) diferenciación del núcleo celular Producción animal Limitación de la variabilidad genética Estudio de las influencias genéticas y ambientales en el animal Disminución del número de animales de experimentación Aceleración del progreso genético Selección del sexo Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 258 Brem & Clement-Sengewald Investigación básica El empleo de animales genéticamente idénticos conduce, en experimentos que no son repetidos, a una consecuente disminución de la varianza. Con la distribución de animales idénticos en diferentes alternativas de tratamientos, el efecto de los mismos es posible de medir con mayor exactitud que con el empleo convencional de animales experimentales. Esa superioridad de los mellizos idénticos puede definirse como el "valor de la eficiencia de los mellizos" (VEM). El mismo establece cuántos animales, en cada uno de los 2 grupos estudiados, pueden reemplazarse por mellizos idénticos sin que el ensayo pierda su validez estadística. La eficacia de los experimentos con mellizos idénticos o clones es mayor aún con el aumento de la heredabilidad. Una ventaja particular del empleo de animales idénticos producidos por medio de microcirugía la constituye el hecho que ya se pueden llevar a cabo estudios durante la gestación, la perinatalidad y en las primeras semanas de cría. Los animales genéticamente idénticos son adecuados también para el estudio de la interacción genotipo-ambiente. Los genotipos idénticos pueden ser distribuidos en diferentes ambientes y al mismo tiempo es posible alcanzar en cada grupo, una división de los componentes de la varianza, por medio de los valores de medición y de la varianza dentro de los clones. La distribución de clones de razas europeas en regiones tropicales y subtropicales son un ejemplo de tales estudios. A través de los mismos es posible establecer si los valores de rendimiento son los mismos para condiciones extremas o si deben establecerse nuevos criterios de selección para la elección de los reproductores más adecuados. Otro componente de investigación es la interacción genotipo-año, a través de la conservación y la transferencia distribuida en el tiempo de embriones divididos o clonados. Con un empleo consecuente de este método es posible también establecer valores genéticos estimativos de ∆G. Los animales originados de la microcirugía y transferencia nuclear son también adecuados para el estudio y medición de los efectos maternos. Estos efectos se caracterizan por aquellas características de la descendencia afectadas no solo por el genotipo sino también por el fenotipo materno, que contiene a su vez componentes genéticos y ambientales. Los componentes genéticos de la madre pueden tener origen en el núcleo o en factores citoplasmáticos. En los animales mamíferos la herencia extracromosomal tiene lugar exclusivamente en el ADN mitocondrial. Los mellizos idénticos no solo tienen el mismo genotipo sino también el mismo ADN extracromosómico. Por el contrario los clones se diferencian en su ADN citoplasmático, dado que el ovocito receptor de los núcleos puede originarse de diferentes vacas. El estudio de las interacciones núcleo-plasma puede, en consecuencia, aclarar la pregunta no respondida aún sobre el rol que desempeña el ADN no contenido en el núcleo. Esto es, establecer la función del ADN de las mitocondrias o los centrómeros (herencia matroclin). A través de la transferencia de núcleos celulares de una edad definida, es posible establecer el momento conocido como "diferenciación nuclear", en el cual la capacidad de la célula de poder diferenciarse en cualquier órgano (totipotencia) se pierde. A partir de ese momento no es posible provocar un nuevo comienzo de división celular. En consecuencia una rediferenciación es imposible. Ello significa que en el interior del núcleo celular se manifiestan procesos de envejecimiento y cambios que hasta el momento no han sido estudiados suficientemente (STICE y ROBL, 1989). El ambiente pre- y post-natal es separado de la propia madre por medio del empleo obligado de la transferencia de embriones. Los efectos maternos se pueden dividir principalmente en las siguientes áreas: 1. 2. 3. 4. Genéticas, extracromosomales, ambiente uterino, y ambiente post-parto durante el período de amamantamiento. www.reprobiotec.com Biotecnología de la Reproducción Aplicaciones de los mellizos homocigotas y clones 259 La varianza genotípica total para una característica cuantitativa determinada se compone, sin considerar el efecto génico epistático, de componentes directos, maternos, aditivos y de aquellos condicionados por la dominancia, los efectos mitocondriales y las influencias ambientales: Vp = VGa(d) + VGa(m) + VGd(d) + VGd(m) + VMi(m) + VUt(m) + VU(d) Ga Gd Mi Ut U (d) (m) = efectos génicos aditivos = efectos génicos dominantes = efectos mitocondriales = Influencias uterinas = Influencias ambientales = efectos directos = efectos maternos Los componentes genéticos causales pueden estimarse individualmente de las covarianzas entre animales emparentados (tabla 1). Es posible estimar la influencia uterina, el ambiente materno como así también los factores ambientales directos por medio de la transferencia de embriones (1 ó 2 embriones en 1 ó 2 receptoras). Tabla 1: Coeficientes de los componentes de la covarianza genética entre animales emparentados (según Brem 1986, 1990) Covarianzas entre Varianza Cov MH Cov HC Cov HE Cov M D Cov M mH Cov P D Cov P mH MH HC HE mH P M D = mellizos homocigotas = hermanos clon = hermanos enteros = medio hermanos = padre = madre = descendencia 1 1 1/2 1/2 1/4 1/2 1/4 Componentes causales VGa(d) VGa(d) 1 1 1 1/2 1 0 0 VGa(m) 1 1 1/4 0 0 0 0 VGd(m) 1 1 1 0 1 0 0 VMi(m) 1 0 1 1 1 0 0 Los estudios sobre predisposición a enfermar y de enfermedades hereditarias con mellizos idénticos tienen una larga tradición en el hombre y animal. Predisposición a enfermedades se define a la disposición individual para sufrir alteraciones de los procesos metabólicos como consecuencia de carencias particulares. La resistencia es la desensibilidad o la exitosa resistencia pasiva contra agentes patógenos. Resistencia y predisposición son dos términos recíprocos. La mayor parte de las enfermedades hereditarias y anomalías morfológicas congénitas son de naturaleza poligénica. La Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 260 Brem & Clement-Sengewald estimación de la heredabilidad tiene gran importancia en la patogénesis. Su determinación se dificulta porque la mayor parte de las malformaciones y enfermedades no presentan una variación continua sino que se presentan como características umbrales. Esto significa que sólo se manifiestan superando determinado umbral. El empleo de la concordancia de mellizos homocigotas o hermanos clon en la estimación de la heredabilidad de la disposición a una enfermedad evita la desviación provocada cuando se incluye toda la población. Ello se cumple si se garantiza la ausencia de influencias familiaambiente. A través de la elección del material animal adecuado (animales idénticos genéticamente o emparentados) y del ambiente uterino y post-natal puede aclararse si la expresión del defecto o la disposición están afectados y en que intensidad por uno o varios loci, componentes genéticos aditivos, dominantes y/o epistáticos, uterinos, ambientales, penetrancia o expresividad. La realización de este tipo de estudios está limitada por la complejidad de producir el material animal adecuado, sin embargo los mismos constituyen el único modelo experimental adecuado para responder a las preguntas sobre la disposición a enfermedades y a su patogénesis. Producción animal Como ya fue mencionado los animales idénticos se adecuan bien para estimar la varianza genética y las influencias ambientales. Con el material animal adecuado es posible obtener también los valores estimados de heredabilidad. Otro parámetro que influye sobre la intensidad del progreso genético es la exactitud de la estimación del valor genético. Aumentos de su exactitud tienen efecto directo en el incremento del éxito de la selección. En los programas de mejoramiento por medio de la inseminación artificial los valores genéticos de los machos pueden ser estimados con seguridad en base a la información obtenida de la descendencia. En cambio la exactitud de la estimación del valor genético de las hembras es considerablemente menor. Con la información obtenida de dos pruebas de rendimiento propio de mellizos idénticos es posible aumentar la exactitud de la estimación del valor genético en 40% para valores de baja heredabilidad (p< 0,1) y para heredabilidades de valor medio (0,2 hasta 0,4) hasta 30%. La producción de mellizos homocigotas en un programa de mejoramiento por medio de IA tiene efecto sobre la línea madre-hijo con un aumento de la intensidad de selección anual, dado que el número de terneros machos por madre de toro aumenta. En programas convencionales de mejoramiento, el progreso genético absoluto es de 0,173; 0,2 ó 0,21 desviaciones estándar para una reposición de 10, 1 ó 0,1% respectivamente. Con la aplicación de la TE y la MC puede provocarse un aumento de 20-25% en la línea madre-hijo con una reposición de 1%. Con una tasa de reposición de 10% los valores ascienden a 40-50% aproximadamente (fig. 1). En razas productoras de carne los mayores aumentos del progreso genético en un programa de TE podrían ser alcanzados por medio de la microcirugía. Ese método no cubre, sin embargo, los costos de la técnica, a pesar del mayor precio de los terneros. Este método es interesante para empresas elite, cuyos ingresos principales no provienen de la comercialización de ganado destinado a la faena sino a través de la venta de reproductores de alto valor genético, los cuales pueden alcanzar altos precios. La producción de mellizos idénticos tiene aspectos muy interesantes cuando se aplican en la producción de toros. Animales idénticos pueden ser sometidos, por ejemplo, a una prueba de rendimiento propio y al final pueden ser faenados a fin de recabar la información sobre la composición y calidad de la carne. A partir de esos datos pueden ser seleccionados sus hermanos idénticos. Precisamente, la información de las características con alta heredabilidad tiene un significado de importancia. Por medio de la congelación de los embriones divididos o clonados es posible reducir el tiempo de espera de los toros en selección. Los toros sometidos a la selección durante 3 años son mantenidos como "toros de espera" hasta que se dispone de la información de la descendencia y se lleve a cabo la selección. La espera no solo ocasiona altos costos sino también pérdidas de animales (20%). Cumplidos los plazos no todos los toros seleccionados están en las condiciones óptimas para la Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Aplicaciones de los mellizos homocigotas y clones 261 reproducción. A través de la transferencia de los embriones y la congelación de los embriones idénticos es posible, después del nacimiento, recría y evaluación de los animales producidos, llevar a cabo la selección y recién entonces recurrir a los genotipos congelados. En la evaluación de las consecuencias genéticas de los programas de clonado debe diferenciarse entre el valor genético general y el valor clon. Bajo la denominación valor genético general se entiende la suma de los efectos génicos aditivos que el animal a seleccionar transmite a la descendencia, al ser cruzado con animales elegidos por azar. Ese valor se refiere a una determinada población. El valor clon es la suma de todos los efectos génicos (aditivos, dominantes, epistáticos) que conducen al mismo rendimiento en los hermanos clon bajo las mismas condiciones ambientales. Dado que el parámetro más importante es el valor genético general, la selección de toros y vacas se lleva a cabo según ese principio. Figura 1: Resultados de la selección de una característica en programas de mejoramiento (progreso genético en desviaciones estándar) En la aplicación de rutina del clonado de embriones la selección clonada juega un rol decisivo junto con la selección genética condicionante del progreso genético. De la comparación entre valor clonado y genético resulta que el clonado no conduce a priori a un mejoramiento del progreso genético. Recién la combinación de la selección clonada y genética junto con la óptima aplicación de la capacidad de evaluación conduce a un éxito acumulativo (fig. 2). Por ello es importante aprovechar simultáneamente las selecciones clonal y genética (cuadro 1). El éxito de ambas selecciones dependerá, en primer lugar, de la exactitud de la estimación del valor genético, del valor clonado y de la intensidad de selección. El intervalo generacional en la prueba de las hermanas puede llevarse a cabo según el modelo del programa MOET para adultos en 4 años (capítulo XIX). Con una gran similitud entre hermanos clon, 1 ó 2 animales alcanzan para seleccionar el mejor clon (tabla 2). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 262 Brem & Clement-Sengewald Año Selección Según el valor genético: Padre de toro y Madre de toro Según el valor clon: a) Los mejores clones para la selección a través de la clonación b) Clones elite para su reproducción Medidas Recolección y clonado de embriones test Descongelación de embriones y: a) Reproducción por medio de clonado b) Cruzamientos entre los animales evaluados, clones superiores y descendientes de clones hembras con toros elite 0 4 5a8 Ventas de los animales de lo clones seleccionados Fig. 2: Combinación de las selecciones genética y por medio de clonación Tabla 2: Exactitud de la estimación del valor genético (A) y del valor clon (C) con una h2 = 0,25 (TEEPKER and SMITH, 1989) Correlación entre hermanos clon 0,25 A 0,50 0,80 0,25 C 0,50 0,80 1 0,50 0,50 0,50 0,50 0,71 0,89 Número de hermanos probados 2 5 0,63 0,58 0,53 0,63 0,82 0,94 0,79 0,65 0,55 0,79 0,91 0,98 10 0,88 0,67 0,55 0,88 0,95 0,99 Otra situación se cumple con la determinación de los valores genéticos de los clones. Con un aumento de la diferenciación entre heredabilidad y similitud entre los hermanos clon disminuye la estimación del valor genético. En un ensayo modelo con mellizos idénticos se llevaron a cabo los siguientes puntos: Prueba de rendimiento propio de engorde de 4 mellizos idénticos. Empleo de los toros mellizos en la inseminación. Destino de 12 hijos machos por toro a las estaciones de prueba de descendencia para ser evaluados en su engorde y rendimiento a la faena. Destino de 12 hijas por toro para ser evaluadas en su engorde y rendimiento a la faena. Faena y análisis completo de los toros después de los tests. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Aplicaciones de los mellizos homocigotas y clones 263 Los análisis llevados a cabo concluyeron, como era esperable, en la existencia de una alta similitud entre los mellizos homocigotas en el engorde. La similitud varió entre 65 y 80%, lo que significa que el test de un mellizo permite obtener buena información sobre la predisposición genética del hermano y eventualmente también de los hermanos clones. Las diferencias entre los grupos de descendientes machos y hembras fueron extremadamente reducidas para los valores de engorde y faena. La prueba estadística indicó que esas diferencias entre la descendencia de los pares de mellizos son casuales y pueden aclararse por medio de la variación de la toma de muestra. En consecuencia, las relaciones entre la descendencia de los mellizos idénticos son altas. Como es de esperar no tiene importancia qué mellizos se empleen en el programa de mejoramiento, dado que los valores genéticos producto de la evaluación de la descendencia deben arrojar los mismos resultados. La correlación entre las pruebas de rendimiento propio y de la descendencia es muy alta. A partir de esos resultados se supone que el valor genético aditivo de los toros es predecible por medio de la prueba de rendimiento propio del hermano mellizo y de los hermanos clones. A través de ello es posible aprovechar mejor las capacidades de evaluación de las estaciones de prueba de engorde y faena por medio del empleo de la transferencia de embriones y del clonado que con los métodos convencionales. TEEPKER y SMITH (1989) llevaron a cabo modelos de cálculos de las mejoras de la eficiencia esperable con la aplicación de la transferencia de embriones. La selección clonal puede provocar una mejora de la eficiencia de 1,9 unidades estándar en una ronda de selección (tabla 3). Ello correspondería a una eficiencia de lactación de 1 500 kg, lo que conduciría a que el rendimiento de los mejores animales del clon superarían considerablemente los rendimientos de los animales reproductores de la población. Se debe considerar que los resultados de la selección de clones posiblemente no puedan ser acumulados como los progresos genéticos a largo plazo. El progreso genético anual de los programas de IA es de 1% aproximadamente, en programas con una buena eficiencia hasta 1,5%. Con programas MOET aplicados en madres de toros o programas de núcleos de producción se pueden alcanzar progresos genéticos de 2 a 2,4%. La selección clonal puede posibilitar, por otra parte, un progreso genético de 20 a 25%. Tabla 3: Modelo de cálculo del éxito de selección (genético = A y clonal = c) después de una ronda de selección (h2 = 0,25 y correlación entre hermanos clon = 0,50; según TEEPKER y SMITH, 1989) Selección según A C C+A Estructura genética MH mH HC 4-5 1-4 4-5 3-5 2-5 2-4 1,0-1,7 3,1-5,0 1,3-2,5 Elevación del rendimiento 0,528 1,879 2,339 A Valores relativos C A+C 96 100 98 99 96 100 100 70 96 Uno de los primeros modelos de cálculo del progreso genético anual con la aplicación del clonado de embriones fue propuesto por NICHOLAS y SMITH (1983). Los autores compararon el éxito genético con la producción de grandes clones frente al de un programa de inseminación artificial (fig. 3). A través de la selección de los padres de los clones es posible alcanzar una ventaja inicial de 4 años (medidos en progreso genético teórico anual) comparado con el programa convencional por medio de IA. Después de 3 años se dispone del rendimiento de los clones, los mejores pueden ser seleccionados y destinados a la población. La descendencia nacida el año siguiente estaría 13-17 años más adelantada que aquella de un programa de IA. En el mismo año se cruzan los mejores clones entre sí, a fin de disponer de una nueva ronda de selección en el 8 año. Después de 16 años la diferencia entre la producción y empleo de los clones y el sistema de selección convencional por medio de la descendencia sería de aproximadamente 30 años. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 264 Brem & Clement-Sengewald En la evaluación de las ventajas genéticas de los programas de clonado se debe diferenciar entre clones machos y hembras. Los clones machos permiten un progreso genético seguro y eficiente en las características de engorde y rendimiento a la faena en razas productoras de carne y de doble propósito. Permiten, además, un mayor y más eficiente aprovechamiento de los toros elite, si se produjeron embriones idénticos y uno de ellos fue congelado. Existe la posibilidad de estudiar la disposición y resistencia a enfermedades cuando se dispongan de métodos adecuados para su estudio. Con los clones hembra sería posible producir grandes grupos de animales que, bajo condiciones ambientales definidas, estarían 2 desviaciones estándar por encima de la media. Ello significaría para una raza lechera como Holstein Friesian una garantía de producción de 10 000 kg de leche. En la raza Fleckvieh sería posible alcanzar una producción de 7 000 kg con un buen desarrollo muscular. 44 Cría y uso de los clones seleccionados 36 Subsecuente tasa de respuesta 28 20 Prueba de progenie Padres de toros IA comercial Posible respuesta Selección de los 12 mejores clones 4 Respuesta alcanzada Mejora genética 0 inicial 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Fig. 3: Posible progreso genético por medio de la producción y empleo de clones seleccionados en comparación con el ∆G teórico en programas convencionales de selección por medio de la descendencia (NICHOLAS y SMITH, 1983) En el futuro, una adecuada combinación de selección clonal y genética podría provocar una marcada aceleración del progreso genético. Bibliografía NICHOLAS, F.W., C. SMITH. 1983. Increased rates of genetics change in dairy cattle by embryo transfer and splitting. Animal Prod., 36: 341-353. STICEL, S.L., J.M. ROBL. 1989. Current success in cloning mammalian embryos. Age 12: 83-88. TEEPKER, G., C. SMITH. 1989.Combining clonal response and genetic response in dairy cattle improvement. Animal Prod., 49: 163-169. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Aplicaciones de la transferencia génica 265 APLICACIONES DE LA TRANSFERENCIA GENICA G. Brem Introducción Durante los últimos años se discutieron una serie de áreas de aplicación de la transferencia génica en los animales domésticos. Hasta el momento sólo se pueden modificar, a través de la transferencia génica, características genéticas, las cuales están asociadas a pocos genes (cualitativas). Sin embargo se conocen pocas características en producción animal que son afectadas por los conocidos como genes simples (genes principales). En las características más importantes de producción y reproducción se trata, en consecuencia, de las características denominadas cuantitativas, que responden a una herencia de tipo poligénica. El hecho que el límite entre las características cuali- y cuantitativas carece de solución de continuidad fue plenamente demostrado con la producción de ratones transgénicos gigantes. El crecimiento, una de las clásicas características cuantitativas en producción animal, se convirtió en una característica cualitativa cuando el gen de la hormona de crecimiento se transfirió en ratones estableciendo un mecanismo de retroalimentación independiente. En parte, es posible provocar similares efectos también con la aplicación de somatotrofina bovina en vacas lecheras. A pesar que nuestros conocimientos en esa área aún son insuficientes, los resultados de esos estudios pueden interpretarse, en el sentido de una hipótesis de trabajo, que genes principales pueden provocar efectos génicos similares a los aditivos determinando el rendimiento de una característica, particularmente debido a la gran variabilidad de los efectos individuales. Según la definición de genética cuantitativa, en el efecto génico aditivo no es posible reconocer el efecto de un único gen. Esa definición se basa en análisis estadísticos de la distribución de las características en la descendencia o la población, sin conocimientos de los efectos génicos que lo motivan. Es de esperar que estudios posteriores puedan aumentar nuestros conocimientos sobre la determinación y efecto de ciertas características. En lo que respecta a las áreas de aplicación de la transferencia génica en los animales de interés productivo existen perspectivas reales de afectar la eficiencia productiva en forma positiva. Actualmente las actividades en la investigación se concentran en las áreas: crecimiento, resistencia a las enfermedades, calidad de los productos animales, "gen farming" y nuevos mecanismos o caminos metabólicos. Crecimiento El crecimiento es un fenómeno extremadamente complejo que, dependiendo de la determinación genética, es influenciado por el efecto conjunto de hormonas y factores auto- paracrinos como también alimentación y factores ambientales. Desde el punto de vista de genética básica son especialmente interesantes los genes de proteínas de la cascada hormonal de crecimiento, que se originan en el hipotálamo o en la hipófisis y que afectan, vía hígado, sus órganos blanco periféricos. Las secuencias de aminoácidos y genes para esas hormonas proteicas son conocidas y fueron ya clonadas y secuenciadas. El comienzo del círcuito neuroendócrino de la hormona de crecimiento se encuentra en el hipotálamo. Allí se sintetizan la hormona estimulante somato-liberina (GHRH = Growth Hormon Releasing Hormone, GHRF = Growth Hormone Realising Factor) y la hormona inhibidora somatostatina (SRIF = Somatotropin Inhibiting Factor Hormone) según un período circadiano y en dependencia de diversos factores, especialmente de la concentración sérica de diversas hormonas (GH, IGFI, etc.). La GHRH es un oligopéptido de 43-44 aminoácidos con diferente homología entre las especies que se sintetiza en los núcleos arcuato y ventromedial del hipotálamo. La SRIF no indica, por el contrario, Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 266 Brem especificidad alguna. Está formada por dos diferentes péptidos de 14 y 28 aminoácidos de largo y se produce no solo en el hipotálamo sino también en el páncreas y en el intestino. La hormona de crecimiento (GH = Growth Hormone, STH = Somatotropes Hormone, Somatotropin) es sintetizada en las células acidófilas del lóbulo anterior de la hipófisis. La misma está compuesta de 190191 aminoácidos y contiene 2 puentes disulfúricos intramoleculares. Junto con la forma 22 kDa se encuentran en el hombre otras formas (20, 45 y 80-90 kDA). El péptido de señal, originado en la síntesis primaria, se separa en el retículo endosplasmático. La homología entre la hormona de crecimiento del bovino y otras especies corresponde, para el ovino en un 99,5% (un aminoácido diferente), cerdo 90,5% (18 diferentes aminoácidos) la rata y el ratón 87,9 y 87,4 respectivamente (23 y 24 aminoácidos diferentes) y frente al hombre 66,3% (64 aminoácidos diferentes). La somatomedina C (IGFI = Insulin-like Growth Factor I), polipéptido básico de 70 aminoácidos y 7,5kDa, es un factor mitogénico subordinado a la hormona de crecimiento. Se sintetiza en el hígado, riñón, pulmón, corazón, glándula mamaria y la epífisis ósea. De la misma forma fue encontrado en diferentes células tumorales. La somatomedina tiene efectos endócrino, autócrino y parácrino. La homología de las secuencias polipéptidas del IGFI entre las especies ya mencionadas es superior al 90%. El IGFI tiene 2 hormonas precursoras ("prepro" IGFIA e IB) que son el resultado de la separación alternativa del ARN. Las mismas son idénticas en sus terminales amínicas pero se diferencian en sus terminales carboxiladas. La liberación de la hormona de crecimiento se produce, como ya fue mencionado, en dependencia de GHRH y SRIF e indica un marcado episodio circadiano de varios picos. La hormona de crecimiento es distribuida en el organismo a través de la circulación sanguínea y asociada, principalmente, con receptores GH del hígado como así también del tejido graso, muscular, renal cardíaco y tejido de crecimiento óseo. El efecto de la GH varía de acuerdo al balance energético (KARG, 1988). Bajo un balance energético positivo, la somatotrofina tiene, junto con la IGFI, un efecto anabólico proteico estimulante del crecimiento. Con un balance negativo predomina un efecto lipídico catabólico. El factor IGFI tiene un efecto estimulante sobre la síntesis de ADN, la tasa de división y la diferenciación celular como así también sobre la síntesis de proteína. La aplicación de hormonas de crecimiento en producción animal fue estudiada intensamente a partir de la disposición de somatotrofina producida en forma recombinante. En un gran número de trabajos se señaló que después de la administración de la hormona de crecimiento se alcanzaron efectos positivos en el mejoramiento de los parámetros de rendimiento del crecimiento (aumento de peso diario, conversión del alimento, distribución de la grasa y de rendimiento lechero). En el año 1982, como ya fue mencionado, fueron producidos ratones transgénicos con la hormona de crecimiento. En esos ratones se observó un enorme aumento del potencial de crecimiento con una multiplicación de su velocidad y una duplicación del peso final. En la actualidad existen numerosas publicaciones sobre animales transgénicos de interés productivo, los cuales contienen y exprimen genes de la familia de la somatotrofina. En la especie bovina no se ha publicado aún la producción de un animal transgénico con efectos comprobados de la hormona GH. Al contrario de los resultados publicados sobre ratones transgénicos con GH y sobre tratamientos de la misma hormona en animales de interés zootécnico se observó, con sorpresa, que los cerdos transgénicos con los genes MT-hGH y MT-bGH no presentaban aumento de crecimiento. El rendimiento de los cerdos transgénicos tendió a ser ligeramente menor que el de los animales control cuando los animales tratados fueron alimentados con una ración normal de 16% de proteína cruda. En la actualidad se conoce que para mejorar la eficacia del crecimiento de estos animales transgénicos se los debe alimentar con una ración rica en proteína (18% de proteína cruda) con el complemento de lisina. Después de una alimentación consecuente de la descendencia transgénica con una ración rica en Aplicaciones de la transferencia génica 267 proteínas se observó que, efectivamente, se producía un aumento de la ganancia de peso de 16,5% (PURSEL y col., 1988; 1989). Otro problema de la aplicación de la somatotrofina en los animales domésticos se origina en la depresión de la ingesta en aproximadamente un 20% que se contrapone al aumento del crecimiento. Cerdos transgénicos GH muestran una clara mejora de la conversión alimenticia hasta el 18%. El cambio más marcado es sin duda la reducción masiva de la grasa corporal. El espesor de la grasa dorsal se reduce de 18-20mm a 7-8mm (HAMMER y col., 1986, PURSEL y col., 1989 y 1990). La redistribución de los nutrientes (nutrient portioning) es el aspecto más positivo de los cerdos transgénicos. El crecimiento es el resultado de la hiperplasia de células diferenciadas y su posterior hipertrofia. Cuando un tejido se ha diferenciado y su contenido de ADN es relativamente estático, el crecimiento es el resultado de la concurrencia de la hipertrofia de distintos tejidos y de la disponibilidad de sustancias nutritivas. Según un modelo de HAMMOND (1952) los tejidos neural y óseo tienen prioridad aún con baja disponibilidad nutricional. Los tejidos muscular y graso se hipertrofian, de acuerdo a su potencial genético, frente a una sobreoferta nutricional (STEELE y PURSEL, 1990). La práctica de la producción animal está concentrada en la obtención óptima de tejido muscular con reducido contenido de grasa intramuscular y moderado crecimiento del tejido graso. Dado que en nutrición animal existe la sensación que la capacidad genética está agotada con los estándares nutricionales actuales, existe ávido interés en la aplicación de la transferencia génica y en tratamientos con la hormona de crecimiento. No existe, sin embargo, camino seguro mediante el cual se pueda lograr -vía transferencia génica- un mejoramiento de la distribución grasa intramuscular y con ello del sabor de la carne. El mecanismo de acción de la somatotrofina no está aclarado totalmente. Junto con los efectos directos sobre el metabolismo celular existen una serie de efectos indirectos a través de mediadores secundarios. El factor IGFI es responsable, por ejemplo, de numerosos efectos anabólicos de la hormona de crecimiento. La influencia directa de esta última sobre el metabolismo lipídico conduce a una reducción de la conversión de la glucosa, a la inhibición de la síntesis lipídica, aumenta el metabolismo lipídico y conduce por esa vía a una reducción del depósito graso de los animales tratados con GH. En forma sincrónica con el efecto inhibidor de la hormona de crecimiento sobre el tejido graso se provoca una estimulación del crecimiento adicional del músculo por una adaptación el organismo a su nuevo estatus. Los lípidos destinados originalmente a las reserva grasa son metabolizados para colaborar con la síntesis proteica. En un experimento se empleó un promotor de la prolactina bovina con el gen de la hormona de crecimiento de la misma especie en el cerdo. Los cerdos transgénicos producidos tuvieron una concentración de GHb dentro de los niveles fisiológicos de 20 ng/ml y su crecimiento fue normal. La liberación episódica fué lograda a través de sulpirida, un antagonista de la dopamina y a través de TRH (Thyreotropin Realising Hormone). Según ello el transgen está subordinado al mecanismo normal de retroalimentación de la prolactina (POLGE y col., 1990). Ovejas transgénicas GH y GHRH mostraron un incremento del nivel de hormona de crecimiento pero no un aumento del crecimiento (REXROAD y col., 1990). La aplicación del promotor de la metalotionina Ia y del gen de la hormona de crecimiento de la oveja condujo, de la misma forma a un aumento del nivel sanguíneo de la hormona de crecimiento (NANCARROW y col., 1990). Mientras la velocidad de crecimiento no fue afectada, el contenido graso de la reses ovinas contenía menos grasa (5-7%) que los animales controles (25-30%). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 268 Brem Resistencia a las enfermedades Resistencia, cualidad adquirida genéticamente, es la insensibilidad de las especies, razas o animales frente a determinados microorganismos, parásitos o toxinas. Dado que los costos producidos por las enfermedades en los animales de interés productivo corresponde a un 10% del valor de la producción, cobra importancia junto con la profilaxis también la producción de animales resistentes. Lamentablemente, la selección por resistencia a las enfermedades no está libre de dificultades. En muchos casos si bien la variabilidad de la predisposición a enfermar varía en forma discontinua, no se hereda según las leyes de Mendel. Con frecuencia la predisposición a una enfermedad es un característica con valor umbral y una variación continua pero no reconocible. Los animales con un valor de la predisposición por debajo del umbral son sanos, aquellos con un valor mayor serán afectados por la enfermedad. Frente a esa situación se desarrollaron estrategias genéticas para la selección de la característica "presencia o ausencia". Las mismas tendrán un éxito satisfactorio mientras no sea posible producir una característica con varias clases o con una variación diagnosticable. Los primeros estudios sobre resistencia y predisposición a las enfermedades se llevaron a cabo hace algunos años. Una serie de resistencias a enfermedades son caracteres poligénicos, como por ejemplo la tolerancia a la tripanosomiasis de algunas razas africanas, las cuales son también muy rústicas y resistentes al calor. Por otra parte existen mecanismos de resistencia, que dependen de un solo gen como lo es la resistencia a la diarrea neonatal de los cerdos, provocada por E. coli K 88, y la resistencia a la influenza del ratón. Los mecanismos de defensa contra agentes infecciosos pueden ocurrir, por ejemplo, a través de la modificación o pérdida de receptores. Esto impide la penetración del agente patógeno. El ingreso o la reproducción de los agentes patógenos son afectados por mecanismos generales de respuesta inmunitaria y expresión del MHC. Esas resistencias son en general muy complejas. Diferentes moléculas como interferon, neuropéptidos, interleuquinas y hormonas fueron estudiadas en sus propiedades inmunomoduladoras. La respuesta inmunitaria humoral puede correlacionarse en forma negativa con la actividad microbicida de los macrófagos. Es conocido que los productos génicos del MHC desempeñan un rol importante en la respuesta inmunitaria y que influyen la resistencia y predisposición frente a enfermedades. Ya se han encontrado asociaciones de haplotipos MHC con determinadas enfermedades en los animales domésticos. El Instituto de investigación en genética animal (DLO) de Holanda pretende aumentar la resistencia a la mastitis bovina (especialmente producida por E. coli), aumentando los niveles de lactoferrina en el tejido mamario a través de transferencia génica. Para los programas de transferencia génica se consideran fundamentalmente 5 clases de genes mamíferos: MHC del receptor de las células T de la inmunoblobulina linfoquina especiales de resistencia a enfermedades. Un comienzo interesante en el desarrollo de resistencia contra infecciones virales es la denominada "inmunización intracelular". La inmunización automática sería posible a través de la expresión de partes proteicas, integradas como transgenes, con efecto antígeno. Junto con esa posibilidad se podrían transferir también genes de anticuerpos reorganizados (inmunización genética). En un ejemplo de un antígeno que en condiciones naturales no está presente en ratones, conejos y cerdos se demostró que la expresión de transgenes puede conducir a altos títulos de anticuerpos (WEIDLE y col., 1991). Aplicaciones de la transferencia génica 269 La producción de animales transgénicos constituye una técnica particular pero también prometedora contra infecciones virales. Los animales transgénicos contienen genes antisense, los cuales actúan contra el virus. A través de la expresión del RNA antisense (RNAas), el cual debe estar presente intracelularmente en abundancia, se produce la hibridación con el RNA sense y con ello una inhibición de la replicación del genoma viral. ERNST y col. (1990) describieron la producción de conejos transgénicos, los cuales exprimian RNAas contra adenovirus H 5 (Ad 5). Aún queda por aclarar, en qué medida los animales transgénicos están protegidos contra la replicación viral. Al menos en el cultivo celular pudo demostrarse que las líneas celulares, conteniendo el RNA as fueron 90-98% más resistentes contra Ad 5 que las líneas celulares normales. Actualmente se trabaja en la aplicación de esa particularidad en los bovinos transgénicos. La transferencia génica representa, sin lugar a dudas, un interesante y seguramente prometedor método de reducir, en forma exitosa, la disposición a enfermedades provocadas por determinados agentes patógenos. No obstante debe destacarse que es necesario aún llevar a cabo una intensa investigación básica en genética molecular para que dichas técnicas sean empleadas con éxito en la práctica. Calidad de los productos animales La mejora de la calidad o composición de productos animales a través de la transferencia de genes podría abrir nuevos caminos en la producción animal. Un modelo propuesto por MERCIER (1987) contempla la reducción del contenido de lactosa en la leche. Con la producción de vacas transgénicas, que posean el gen de la lactasa acoplado a un promotor específico de la mama, se podría lograr la metabolización de la lactosa en glucosa y galactosa; permitiendo que personas que sufren de intolerancia a la lactosa puedan consumir leche. Ello tendría singular importancia en los países en vías de desarrollo, donde más del 90% de la población adulta sufren de intolerancia a la lactosa y los métodos de separación son difíciles o imposibles de llevar a cabo. BREMEL y col. (1989) discutieron otras posibilidades de modificación del contenido de la leche (cuadro 1). Además de la producción de otras proteínas, las cuales pueden ser aisladas independientemente de su localización original, se piensa en una modificación de la composición de la leche per se. De esta forma sería posible modificarla a fin de poderla emplear con mejores resultados en la alimentación del bebé. Gene farming Como ya fue explicado, es posible que la expresión génica puede producirse solamente en un órgano determinado, a través de la combinación de genes con elementos reguladores específicos. De esta forma es evidente que genes unidos a promotores de proteínas de la leche se expriman en primer lugar en las células mamarias. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 270 Brem Cuadro 1: Posibilidades de modificación de la composición de la leche (BREMEL y col., 1989) Objetivo Aumento del contenido proteico Posibilidades de procesamiento Leche libre de β-globulina Reducción del contenido graso Mayor contenido de materia seca Prevención de mastitis Caseina Variantes de caseina o variantes de caseina manipuladas β-globulina anti-sense Acetil-CoA-carboxilasa β-galactosidasa, Lactasa Genes de anticuerpos Genes En consecuencia de ello, si la translación del RNAm, el transporte de las proteínas y la sección de los péptidos de señal funcionan consecuentemente, la proteína codificada por el gen se fracciona en el alvéolo mamario y se obtiene, como producto gentecnológico, en la leche ordeñada. De ello surge la pregunta: porqué debe optarse por animales mamíferos como "bio-reactores" para la producción de importantes proteínas genéticas, en lugar de producir esas sustancias con el cultivo de E. coli u otros microorganismos? Los siguientes argumentos respaldan el empleo de la glándula mamaria como órgano productor de proteínas extrañas: - Muchas proteínas necesitan para su funcionalidad -en parte- amplias modificaciones postranslacionales (por ejemplo: glicosidación, hidroxilación β o carboxilación β). En muchos casos ello no es posible en los sistemas recombinantes simples desde E. coli a S. cervesiae o lo es en una forma insuficientemente precisa. Las proteínas producidas de esta forma pueden modificase convirtiéndose en antígenos, por un lado, por el otro pueden faltarles una actividad o tenerla incompleta.Los animales mamíferos están en condiciones, contrariamente a los sistemas procarióticos de producción, de establecer las modificaciones postranslacionales en las proteínas nuevas. No fue aclarado hasta el momento en qué medida es posible llevar a cabo esa producción con células in vitro en forma idéntica a la de las células en sus órganos de origen (p. e.: hígado). - La expresión de proteínas extrañas en la leche es un sistema en el cual el producto puede obtenerse en forma convencional a través del ordeñe y sin perjuicio de los animales empleados. - La capacidad de síntesis de la glándula mamaria es considerable. La concentración de la suma de proteínas lácteas endógenas es de 4-6%. Aún cuando no sea posible producir 60 g de proteína recombinante en un litro de leche, a través de gene farming, las cantidades de 1 y 2 µg/l son suficientes para obtener importantes cantidades de proteínas de alto valor farmacéutico con vacas de alta producción. - La leche es un producto de alta pureza e higiene. No deberían presentarse problemas insolubles en la aislación de las proteínas extrañas de la leche. Se evita en particular la presencia de restos procarióticos y residuales en las proteínas purificadas. Para el empleo de la glándula mamaria como bio-reactor es necesario la presencia de los elementos regulatorios clonados. Ya fueron aislados los genes y promotores para la caseína alfa s1, caseina ß, lactoalbúmina alfa, lactoalbúmina ß y la proteina whey acidi (WAP) en algunas especies incluida la bovina. Se pudo demostrar que casi todos esos genes se exprimen con especificidad de tejido, aún en animales transgénicos de otras especies. Aparte del ratón fue posible comprobar, en parte, alto contenido de proteína extraña en conejos, ovejas, cabras y cerdos transgénicos. Es necesario continuar Aplicaciones de la transferencia génica 271 con la investigación, sin embargo la posibilidad básica de lograr una valorable expresión, traducida en algunos gramos por litro de leche fue comprobada en varios experimentos. De acuerdo a los conocimientos actuales, las proteínas segregadas por la glándula mamaria aparentan ser más activas biológicamente. La posibilidad y medida de las modificaciones no ha sido aclarada completamente. Se puede suponer que ese sistema significará un importante aporte de proteínas de alto valor en medicina. Nuevas vías metabólicas Un área de importancia, en el cual la transferencia génica afectará la productividad es la modificación de las vías metabólicas. WARD y col. (1986) pensaron especial-mente en la reconstitución de vías metabólicas presentes normalmente pero perdidas en determinadas especies como así también en la incorporación de nuevas vías que hasta el momento no fueron observadas. Ello significaría que los genes necesarios para esa vía metabólica deben obtenerse de otras fuentes y que antes de la transferencia deben ser preparados para la expresión en organismos mamíferos. El interés se concentra en la modificación de vías metabólicas por medio de la introducción de métodos biosintéticos para elementos esenciales. Se conoce que el aminoácido cisteina es un substrato limitante de la síntesis de lana en la oveja y que no es posible aumentar su concentración sérica con medidas nutricionales porque la cisteina excedente es eliminada en el rumen. Por esa razón sería ventajoso si ovejas transgénicas pudiesen sintetizar cisteina. Para ello deben aislarse los genes para la serina transacetilasa y la acetil serin acetilasa de procariotes y transferirse a la oveja con nuevos elementos regulatorios. Las ovejas transgénicas deberían estar en condiciones, de acuerdo a su nueva vía metabólica transgénica, de sintetizar la cisteina en el epitelio ruminal, empleando H2S, y transportarla a los folículos. Un segundo camino propuesto por WARD y col. (1986) sería la vía metabólica de glicoxilato, que permitiría a los ovinos sintetizar glucosa a partir de acetato. Ello es interesante por que todos los rumiantes emplean la glucosa como fuente energética para determinados tejidos (cerebro, feto) pero carecen de una fuente suficiente para ese sustrato. En consecuencia los rumiantes deben sintetizar la glucosa a partir de aminoácidos y de los ácidos libres como propionato. El isositrato se forma a partir de acetato y oxalacetato y bajo la influencia de isotratliasa se forma glicoxilato y succinato. De dos moléculas de acetato se origina una de succinato. No debe quedar sin mencionar que la introducción de estas nuevas vías metabólicas no es simple y que deben considerarse y cumplirse una serie de condiciones complementarias. Debe pensarse tan sólo en la localización y disponibilidad de las enzimas correspondientes. Un interesante hallazgo en relación con el desarrollo de nuevas vías metabólicas se llevó a cabo en una línea de ratones transgénicos, que poseían 250 copias de un filamento intermediario del gen de la queratina ovina. En esa línea murina se observó la caída y crecimiento cíclicos del pelo, originados por el desbalance provocado por el aumento del nivel del filamento intermediario queratina y el consecuente nivel reducido de proteínas asociadas al filamento (POWELL y ROGERS, 1990). La consecuencia genética del problema descrito, como consecuencia del origen de mosaicos o mutantes de inserción, es que para la incorporación de un determinado gen en una población no alcanza la producción de un sólo animal transgénico. Independientemente de que a través de ello se puedan originar problemas de consaguinidad, las posibilidades de crear una línea funcional con un sólo animal transgénico son muy reducidas. Para que una línea transgénica pueda ser empleada con éxito en producción animal debe cumplir las siguientes condiciones: Transmisión estable del transgen a la descendencia. Estar libre de mutaciones de inserción y poder producir animales transgénicos homocigotas. Expresión estable del transgen y efecto biológico positivo de la característica deseada. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 272 Brem De ello surge que deben producirse por lo menos 5 a 10 animales transgénicos primarios para establecer, con alta probabilidad, líneas transgénicas que respondan a los objetivos. Para la producción de líneas transgénicas el objetivo genético y la velocidad en que pueden producirse esos cambios (progreso genético) son definitivos en el resultado final. Un análisis de costos, similar a los efectuados en los programas de mejora genética tradicionales, puede llevarse también a cabo para los cambios genéticos transgénicos. Si la finalidad genética de la transgénesis comprende características que son consideradas en una programa genético tradicional, es necesario comparar el progreso genético posible con y sin líneas transgénicas. En las especies bovina y porcina la comparación indicó que en las líneas transgénicas es necesario un aumento del progreso genético de 5,5 a 16,5%, según cual sea la característica productiva (BREM, 1989), para alcanzar el progreso genético adecuado en el mismo lapso que se alcanza con la IA (cuadro 2). Cuadro 2: Progreso genético necesario en las líneas transgénicas para producir la misma mejora del rendimiento que en los mejores programas de selección por medio de la inseminación artificial (BREM 1989) Promedio Progreso genético anual esperado % Años necesarios para producir líneas transgénicas (F3) Efecto transgénico esperado % Característica Bovino Cantidad de leche Aumento de peso diario Rendimiento cárneo Cerdo Grasa dorsal Aumento de peso diario Rendimiento cárneo 20 mm 700 g 57% 2,0 2,5 1,5 4 4 4 8% (0 1,6 mm) 10% (= 70 kg) 6% (0 3,4%) 6000 kg 1200 kg 60% 1,5 1,5 0,5 11 11 11 16,5 (= 960 kg) 16,5 (= 200 g) 5,5 (3,3%) De ello se concluye que en aquellas características de trascendencia en programas de mejoramiento genético por medio de IA, es necesario un alto efecto biológico del transgen para alcanzar el mismo progreso genético. Dado que, de acuerdo a la experiencia obtenida, los efectos génicos tienen con frecuencia efectos colaterales no deseados, la finalidad productiva de los animales transgénicos son las características que no pueden mejorarse con los programas de mejoramiento tradicionales o lo son en forma insuficiente (como por ejemplo como consecuencia de la baja heredabilidad). Esas características son las que afectan la resistencia a las enfermedades o a la calidad de los productos animales. La aplicación de líneas transgénicas para el mejoramiento comercial o nacional no requiere de medidas genéticas especiales. Junto con el efecto del transgen el pool genético inicial (pedigree o población núcleo) es de definitiva importancia. Con los altos costos y esfuerzo que requiere la producción de líneas transgénicas, la selección de los animales para la transferencia génica es de suma importancia. Como medida de seguridad se recomienda establecer de cada línea transgénica un banco genómico, en forma de semen y embriones congelados. Las líneas transgénicas se adecuan especialmente para Aplicaciones de la transferencia génica 273 las líneas paternas, porque la difusión del transgen es relativamente fácil a través de la IA o el servicio natural. Particular-mente cuando el alelo transgénico tiene efecto en su forma más simple (genotipo TO). El desarrollo de un pool transgénico en un rodeo núcleo de producción o programa de mejoramiento con MOET fue discutido por SMITH y col., (1987). Los conocimientos actuales no son suficientes aún como para hacer definiciones sobre los efectos de la acumulación de los alelos transgénicos en un pool genético. La producción de líneas transgénicas exige del esfuerzo técnico, en laboratorios adecuados para ese, fin y de personal altamente calificado. Firmas productoras de líneas maternas y paternas, como ya existen en las producciones avícola y porcina, como así también el trabajo conjunto entre estaciones de IA y Asociaciones de productores deberían estar en condiciones de proporcionar el adecuado marco organizativo y las inversiones necesarias. La incorporación de otros métodos biotecnológicos como la producción de quimeras de la hilera germinal con clones embrionarios a través de la transferencia nuclear de embriones totipotentes o de células primordiales embrionarias (cap. XIV) en ovocitos enucleados podría tener un efecto importante en el futuro. Esa combinación uniría las ventajas genéticas del clon embrionario (cap. 12) con las de las líneas transgénicas (cap. 13). Bibliografía BREM, G. 1989. Aspects of the application of gene transfer as a breeding technique for farm animals. Biol. Zent. Bl., 108: 1-8. BREMEL, R.D., YOM, H.CH., BLECH, G.T. 1989. Alteration of milk composition using molecular genetics. J. 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El progreso genético alcanzado a través del registro de pedigree se transfiere al resto del rodeo por medio de la venta de los reproductores. Toros Registro de pedigree Rodeo puro por cruza y general Fig. 1: Programa tradicional de mejoramiento Las condiciones para un moderno registro de pedigree junto con la definición de un objetivo productivo uniforme, son: a. Identificación de los toros, vacas y terneros (caravanas, tatuajes). b. Registro de los servicios naturales (monta), inseminaciones artificiales y los nacimientos (notificación del nacimiento). c. Registro de la ascendencia a partir de los certificados de servicio y de nacimiento (certificación a través de la determinación del grupo sanguíneo o del ADN-fingerprinting). d. Tests de producción para las características establecidas en los objetivos. e. Evaluación fenotípica de acuerdo a los estándares de la raza. f. Selección (registro en el libro de pedigree) y apareamiento de los animales, que responden a las exigencias establecidas. Selección por medio de la inseminación artificial En poblaciones con un alto porcentaje de inseminaciones artificiales y con una parte aceptable de su población bovina bajo pruebas de selección, se establecieron los programas de selección por medio de la inseminación artificial bajo la base del registro de pedigree. Los programas de selección se basan en el modelo de 4 líneas (fig. 2). Los reproductores machos y hembras con cualidades por encima de la Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 276 núcleos media son destinados a ser los padres de las vacas (PV) y madres de las vacas (MV). El cruzamiento de padres de toros con madres de toros será para cubrir la próxima generación de toros de prueba. Progreso genético Madres de toros Padres de toros Padres de vacas Madres de vacas Descendencia Fig. 2: Programa de selección empleando el modelo de 4 líneas El progreso genético en programas de selección por medio de inseminación artificial puede ser estimado según el modelo de RENDEL y ROBERTSON (1950) de la suma del éxito de selección (SE) de las cuatro líneas de selección y de la suma de los cuatro intervalos generacionales: SEPT + SEPV + SEMT + SEMV SE/t = -----------------------------------------------TPT + PV + TMT + TMV SE/t T PT PV MT MV = Exito de selección anual = Intervalo generacional = Padres de toros = Padres de vacas = Madres de toros = Madres de vacas El éxito de la selección (SE) está influenciado por la intensidad de selección (dependiente de la tasa de selección), la exactitud del valor de la heredabilidad y la desviación estándar. SE SE i rAI = i. rAI . sA = Exito de la selección por generación = Intensidad de la selección = Desviación estándar aditiva La figura 3 muestra el esquema general del programa de selección por medio de la inseminación artificial basado en el modelo de las cuatro líneas. En la producción de leche las características de selección más importantes se marcan solamente en las hembras. Por esa razón se emplea el test de las hijas para la estimación del valor genético de los toros. (Exactitud del valor génico= rAI = 0,8 hasta 0,9), a través del cual el intervalo generacional se prolonga Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Kräusslich 277 de 2-3 a 6-7 años con servicio natural. En la producción bovina para carne es posible determinar el valor genético de los toros y vacas exclusivamente a través del rendi-miento propio y del test de los hermanos, lo que permite acortar el intervalo generacional (2-3 años). La tabla 1 da un panorama del progreso genético para la producción de bovinos para leche en programas de mejoramiento por medio de inseminación artificial bajo condiciones adecuadas. Madres de toros Madres con registro genealógico Terneros Vacas en producción Toros sometidos al test de rendimiento propio Toros test IA Toros Semen Padres de toros Fig. 3: Esquema de un programa de mejoramiento por medio de inseminación artificial Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 278 núcleos Tabla 1: Progreso genético esperado por año para el ganado lechero Condiciones iniciales Rendimiento promedio Heredabilidad (h2) Coeficiente de variación 5000 kg 25 % 15 % Selección de vacas 50 2 Toros Número de padres (rendimiento de la descendencia Número de madres (rendimiento propio) Exactitud de la estimación del valor genético (rAI) Toros (%) Vacas (%) 50 3 88 66 88 66 Tasa de selección (% seleccionado) Toros Vacas Intensidad de selección (i) Toros Vacas Intervalo generacional (años) Toros Vacas Progreso genético esperado (%) 1:20 1:50 2,1 2,4 1:5 9:10 1,4 0,2 7 6 1,5 7 4 La aplicación de la transferencia de embriones en programas convencionales de mejoramiento para razas lecheras y de doble propósito se basa fundamentalmente en la línea madre de toro en test (fig. 2). CUNNINGHAM (1976) concluyó que un aumento del numero de terneros de 1 a 10 por madre de toro y por año conduciría a un aumento del progreso genético anual de 8% en las razas productoras de leche. Dado que los programas de mejoramiento convencionales por medio de inseminación artificial provocan un progreso genético de 1,5%, puede considerarse ese aumento como reducido. El estudio sobre el efecto de la transferencia de embriones en programas de mejoramiento por medio de inseminación artificial para razas bovinas de doble propósito estableció que es posible incrementar entre 5-10% el progreso genético por año tanto para la característica producción de carne como de leche KRÄUßLICH (1976). La tabla 2 muestra los valores esperados de progreso genético comparando el servicio natural con la transferencia de embriones. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Kräusslich 279 Tabla 2: Progreso genético esperado anualmente para razas bovinas de producción de carne Condiciones inciales, aumento diario de músculo Eficiencia media Heredabilidad (h2) Coeficiente de variación Servicio natural Aumento diario (g) Exactitud de la estimación del valor genético (rAI) Descendencia/vaca Intervalo generacional (años) Toros Vacas Selección Toros Vacas Intensidad de selección (i) Toros Vacas Progreso genético esperado por año (%) 1,4 Músculo (%) Aumento diario (g) 1000 g 30 % 10 % TE Músculo (%) 60 % 30 % 5% 63 1 55 63 4 55 2 3 1:10 1:1 2 3 1:20 1:3 1,8 0,0 0,5 2,6 2,1 1,1 1,0 La tabla 2 indica que con el servicio natural practicado en los bovinos para producción de carne se logra el mismo progreso genético en la característica ingesta diaria (casi la misma heredabilidad que rendimiento lechero) que en el ganado lechero bajo un programa de mejoramiento por medio de inseminación artificial. La causa principal es que el intervalo generacional de los toros es considerablemente más corto (2 años en bovinos de carne frente a 7 años en bovinos lecheros). La transferencia de embriones permite, con tasas de éxito aceptables, un aumento del progreso genético de casi un 100%, como consecuencia de la drástica reducción de la tasa de selección. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 280 núcleos Núcleos de producción con transferencia de embriones (Programa-MOET, Multiple-ovulationembryo-transfer) La producción de bovinos en núcleos exige la formación de rodeos núcleos con toros y vacas elite como así también llevar a cabo tests de rendimiento y la selección en esos rodeos. Los programas de superovulación, transferencia de embriones y división microquirúrgica para la producción de mellizos idénticos pueden ponerse en práctica de dos maneras: a. Para la formación del rodeo de excelencia (núcleo), con el objeto de concentrar los mejores genotipos hembra. b. Para aumentar la intensidad de selección (i) y la exactitud de la estimación del valor genético (rAI) del rodeo núcleo, con el fin de acelerar el progreso genético. En países con programas eficientes de mejoramiento con el empleo de IA será difícil lograr mejoras considerables, a través de programas de núcleos de producción, para las principales características: cantidad y contenido de la leche, consumo diario, peso a la faena (CUNNINGHAM 1976, KRÄUßLICH, 1976). Las ventajas de los núcleos de producción las constituyen en esas razas las características: conversión del alimento, resistencia a las enfermedades y fertilidad. Esas características pueden ser controladas con suficiente seguridad sólo en establecimientos ganaderos, cuyo manejo y productividad pueden ser programados y dirigidos directamente por el responsable de la producción (Estaciones de prueba). Ello es común en núcleos de producción de empresas productoras de aves o cerdos, no así en las Uniones de productores privados como las Asociaciones de las diferentes razas, organizaciones para la prueba de los reproductores e inseminación artificial. La TE hace posible trabajar también en la producción animal con núcleos de producción. Los programas MOET son también adecuados para regiones con una reducida concentración de tests de rendimiento como también de inseminaciones, dado que permiten llevar a cabo un programa de selección efectivo con progresos genéticos aceptables a pesar de la falta de infraestructura. A continuación se discutirán algunas formas de MOET: - Programas de TE para los rodeos - Programas MOET cerrados para razas bovinas productoras de carne - Programas MOET cerrados para razas lecheras y de doble propósito - Programas MOET abiertos Programas de TE para los rodeos En los programas para rodeos aplicando TE el principal aspecto genético para la aplicación de la transferencia de embriones se basa en la línea madre-hija. Para el sevicio o inseminación se eligen los mejores toros de la población total de esa raza. Los programas de mejoramiento de los rodeos son especialmente adecuados para productores que quieren mejorar genéticamante su rodeo a través de una rápida reproducción de las mejores vacas. BREM (1986) desarrolló un modelo para la aplicación de la transferencia de embriones y la división microquirúrgica para producir mellizos idénticos. Las vacas adecuadas para la recolección de los embriones serán donantes destinadas al rodeo seleccionado. Las vacas que, desde el punto de vista genético, no son adecuadas para la TE serán empleadas como receptoras, las que no son adecuadas para la recolección de los embriones serán inseminadas. Finalmente se emplearán las vaquillonas recriadas como receptoras. El éxito de la selección de este programa empleando siempre el mismo toro y comparándolo con el servicio natural y la inseminación artificial, depende del número de embriones transferibles obtenidos de cada donante, de la tasa de preñez y en el caso de la división microquirúrgica de la tasa de mellizos producidos (fig. 4). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Kräusslich 281 GT = progreso genético de la generación de terneros rIA = exactitud del valor de estimación de la varianza SA = desviación estándar genética aditiva TP = tasa de preñez TM = tasa de mellizos Fig. 4: Superioridad genética de la descendencia empleando transferencia y microcirugía de embriones en un rodeo lechero (BREM, 1986) En la tabla 3 se indica la mayor producción de terneros con el empleo de la transferencia de embriones y de la división microquirúrgica con diferentes tasas de éxito como también diferentes tasas de éxito del programa de TE, de la preñez obtenida y de mellizos producidos. Con el aumento de la tasa de éxito de la transferencia de embriones desciende el porcentaje de animales seleccionados, aumenta la eficacia de la selección y en consecuencia el éxito final del programa. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 282 núcleos Tabla 3: Mayor producción porcentual de terneros por medio de la aplicación de TE-MC con diferentes tasas de éxito. Número de embriones transferibles Producción preñez 0,5 0,4 12,8 15,4 15,4 18,4 16,5 19,8 de mellizos 0,6 19,2 23,0 23,0 27,7 24,7 29,6 0,5 16,0 19,2 19,2 23,0 20,6 24,7 2 0,6 0,5 4 0,6 0,5 6 0,6 La superioridad genética de la descendencia aumenta con el incremento de la eficacia de la TE-MC y alcanza, con una producción de 6 embriones, una preñez y producción de mellizos de 0,5; 68% más que en un programa sin TE-MC. La división microquirúrgica posibilita la aislamiento de los blastómeros para la determinación del sexo por medio del método de PCR. De esta forma pueden ser transferidos en primer lugar embriones hembra y así incrementar el reducido potencial de receptoras disponibles. En general coinciden todos los trabajos publicados sobre programas de mejoramiento de rodeos en que el éxito de la selección sobre la línea vaca-vaca empleando la TE puede ser incrementado considerablemente. El factor limitante lo constituyen los costos de la transferencia de embriones (FEWSON, 1989). Programas MOET cerrados para razas bovinas productoras de carne LAND y HILL (1975) fueron los primeros en presentar un modelo de núcleo en bovinos productores de carne, empleando transferencia de embriones, para la selección de caracteres en animales en crecimiento. El modelo se basa en el empleo de un número fijo de vacas en el núcleo y en el destino como receptoras de las vacas no seleccionadas. La intensidad de selección en la línea de vaca a vaca depende del número de terneros obtenidos por donante y del tamaño del núcleo (ver tabla 3). Para ambos sexos se establece el principio de selección individual y en masa (rendimiento propio) y el intervalo generacional se puede acortar hasta dos años. La comparación del progreso genético entre el programa de núcleo y el convencional de mejoramiento la constituye la característica peso vivo a los 13 meses (h2 = 0,5 desviación estándar = 40 kg). En el programa de mejoramiento de la British Meat and Livestock Commision (MLC 1971) se esperaba en 1971 un progreso genético de 9 kg de peso vivo. En un lapso de 20 años y con una consanguinidad tolerable de 10% (0,5% anual) sería necesario un rodeo de 500 hembras, destinando 1 toro cada 8 donantes. Reduciendo el rodeo a 300 vacas y empleando 4 donantes/toro se logra un 90% del valor máximo del progreso genético. La fig. 5 representa el progreso genético esperado con rodeos de diferentes tamaños y con un esquema de apareamientos según HILL y LAND (1976). Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Kräusslich 283 Fig 5: Comparación entre esquemas de selección convencionales y empleando TE. La respuesta está representada en términos relativos como la intensidad de selección anual (media de la selección diferencial entre vacas y toros/ intervalo generacional) y en la predicción del peso a los 400 días, asumiendo h2 = 0.5 y = 40 kg. La tasa de consanguinidad está expresada para el total de donantes y receptoras (HILL y LAND, 1976) Programas MOET cerrados para razas lecheras y de doble propósito El primer modelo para un programa de núcleos de producción para razas lecheras fue presentado por NICHOLAS en el año 1979. En principio es similar al modelo propuesto por LAND y HILL (1975, ver más arriba). Resumiendo se puede afirmar que el programa MOET, aplicado en razas productoras de carne para las características que pueden ser evaluadas en el animal vivo, posibilita un duplicación del progreso genético comparado con los programas de mejoramiento convencionales. Para mantener la consanguinidad dentro de un límite tolerable, el rodeo debe contar con 500 hembras. El intervalo generacional puede reducirse 2 años. La aplicación del programa de núcleos de producción es especialmente de interés en regiones donde los tests de producción para los programas de mejoramiento, sobre la base de pruebas a campo, no se han establecido aún o sólo pueden llevarse a Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 284 núcleos cabo con dificultades. Los programas MOET son interesantes también para empresas privadas de producción, las cuales pretenden seleccionar un gen determinado (por ej.: "Coulard- Doppellendegen", ausencia de cuernos, animales transgénicos) y desean aplicar método biotécnicos (determinación del sexo, clonado, análisis de genoma, transferencia de genes). Los productores de animales de cabaña deben aplicar la TE y la microcirugía de embriones para aumentar la intensidad de selección de las madres de toros y vacas para continuar luego con los métodos tradicionales de mejoramiento (programa de selección del rodeo). Ello tiene la ventaja de evitar desde el principio los problemas de consanguinidad. Los modelos MOET, en discusión actualmente, se basan en los modelos publica-dos por NICHOLAS y SMITH (1983). En modelos juveniles la selección se lleva a cabo en ambos sexos a una edad de 12 meses a partir de la información de la familia materna, como el rendimiento lechero de la madre, de las medio-hermanas, hermanas enteras y de la abuela. En los modelos adultos se seleccionan los machos y hembras en base al rendimiento de las hermanas enteras, medio-hermanas y de la madre. En las reproductoras se dispone del rendimiento de su primera lactación. El intervalo generacional para el modelo juvenil comprende cerca de 2 años, para el adulto 3,5-4 años mientras que en el programa de selección convencional son necesarios 6,5 a 7 años. El cuadro 1 contiene información sobre el progreso genético de los programas juveniles y adultos en el momento de la selección. Las ventajas del acortamiento del intervalo generacional tienen, sin embargo, como consecuencia una menor exactitud de la estimación del valor genético. Cuadro 1: Comparación entre los esquemas MOET juveniles y adultos según NICHOLAS y SMITH (1983) Mes 1 13 14-15 23-24 Esquema juvenil NACIMIENTO Selección de la generación inicial según el pedigree TE de la generación inicial Nacimiento de la 1o generación de la descendencia de TE Servicio Destete Esquema adulto NACIMIENTO 34-35 36-37 Primera lactación concluida Selección de la 1o generación según el pedigree Primera lactación concluida Selección de la generación inicial según el rendimiento propio y el de las hermanas TE con la generación inicial TE con la 1o generación 44-46 Nacimiento de la 2o generación. Descendencia de TE Nacimiento de la 1o generación. Descendencia de TE Formación del núcleo Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Kräusslich 285 La formación del núcleo se puede llevar a cabo mediante la selección de las mejores vacas de la población o la compra de vacas de alto rendimiento productivo (cuadro 2). Para la inseminación de esas hembras se eligen en general toros de calidad internacionalmente reconocida. Según BREM (1986) la elección de las hijas de las mejores madres como base del núcleo brinda la siguiente superioridad en la población en la misma generación, expresada en desviaciones estándar genéticas, frente a la selección de vacas de cabaña (hembras de pedigree): Vacas en la poblaciónVacas fundadoras del núcleo 0,53 1,83 Diferencia 1,50 De ello se concluye que la cuidadosa selección de las vacas fundadoras del núcleo tiene un significado definitivo en el éxito de programa de núcleos de producción. Cuadro 2: Formación de núcleos de producción - Formación del núcleo Selección de las mejores hembras Selección de los reproductores machos de la población extraña - Núcleo Superovulación y TE Pruebas de rendimiento Selección de reproductores hembras y machos - Transferencia a la población Distribución de los reproductores machos para el servicio natural o IA Esquema de un programa de núcleos cerrados de producción Los modelos para núcleos cerrados publicados hasta el momento parten de 200 a 400 vacas en el núcleo, 16 a 64 donantes elegidas por año y 4 a 8 toros. La figura 6 presenta el esquema de un programa de núcleo cerrado con 250 vacas en el núcleo, 32 donantes seleccionadas y 8 toros. Este programa requiere la transferencia de 500 embriones por año. Valores esperados del progreso genético con programas MOET cerrados El aumento esperado del progreso genético, resultante del acortamiento del intervalo generacional, se reduce como consecuencia de la disminución de la exactitud de la estimación del valor genético, la prueba de la descendencia logra la mayor exactitud, el test de las hermanas y del rendimiento propio permiten lograr sólo exactitudes medias (cuadro 3). RUANE y SMITH (1988) estimaron que el progreso genético en un núcleo con un esquema juvenil es, en 20 años, 55% superior al mejoramiento alcanzado por medio de la prueba de la descendencia. Con un esquema adulto la superioridad es del 20%. Esas estimaciones con modelos deterministas no pudieron ser comprobadas en estudios de simulación. Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 286 núcleos RUANE y THOMPSON (1991) encontraron a partir de estudios de simulación sobre 6 generaciones que los resultados alcanzan sólo el 60% (4 padres en el núcleo) hasta 70% de los valores estimados para el progreso genético con modelos deterministas. La razón más importante es la reducción de la varianza entre familias como consecuencia de la selección (efecto Bulmer). Las tasas de consanguinidad en los estudios de simulación después de 6 generaciones variaron entre 4,2-4,8% con 8 padres y 7,7-7,9% con 4 toros. Ello implica 1,7 a 2,7 veces mayor tasa de consanguinidad que con modelos deterministas. La consanguinidad puede disminuirse considerablemente empleando más de 1 toro por familia seleccionada (24-34%). Reposición 250 vacas del núcleo bajo control de producción de leche e ingesta Las vacas excedentes se destinan a los establecimientos con control de producción 30 terneras son recriadas. 1er. Parto a los 2 años Eliminación anual Selección anual de las 32 mejores hembras y de los 38 mejores machos para la producción de embriones 130 toros de ellos se seleccionan a partir del test de las hermanas (1. lactación) y rendimiento propio 500 embriones Nacimiento de 130 terneras Los embriones con transferidos Nacimiento de 130 terneros Fig. 6: Ciclo anual de un rodeo-núcleo con un programa de superovulación y transferencia de embriones Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Kräusslich 287 Cuadro 3: Comparación de la prueba de la descendencia frente al test de las hermanas para la producción de leche Años 1 1/2 3 1/2-4 Prueba de la descendencia Vaca preñada con el semen del toro en prueba Prueba de las hermanas Medio-hermanas y hermanas enteras preñadas o Lactación de 4 hermanas 1 enteras y 16 medio-hermanas. Estimación del valor genético y selección 6 1/2-7 1o de 50 hijas. Estimación del valor genético y selección Mayor exactitud de la estimación del valor genético Intervalo generacional más corto WRAY (1989) desarrolló una algoritmia determinista para programas de núcleos de producción para la especie porcina, que considera los efectos de la selección y la consanguinidad sobre la varianza genética y la exactitud de la estimación del valor genético. Los primeros análisis indican una mayor coincidencia de los valores estimados de ese modelo con los de los estudios de simulación. Falta todavía una comprobación empírica del alto progreso genético en programas cerrados de núcleos de producción. Hasta el momento no se publicaron los análisis de los datos de esos núcleos. Las ventajas y desventajas de los núcleos de producción se presentan en los cuadros 4 y 5. Las figuras 7 y 8 ejemplifican un núcleo de producción básico y otro para la producción de 60 toros test respectivamente para ganado Holstein en Sudáfrica (DICKS, 1991a y b). Cuadro 4: Ventajas de los núcleos de producción - Aumento del nivel genético en la formación del núcleo - Progreso genético más rápido - Mejores controles de los tests y del manejo (se evitan las manipulaciones) - Una selección más orientada al valor económico - Selección de características, difíciles de evaluar a campo (por ej.: conversión del alimento) - Concentración de los recursos genéticos - Posibilita el empleo de técnicas costosas y complicadas - Los resultados económicos son alcanzados más temprano - Menores costos a nivel nacional - Formación de unidades-núcleos separadas para diferentes objetivos productivos y diferentes ambientes Cuadro 5: Desventajas de los núcleos de producción - Riesgo de enfermedades (concentración) - Riesgo como consecuencia de la concentración de la población en un sólo establecimiento ganadero - Posibilidad de una interacción genotipo-ambiental - Necesidad de capital para la formación del establecimiento del núcleo - Una comercialización más intensiva del los reproductores con las desventajas que ello implica Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 288 núcleos Donante de embriones Venta 50% Lavaje 30% Donante de semen Receptoras Vaquillas Venta o alquiler Toritos Venta de hermanos enteros ± 20% Venta del ± 10% Distribución 50% en el/los Centro/s Registro de producción Distribución 50% en el rodeo Registro de producción Toros de prueba Progenie en test Venta del 80% Destino del 20% a la industria Venta 90% Lavaje Selección: 10% de las mejores Vacas en producción Selección: 10% de las mejores Lavaje Identificación del mejor 5% (±) Fig 7: Un programa básico de núcleo de producción propuesto para la empresa Taurus stock improvment cooperative limited para ganado Holstein Friesian en Sudáfrica (DICKS, 1991a) Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Kräusslich 289 260 embriones 60% de preñez 160 preñeces (requiere 200 receptoras aprox.) 75 ♀ 75 ♂ 55 ♀ venta 20 ♀ 15 ♂ venta 60 ♂ a 80 embriones Recolección de embriones 180 embriones Fig. 8: Un programa-núcleo para la producción de 60 toros Holstein para pruebas de rendimiento (DICKS, 1991b) Programas abiertos de núcleos de producción CHRISTENSEN (1984) y COLLEAU (1985) desarrollaron programas híbridos a partir de programas MOET cerrados y programas de mejoramiento convencionales, aplicando inseminación artificial. Esos programas se designan en general como programas abiertos de núcleos de producción. La selección se realiza sobre la línea masculina (padres de vacas y toros, ver figura 2) como en los programas convencionales de selección con IA. Los toros test, seleccionados en el núcleo, son sometidos a una prueba de la descendencia a campo. Los mejores toros elegidos de la descendencia (padres de toros) son incorporados al núcleo. El manejo de las madres de toros en el rodeo núcleo bajo un ambiente controlado sirve para impedir su trato preferencial ("preferential treatment") por parte de los cabañeros. Al mismo tiempo el ambiente controlado provoca una mayor heredabilidad como consecuencia de la baja varianza fenotípica. VA h2 =-------; (VA = varianza genética aditiva; VP = varianza fenotípica) VP Ambas conducen a una mayor exactitud de la estimación del valor genético y con ello a una mayor seguridad en la selección de las madres de los toros. COLLEAU (1985) desarrolló un programa abierto con 3 variantes, de las cuales 2 (A y B) se describen en el cuadro 6. En la variante A la descendencia cuenta con una edad de 9 meses en el momento de la selección de las vacas donantes, de forma tal que el intervalo generacional comprende 2 años. Ese acortamiento del intervalo generacional exige sin embargo la transferencia de los embriones en un Población Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 290 núcleos momento en el cual aún no es seguro si la vaca será elegida como donante. Ello transferencias de los embriones y con ello los costos comparándolo con la variante B, intervalo generacional se duplica frente a la variante A. Comparando con el programa mediante IA la variante A es superior en aproximadamente 10% y en todos los casos variante B. Cuadro 6: Modelos para núcleos de producción abiertos según COLLEAU (1985) Edad de la donante en meses 16 18 20 25 29 36 a partir de una lactación parcial 38 partir de la primera lactación TE Esquema A ET ET Destete Selección Selección a Esquema B Concepción Destete aumenta las en la cual el convencional mejor que la COLLEAU (1986) amplió la variante A mediante la importación de semen congelado de toros probados de otras poblaciones o de embriones congelados. La tabla 4 contiene los resultados más importantes. Tabla 4: Progreso genético (%/ año) en el rodeo-núcleo con el empleo de semen de toros probados de una población extraña frente al método convencional con uso de IA. Progreso genético/año (%) Años A 0 500 100 1 500 165 130 121 140 120 127 81 29 6 137 151 115 121 120 121 125 133 119 120 121 125 62 75 18 25 3 6 B 100 127 109 119 120 119 120 36 11 2 0-10 10-20 20-30 Inseminaciones de la población extraña 0-10 10-20 20-30 A = Superioridad inicial de los toros extraños (0 ó 1 ∆G) B = Número de toros en test/año en la población extraña En la tabla 4 se parte de la premisa que sólo toros elite son seleccionados para el núcleo (los mejores 3 toros por año). Los resultados muestran que en la superioridad de la población extraña el nivel genético de esa población con esos toros puede alcanzarse en 10 años. En una selección consecuente los toros Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Kräusslich 291 criados en el núcleo son mejores que los extraños, lo que se destaca en los bajos valores del semen extraño. La transferencia a la población hembra local es, sin embargo, lenta. Después de 30 años la situación genética de la población, con la aplicación de un programa abierto de núcleo de producción, es superior en un 25% comparado con la importación de semen de una población extraña, en marco de un programa convencional de mejoramiento con IA. CHRISTENSEN (1989) sugiere otra variante en la combinación entre las pruebas de la descendencia y los programas de mejoramiento con IA para el plan de selección de toros elite. En ese plan las hijas, producto del apareamiento de los toros elite (padres de toros) con madres de toros, son superovuladas lo más temprano posible (14-18 meses). Los embriones recolectados son transferidos frescos, de manera tal que dos años después la primera generación de hembras alcance la pubertad, pueda ser apareada con los toros elite de la siguiente generación y esté disponible para el programa MOET. El cuadro 7 indica que en la 4o generación 86,5% de los genes de las hembras del núcleo se originan de toros elite. La probabilidad de que ello ocurra sin transferencia de embriones comprende 2,6%. Ese plan tiene la ventaja, que los animales del núcleo no deben ser mantenidos en un rodeo cerrado o en una Estación para madres de toros. El único criterio de selección es el componente genético de los toros elite, sobre el cual los tratamientos especiales no tienen efecto y la cría de las madres de toros puede llevarse a cabo en cabañas normales. Sin embargo de esta forma no es posible considerar algunas características porque no pueden ser controladas a campo, como por ej. conversión del alimento. Cuadro 7: Componente genético de toros elite según CHRISTENSEN (1989) Generación Componente genético de toros elite años I a V (%) I = 50 I = 25 III = 50 I = 12,5 II = 25 III = 50 I = 6 II = 12,5 III = 25 IV = 50 I = 3 II = 6 III = 12,5 IV = 25 V = 50 Probabilidad sin MOET (%) 100 40 16 0 1 2 3 6,4 4 2,6 El programa de evaluación de las donantes de la Cooperativa de Producción de Osnabrück (República Federal de Alemania) sigue un camino totalmente diferente, combinando partes del modelo MOET con los programas convencionales de mejoramiento con IA. El objetivo principal de esa iniciativa es la evaluación neutral estandarizada del rendimiento de las potenciales madres de toros (Estación de prueba de toros), para eliminar el efecto del tratamiento especial de las madres de los toros por parte de Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com 292 núcleos los cabañeros y considerar además otras características. El intervalo generacional puede mantenerse, a través de un programa de dos niveles, relativamente corto. En la primera lactación se lleva a cabo una preselección a partir del rendimiento en la cantidad de leche, grasa (%) y proteína (%, rendimiento en 100 días). En ese nivel se selecciona 1% de las vaquillonas en prueba y se lleva a cabo la TE. La selección inmediata y definitiva de las madres de los toros se lleva a cabo en la 2o lactación. En el segundo nivel de la selección se elegirán 20 madres de toros de 70 vacas en test. La figura 9 muestra el programa de la Cooperativa de producción de Osnabrück. Según KANDZI y GLODEK (1987) se puede aumentar con ese programa el progreso genético tres veces sobre la línea madre-hijo y 20% en total, eliminado los tratamientos especiales. Los ejemplos acentúan en suma, que los programas abiertos de núcleos de producción no muestran un sistema uniforme sino la integración de la TE bajo las condiciones dadas en los programas establecidos de mejoramiento genético mediante IA, con el objeto de optimizar el progreso genético. Tiempo Progreso selectivo en las madres 10 000 vaquillonas OHG 1º - Prueba de ascendencia - Prueba propia - Clasificación del tipo - Facilidad de ordeñe 31 meses: Producción de embriones 40 meses: Nacimiento de la descendencia TE 100 vaquillonas donantes 300 donantes Empleo de la descendencia Reposición 28 meses: Parición de vaquillonas Transferencia de embriones para producir: 42 meses: 2º parición 70 mejores vaquillonas donantes 2º selección Prueba de Estación de TE: - 2º lactación - Fertilidad - Estabilidad metabólica - Sanidad de la ubre Venta 50 meses: Selección de las madres de toros 20 madres para toros de prueba de OHG 20 toros de prueba Fig. 9: Programa de evaluación de las vacas donantes de la Cooperativa de Productores de Osnabrück (República Federal de Alemania) Biotecnología de la Reproducción www.reprobiotec.com Kräusslich 293 Bibliografía BREM, G. 1986-1990. Mikromanipulation an Rinderembryonen und deren Anwendungs-möglichkeiten in der Tierzucht. Ferdinand Enke Verlag Stuttgart; Editorial Hemisferio Sur, Buenos Aires. CHRISTENSEN, L.G. 1984. Breeding problems in small cattle populations. 35th Annual Meeting of EAAP, The Hague (C) Session II, 18 pp. CHRISTENSEN, L.G. 1989. Rinderzucht nach 1992. Züchtungskunde 61,428-439 COLLEAU, J.J. 1985. Efficacité génétique du transfert d'embryons dans les noyaux de sélection ches les bovins laitiers. Génétique, Sélection, Evolution 174, 499-538. COLLEAU, J.J. 1986. Genetic improvement by ET within an open selection nucleus in dairy cattle. Proceedings of the 3rd World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, Lincoln, Nebrasca USA, 127-132 CUNNINGHAM, E.P. 1976. The use of egg transfer techniques in genetic improvement. Publication Commission of the European Communities, EUR 5491; 345-35 DICKS, E. L. 1991a. Taurus nucleous herd breeding. The concept. Taurus Koöp/ Coop news-nuus. 13 (vol 2): 5-6. DICKS, E. L. 1991b. Nucleeus herd breeding. II. The requeriments. 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