Caso 1Hombre de 32 años con HIV + sometido a biopsia de medula ósea. Cuál es el diagnóstico . Reacción de PAS 100 X Impregnación argéntica de Grocott 40 X . . Laboratorio Clínico y de Anatomía Patológica TECNOLOGÍA MÉDICA Histoquímica: Biopsia de médula ósea •Prof. Eduardo Sedano Gelvet Estructura de la Médula ósea • Células reticulares y fibras de reticulina, que forman una malla de soporte; • Vasos sanguíneos y nervios, que dan origen al sistema de sinusoides encargados de recibir las células sanguíneas recién producidas y llevarlas a circulación; • Tejido hematopoyético maduro y precursores (médula roja), donde se produce la hematopoyesis propiamente dicha y • Grasa (médula amarilla), que actúa como soporte del tejido hematopoyético y como reserva frente a una necesidad de mayor hematopoyesis. . Biopsia de médula ósea Es una biopsia por trepanación y consiste en la obtención de muestras de hueso para el estudio de enfermedades de la medula ósea en los trastornos hematológicos. . Anemias. hongos). Leucemias. micobacterias. Valorar la eficacia del tratamiento de leucemias y linfomas. • Diagnosticar recidivas. Síndromes mielodisplásicos.Este proceso se realiza: • • • • • Infecciones (bacterias. . . Toma de muestra Aspirado (líquida) Porción sólida (hueso) Aspirado (coagulo)) Fijación Frotis Fijación Descalcificación Inclusión en parafina Inclusión en parafina Fijación Microtomía Microtomía Colorantes hematológicos Histoquímica Inmunohistoquímica Citogenética . Frotis • Coloración de Wright. • Histoquímica enzimática: – Peroxidasa – Fosfatasa alcalina – Fosfatasa ácida – Reacción de PAS – Reacción de Perls • Inmunohistoquímica . . . . Coloración de Wright Reacción de la peroxidasa . . . Porción sólida Hueso . Fijación • La mayor parte de las dificultades de interpretación de las biopsias se deben a problemas de fijación. • Fijadores: – Formol tamponado – B5 – Líquido de Bouin . .Formol tamponado • Ventajas: – Aplicación de reacciones histoquímicas. • Desventajas: – No se puede hacer una buena evaluación morfológica. – Aplicación de reacciones inmunohistoquímicas. • Desventajas: – Endurece demasiado el tejido.B5 • Ventajas: – Buena evaluación morfológica. . – Dificulta la inmunohistoquímica – No procedimientos moleculares para ADN. Líquido de Bouin • Ventajas: – Fijación rápida (2 a 4 horas) – Aplicación de reacciones histoquímicas. • Desventajas: – No procedimientos moleculares para ADN. – Aplicación de reacciones inmunohistoquímicas. . • Usar formol-ácido fórmico: – Después de fijar con líquido de Bouin – Buenos resultados .Descalcificación: • Evitar el formol nítrico: – Altera la morfología. – Dificulta la inmunohistoquímica • Algunos usan el EDTA: – Descalcificación lenta. Secciones de tejidos fijados en formol e incluidos por el método de la parafina • • • • Coloración de hematoxilina-eosina. Inmunohistoquímica . Histoquímica. Coloración de Giemsa. . . La oxidación del azul de metileno produce los azures de metileno.Colorantes neutros o hematológicos o de Romanovsky Sales neutras complejas que se obtienen mezclando un colorante de naturaleza ácida (eosina) con otro de tipo básico (azul de metileno). • Poco solubles en el agua • Deben disolverse en alcohol metílico o en glicerina para evitar la formación de precipitados.Características • Propiedades colorantes van unidas a los componentes ácido y básico de la molécula. . . ambos portadores de color y con afinidad por elementos celulares de carga opuesta.• Disueltos en alcohol o en glicerina no actúan como colorantes.4-6.6 • Disociación de la molécula en aniones y cationes. • El colorante disuelto en alcohol o en glicerina se disocia en agua destilada o en buffer fosfato pH=6. – Rosado por la eosina. – Púrpura por metacromasia de los azures y del azul de metileno.• Después de la disociación de la molécula colorante. . sobre el tejido se observa tres colores: – Azul por el azul de metileno. • Giemsa • Wright • Leishman • May-Grünwald . .The granules in eosinophils stain bright red with the giemsa stain in this case of acute esophagitis The granules in eosinophils stain bright red with the giemsa stain in this case of acute esophagitis. Reacciones histoquímicas . Reacción para demostrar actividad de peroxidasa La enzima peroxidasa de las células mieloides actúa sobre su substrato el peróxido de hidrógeno produciendo oxigeno. . este oxida la bencidina la cual se deposita en el citoplasma. • Eosinófilos • Mielocitos.Células peróxidasa positivo • Neutrófilos. . • Células plasmáticas.Células peróxidasa negativo • Linfocitos. . permite la liberación de las bases purínicas del ADN con la consiguiente formación de grupos aldehídos (CHO). Estos son reconocidos por el reactivo de Schiff produciendose un color rojo magenta que denota la presencia de ADN.Reacción de Feulgen La hidrólisis con HCl 1 N a 60°C. . S.Reacción de P. Estos son reconocidos por el reactivo de Schiff produciendose un color rojo magenta. con la consiguiente formación de grupos aldehídos (-CHO).A. . La oxidación con ácido peryódico permite la ruptura y oxidación de los grupos alfa glicol. negativa.• Leucemia aguda linfoblastica (LAL) es P.A. positiva.S. • Leucemia aguda mieloblastica (LAM) es P.A. .S. . el verde de metilo (trifenil metano) colorea el ADN mientras que la pironina (xanteno) colorea el ARN.Coloración con verde de metilo pironina (Unna-pappenhein) Colorantes básicos.8 se produce una coloración selectiva. . cuando la mezcla de ambos se aplica a pH=4. Verde metil . Cristal violeta . Pironina . • Hematíes policromatófilos.• Cuerpos de inclusión de Döhle. . Células plasmáticas malignas . . . permite la liberación del hierro. que esta almacenado en las células unido a las proteínas del citoplasma.Reacción de Perls (azul de Prusia o azul de Berlin) Hidrólisis con HCl. El hierro al enfrentarse al ferrocianuro de potasio forma “in situ” ferrocianuro férrico de color azul de Prusia. El contenido de hierro determina observando precursores eritroides: medular se en 100X • No se identifican gránulos intracelulares: 0 • Se identifican gránulos ocasionalmente: + • Se considera como normal. cuando se observan gránulos en el 10% de las células observadas: ++ • Cuando están moderadamente aumentados: +++ • Cuando es evidente el exceso de hierro tanto en los precursores celulares como extracelularmente: ++++ . Reacciones inmunohistoquímicas . Nomenclatura unificada CD CD significa “grupos de diferenciación”(del ingles cluster of differentiation). son moléculas de proteínas reconocidas por un “grupo” de anticuerpos monoclonales. . Por ejemplo. la mayoría de las células T colaboradoras expresan una proteína de superficie llamada CD4 .Estas proteínas sirven como marcadores fenótipicos de las diferentes poblaciones leucocitarias. Linfomas. Leucemias .Identificación de células en: • • • • Respuesta inflamatoria. Respuesta inmunitaría. Marcador general . .Antígeno común leucocitario (CD 45) Este antígeno (proteína) se encuentra localizado en la superficie de la membrana de las células linfoides y de los polimorfonucleares. . Marcadores específicos . . Linfocito Th y Tc UNIDAD DE ANATOMIA PATOLO GICA . Linfocito B UNIDAD DE ANATO MIA P ATOLOGICA . . CÉLULA CITOLITICA NATURAL (NK) UNIDAD DE ANATO MIA P ATOLOGICA . CD 15 . CD 30 .