Bioquímica informe N°8 y 9 - Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica ResumenSe realizó el análisis de la dependencia de la velocidad de reacción en función de la cantidad enzimática (composición), de la temperatura y del pH. Así mismo se analizó la especificidad de la acción enzimática, empleando la presencia de ureasa en la harina de soya y contrastar su acción en la tiourea y la acetamida. Los resultados obtenidos demostraron que la velocidad enzimática se ve influenciada por la cantidad de enzima presente en solución. La gráfica que se produce como consecuencia de la aparición de eritrodextrinas del almidón genera una recta de pendiente positiva, lo cual permite pensar que a medida que la concentración de la enzima es mayor el tiempo que se necesita para transformar el sustrato en producto es mucho menor (al graficar 1/t vs concentración). Estos últimos resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores biológicos de una reacción. Así mismo se demostró que la temperatura tiene un efecto importante en la velocidad enzimática. Si la temperatura aumenta considerablemente la reacción puede no producirse debido a la desnaturalización de la enzima. Si la temperatura es alta y propicia se obtienen los productos de la acción enzimática sobre el sustrato. Siendo 38°C la temperatura optima para la acción enzimática de la ptialina. De igual forma se pudo observar que la reacción enzimática también se ve influenciada por el cambio del pH del medio hasta alcanzar un pH óptimo, el cual para la ptialina está alrededor de 6.7-6.8 cerca del pH neutro. Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima ptialina así como muchas enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actúan en pH neutro. Este resultado puede ser ubicado en la punta de la campana. Finalmente se pudo comprobar la especificidad enzimática de la ureasa sobre la urea, en la descomposición de la urea en amoniaco y dióxido de carbono. 1 Practica N° 8 Cinética enzimática Laboratorio de Bioquímica Introducción Los enzimas son macromoléculas, específicamente proteínas, que tienen la propiedad de catalizar las reacciones bioquímicas. Pero las condiciones en las cuales se realice dicha catálisis afectarán la eficiencia de la reacción por lo tanto estas se deben de controlar en todo momento. Por ejemplo son muy importantes los factores como la concentración del enzima, la temperatura y el pH. Por ejemplo si la temperatura es muy elevada, el enzima se desnaturaliza y queda inactiva; si la temperatura es muy baja, el enzima no se desnaturaliza, pero igual queda inactiva. Mientras que valores de pH extremos pueden desnaturalizar a los enzimas. Los enzimas, también se caracterizan por tener un alto grados de especificidad, es decir sólo actúan para un solo tipo de sustrato. Esto puede deberse a la relación estereoquímica entre el sustrato y el enzima, así como también al tipo de grupos funcionales que del sustrato. Por ejemplo la ureasa contenida en la harina de soya sólo actúa sobre la urea descomponiéndola en amoniaco y dióxido de carbono. Pero este enzima no actúa sobre la tiourea o acetamida a pesar de tener una estructura muy parecida. H2N O H2N + H2O ureasa NH3 + CO 2 2 Practica N° 8 Cinética enzimática cómo es controlada su actividad en la célula y cómo puede ser inhibida su actividad por fármacos o venenos o potenciada por otro tipo de moléculas. denominadas sustratos. 3 Practica N° 8 Cinética enzimática . lo que incrementará la eficiencia de la reacción. Al igual que ocurre en otros tipos de catálisis. En ese momento se habrá alcanzado el punto de saturación de la enzima y. también suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reacción. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos. mayor número de centros catalíticos estarán ocupados. como en el caso de la ADN polimerasa. En otros casos. Fundamentos La reacción catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma cantidad de producto que una reacción no catalizada. su papel en el metabolismo. Un sustrato es capaz de unirse al centro catalítico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimático. hasta el momento en que todos los sitios posibles estén ocupados. Esto significa que a mayor cantidad de sustrato. Las enzimas son proteínas (macromoléculas) con la capacidad de manipular otras moléculas. se produce la unión simultánea de dos sustratos. no aumentará más la eficiencia. las enzimas se saturan. al contrario que las reacciones químicas. como es el caso de las proteasas al romper una proteína en dos polipéptidos.Laboratorio de Bioquímica Marco teórico Cinética enzimática La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas por las enzimas. que es capaz de incorporar un nucleótido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Esta etapa limitante puede consistir en una reacción química o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato. Sin embargo. aunque se añada más sustrato. las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reacción entre sustrato y producto. Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos. El estudio de la cinética de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo catalítico. estos ensayos son extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy bajos de actividad enzimática.Laboratorio de Bioquímica Las dos propiedades cinéticas más importantes de una enzima son: el tiempo que tarda en saturarse con un sustrato en particular y la máxima velocidad de reacción que pueda alcanzar. También se puede utilizar la espectrometría de masas para detectar la incorporación o liberación de isótopos estables cuando el sustrato es convertido en producto. La velocidad de la reacción va aumentando a medida que aumenta la concentración de sustrato hasta que la enzima se satura.com/Corbis. La espectrofotometría permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (según la concentración de estos) y la radiometría implica incorporación o liberación de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo. los ensayos enzimáticos suelen medir los cambios experimentados bien en la concentración de sustrato (que va decreciendo). Los ensayos espectrofotométricos son los más utilizados. ya que permiten medir la velocidad de la reacción de forma continua. El conocimiento de estas propiedades hace posible hipotetizar acerca del comportamiento de una enzima en el ambiente celular y predecir cómo responderá frente a un cambio de esas condiciones. los ensayos radiométricos requieren retirar las muestras para medirlas. Por el contrario. por lo que son ensayos discontinuos. Standard RF. MedicalRF. Sin embargo. mediante el cual se puede medir la velocidad de una reacción enzimática. ©1999) Ensayos enzimáticos Un ensayo enzimático es un procedimiento. 4 Practica N° 8 Cinética enzimática . llevado a cabo en un laboratorio. bien en la concentración de producto (que va aumentando). Existen diversos métodos para realizar estas medidas. (Imagen. Como las enzimas no se consumen en la reacción que catalizan. Los ensayos enzimáticos suelen estar estandarizados para que el período inicial dure en torno a un minuto. En la figura de la derecha se puede observar la típica evolución de una curva obtenida en un ensayo enzimático. Inicialmente. la velocidad de la reacción. para llevar a cabo las medidas más fácilmente. A medida que avanza la reacción. Dependiendo de las Curva de saturación de una reacción enzimática. La pendiente representa. La ecuación de Michaelis-Menten describe cómo va variando la pendiente con la concentración de sustrato o de enzima. lo que se manifiesta en forma de curva asintótica en la gráfica. el período inicial puede durar desde milisegundos hasta horas. en los que se observa y se mide el comportamiento de una población de millones de moléculas de enzima. en oposición a los estudios de cinética enzimática tradicionales. (Standard RF.com/Corbis. que permitan detectar movimientos ocurridos durante la catálisis. los modernos equipos de mezcla rápida de líquidos permiten llevar a cabo medidas cinéticas de períodos iniciales cuya duración puede llegar a ser inferior a un segundo. 5 Practica N° 8 Cinética enzimática . Estas medidas pueden utilizar cambios producidos en la fluorescencia de cofactores que intervienen en el mecanismo de catálisis o bien unir moléculas fluorescentes en lugares específicos de la enzima. se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reacción).Laboratorio de Bioquímica Los ensayos enzimáticos más sensibles utilizan láseres dirigidos a través de un microscopio para observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando catalizan una reacción. MedicalRF. en el período inicial. Estos estudios están dando una nueva visión de la cinética y la dinámica de las moléculas individuales. Sin embargo. ©1999) un comportamiento condiciones del ensayo y del tipo de enzima. la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo lineal. descomponiéndolos en maltotriosa y maltosa desde la amilosa o maltosa. Esta aproximación es muy útil como alternativa a las cinéticas rápidas. ya que las enzimas precisan de una adecuada concentración de iones para mantener su carga y su estructura. completamente afuncionales en ausencia de calcio. esta verá modificada su carga eléctrica al aceptar o donar protones. Puede encontrarse en algunas plantas. Concentración salina: al igual que en los casos anteriormente mencionados. a medida que aumente la temperatura. Normalmente. también es posible medir toda la curva de la reacción y ajustar estos datos a una ecuación no lineal. Los rangos de temperaturas óptimos pueden llegar a variar sustancialmente de unas enzimas a otras.4-α-D-glucano-glucanohidrolasa. Esta forma de medir las reacciones enzimáticas es denominada análisis de la curva de progreso.Laboratorio de Bioquímica La mayoría de los estudios de cinética enzimática se centran en el período inicial. pH: el rango de pH óptimo también es muy variable entre diferentes enzimas. Dado que puede actuar en cualquier punto de la cadena es más rápida que la β-amylasa. es decir. Actúan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos. 6 Practica N° 8 Cinética enzimática . en la zona lineal de la reacción enzimática. Si el pH del medio se aleja del óptimo de la enzima.7 y 7. En los animales es una enzima digestiva mayor y su pH óptimo está entre 6. glucosa y dextrina desde la amilopectina. cuando el período inicial es demasiado rápido para ser medido con precisión. glucogenasa) Las α-amylasas son metaloenzimas de calcio. En fisiología humana tanto la procedente de la saliva como la pancreática son α-Amylasas. una enzima verá incrementada su actividad hasta el momento en que comience la desnaturalización de la misma. la concentración de sales del medio es crucial para una óptima actividad enzimática. Una elevada concentración o una ausencia de sales en el medio pueden impedir la actividad enzimática. hongos y bacterias. Factores físico-químicos que pueden modificar la actividad enzimática Temperatura: las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse modificada su actividad por este factor. lo que modificará la estructura de los aminoácidos y por tanto la actividad enzimática. Sin embargo.0. que dará lugar a una reducción progresiva de dicha actividad. α-Amilasa (Nombre alternativos: 1. formándose el complejo enzima-sustrato ES. Primeramente.Laboratorio de Bioquímica Cinética de Michaelis-Menten Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables.com/Corbis. tiene lugar una reacción química bimolecular entre la enzima E y el sustrato S. independientemente de la [S]. hace referencia al máximo número de reacciones enzimáticas catalizadas por segundo. 7 Practica N° 8 Cinética enzimática . (Standard RF. MedicalRF. la velocidad de la reacción (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la [S]. k-1 y k2 son las constantes cinéticas para cada una de las etapas de la reacción. Si la velocidad inicial de la reacción se mide a una determinada concentración de sustrato (representado como [S]). Aunque el mecanismo enzimático para una reacción unimolecular puede ser bastante complejo. que no sobrepasará en ningún caso. cuando aumentamos la [S]. (Ecuación 1) k2 también llamado kcat o número de recambio. existe una etapa enzimática limitante que permite que el mecanismo sea simplificado como una etapa cinética única cuya constante es k2. Sin embargo. k1. la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad máxima (Vmax). como se puede ver en la figura. Mecanismo de unión de único sustrato para una reacción enzimática. ©1999) El modelo de cinética micheliana para una reacción de único sustrato se puede ver en la figura de la izquierda. la velocidad de catálisis no muestra un comportamiento lineal en una gráfica al aumentar la concentración de sustrato. Aunque a bajas concentraciones de sustrato se mantenga lineal. Aumentando la [S] también aumentamos la [ES] a expensas de la [E]. la enzima se satura y solo queda la forma unida al sustrato ES. la velocidad de la reacción (v ≈ k2[E]tot = Vmax) deja de ser sensible a pequeños cambios en la [S]. Leonor Michaelis y Maud Menten demostraron que si k2 es mucho menor que k1 (aproximación del equilibrio) se puede deducir la siguiente ecuación: (Ecua ción 2) Esta famosa ecuación es la base de la mayoría de las cinéticas Representación gráfica de la curva de saturación de una enzima donde se puede observar como evoluciona la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción. ©1999) enzimáticas de sustrato único. la enzima permanece en un equilibrio constante entre la forma libre E y el complejo enzima-sustrato ES. Puesto que la velocidad de reacción depende de la [ES]. la concentración total de enzima ([E]tot) es aproximadamente igual a la concentración del complejo ES: La ecuación de Michaelis-Menten7 describe como la velocidad de la reacción depende del equilibrio entre la [S] y la constante k2. la velocidad es sensible a pequeños cambios en la [S].Laboratorio de Bioquímica A bajas concentraciones de sustrato. Bajo estas condiciones.com/Corbis. Sin embargo. desplazando el equilibrio de la reacción hacia la derecha. Representación de la ecuación de Michaelis-Menten La gráfica de velocidad frente a [S] mostrada anteriormente no es lineal. a altas [S]. se va curvando a medida que aumenta la 8 Practica N° 8 Cinética enzimática . (Standard RF. MedicalRF. En este caso. Laboratorio de Bioquímica concentración de sustrato. las gráficas de Lineweaver-Burke distorsionan las medidas realizadas a bajas concentraciones de sustrato y esto puede dar lugar a estimaciones no muy exactas de la V max y de la Km. Para ello. el mínimo valor posible es 1/[S] = 0.com/Corbis. podía llegar a ser realmente difícil estimar los valores de la Km y la Vmax en las gráficas no lineales. donde 1/v = 1/Vmax. (Standard RF. todo este tipo de linearizaciones han quedado obsoletos y han 9 Practica N° 8 Cinética enzimática La gráfica de Lineweaver-Burke o del doble recíproco muestra el significado de los puntos de corte entre la recta y los ejes de coordenadas. La gráfica de Lineweaver-Burk o representación de doble recíproco es la forma más común de mostrar los datos cinéticos. Como se puede apreciar en la figura de la derecha. ©1999) . Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran sus esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la ecuación de Michaelis-Menten. pero en las investigaciones científicas actuales. el resultado de este tipo de representación es una línea recta cuya ecuación es y = mx + c. se toman los valores inversos a ambos lados de la ecuación de Michaelis-Menten. MedicalRF. que correspondería a una concentración infinita de sustrato. Generalmente. que permiten ajustar regresiones no lineales de forma sencilla. El valor del punto de corte entre la recta y el eje x es una extrapolación de datos experimentales obtenidos en laboratorio. y el gradiente de la velocidad. Obviamente. y el punto de corte entre la recta y el eje de abscisas equivalente a -1/Km. Antes de la llegada de los ordenadores. dando como resultado la gráfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-Hofstee. se puede simular el comportamiento de una enzima variando las constantes cinéticas. no se pueden tomar valores negativos para 1/[S]. Con el siguiente tutorial de la cinética de Michaelis-Menten realizado en la Universidad de Virginia α.9 Un modelo lineal mucho más exacto es el diagrama de Eadie-Hofstee. siendo el punto de corte entre la recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/Vmax. hongos y varias plantas superiores. La forma. regioselectividad y quimioselectividad. se ha sugerido que esta amplia especificidad de sustrato podría ser clave en la evolución y diseño de nuevas rutas biosintéticas. para comprobar posteriormente si el producto obtenido es el correcto. James Batcheller Sumner demostró que la ureasa es una proteína. Algunas de estas enzimas que muestran una elevada especificidad y precisión en su actividad son aquellas involucradas en la replicación y expresión del genoma. La reacción ocurre de la siguiente manera: (NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3 En 1926. Estas enzimas tienen eficientes sistemas de comprobación y corrección de errores. en la ARNt aminoacil sintetasa y en los ribosomas. que cataliza una reacción de replicación en un primer paso.5. Por ello. da como resultado una media de tasa de error increiblemente baja. ya que pueden actuar sobre una gran variedad de sustratos.Laboratorio de Bioquímica sido sustituidos por métodos más fiables basados en análisis de regresión no lineal. Este proceso. 10 Practica N° 8 Cinética enzimática . Aquellas enzimas que producen metabolitos secundarios son denominadas promiscuas. Es producida por bacteria.5) es una enzima que cataliza la hidrólisis de urea a dióxido de carbono y amoniaco. en torno a 1 error cada 100 millones de reacciones en determinadas polimerasas de mamíferos. Ureasa La ureasa (EC 3. Este tipo de mecanismos de comprobación también han sido observados en la ARN polimerasa. Las enzimas también pueden mostrar un elevado grado de estereoespecificidad. Para analizar los datos es conveniente la normalización de los mismos. la carga y las características hidrofílicas/hidrofóbicas de las enzimas y los sustratos son los responsables de dicha especificidad. que tiene lugar en dos pasos.1. Especificidad Las enzimas suelen ser muy específicas tanto del tipo de reacción que catalizan como del sustrato involucrado en la reacción. como en el caso de la ADN polimerasa. ya que esto puede ayudar disminuyendo la cantidad de trabajo experimental a realizar e incrementando la fiabilidad del análisis. pH óptimo : 7.4 Temperatura óptima: 60ºC Especificidad enzimática: urea e hidroxiurea Inhibidor enzimático: metales pesados Diagnóstico Los organismos que producen ureasa tienden a ser patógenos del tracto gastrointestinal o urinario. Metal en el sitio activo: Niquel(II). Los patógenos ureasa positivos. siendo que la ureasa les permite neutralizar el ácido presente en estos medios acídicos. incluyen:      Helicobacter pylori Bacterias entéricas incluyendo Proteus. Klebsiella y Serratia Nocardia. una bacteria filamentosa Ureaplasma urealyticum. un hongo oportunista 11 Practica N° 8 Cinética enzimática .Laboratorio de Bioquímica Características       Peso molecular: 480 kDa o 545 kDa para la ureasa de frijol. relacionada con mycoplasma Cryptococcus. Dependencia de la velocidad de reacción de la cantidad de enzima 1.0. 12 Practica N° 8 Cinética enzimática .6. termómetro.  Material biológico: solución de saliva diluida. probeta. 3. buffer fosfato –citrato 0.7.8. Primero se diluye la saliva en 20.1M con pH 5.2. cocinilla. vasos de 100 y 500mL.80 y 160 veces su volumen. A cada uno de los 4 tubos se agrega 1mL de solución de almidón y se coloca en un baño de 38°C y se controla el tiempo inicial de la reacción. solución de yodo en yoduro de potasio (Lugol). 2. 10 tubos de ensayo.  Reactivos: solución de almidón al 1%. Se toma 4 tubos de ensayo y se coloca en cada uno de ellos 1mL de cada una de las soluciones preparadas.Laboratorio de Bioquímica Procedimiento Experimental  Materiales de laboratorio: Rejilla. 40.6.4. Al primer y segundo tubo se les coloco en un baño de 38°C y al tercer tubo en agua con hielo por 3 minutos. 2. 3. Se registra el tiempo en que la reacción ha terminado pues primero se presenta una coloración azul. luego rojo-violeta y por ultimo roja. Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la temperatura 1. 4. 5. Después de unos 2 minutos toman 2 gotas del líquido de cada muestra y le agregan a ellas 1 gota de solución de Lugol. Por ultimo se añadió a cada tubo 1 gota de solución de Lugol y se comparo las coloraciones. Se coloco en un tubo de ensayo 5 gotas de saliva. A todos los tubos se les agrego 10 gotas de solución de almidón.Laboratorio de Bioquímica 4. En otros dos tubos se coloca 5 gotas de saliva también pero sin hervir. 13 Practica N° 8 Cinética enzimática . Luego se hirvió por 2 minutos en un baño de agua y se paso a enfriar. Luego de 2 a 3 minutos se toma 1 gota de cada tubo y se le realiza el ensayo de Lugol en donde anotaremos el tiempo de aparición de la coloración roja. 3. En 5 tubos se miden 10 gotas de solución buffer de fosfato-citrato con los diferentes pH mencionados. 2. 14 Practica N° 8 Cinética enzimática . Luego a cada uno de los tubos se le agr3go 5 gotas de saliva diluida 10 veces su volumen y 10 gotas de solución de almidón y todo se coloca en un baño de agua a 38°C.Laboratorio de Bioquímica Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática del pH del medio 1. En un tubo de ensayo se coloca 1mL de urea ya preparada.Laboratorio de Bioquímica Demostración de la especificidad absoluta de la ureasa (Laboratorio N°9) 1. A cada tubo se le agrego aproximadamente 100mg de harina de soya y 2 gotas de fenolftaleína. 3. en un segundo tubo se coloca tiourea y en el tercero acetamida. 15 Practica N° 8 Cinética enzimática . 2. Por ultimo se observa la aparición de color rosado claro y detectamos la presencia de amoniaco por el olor característico. mezclamos cuidadosamente y dejamos reposar a temperatura ambiente. Demostración de la especificidad absoluta de la ureasa El método se basó en la determinación del amoníaco que se forma por la acción de la ureasa de la harina de soya sobre la urea: (NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3 El desprendimiento de amoniaco se detectó por el olor y por el cambio de color de la fenolftaleína y del papel de tornasol rojo. el glucógeno – pardo rojizo o amarillento. Así mismo se cumplen las reacciones al influir la temperatura y el pH. en dependencia de la cantidad añadida del alfa-amilasa de la saliva. esto ocurre en la boca. 16 Practica N° 8 Cinética enzimática .Laboratorio de Bioquímica Reacciones Químicas El método está basado en el estudio de la velocidad de hidrólisis del almidón revelado con Lugol. La primera reacción que se describe a continuación es el fraccionamiento del almidón en maltosa y dextrina por la enzima amilasa. La amilasa del almidón forma con el yodo un complejo de color azul. 0 1/T (min) 0.6 6.Laboratorio de Bioquímica Cálculos Experimentales Dependencia de la velocidad de reacción de la cantidad de enzima T(s) 8 10 14 20 1/T(s) 0.02 0 0 50 100 [concentracion] de amilasa 150 200 Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la temperatura Enzima Amilasa Amilasa Amilasa Sustrato Almidón Almidón Almidón Coloración con Lugol Transparente Transparente Azul Temperatura (°C) 38 38 8 Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática del pH del medio pH 5.170 0.2 8.330 0.07 0.14 0.12 0.070 0.13 0.1 1/T(s) 0.10 0.8 7.06 0.125 17 Practica N° 8 Cinética enzimática .08 0.4 6.04 0.200 0.05 [amilasa diluida] 20 40 80 160 Dependencia de la velocidad de reacción de la cantidad de enzíma 0. 2 0.Laboratorio de Bioquímica Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática del pH del medio 0.3 0.35 0.05 0 5 6 7 pH del buffer fosfato-citrato 8 9 18 Practica N° 8 Cinética enzimática .15 0.1 0.25 1/T(min) 0. Si la temperatura es alta y propicia se obtienen los productos de la acción enzimática sobre el sustrato. que es una temperatura ideal de acción de la enzima.Laboratorio de Bioquímica Discusión de resultados Dependencia de la velocidad de reacción de la cantidad de enzima Los resultados obtenidos demuestran que la velocidad enzimática se ve influenciada por la cantidad de enzima presente en solución. Dependencia de la velocidad de reacción enzimática de la temperatura Los resultados del experimento demuestran que la temperatura tiene un efecto importante en la velocidad enzimática. La gráfica que se produce como consecuencia de la aparición de eritrodextrinas del almidón genera una recta de pendiente positiva. Por otro lado se pudo corroborar cualitativamente la presencia de eritrodextrinas del almidón. que se pudo observar que la reacción enzimática siguió una cinética de Michaelis por tener un comportamiento lineal al ser graficada la velocidad versus la concentración. como consecuencia de la acción enzimática de la ptialina sobre el sustrato (almidón). Así mismo destacar que la reacción enzimática de la amilasa sobre el almidón es de naturaleza específica. Así mismo se produce este resultado a 38°C. lo cual permite pensar que a medida que la concentración de la enzima es mayor el tiempo que se necesita para transformar el sustrato en producto es mucho menor (al graficar 1/t vs concentración). Si la temperatura aumenta considerablemente la reacción puede no producirse debido a la desnaturalización de la enzima. Cabe destacar por ultimo. Finalmente la acción enzimática no se produce a 7°C debido a que no es la temperatura de acción de la ptialina. Estos últimos resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores biológicos de una reacción. 19 Practica N° 8 Cinética enzimática . Como es el caso de la ptialina actuando sobre el almidón. El pH funciona de esta manera como un tercer factor además de la temperatura y la composición del sistema. Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima ptialina así como muchas enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actúan en pH neutro. 20 Practica N° 8 Cinética enzimática . que la acción enzimática es específica no solamente a la estructura del sustrato sino también a una temperatura adecuada. el cual para la ptialina está alrededor de 6. Dependencia de la velocidad de reacción enzimática del pH del medio Los resultados demuestran que la reacción enzimática también se ve influenciada por el cambio del pH del medio hasta alcanzar un pH óptimo.7-6.Laboratorio de Bioquímica Estos resultados pues indican. Este resultado puede ser ubicado en la punta de la campana.8 cerca del pH neutro. para que se puedan generar los enlaces de naturaleza covalente y se pueda producir el fenómeno termodinámico y por ultimo la transformación de los reactantes en productos.  Los resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores biológicos de una reacción. el cual para la ptialina está alrededor de 6. que es una temperatura ideal de acción de la enzima.  La temperatura tiene un efecto importante en la velocidad enzimática. lo cual permite pensar que a medida que la concentración de la enzima es mayor el tiempo que se necesita para transformar el sustrato en producto es mucho menor (al graficar 1/t vs concentración).  La velocidad enzimática se ve influenciada por la cantidad de enzima presente en solución. Si la temperatura es alta y propicia se obtienen los productos de la acción enzimática sobre el sustrato.  Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima ptialina así como muchas enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actúan en pH neutro. Si la temperatura aumenta considerablemente la reacción puede no producirse debido a la desnaturalización de la enzima. su papel en el metabolismo. Finalmente la acción enzimática no se produce a 7°C debido a que no es la temperatura de acción de la ptialina.Laboratorio de Bioquímica Conclusiones  El estudio de la cinética de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo catalítico. 21 Practica N° 8 Cinética enzimática .  Los resultados demuestran que la reacción enzimática también se ve influenciada por el cambio del pH del medio hasta alcanzar un pH óptimo. La gráfica que se produce como consecuencia de la aparición de eritrodextrinas del almidón genera una recta de pendiente positiva.  Como es el caso de la ptialina actuando sobre el almidón. cómo es controlada su actividad en la célula y cómo puede ser inhibida su actividad por fármacos o venenos o potenciada por otro tipo de moléculas. Este resultado puede ser ubicado en la punta de la campana.7-6.8 cerca del pH neutro. Así mismo se produce este resultado a 38°C.  2. UNMSM.. Plummer. 22 Practica N° 8 Cinética enzimática . García Alayo.Laboratorio de Bioquímica Bibliografía  1. Legninger. Edit. 1981.BIOQUÍMICA PRÁCTICA. Fred. Madrid. Edit. Perú. Segunda edición. McGraw-Hill.BIOQUÍMICA.. FQIQIA.GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA..  3. Omega. 2011.