Catedrática: Dr. Alumno: [BIOLOGIA MOLECULAR] Diagnostico del Virus del Papiloma Humano, utilizando técnicas de Biología Molecular: extracción de DNA, cuantificación en el espectrofotómetro y en electroforesis en gel, PCR Generalmente no duelen y pueden ser sobresalientes. La infección puede ser causada por una de las más de cien cepas (tipos) diferentes de VPH que existen. La inserción de los tampones puede trasladar el virus desde los labios hacia la vagina. Sin embargo. aunque es posible que la infección desaparezca de forma espontánea en los primeros seis meses evitando que cronifique. Las toallas femeninas pueden retener y transmitir al virus. mientras que otros necesitan tratamiento. pudiendo cursar con un cuadro subclínico y por lo tanto sin síntomas. fenómeno que ocurre en casi todos los procesos. 2 . El coito anal es una forma de transmisión frecuente porque la mucosa anal es frágil y muy susceptible a la infección por VPH. El virus puede producir la aparición de bultos carnosos similares a una coliflor en áreas húmedas ubicadas en y alrededor de los órganos sexuales. El VPH se encuentra tan difundido que sólo las personas que no han tenido relaciones sexuales no han estado expuestas a el. haciendo que el paciente no tenga conocimiento a menos que aparezcan alteraciones en la prueba de papanicolaou o en la colposcopia. En casi todos los casos la infección es subclínica y de corta duración. puntiagudos o planos. por lo que es considerada dentro del grupo de enfermedades venéreas. Los condones no previenen por completo de la transmisión del VPH porque se puede contagiar durante los juegos sexuales y otras actividades distintas al coito. Los productos que se utilizan durante la menstruación también pueden transportar al virus. La enfermedad provocada por el VPH es una infección incurable. En algunos casos las lesiones pueden desaparecer espontáneamente. Las verrugas pueden aparecer solas o en grupos. el riesgo se reduce con los condones.VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO El virus del papiloma humano ('VPH o HPV del inglés human papilomavirus) son un grupo diverso de virus ADN perteneciente a la familia de los Papillomaviridae y representan una de las infecciones de transmisión sexual más común. y la humedad y la abrasión facilitan cualquier vía de transmisión. ORIGEN DE LAS MUESTRA Y SUS PROCESAMIENTOS La toma de la muestra se realizo de dos maneras. extraída del brazo del paciente y cepillado vaginal. se recomienda la realización de una colposcopia y una biopsia de cualquier área anormal. que ya está disponible en México y cuyo nombre es PCR-VPH. ayuda no solamente a salir de dudas. son suficientes para diagnosticar la presencia de papilomavirus. sin embargo y como no siempre estas son visibles. El siguiente paso es el análisis cuantitativo (espectrofotómetro) y cualitativo (electroforesis en gel) para saber si se cuenta con DNA en la muestra. Para visualizar las lesiones se puede aplicar gasa con vinagre para visualizar las lesiones en el pene o realizar una peneoscopía o un cistoureterograma miccional para identificar lesiones intrauretrales. Si en la prueba se detectan cambios anormales importantes. DIAGNOSTICO MOLECULAR Para realizar el Dx molecular que es la prueba de PCR. con muestra sanguínea. En algunos casos un examen de ADN. Por último pero no por eso menos importante PCR y la lectura en electroforesis. en nuestro caso se obtuvo de muestra sanguínea y cepillado vaginal. sino también a conocer el tipo de virus existente.DIAGNOSTICO DEL VPH La presencia de papilomas o verrugas en los genitales externos o en la zona anal. En los hombres es más difícil el diagnóstico. es recomendable siempre confirmarlo mediante el examen del Papanicolaou en las mujeres que son sexualmente activas o que han cumplido los 18 años de edad. tomada en el CESS 3 . se tiene que realizar primero la extracción del DNA. La adición de un detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas. El alcohol del sobrenadante se llevará las sales añadidas previamente. El sedimento se puede re-suspender en agua o tampón Tris tras ser secado completamente. Recuperación. recuperar mediante una centrifugación. 2. 4. La fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico. por lo que se puede precipitar etanol frío o isopropanol. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN.Inmediatamente se prosiguió a prosiguió de lleno a lo que es extracción de DNA. Finalmente se lava con alcohol y se diluye el contenido. Purificación. Consta de 3 fases: Precipitación del ADN. 4 . Las sales cao trópicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su desnaturalización. El paso 3 puede realizarse con la ayuda de mini columnas equipadas con una membrana de sílica que retiene específicamente el ADN permitiendo el paso de las moléculas y sales que acompañan la reacción de lisis. Se consigue mediante la adición de una proteasa. 3. por el método de TTS Los pasos necesarios para una correcta extracción y purificación del ADN mediante un procedimiento químico son: 1. El ADN es insoluble en alcohol. Lisis de las células o virus. Adicionar 50 µl de solución TD3 en el centro de la membrana. Cuidadosamente se coloca en un tubo nuevo. Adicionar el tejido. . Se centrifuga 1min a 10000 rpm. Se decanta el sobrenadante y el tejido que se obtiene será el “botón”. se centrifuga a 10000 rpm por 30 segundos. Agitar la solución TD1. Se quita la columna y se rotula el tubo. 420 nm… 700 nm). 9. Esto se consigue haciendo pasar la luz a través de un dispositivo monocromático que fracciona la luz en distintos intérvalos de 5 . se transfiere el sobrenadante a una columna de separación.En el caso de la extracción de las muestras vaginales el procedimiento es el siguiente. y de nuevo se centrifuga 10000 rpm por 1 minuto 8. Decantar el liquido. 4. 3. se agita en el bortex a máxima velocidad durante 10 min. Se decanta el liquido y se le adiciona 400 µl de solución TD2 6. 410 nm. CUANTIFICACION EN EL ESPECTOFOTOMETRO Para corroborar que al final de la extracción haiga DNA. Centrifugar a 10000 rpm por 30 segundos 7. se lee la muestra en el espectrofotómetro El funcionamiento de un espectrofotómetro consiste básicamente en iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda. 1. y de nuevo se centrifuga a 10000rpm por 30 segundos 5. centrifugar los tubos PVS 10 min. y se adiciona 700 µl de solución TD1 2. Lo más usual es que los datos se recojan en 31 intérvalos de longitudes de onda (los cortes van de 400 nm. 6 . permite observar el resultado de ésta migración. Los pasos son los siguientes. CUANTIFICACION EN ELECTROFORESIS EN GEL La electroforesis es una técnica habitual en el laboratorio clínico. tienen por naturaleza carga negativa. es perfectamente correcto calcular los valores colorimétricos para cualquier iluminante conocido. puede ser extraído para análisis posteriores. Colocar en un tubo 5 µl de la muestra y 5 µl de azul de mercaptoeptanol. La electroforesis de ADN es útil para comparar patrones de bandas de diferentes muestras biológicas. 1. una vez localizado en el gel. Es importante darse cuenta de que los valores de reflectancia obtenidos son valores relativos y. o como un porcentaje entre 0 y 100. para la identificación de ácidos nucleicos de agentes infecciosos o para la obtención de un fragmento determinado de ADN que.longitudes de onda. Permite separar especies químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo de un campo eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica. La reflectancia de una muestra se expresa como una fracción entre 0 y 1. que es una sustancia fluorescente que se intercala en la molécula de ADN. son independientes de la calidad y cantidad de la luz usada para iluminar la muestra. Así por ejemplo se puede usar para comparar muestras de individuo sano frente a individuo enfermo. El tamaño de los fragmentos de ADN se puede estimar comparándolos con el patrón de bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular conocido. Los ácidos nucleicos. para muestras no fluorescentes. aunque los factores de reflectancia se midan usando una fuente de luz concreta. Si ponemos fragmentos del ADN extraído de una muestra biológica sobre un soporte poroso (gel) y aplicamos un campo eléctrico. se producirá la migración diferencial de los fragmentos a través de los poros de la matriz. y la exposición con luz ultravioleta. Así. El instrumento se calibra con una muestra o loseta blanca cuya reflectancia en cada segmento de longitudes de onda se conoce en comparación con una superficie de reflexión difusa perfecta. ADN y ARN. La tinción del gel con bromuro de etidio. Se utiliza la misma punta para cargar todas las muestras haciendo varios lavados de la misma con agua bidestilada entre cada muestra. Es fundamental realizar este paso sin que haya contaminaciones cruzadas entre los distintos pozos. También se debe incluir el marcador de PM en uno de los carriles laterales. con una micro pipeta y puntas largas descartables para geles. 7 . Separar los vidrios que contienen el gel con cuidado. como referencia. 4. Sacar el gel y eliminar la parte del gel. Cargar las muestras en los pozos del gel (10 µl). Colocar el gel en la cámara y correr las muestras a 200 V (voltaje constante) hasta que el azul de bromo fenol llegue casi al borde inferior del gel (aproximadamente 60 min).2. 5. Llenar la cámara con el amortiguador de corrida: 180 ml en el tanque inferior y 120 ml en el superior. 3. Observar el corrimiento del gel y la apreciación del ADN. Esto se evita depositando las muestras despacio pero de forma continua en los pozos. A la mezcla de reacción se le añade una DNA polimerasa resistente al calor (polimerasa Taq). El DNA que se quiere amplificar se desnaturaliza en cadenas sencillas.PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA) Permite la amplificación directa de segmentos específicos y puede utilizarse en fragmentos de DNA que estén presentes inicialmente en cantidades pequeñas. Los cebadores hibridan al DNA de cadena sencilla. el DNA de doble cadena se desnaturaliza por calor (a unos 90 ° C) hasta que se disocia en cadenas sencillas. el producto es un molécula de DNA de doble cadena con los cebadores incorporados en el producto final. oligonucleótidos que hibridan con la cadena complementaria de la secuencia a amplificar. Procedimiento Existen 3 pasos fundamentales en la reacción de PCR y la cantidad de DNA amplificado: 1. La polimerasa extiende los cebadores en dirección 5 ` a 3’ . 2. Este DNA no necesita estar purificado ni clonado. utilizando como molde al DNA de cadena sencilla unido al cebador . Generalmente se utilizan 2 cebadores diferente cada uno de ellos tiene la secuencia complementaria a una de las cadenas de DNA. Se basa en la amplificación de un segmento de DNA utilizando ADN polimerasa y cebadores. Estos cebadores son oligonucleótidos sintéticos que hibridan con las secuencias flanqueantes del segmento a amplificar. Los cebadores se alinean con sus extremos 3` complementarios ya que hibridan en cadenas opuestas.. y puede provenir de distintas fuentes. utilización de cebadores sintéticos significa que se debe tener alguna información de la secuencia de DNA a amplificar 3. 8 . 073 0.249 0.109 0.536 3.366 -1.232 0.893 0.5 99.929 1.122 0.81 8.RESULTADOS Cuantificación en el espectrofotómetro # muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tipo muestra Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Vaginal Vaginal 260nm 280nm Relación ADN 0.310 2.48 44.105 0.560 4.04 106.163 0.601 7.031 -0.018 0.975 0.008 1.644 2.131 0.308 3.130 0.124 0.038 1.132 0.8 113.86 102. 9 .464 3.044 -0.109 0.157 0.131 0.956 1.4 92.065 0.705 6.6 120.2 171.003 Resultados de PCR en electroforesis en gel.000 DNA g/ml 2.113 0.932 0.024 Proteína g/ml 95.117 0.839 0.137 0. Describe que actividad realiza un especialista en Biología o genética Molecular : otros 4% Vida y Salud 16% Moleculas y atomas 30% DNA y Genes 50% ¿Que es el Dx molecular? Con una idea 17% Ni idea 83% 10 . M.? NUNCA VA A CAMBIAR 25% VEN UN FUTURO OPTIMISTA 45% Si 89% IGUAL QUE EN LA ACTUALIDAD 30% 11 .¿Consideras que el Dx molecular es ùtil en el Dx clínico? No 3% Si 97% No Indeciso 6% 5% ¿Te someterías a una prueba de Dx molecular? ¿Cómo visualizas el uso de pruebas basadas en tecnicas de B.