MetodologíaCélulas libres Análisis de muestras tomadas a lo largo de la edad de cultivo. Recordando que se tomaron tres muestras por tiempo. . Células inmovilizadas . 1 mL de Dricromato de potasio Resultados correspondientes a la producción de enzima alfa amilasa con enzimas libres de Bacillus subtilis Los resultados correspondientes a las muestras tomadas a lo largo del tiempo. Observando que la longitud de onda a la cual se determinó el crecimiento celular correspondió a 600 nm mientras que para la actividad enzimáticas correspondió a 540 nm. Actividad enzimática Se le dio tratamiento a los valores de absorbancia obtenidos de la actividad enzimática a los diferentes tiempos. La discusión de los datos y/o valores obtenidos se presentan en la sección de análisis de resultados. . observándose éstos en la Tabla 2 al igual que las gráficas obtenidas para finalmente calcular la actividad enzimática que hubo presente (Gráficos 1 a 3). se muestran en la Tabla 1. 008 0.5196 180.2237 0. -0.088 Bacilos 2. .014 -0.15 0.0552 0. Para los cálculos involucrados en la presente tabla revisar la hoja de cálculo.3183 0.118 -0.15 -0.0001 179.25) 0.017 0.524 0.15 5 -0.255 Cocos/Bacilos 4. Resultados de la cinética de Bacillus subtilis para la producción de alfa amilasa Edad Cultivo Densidad Testigo Actividad enzimática Cantidad de Pureza Óptica (λ=540 nm) (λ=540 nm) proteína en (λ=600 nm) el medio (λ=595 nm) T0 T1 T2 0 0.049 -0.0783 0.6 5 -0.25 .0006 623.2132 0.0001 161.0006 654.7149 10 4.0516E-05 50. Tabla 1.9715E-05 19.0889 0. Actividad enzimática de alfa amilasa producida por Bacillus subtilis a lo largo del tiempo (edad de cultivo) ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EDAD DE Tiempo (min) Absorbancia Concentración Concentración Concentración de Actividad enzimática (mol Glc+Fruct CULTIVO (λ=540 nm) de Glc+Fruct de Glc+Fruct Glc+Fruct (µmol/mL) /mL_solución enzimática (H) (mg/mL) (mol/mL) introducido*min) 0 0.15 -0.0172 5.326 5 -0. Curva tipo para la determinación de Maltosa mediante el reactivo DNS (Ver Anexos).056 0.1078 0.25 0.2090 0.006 0.0067 1.04 0. .040 .288 5 0. -0.049 0.063 0.008 0.25 0.7333 2.063 0.056 0.014 0.25 0.25 0.001 -0.006 -0.0122 -3.8991 38.76176 Para el cálculo de la concentración de maltosa se hizo uso del Gráfico 4.004 Cocos/Bacilos 6.035 0.440 -0.4163 T (4.001 0.0615 0.0002 259.1581 6.4859 10 0.0002 229.4023 89.5733E-05 -35.1865 10 -0.25 0.054 Cocos/Bacilos Tabla 2.9911 10 -0.0006 610.058 0.035 -0.058 0.017 0. 660 y = 4. 3 Actividad enzimática de alfa amilasa producida por Bacillus subtilis para la edad de cultivo correspondiente a las 6. 2 Actividad enzimática de alfa amilasa producida por Bacillus subtilis para la edad de cultivo correspondiente a las 0 horas edad de cultivo correspondiente a las 4.95 R² = 0.0163x + 137.51 300 y = -9.25 horas .12 R² = 0.9366x + 199.0853 Concentración de Glc (µmol/L) 650 Concentración de Glc (µmol/L) 200 640 150 630 100 50 620 0 610 0 2 4 6 8 10 -50 600 0 2 4 6 8 10 -100 Tiempo (min) Tiempo (min) Gráfico.374x + 607.9468 250 R² = 0.25 horas 250 y = -1. 1 Actividad enzimática de alfa amilasa producida por Bacillus subtilis para la Gráfico.0741 Concentración de Glc (µmol/L) 200 150 100 50 0 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (min) Gráfico. se hizo uso del método de Bradford.8524 Enzima producida por Bacillus subtilis a lo largo del tiempo (Edad de cultivo) en un medio sumergido.054 -12.25 -0.25 0. cabe destacar que una vez tratados los datos (valores de absorbancias) se obtuvieron concentraciones de proteína negativas.25 0.088 -7.5081 2. La justificación de los valores obtenidos se discuten en la sección de análisis.255 -63.27868 4. sin embargo no significa que no haya habido presencia de las mismas. Para el cálculo de la concentración de proteínas se hizo uso del Gráfico 4. Para los cálculos involucrados en la presente tabla revisar la hoja de cálculo . Curva tipo para la determinación de concentración de proteínas mediante el método Bradford (Ver Anexos).004 -21. Resultados de la determinación de concentración de proteínas mediante el método Bradford Tiempo de Absorbancia Proteína (µg/mL) vida (h) (λ=595 nm) 0 0.Determinación de proteína Para la determinación de proteína que se realizó para las muestras a diferentes tiempos. Tabla 3.0491 6. utilizando placas Petri con Agar Nutritivo. Cultivo en placa de Bacillus por la técnica de siembra estría simple en subtilis por la técnica de siembra masiva en agar Nutritivo para la edad de cultivo agar Nutritivo para la edad de cultivo correspondiente a las 2. Las muestras obtenidas se observan en las figuras 1 a 4 correspondientemente a los tiempos 0 (inóculo). Crecimiento celular Para la determinación de crecimiento bacteriano en el biorreactor se hizo uso de la técnica sembrado en placa.25. y en su mayoría aplicando estría simple. 4.25 horas. 2. Cultivo en placa de Bacillus subtilis simple en agar Nutritivo para la edad de por la técnica de siembra estría simple en cultivo correspondiente a las 4.25 horas correspondiente a las 0 horas Figura 3. Figura 2.25 horas agar Nutritivo para la edad de cultivo correspondiente a las 6.25 horas . Cultivo en placa de Bacillus subtilis por la técnica de siembra estría Figura 4.25 y 6. Cultivo en placa de Bacillus subtilis Figura 1. ya que dicho medio (LB) posee entre sus componentes extracto de levadura.Actividad enzimática de alfa amilasa producida por Bacillus subtilis a lo largo del tiempo (edad de cultivo)). En cuanto al crecimiento de la bacteria se cultivó ésta en medio LB (Luria-Bertani) el cual proporcionó los nutrientes necesarios para su desarrollo óptimo pero no para la producción de la enzima en estudio. También puede mencionarse que la curva tipo que permitió el cálculo de actividad enzimática no cubre valores de absorbancia menores a 0. cantidad de proteína principalmente). Sin embargo. Para el caso del tiempo 0 (Ver Tabla 2. Alfa amilasa resulta ser una enzima extracelular (exoenzima). Lo que se esperaba era notar un incremento de la enzima mencionada. De haberse determinado la forma en que se tomarían las muestras desde un inicio al igual que los materiales a utilizar se hubieran esterilizado correctamente como fue se hizo en el caso del biorreactor. el cual podría contener dentro de su conformación amilasas. a partir de los parámetros establecidos (actividad enzimática. se pudo haber evitado la contaminación del cultivo. En la experimentación el inductor correspondió al almidón. La implementación de un sistema que permitiera tomar muestras del biorreactor planteado consistió en la adición de un sistema de venoclisis en conjunto de mangueras que fueron esterilizadas únicamente con etanol durante 5 minutos antes de su implantación. resultó ser ineficiente al momento de tomar las muestras posteriores. para lo cual sería incorrecto su aplicación para las absorbancias obtenidas. Y efectivamente hubo crecimiento de Bacillus subtilis. También la agitación en el medio sumergido no se vio presente. recordando que Bacillus subtilis es una bacteria aeróbica.90 ºC. siendo dicha condición operativa importante debido a que ésta es necesaria para distribución de oxígeno en el mismo. ya que el biorreactor se mantuvo a temperatura ambiente (aproximadamente 21°C) cuando la temperatura óptima para Bacillus subtilis se encuentra en un rango de 25. La principal función de las exoenzimas reside en romper moléculas complejas que existen en el medio ambiente. como pudo haber ocurrido en caso de haberse aplicado la inmovilización de ésta en esferas de alginato de calcio. sino del medio en el que se encontraba. es posible notar que las absorbancias arrojadas no resultaron representativas para la determinación de actividad enzimática. radicó primordialmente en la facilidad de que ésta recibiera al polisacárido sin ninguna dificultad. ya que la secreción de ésta se da debido a la imposibilidad de que actúe el sustrato dentro de la célula del microorganismo que la produzca. cuando se realizó la inoculación de la cepa al biorreactor y la no inducción de almidón y a pesar de ello. su concentración aumenta en respuesta a señales ambientales o en presencia de una molécula. recordando que los poros pueden llegar a ser tan pequeños que impidieran la entrada del almidón a la enzima. Para el caso de Bacillus subtilis. resultó inevitable la contaminación del mismo. sin embargo debido a cuestiones de contaminación debido a la incorrecta manipulación de la toma de muestra del biorreactor y condiciones operativas no es posible asegurar al cien por ciento que se produjera dicha enzima proveniente de la cepa mencionada. el cual se agregó en el tiempo 2. Pero no todo puede verse atribuido a las condiciones operativas. recurriendo así a cambiarlo por la adición de mangueras y jeringas (que se esterilizaron de la misma manera que el primer sistema). se esperaban valores muy bajos. dan un indicio claro acerca del experimento fallido. Cabe destacar que dentro de los cuidados que se tuvieron a lo largo de la cinética para la producción de alfa amilasa.Análisis de resultados Los resultados arrojados con anterioridad con respecto a la producción de enzima alfa amilasa libre a partir de Bacillus subtilis. es decir. ya que algunas son características de ciertas especies. La elección de producir alfa amilasa en células libres. ya que fue en ese tiempo. puede especularse que la presencia de alfa amilasa en dicho tiempo no venga directamente de la bacteria. ya que la contaminación del mismo fue evidente en los análisis de pureza de la muestra. hubo valores a una longitud de onda de 540 nm. también se vieron involucrados errores personales o de manipulación. resultó dicha bacteria poseer la enzima mencionada. teniendo en un inicio Bacillus subtilis y a lo largo del tiempo aparecieron Cocos (de sepas no identificadas) . inductor.25 horas. Dicho sistema. No todos los microorganimos poseen las mimas exoenzimas. no se contemplaron algunos de ellos como fue el caso de la temperatura.221 a una longitud de onda de 540 nm. Alfa amilasa además es una enzima inducible. muestra de ello se refleja en las figuras 1 a 4 donde se sembró la cepa en placas de agar LB a los diferentes tiempos que duró la cinética experimental. pero a pesar de la cepa elegida como productora de alfa amilasa así como las condiciones a las cuales fue adaptado el biorreactor. D. (Mayo 1994). de Universidad Autónoma de Nuevo León Sitio web: http://eprints.. Purificación y caracterización de una œ-amilasa producida por la cepa nativa bacillus sp. Producción de alfa amilasa por una cepa de nativa de Bacillus y su aplicación al tratamiento del almidón residual en granos de malta agotados. núm. 162 (2010). 162 (2010). I.Referencias Ochoa. & Poutou.. Dyna. Vol. 31-38 DYNA. Producción de a-Amilasa con celulas libres e inmovilizadas de Thermus sp. Vargas. Revista MVZ Córdoba. V. A. P. M. R. bbm1. (2003). 77. A..PDF Sarmiento. M. .mx/7120/1/1080074567. 25/11/17. Pedroza. A. MONTOYA CAMPUZANO. Vol. 77. 31-38 2346-2183 0012-7353. C.uanl. Quintero Moreno. Matiz. núm. A.. M. H.. 8(2)... O. & GUTIÉRREZ SÁNCHEZ. Datos obtenidos de Tabla 2). Edad de cultivo 4.0432 mg 1 𝑥= | | 0.862) Despeje 𝑦 − 0.4746 mL 320 g mol 𝑚𝑜𝑙 1µmol µ𝑚𝑜𝑙 𝑥 = 0. Curva tipo para la determinación de Maltosa mediante el reactivo DNS(Ver Anexos)y se obtiene la ecuación de la recta. Concentración de Glc+Fruct (g/L) Se toma como referencia el Gráfico 4.7616 𝑚𝐿 𝑚𝐿 µ𝑚𝑜𝑙 Concentración final de maltosa = 610.0432 𝑥= 0.25 horas.0432 Donde y representa la absorbancia y x la concentración de maltosa en g/mL.000611 | | = 611.4023 𝑚𝐿 .1640 − 0. Se despeja entonces x para conocer la concentración de maltosa a una cierta absorbancia (0.4746𝑥 + 0.056 a una longitud de onda de 540 nm (Tiempo 0.4746 Sustituyendo valores y obteniendo la concentración de maltosa en unidades (µmol/mL) por medio del peso molecular de la misma: 0.000001 mol 𝑚𝐿 Concentración final de maltosa (µmol/mL) Concentración final de maltosa = Concentración final de Glc + Fruct − Concentración del testigo µ𝑚𝑜𝑙 µ𝑚𝑜𝑙 Concentración final de maltosa = 611. siendo esta: 𝑦 = 0.15. HOJA DE CÁLCULO Concentración de Glc+Fruct como producto de la actividad enzimática de α-amilasa Para un valor de absorbancia de 0.056 − 0.1640 𝑚𝐿 0. Resultados de la determinación de concentración de proteínas mediante el método Bradford) Concentración de proteína (mg/mL) Se toma como referencia Gráfico 5.28 𝑚𝐿𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑖𝑛𝑡𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜 ∗ 𝑚𝑖𝑛 Concentración de proteínas mediante el método Bradford sobre la actividad enzimática de α-amilasa producida por Bacillus subtilis Para un valor de absorbancia de 0.27868 0. Se despeja entonces x para conocer la concentración de maltosa a una cierta absorbancia (0. 2 Actividad enzimática de alfa amilasa producida por Bacillus subtilis para la edad de cultivo correspondiente a las 4.1324 𝑥= 0.0061𝑥 + 0.088 − 0.862) Despeje 𝑦 − 0.088 a una longitud de onda de 595 nm (Tabla 3.1324 Donde y representa la absorbancia y x la concentración de maltosa en g/mL.374 𝑚𝐿𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 ∗ 𝑚𝑖𝑛 Factor de dilución 𝑉𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 𝑉𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑖𝑛𝑡𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜 1 𝑚𝐿 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 0. Curva tipo para la determinación de concentración de proteínas mediante el método Bradford (Ver Anexos)y se obtiene la ecuación de la recta. siendo esta: 𝑦 = 0.1324 µ𝑔 𝑥= = −7.0061 𝑚𝐿 ANEXOS .Actividad enzimática de α-amilasa (2 mg/mL) Pendiente obtenida en el Gráfico.25 horas µmo𝑙 𝑚𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 𝑚 = 4.05 𝑚𝐿 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 20 Actividad enzimática de α-amilasa (2 mg/mL) 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 = 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 ∗ 𝑚 µmol 𝐺𝑙𝑐 + 𝐹𝑟𝑢𝑐𝑡 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 = 89.0061 Sustituyendo valores y obteniendo la concentración de proteína: 0. 0 2.200 1.5 3.0243 R² = 0.000 0.3867x .000 0.400 0.200 Concentración Maltosa (mg/mL) Gráfico 4.0 1.600 λ=540 nm 0.0.9928 1.200 0. Curva tipo para la determinación de Maltosa mediante el reactivo DNS y = 0.800 Absorbancia 0. Curva tipo para la determinación de Maltosa mediante el reactivo DNS .5 1.0 -0.0 0.5 2.