UNIVERSIDAD TECNOLOGICA METROPOLITANALABORATORIO DE BIOQUÍMICA Informe Practico N°2 “Centrifugación” Autores: Xiomara Campos Lorca Sebastián Sandoval Grandon Wladimir Vega Valdes Fecha: 21 de Abril del 2015 -Una de la etapas más relevantes. las herramientas. tiempos y medios. . mientras que los componentes menos densos de la mezcla se desplazan hacia el eje de rotación. Esta fuerza es provista por una máquina llamada centrifugadora. la densidad de la solución (p).Introducción Por muchos años el hombre ha intentado estudiar las unidades estructurales que componen a las células y otros organismos microscópicos. el coeficiente de roce (ƒ) y del campo centrífugo de magnitud (w2r). y macromoléculas biológicas se ha implementado la técnica de centrifugación la cual no solo es aplicable en organismos vivientes sino que también se puede emplear en la materia inerte. es la de limpiar. La velocidad de sedimentación (V) a la que es sometida una muestra depende directamente de la masa de la partícula (m). y el material que se utilizará. el volumen de la partícula (v). al comenzar un práctico de laboratorio. La centrifugación es un método por el cual se pueden separar sólidos de líquidos de diferente densidad por medio de una fuerza giratoria. Los componentes más densos de la mezcla se desplazan fuera del eje de rotación de la centrífuga. con la finalidad de comprender su funcionamiento. Por otro lado también existe la centrifugación en gradientes la cual permite obtener un mayor grado de resolución en la separación lo que permite un análisis más específico de los componentes. la cual imprime a la mezcla un movimiento de rotación que origina una fuerza que produce la sedimentación de los sólidos o de las partículas de mayor densidad. organelos. Procedimientos 1. existe la centrifugación diferencial la cual permite separar componentes celulares por diferencias en coeficientes de sedimentación a partir de un homogenizado celular. desinfectar e higienizar el lugar de trabajo. empleando distintos rotores. De esta manera los químicos y biólogos pueden aumentar la fuerza de gravedad efectiva en un tubo de ensayo para producir una precipitación del sedimento en la base del tubo de ensayo de manera más rápida y completa. Para separar y analizar estas células. Esta acción permite que el resultado final de las reacciones químicas efectuadas no sean alteradas desfavorablemente por el hecho de que ocurra una contaminación por falta de higiene. Como por ejemplo. Todos estos factores por los cuales depende la velocidad de sedimentación se pueden definir por medio de la siguiente expresión: V = m ( 1 – v p ) w2 r / ƒ Existen diversos tipos de centrifugación que se utilizan de acuerdo a lo que se desee separar. velocidades. se prepararon dos tubos de centrífuga para la gradiente de sacarosa.0 ml de sacarosa 57% 4. agregándole paulatinamente 30 ml de medio homogenizante frio mientras se trituraba el vegetal. Se colocaron las siguientes soluciones lentamente y en orden a cada tubo.-Por otro parte. Luego se fraccionó su contenido con una micropipeta tomando volúmenes de 1 ml colocándolos en tubos eppendorf.5 ml de sacarosa 60% 3.000 r/min en la centrífuga Beckman.5 ml de medio homogenizante.5 ml de sacarosa 33% 7. 5.-Una vez completada la centrifugación se eligió el tubo que mejor tenia enmarcada las zonas de sacarosa.2. 4. . 3.5 ml de sacarosa 44% 1. Posteriormente se centrifugó a 4°C por 10 minutos a 12. 9.-Luego de la segunda centrifugación se retiró el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 1.-Inmediatamente se transfirieron 15 ml del filtrado en un tubo y se centrifugó a 4°C por 5 minutos a 1000 r/min para remover células enteras y otros restos de tejidos vegetales. escurriendo el líquido por las paredes del tubo: 1.-Luego se retiró el sobrenadante de la primera centrifugación y se depositó en dos tubos de manera que tuviesen la misma cantidad del zumo.-Rapidamente se filtró la pulpa a través de un trozo de gaza. 8. 10.5 ml de sacarosa 50% 4.-Finalmente con la ayuda de un refractómetro se determinó el porcentaje de sacarosa en cada fracción y su correspondiente densidad. extrayendo así el líquido residual y depositándolo en un vaso precipitado.-En seguida se equilibró el peso de los tubos en porciones iguales y se procedió a centrifugarlos a 4°C por 1 hora a 25.000 r/min en la centrífuga Sigma. 6.-En primera instancia se pesaron 15 gr de hojas de espinacas y se molieron en un mortero. Seguido de esto se distribuyó cuidadosamente 1 ml de pellet sobre la gradiente de sacarosa de los tubos de centrífuga que se había preparado previamente. 8 1.5 1.9 1. separada en los distintos tubos eppendorf y su correspondiente densidad según su porcentaje de concentración.21 16 46.18 11 43.14 4 33.Resultados Los siguientes resultados representan la concentración de sacarosa en cada muestra de 1.21 15 48.6 1.20 14 48.6 1.9 1.5 1.7 1.20 .14 2 34.19 12 45.13 6 35.14 5 32.17 10 42.3 1. N° de muestra Porcentaje gr / 100 ml Densidad (gr/cm3) 1 34.7 1.7 1.4 1.15 7 37.5 1.4 1.14 3 34.0 ml de solución.16 9 40.8 1.20 13 46.5 1.16 8 38. las moléculas en sedimentación estarían constantemente entrando en una zona de mayor densidad. Para los tejidos de plantas. La suspensión de células constituyentes se llama homogenado. Estructura celular Densidad de la estructura (gr/cm3) N° de muestras donde se pueden encontrar Membranas plasmáticas 1. Después de rebanar las hojas. . Tanto la viscosidad de la disolución-muestra como las propiedades físicas de las partículas afectarán a la sedimentación individual de las mismas. el tejido está preparado para la homogenización. se prosiguió a estimar en que fracciones se es posible encontrar las diferentes estructuras celulares según su densidad. Luego para poder extraer los organelos se dispuso a centrifugar en centrifuga sigma para poder remover células enteras y resto de tejidos vegetales. Se refiere al rompimiento de las células o el tejido del cual se pretende extraer la organelo o la molécula de interés biológico. Una vez terminado la primera centrifugación se dispuso a realizar una sedimentación a través de un gradiente de concentración previamente formada.Una vez determinada la densidad de cada fraccionamiento. pero si el gradiente fuera suficientemente fuerte. el soporte de las moléculas recién llegadas sería insuficiente para ocasionar una inversión de la densidad y el sistema permanecería estable.16 7y8 Retículo endoplasmico liso 1. Como resultado. Para mantener la integridad de los organelos y enzimas durante el procedimiento del fraccionamiento.21 14 y 15 Discusión: Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular. al cual se le añade homogenizante frío. Su llegada aumentaría la densidad de la región. sin dañar el medio en suspensión. salina o azúcar isotónica). la homogenización se realizó con un mortero. todas las soluciones y cristalería deben mantenerse frías. primero se debe suspender en un medio apropiado (una solución amortiguadora. queda una pasta fina que consiste de las células y sus organelos por separado.16 7y8 Mitocondrias 1.19 11 Lisosomas 1. procedimiento que rompe los enlaces celulares y libera el contenido celular. las soluciones concentradas tienden a caramelizarse por arriba de los 100 0 C. y es posible encontrar las descripciones de los gradientes disponibles y condiciones de centrifugación para la separación de un gran tipo de muestras biológicas. Las partículas viajan a través del gradiente hasta el punto en el que su densidad es igual a la de la sacarosa circundante. Las soluciones concentradas de sacarosa requeridas para separaciones isopícnicas son muy viscosas. La principal desventaja de la sacarosa son algunas de sus propiedades fisicoquímicas. Esta caramelización provoca cambios en las propiedades de la solución de sacarosa.El material utilizado para formar gradientes de densidad en esta centrifugación es la sacarosa. que fue preparado previamente. Resultado de la centrifugación: . por ejemplo. -Cada capa debe depositarse muy lentamente sobre la anterior. Luego de disponer los tubos de sacarosa con el pellet homogenizado suspendidos en ella. se han caracterizado las propiedades de la sacarosa y de sus soluciones con respecto a sus relaciones de concentración y viscosidad. su bajo costo y su naturaleza estable. ribosomas y polisomas. proteínas. y a menos que se ajuste el pH a 5-6. también se utiliza gradientes de sacarosa para la separación isopícnica. Las soluciones de sacarosa tienen alta fuerza osmótica y las soluciones por arriba del 9% (p/V) son hipertónicas y solo tienen una densidad de 1. Cuando se calientan. por lo que. La sacarosa es muy susceptible a hidrólisis de los enlaces glicosílicos a pH menores a 3. -Sobre la última capa se deposita la muestra biológica que consiste en un ml de un homogenizado de células de espinaca. Para que el gradiente salga bien se tuvo que tomar las siguientes precauciones: -La densidad de las partículas utilizadas debe estar dentro de los límites de las densidades de los gradientes. para evitar que se mezclen las disoluciones. dado su comportamiento inerte ante la presencia del material biológico. ácidos nucleicos. -Con cada disolución se utiliza una pipeta Pasteur diferente. densidad e índice de refracción en un gran rango de temperaturas. En centrifugaciones sucesivas de mayor fuerza gravitacional y mayor tiempo se obtiene las diferentes fracciones de nuestro interés. -Las disoluciones deben de estar frías (nevera). Los gradientes de sacarosa pueden ser preformados para fraccionamiento zonal de macromoléculas y complejos macromoleculares. Debido a su gran uso.03 g/cm 3 lo que reduce su uso en la separación de partículas osmóticamente sensibles. se vuelve a centrifugar en ultracentrifuga Beckman. las partículas pequeñas son incapaces de alcanzar su posición isopícnica en el gradiente. de esta manera se planifica el número de centrifugaciones. También se puede concluir que existen diferentes tipos de centrifugaciones y su uso depende de la estructura que se desea observar. también podemos separar las organelos de acuerdo a sus densidades relativas con respecto a un gradiente de densidades. Esto se midió mediante refractómetro en base a su porcentaje de densidad en cada refracción de sacarosa.De acuerdo a la ley de Stokes. ya que. Trabajo de investigación . se es posible un mejor estudio y enfoque cuando la estructura se encuentra aislado de los demás organelos celulares. Conclusión A través de esta experiencia se logró comprender los procedimientos adecuados para realizar las centrifugaciones y su importancia en el estudio del funcionamiento de las estructuras celulares. la intensidad y la cantidad de tiempo que se necesita para obtener el organelo deseado. que son plaquetas y finalmente otro nivel del plasma total. calcular el volumen de sangre y la masa eritrocítica total. dividido por el volumen total de la muestra de sangre da el PCV Con equipos de laboratorio modernos. de leucocitos y una delgada de color gris. el hematocrito se calcula por un analizador automático y no se mide directamente. El método de referencia para la determinación del hematocrito es la centrifugación. El hematocrito es un poco más preciso como el PCV incluye pequeñas cantidades de plasma de la sangre atrapada entre los glóbulos rojos. uno con el depósito de los glóbulos rojos principalmente en color rojo oscuro.Tras una centrifugación de la sangre total se pueden apreciar dos niveles. . La cantidad y proporción relativa de cada una de estas partes se denomina valor o índice hematocrito.“Determinación del valor de hematocrito mediante centrifugación” El valor de hematocrito indica el porcentaje volumétrico de eritrocitos en sangre. Se determina multiplicando el recuento de glóbulos rojos por el volumen corpuscular medio. En este método la sangre se centrifuga en tubos capilares para hematocrito hasta que se alcanza la densidad máxima de compactación celular. de un leve color amarillento. Mediante la centrifugación se separan los componentes sólidos de la sangre de los líquidos y se envasan herméticamente. La medición del valor hematocrito se fundamenta en la simple centrifugación de una muestra de sangre incoagulable colocada en un tubo especial (tubo hematocrito) que lleva una escala de diez divisiones y que. Se usa el hematocrito para determinar los índices de critrocíticos. y establecer si el paciente es anémico. tras la centrifugación. Un hematocrito calcula como un porcentaje puede ser derivado al triplicar la hemoglobina concentración en g/dL y colocar las unidades. mientras que sobrenada la fracción plasmática. El volumen de concentrado de glóbulos rojos. permite medir la altura del volumen que ocupan los glóbulos en el fondo del tubo y la del plasma que sobrenada. otra capa blanca. La parte corpuscular por ser más densa queda en el fondo del tubo.
Report "Bioquímica Centrifugación de Organelos de espinaca"