Paraclínicos Moleculares y deGenética Forense GISEL GORDILLO GONZÁLEZ ESP. GENÉTICA MÉDICA HIBRIDACIÓN “Unión complementaria de ácidos nucleicos” Técnicas: Detectar una molécula partiendo de una sonda complementaria a ella. PCR Arrays Hibridación in situ ELECTROFORESIS Separa moléculas en un campo eléctrico según tamaño y carga eléctrica. Siembra de la muestra Gel poroso Aplicar campo eléctrico Migración Tinción (bromuro de etidio) para visualización PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) Técnica de Biología Molecular descrita por Kary Mullis en 1983, bioquímico. Premio Nobel de Química, en 1993 junto con Michael Smith PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) Objetivo: Amplificación directa de un gen o fragmento de ADN, o indirecta de un RNA Requisito Conocer la secuencia de una parte PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) FUNDAMENTO: Propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, usando ciclos de alta y baja T° para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. Aplicaciones de la PCR Diagnóstico clínico Monitoreo y evaluación de terapias Detección de cepas resistentes a antibióticos Detección de mutaciones puntuales Polimorfismos genéticos Medicina forense Pedigrí animal Control de calidad Termociclador Componentes de la PCR Muestra ADN Primers (cebadores) dNTPs Muestra de ADN No quelantes (EDTA) ↓ [Mg] Terapia de Quelantes Muestra de ADN ADN no puede estar fragmentado en trozos más pequeños de lo que queremos amplificar. Cantidad de la muestra: mínimo 10-100 ng. y máximo 400-500 ng. Primers (Cebadores) El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50%. Relación máx purinas/pirimidinas = 60%/40%. Tamaño: 18-30 pb. Tm= 4 (G+C) + 2(A+T) ADN Polimerasa Termolábiles Termoestables Actualmente la polimerasa que se utiliza es la Taq polimerasa. Termus aquaticus Otros reactivos Utilizamos dNTPs (Deoxinucleótidos trifosfato) dATP, dGTP, dCTP y dTTP Concentraciones iguales. [dNTPs] = [Mg++] Principios (pasos) de la PCR 1. Denaturalización reversible del ADN, por calentamiento 2. Anillamiento del primer 3. Síntesis de la cadena de ADN por una ADN polimerasa en sentido 5´→ 3´ http://www.fitolab.com.mx/fitolabSiteRecs/esquemaPCR.jpg La detección del producto de la PCR, se hace por electroforesis Producto Amplificado (AMPLICON) PCR en Tiempo Real Permite cuantificar además de detectar y amplificar secuencias de ADN Diferencias: Uso de “Reporteros fluorescentes” (Beacons) http://www.docstoc.com/docs/108459246/PCR-en-Tiempo-Real PCR en Tiempo Real http://www.udg.edu/serveis/STRUBM/Tecniques/PCRquantitativa/tabid/13251/ language/es-ES/Default.aspx PCR en Tiempo Real Ventajas Aplicaciones Análisis de la cinética de la reacción Detección del producto en cada ciclo Mayor sensibilidad (menos falsos negativos) Más rápida Menos contaminación (menos falsos positivos) Cuantificación expresión de genes Control eficacia fármacos Detección agentes infecciosos Dx. Tumores Detección polimorfismos BLOTS Western Blot Inmunoblot Nos permite visualizar anticuerpos (Acs) directos contra proteínas Prueba confirmatoria para un ELISA de HIV positivo http://www.pathology.ucla.edu/cirl/pages/publicview/images/autoblot.jpg Pasos del Western Blot 1. Proteínas se separan por gel de electroforesis, usualmente página de SDS (sodium dodecyl sulfate) 2. Las proteínas se transfieren a una hoja de papel de nitrocelulosa. 3. La mancha se incuba con una proteína (proteínas de la leche) 4. Se adiciona un anticuerpo a la solución que se une específicamente a la proteína. http://www.virology.ws/wp-content/uploads/2010/07/western_blot.jpg Pasos del Western Blot 4) El anticuerpo se localiza por tinción de este que lo hace visible Southern Blott Northern Blot Método para localizar secuencias de ADN Método para localizar secuencias de ARN Ejemplo de Southern. http://es.wikipedia.org/wiki/Southern_blot SECUENCIACIÓN Secuenciación Métodos y técnicas bioq. para determinar el orden de los nucleótidos de un fragmento de ADN. Utilidad de la Secuenciación PROYECTO GENOMA HUMANO. Investigacione s biológicas. Investigacione s forenses. Desarrollo de la Secuenciación. 30´ método de terminación de cadena: Sanger. 70´ método de punto corrido: Gilbert y Maxam. Secuenciación de ARN. Secuenciación de ADN. Secuenciación automática. MÉTODO SANGER (terminación de la cadena – dexosi) COMPONENTES: Hebra de ADN. Cebador ó primer (marcado) ADN polimerasa ADN Pol I bacteriofago T4 Nucleótidos trifosfato. Nucleótidos dideoxi Proceso: Método Sanger Nucleótidos modificados (didesoxi): ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP. Proceso: Método Sanger 1. 4 tubos: dNTP + ADN polimerasa I + Primer + ddATP dNTP + ADN polimerasa I + Primer + ddGTP dNTP + ADN polimerasa I + Primer + ddCTP dNTP + ADN polimerasa I + Primer + ddTTP dNTP ddNTP Proceso: Método Sanger Proceso: Método Sanger 50 cm Secuenciación Automática El método automático en lugar de radioactividad utiliza fluorescencia Cada dNTP con un fluorocromo distinto Permite leer al mismo tiempo los ADNs de nueva síntesis producto de las cuatro mezclas de reacción. GENÉTICA FORENSE Genética Forense Pruebas biológicas de paternidad Criminalística biológica Identificación humana Investigación Genética Forense Polimorfismos genéticos ó Marcadores genéticos: Se transmiten mendelianamente Diversidad génica en individuos de la misma especie Datos poblacionales de frecuencias alélicas Genética Forense Tasa de mutación baja Analizable con método rápido Antígenos eritrocitarios y leucocitarios Proteínas séricas Enzimas Regiones hipervariables Regiones Hipervariables ADN codificante (30%) proteína No codificante (70%) altamente polimórfico ADN Microsatélite: tienen un tamaño muy pequeño de hasta 400 pb, por lo que son idóneos para la prueba de PCR usada en forense. También se conocen como Short Term Tandem Repeat (STR), ya que la repetición oscila entre 4 a 7 pb. Se encuentran en todo el genoma. Ejemplo: CCTTACTCCTTACTCCTTACTCCTTACTCCTTACT Algunos marcadores utilizados D8S1179 D7S820 THO1 D13S317 VWA TPOX D18S51 FGA Amelogenina Método Toma de sangre (semen, frotis de vagina, saliva, pelos, orina…) Extracción ADN Secuenciación Electroferograma Genotipificación Electroferograma D8S1179 D16S539 D19S433 D18S51 D8S1179 D16S539 D19S433 D18S51 D8S1179 D16S539 D19S433 D18S51 13 14 11 12 14 14 13 14 13 12 14 12 13 18 18 11 18 11 7 14 14 11 14 21 Núcleo Familiar Mutación de STRs “Stepping-stone” STR = 11 STR = 12 STR = 10 Resultado Prueba Forense MINIMO 13 marcadores estudiados confiabilidad del 99,999% Menos de 13 marcadores no se da un dictamen debe repetirse el estudio. Paternidad/Identidad (con mínimo 13 marcadores): “…existe un 0,001% de probabilidad que el señor X no sea el padre de el individuo Y…” EJEMPLO CASO FORENSE INSTRUCCIONES El objetivo del ejercicio es responder las preguntas que van apareciendo; detenerse y pensar antes de seguir. Pasar cada diapositiva lentamente para no perder el objetivo del ejercicio. Escena del crimen En el baño de un Centro Comercial… Se descubre el cuerpo de una joven asiática, con signos de violencia….. Observe la escena detalladamente. ¿Que le llama la atención? La victima no tiene ropa Manchas de sangre en el suelo Hematomas en cuello Como genetista experto en el área forense, su primera deducción es: 1. La joven se suicidó 2. Tuvo un Infarto y falleció súbitamente 3. Fue violada y asesinada por desconocido/s 4. Resbaló en el baño y cayó RECUERDE LA AUSENCIA DE ROPA, LOS HEMATOMAS EN CUELLO Y LAS MANCHAS DE SANGRE EN LA ESCENA. Cerca de la victima se encontró una gorra de béisbol abandonada. Piense un poco Mx. de la sangre encontrada en la escena Mx. Victima: -Sangre - Fondo de saco de vagina Mx Gorra Con los datos anteriores, ¿qué muestras debe tomar de la escena del crimen? ¿Que otras muestras, además de las anteriores (obvias) podrían recogerse de la escena? - Del lecho ungueal de la victima. Recordemos que fue un acto violento; pudo haberse defendido. Con ayuda de la policía, se descubre que la victima fue traída de Japón por una banda de trata de personas. Se logra encontrar en Japón, un tío quien acepta donar una Mx de sangre para comprobar la identidad de la victima. Investigaciones arrojan datos sobre 2 sospechosos quienes fueron vistos con la victima poco antes de su muerte: ¿En que orden de importancia solicitaría estas muestras? - Sangre - Semen - Cabellos - Saliva Primero sangre, luego saliva, seguido de cabello y por ultimo semen. Finalmente obtenemos la Genotipificación para 16 marcadores de: - Sangre de la victima - Fondo de saco de vagina - Posible tío de la victima - Sospechoso No 1 - Sospechoso No 2 - Sangre del piso - Gorra de béisbol El laboratorio de genética forense realizó la genotipificación de todas las muestras, incluyendo una separación diferencial (fracción masculina y femenina) de la muestra de fondo de saco vaginal, la cual se observa en el siguiente cuadro: Nota: la fracción masculina no específica cuantos individuos aportaron a la muestra. Por eso encontraran 3 STRs en algunos marcadores. Marcador Sangre Victima Fracción masculina FSV Fracción femenina FSV Mx Posible Tío Sospechoso No 1 Sospechoso No 2 Sangre en el piso Gorra béisbol D8S1179 8 , 9 10, 13, 14 8 , 9 8 , 9 10 ,13 8, 12 13, 14 NA D7S820 11 , 12 11, 13, 14 11 ,12 12 ,14 13 ,14 16 ,17 11, 11 11 THO1 9.3 , 10 7 , 8 9.3 , 10 6 , 6 6, 7 6 , 6 7, 8 6,7,8 D13S317 14 , 15 11 ,15 14 ,15 12 ,14 15, 15 12 ,13 11, 12 NA VWA 19 , 20 19 ,19 19 , 20 19 ,20 19, 20 7 , 8 18, 19 18,19 TPOX 7 , 9 9 , 9 7 , 9 7 ,8 8, 9 11 ,16 9, 9 9,11,16 D18S51 21 , 22 10,12,14 21 , 22 21 ,20 10, 12 3 , 5 12, 14 12,14 FGA 14 , 16 NA 14 ,16 24 ,28 18, 18.2 23 , 23 23, 24 NA D21S11 29 , 30 NA 29 ,30 28 ,30 36 , 37 30 ,32 23, 24 34, 35 CSF1PO 10 , 11 7, 8, 9 10 ,11 11 ,11 8, 9 6, 7 34, 35 6,7 D3S1358 15 , 17 15 ,15 15 ,17 16 ,16 15, 15 12,12 7, 7 12, 14,15 D16S539 12 , 13 8 , 10 12 ,13 11 ,12 5, 8 2, 3 14, 15 3 D2S1338 11 , 12 5 , 6 11 ,12 8 , 9 5, 6 13, 14 9, 10 NA D19S433 19 , 20 21 , 22 19 , 20 18 , 19 21, 22 19, 20 13, 14 5, 7, 20 D5S818 14 , 16 11 , 12 14 , 16 14 , 16 7, 11 5, 6 11, 12 11, 12 Amelogenina XX XY XX XY XY XY XY XY NA= No amplifica FSV= Fondo de Saco de vagina A partir de los datos, responda: 1. Cuantos marcadores comparten la victima y el “posible tío”? Cual es la probabilidad que el señor sea el tío de la victima. 2. Cuantos individuos, aportaron a la fracción masculina de la muestra de FSV? A partir de los datos, responda: 3. Cuantos individuos aportaron a la muestra de la gorra de beisbol? 4. Cuantos sospechosos cree usted, estuvieron involucrados en el crimen? 5. A quien corresponde la muestra de sangre en el suelo (victima-sospechosos-otro) y porqué? GRACIAS