Universidade de São PauloInstituto de Química Biologia Molecular – QBQ3401 Química-Noturno 2009 Professora: Nadja Cristhina de Souza Pinto Monitores: Carolina Domeniche Romagna Débora da Silva Freitas QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 QBQ-3401 Biologia Molecular Química-Noturno - 2009 DOCENTE RESPONSÁVEL: Prof. Nadja Cristhina de Souza Pinto (sala 1065 − Bloco 10 superior) MONITORES: Carolina D. Romagna (sala 1065 – Bloco 10 superior) Débora da Silva Freitas (sala – Bloco HORÁRIO E SALAS: Aulas Expositivas e Exercícios (Discussão): 6as feiras das 19 às 22:40h - Sala 10 - Bloco 6 inferior Aulas Práticas: 6as feiras das 19 às 22:40h - Laboratório Didático - Bloco 7 superior ORGANIZAÇÃO DO CURSO: O Curso envolve aulas expositivas, períodos para resolução e discussão de exercícios e aulas práticas. Utilizando as informações das aulas expositivas e a bibliografia recomendada, os alunos deverão resolver os exercícios e entregar as resoluções à professora. Os exercícios serão discutidos em sala de aula com acompanhamento da professora e das monitoras. Nas aulas práticas serão realizadas experiências que envolvem algumas técnicas básicas utilizadas em Biologia Molecular. Os alunos serão divididos em grupos e cada grupo deverá apresentar um RELATÓRIO contendo os resultados obtidos e a resolução das questões correspondentes. Só serão aceitos relatórios de alunos que realizaram as aulas práticas. POR RAZÕES DE SEGURANÇA, O USO DO AVENTAL NAS AULAS PRÁTICAS É OBRIGATÓRIO. AVALIAÇÃO: A avaliação será feita através da média ponderada das notas obtidas nas duas provas (P1, P2), nos quatro relatórios (R) e nos exercícios (E), de acordo com a fórmula abaixo: Nota final= (P1 x 2) + (P2 x 2) + (média dos 4 relatórios)+ (média dos exercícios) 6 A matéria das provas será CUMULATIVA. No final do curso, será oferecida uma prova substitutiva para alunos que tenham sido impossibilitados de fazer uma das provas por motivo de doença, que incluirá toda a matéria do curso. Um atestado médico deverá ser entregue neste caso. O peso da prova substitutiva será igual ao da prova perdida. Os alunos que não atingirem Nota Final ≥ 5,0, porém atingirem ≥ 3,0 e 75% de frequência poderão realizar a prova de recuperação, que será administrada em fevereiro 2010. A FREQUÊNCIA OBRIGATÓRIA MINÍMA ÀS AULAS É DE 75%. 2 QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 CRONOGRAMA QBQ-3401 21/8 28/8 04/9 11/9 18/09 25/09 02/10 09/10 16/10 23/10 30/10 06/11 13/11 20/11 27/11 04/12 11/12 Aula1 - Introdução à Biologia Molecular. Estrutura e Função dos Ácidos Nucléicos. Exercício 1 Aula 2 - Replicação do DNA. Exercício 2 Experiência 1: Extração de DNA de E. coli Aula 3 - Mutação e Reparo de DNA. Exercício 3 Aula 4 - Estrutura gênica e Transcrição. Exercício 4 Experiência 2: Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detecção de genes Aula 5 - Código Genético. Exercício 5 Prova 1 Aula 6 - Processamento do RNA e Tradução/Síntese de Proteínas. Exercício 6 Aula 7 - Regulação da Expressão Gênica. Exercício 7 Experiência 3: Transformação de bactérias com plasmídeos Aula 8 - Transdução de Sinal e Câncer. Exercício 8 Aula 9 - Tecnologia do DNA recombinante. Exercício 9 CONSCIÊNCIA NEGRA– Não haverá aula Experiência 4: Indução de Beta-galactosidase com IPTG Prova 2 Prova substitutiva BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA: Inglês: • Biochemistry - D. Voet & J.G. Voet - John Wiley & Sons – 3rd edition. 2004. • Biochemistry – J. M. Berg, J.L. Tymoczko & L. Stryer. W.H.Freeman – 6th edition - 2006. • Genes IX – Lewis, B. Jones & Bartlett Publishers; 9th edition. 2007 • Lehninger Principles of Biochemistry - D.L. Nelson & M.M. Cox. Worth Publishers 4th edition – 2004. • Molecular Biology of the Gene. James D. Watson, Nancy H. Hopkins, Jeffrey W. Roberts, Joan Argetsinger Steitz ,Alan M. Weiner. 5th Edition - 2003 Português: • Bases Moleculares da Biotecnologia. A.H.Ulrich, W. Coli; P.L.Ho;M. Faria;C.A. Trujillo. Editora Roca.1° Edição. 2008 • Biologia Molecular Básica – A. Zaha. Editora Mercado Aberto. - 3a edição. 2003 • Biologia Molecular do Gene. James D. Watson, Nancy H. Hopkins, Jeffrey W. Roberts, Joan Argetsinger Steitz ,Alan M. Weiner. Editora Artmed. 5a edição. 2006 • Bioquímica - L. Stryer - Editora Guanabara Koogan - 5a edição. - 2004. • Fundamentos de Bioquímica – D. Voet, J. G. Voet & C. W. Pratt – Editora Artmed. 3a edição. 2006. • Princípios de Bioquímica - A.L. Lehninger, D.L. Nelson & M.M. Cox. Editora Sarvier -4a edição. 2007. 3 QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 Exercícios 4 Como se distingue entre uracila e timina.É uma molécula única . Por que? 3.8m.6% A = 32. Uma molécula de ácido nucleico tem a composição de bases abaixo.Pode ter tamanho superior a 100 Mb 8. Calcular o Tm para o DNA desta bactéria.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 Exercício 1. . O núcleo de uma célula humana tem 6µm de diâmetro e a extensão total do DNA dos seus 46 cromossomos soma 1. O valor de Tm para o DNA pode ser calculado usando-se a fórmula: Tm = 69. Como é resolvida a discrepância entre estas duas grandezas? 5 .Escreva a seqüência de bases da fita complementar do DNA dupla fita que apresenta uma fita com a seqüência: (5') ATGCCGTATGCATTGCATTC (3') Exprima. b) As curvas de fusão da maioria dos DNAs que ocorrem naturalmente revelam que o Tm é normalmente maior do que 65oC. a composição de bases do DNA de fita dupla.3 + 0. Por que isto é importante para a maioria dos organismos? c) Como varia o Tm com a força iônica da solução? d) O que acontece com Tm quando se adiciona etanol à solução de DNA? 7. Estrutura e Função dos Ácidos Nucleicos 1. onde GC é a porcentagem de Guanina + Citosina a) DNA de E.É linear e não ramificado . RNA é facilmente hidrolizado por álcali. Explique por que ácidos nucleicos são desnaturados quando submetidos a alta temperatura ou pHs extremos? Uma molécula de DNA desnaturada por aquecimento pode ser renaturada? Como? 6.Quais as diferenças de composição e estrutura entre RNA e DNA.É resistente à quebra durante a extração por seu grande tamanho. em porcentagem. Quais das seguintes afirmações sobre o DNA isolado de um cromossomo eucariótico são corretas? . e entre ribose e desoxirribose? 2.8% 5. coli contém 50% GC. 4. O que você pode afirmar sobre esta molécula? C = 24.5% T = 24. enquanto DNA não o é.1% G = 18.41(%GC). Explique porque certas variedades mutantes da DNA polimerase I podem apresentar atividade de DNA polimerase praticamente ausente. porém de fita simples no meio. mostrando o grupo fosfato que é incorporado. Qual seria o resultado deste experimento se a replicação do DNA fosse conservativa? 3.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 Exercício 2. 5'____________________________3' __________P HO_________ a) O fosfato (P) indicado na fita inferior está na extremidade 5' ou 3' do fragmento ao qual ele pertence ? (Indique no esquema).4 pares de bases por volta (7) Tem a estrutura similar àquela do RNA de fita dupla (8) As fitas na hélice são anti-paralelas 2. na presença de todos os desoxirribonucleotídeos-trifosfato e DNA polimerase. Combine as características da coluna da direita com o tipo de hélice do DNA da coluna da esquerda (a) A-DNA (b) B DNA (c) Z-DNA (1) As pirimidinas estão na configuração anti (2) Os fosfatos na cadeia estão em ziguezague (3) A sua formação é favorecida por superenovelamento negativo (4) Apresenta um sulco maior relativamente largo e profundo (5) Apresenta uma estrutura helicoidal no sentido dextrógiro (6) Tem 10. Que propriedades do DNA e da DNA polimerase sugerem que a duas fitas não podem ser replicadas pelo crescimento no mesmo sentido (como mostra a figura abaixo)? Como a célula supera o problema? Esquematize a formação da ligação fosfodiester durante a replicação a partir do nucleotídeo trifosfato livre. As extremidades da fita superior estão indicadas. mas podem ter atividade de exonuclease 5' → 3' praticamente normal. b) Como você esperaria que a lacuna fosse preenchida pelos processos de reparo do DNA "in vivo" ? c) Quantos fragmentos você esperaria encontrar na fita inferior se o experimento fosse realizado "in vitro". 6. Qual a atividade da DNA polimerase III que é responsável pela editoração durante a replicação? Por que essa atividade é importante? 7. Combine as propriedades ou funções na coluna à direita com a DNA polimerase na coluna da esquerda: (a) DNA polimerase I (1) envolvida na replicação (b) DNA polimerase II (2) requer um iniciador e um molde (c) DNA polimerase III (3) envolvida no reparo de DNA (4) sintetiza a maior parte do DNA durante a replicação (5) remove o iniciador e preenche as lacunas durante a replicação 4. Replicação do DNA 1. O fragmento de DNA no esquema abaixo é de fita dupla em ambas as extremidades. Descreva o experimento de Meselson-Stahl. 6 . mas na ausência de DNA ligase? 5. b) Quais as características da DNA polimerase utilizada? Porque essas características são fundamentais ao desenvolvimento dessa técnica? c) Exemplifique aplicações desta técnica.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 8. A técnica de PCR (polymerase chain reaction) é utilizada para obter grandes quantidades de DNA a partir de amostras contendo quantidades ínfimas de DNA. a) Descreva os passos envolvidos nesta técnica. 7 . Que propriedade da DNA polimerase I é responsável pela observação de que bactérias mutantes polA1 são mais sensíveis à luz ultravioleta ? Explique. Por que a taxa de mutacao observada em E. distantes vários nucleotídeos da primeira mutação.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 Exercício 3. enquanto aquelas causadas por bromouracila geralmente requerem mudanças dentro do mesmo codon. 3.coli é de 10-8 a 10-10 / par de bases replicado. Mutação e Reparo do DNA 1. 6. enquanto acridina causa adições ou deleções de uma base no DNA. Bromouracila é um mutagênico que produz troca de bases. 8. Como a maquinaria de reparo de E. Como os dímeros de timina podem ser diretamente removidos do DNA? 4. Por que extrato de fígado de mamífero está envolvido no teste? 7. Mutações causadas por acridina frequentemente podem ser compensadas por mutações secundárias. Quais os principais tipos de reparo de excisão e qual a especificidade de lesões de cada via? 2. apesar das taxas de erro da Pol I e Pol III serem de 10-6 a 10-7 /par de bases replicado? 8 . Explique. coli identifica a fita de DNA que tem um nucleotídeo não complementar incorporado durante a replicação? 5. Explique como algumas cepas da bactéria Salmonella são usadas para detectar substâncias carcinogênicas. Descreva brevemente as etapas de reparo do DNA lesado por luz UV e as enzimas nelas envolvidas. ao qual se liga um novo nucleotídeo para o crescimento da cadeia polinucleotídica. Estrutura gênica e Transcrição 1.ATGTACCGAAGTGGTTT . Você usaria num paciente. 2. enumere as suas propriedades e diga como podem ser localizados através da técnica de "footprinting". 4. Estas seqüências são tanto transcritas como traduzidas? A remoção dos íntrons (splicing) tem que ser um processo extremamente preciso. coli resistente ao antibiótico rifamicina. Genes de eucariotos são geralmente constituídos de introns e exons. 6. É necessário um iniciador para a ação da RNA polimerase? 3. As DNA polimerases necessitam de um iniciador. como agente terapêutico anti-bacteriano. Combine as descrições na coluna da direita com a RNA pol DNA-dependente eucariótica apropriada: a) RNA pol I (1) localizada no nucléolo (2) localizada no nucleoplasma (3) sintetiza hnRNA b) RNA pol II (4) sintetiza tRNA (5) sintetiza rRNA (6) sintetiza precursores do rRNA c) RNA pol III (7) inibida por α-amanitina (8) sintetiza RNA na direção 5'-3' (9) composta de várias subunidades 7. Quais as principais características das seqüências de promotores de genes eucarióticos transcritos em mRNAs? Qual a função dos fatores de transcrição e “enhancers”? 9 . 8.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 Exercício 4. Defina "promotor". qual destes antibióticos: a) rifamicina ou b) actinomicina D ? Justifique a sua escolha. A seguinte fita simples de DNA vai se transcrita in vitro: 5'. Que subunidades da RNA polimerase bacteriana são necessárias para a iniciação da transcrição a partir de um promotor? E para a terminação da transcrição? Explique como uma mutação poderia dar origem a uma E.3' Coloque os grupos fosfato e um asterisco naqueles que serão radiativos quando a transcrição for feita 32 na presença de [γ P]-ATP (a?) 32 b) Faça o mesmo para [α P]-UTP 5. Por que? Dê um exemplo de "splicing" aberrante que leva a um tipo de talassemia em humanos. A análise do DNA indicou uma mudança de TTC para TAC na fita molde. c) A alteração de um único nucleotídeo no DNA que dirige a síntese destes códons necessariamente levaria à substituição de um aminoácido no polipeptídeo codificado. Selecione uma das opções abaixo e explique o porquê de suas escolhas: fita codificadora de DNA ___________________________________________________ fita complementar ou fita molde de DNA ___________________________________________________ fita de mRNA ___________________________________________________ fita de tRNA (anticódon para Metionina) 2. 5. quais das seguintes afirmações são corretas? AGU = serina AGC = serina AAG = lisina AAA = lisina AUG = metionina AUA = isoleucina a) O código genético é degenerado b) A alteração de um único nucleotídeo no DNA que dirige a síntese destes códons poderia levar à substituição de uma isoleucina por uma lisina no polipeptídeo. Uma globina de 146 aminoácidos sofreu uma mutação no códon correspondente ao sexto aminoácido da cadeia (ver tabela ao final do exercício). Baseando-se na lista de códons e amino ácidos abaixo. Faça um x no ácido nucleico (pode ser mais de um) que corresponde aos conceitos abaixo: código genético ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA códon ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA anti-códon ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA moldura de leitura ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA 3.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 Exercício 5: O Código Genético 1.se: 10 . Qual? Olhando a tabela ao final deste exercício faça a previsão do anti-códon para terminação da tradução e a seqüência das bases correspondentes no DNA codificador . da esquerda para a direita. Um tRNA com o anticódon ACU se ligaria a um ribossomo na presença de um dos códons da questão 3. indique as pontas 5' e 3' em cada uma das fitas. 4. Pergunta. No desenho abaixo. ..3' (c) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGUCGCUGUAUACU. 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGUGGCUUGUAACU. Qual o número de aminoácidos na proteína resultante da transcrição desta seqüência? Explique porque. Abaixo está anotado o gene completo da insulina como se encontra no Banco de dados NCBI.3' Qual é a sequência do polipeptídeo que seria codificado pelo mRNA sintetizado na questão 3 (não intendi!).3' (a) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGGGGCUUGUAACU.3' (b) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCAUGGCUUGUAACU. Uma fita de um fragmento de DNA isolado de E. o que levará à produção de diferentes RNAs mensageiros. O gene de uma proteína. Assuma que o quadro de leitura começa com o primeiro nucleotídeo. coli tem a seguinte sequência 5'. 1 gctgcatcag aagaggccat caagcacatc actgtccttc tgccatggcc ctgtggatgc 61 gcctcctgcc cctgctggcg ctgctggccc tctggggacc tgacccagcc gcagcctttg 121 tgaaccaaca cctgtgcggc tcacacctgg tggaagctct ctacctagtg tgcggggaac 181 gaggcttctt ctacacaccc aagacccgcc gggaggcaga ggacctgcag gtggggcagg 241 tggagctggg cgggggccct ggtgcaggca gcctgcagcc cttggccctg gaggggtccc 301 tgcagaagcg tggcattgtg gaacaatgct gtaccagcat ctgctccctc taccagctgg 361 agaactactg caactagacg cagcccgcag gcagcccccc acccgccgcc tcctgcaccg 421 agagagatgg aataaagccc ttgaaccagc 8. quais são estes aminoácidos? b) Quais as implicações para a estrutura da proteína? 6...3' (d) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGUUGGCUUGUAACU...... sofreu uma série de mutações pontuais independentes.. há um número que denota a primeira base da fila e as bases estão separadas por um espaço colocado a cada 10 bases.3' 11 ... 7.. cuja seqüência parcial está indicada abaixo..QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 a) A mutação provocou a troca de um aminoácido por outro? Em caso afirmativo. O códon de iniciação e o códon de terminação estão sublinhados e em negrito.. Para facilitar a leitura e a contagem....AGGTTACCTAGTTGC. Indique a seqüência de aminoácidos do peptídeo correspondente (a tabela se encontra no fim dos exercícios) e explique a conseqüência do tipo de mutação que ocorreu em cada um dos RNAs resultantes..... QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 12 . Escreva os produtos finais das seguintes reações: a) valina + ATP + tRNAVal + valil-tRNA sintetase b) valina + ATP + tRNAIle + isoleucil-tRNA sintetase 6. Síntese de proteínas 1. qual seria a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo produzido quando um mRNA transcrito deste gene for traduzido? Que características na seqüência do mRNA determinam qual é o códon iniciador? Considere a primeira base como o início da transcrição. No que consiste a sequência de Shine Dalgarno? Ela é universal? Explique. Considere a seguinte sequência de um fragmento de DNA isolado de bactéria: 5'CTGATAAGGGATTTAAATTATGTGTCAATCACGAATGCTAATCGCTTAACACTTC 3' a) Assumindo que esta seqüência corresponde à seqüência da fita codificadora. 5. CUC. que permita o início e término da síntese em qualquer seqüência de RNA. CUU. que peptídeo seria produzido pelo poli-ribonucleotídeo 5'-UUUGUUUUUGUU-3'? Indique qual o aminoácido N-terminal e o C-terminal do polipeptídeo obtido. UUG. 3. 2. Quais eventos podem acontecer com uma proteína depois de terminada sua síntese? 13 . Quais os mecanismos de seleção do códon AUG para a iniciação da tradução em procariotos? 4. O códon AUG funciona tanto para iniciar uma cadeia polipeptídica quanto para dirigir a incorporação de uma metionina em posições internas de uma proteína. Num sistema de síntese de proteínas in vitro. O que se entende por chaperona? 8.UUA. Explique quais são os mecanismos de ação dos antibióticos que agem na célula procariótica.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 Exercícios 6. Se muitos antibióticos exercem sua ação por inibição da síntese protéica. como alguns destes antibióticos podem ser usados em humanos para combater infecções microbianas sem causar efeitos tóxicos devido à inibição da síntese protéica eucariótica? 7. CUA e CUG ? Explique. qual o número mínimo de tRNAs necessário para decodificar os seis códons de leucina . b) De acordo com o princípio de oscilação no pareamento de bases ("wobble"). gene regulador. os genes de globina de adultos foram seletivamente destruídos. indutor. c) número de proteínas resultantes da tradução de um transcrito primário. promotor. coli do tipo selvagem. Compare a expressão gênica em procariotos e eucariotos quanto a: a) grau de acoplamento da transcrição e da tradução.coli utilizaram-se meios contendo além dos sais necessários. Numa cultura de E. O que pode ser afirmado sobre a seqüência de aminoácidos do peptídeo líder para este operon? Explique. d) proporção de seqüências codificadoras no DNA. foi isolado de uma cultura de E. 5. b) número de produtos gênicos em um transcrito primário. qual dos açúcares é metabolizado preferencialmente? Qual é o mecanismo que permite esta seletividade? O que acontece quando a glicose se esgota durante o crescimento da bactéria? 4. Quando núcleos de células de galinha produzindo globina foram tratados brevemente com DNase pancreática. Use o esquema proposto por Jacob e Monod para o operon da lactose e defina os termos operon. além de diversas outras fontes de carbono. e) organização de genes em operons. os componentes: a) lactose d) glicose + cAMP b) lactose + glicose e) lactose + glicose + cAMP c) glicose Analise a produção de β. Compare expressão gênica induzida com repressão gênica. A cromatina que é ativa transcricionalmente (eucromatina) tem estrutura dispersa. 8. 2. 3. Regulação da Expressão Gênica 1. Explique estes resultados. Quando os núcleos de células de oviduto foram tratadas com DNase. Qual o efeito da deleção do gene regulador do operon lac? Haveria outro tipo de mutação resultando no mesmo efeito? 6. gene estrutural. 14 . Que tipo de mutação pode ter produzido estes resultados? 7. enquanto a cromatina que é inativa (heterocromatina) é compacta.galactosidase em cada caso. Demonstrou-se que o operon para a biossíntese do aminoácido fenilalanina de certa bactéria é regulado por um mecanismo de atenuação. Para o cultivo de E. repressor e co-repressor. operador. justificando a resposta segundo o modelo de Jacob e Monod. Defina expressão gênica constitutiva.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 Exercício 7. mas os genes para globina embriônica e ovalbumina permaneceram intactos. Um mutante incapaz de crescer tanto em galactose quanto em arabinose.coli em um meio contendo tanto lactose quanto glicose. os genes de ovalbumina foram destruídos. Como a transcrição de certos genes pode ser influenciada em resposta a um sinal extracelular? 7 A predisposição ao câncer pode ser hereditária. Proponha uma possível função para o gene selvagem (Rb) e que codifica uma proteína de 105 kD localizada no núcleo e capaz de se ligar ao DNA. está asssociado a uma deleção no cromossomo 13. Transdução de Sinal e Câncer 1. Explique este fato lembrando-se que existem proteínas que agem como supressores do crescimento celular. cuja atividade é regulada por fosforilação. 8. um câncer de retina que aflige crianças. A proteína c-src é homóloga à proteína viral oncogênica conhecida com v-src e atua como tirosina quinase citossólica. O que são protooncogenes e oncogenes? Que tipos de proteínas estes genes podem codificar? 3. Qual o tipo de modificação covalente reversível em proteínas mais frequente nas cascatas de sinalização intracelular? Quais são as enzimas que catalisam esta modificação? 5. Descreva o mecanismo de ativação: a. das Proteínas G pelos receptores serpentina b. 4.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 Exercício 8. Como pode ocorrer a ativação da enzima adenilato ciclase após ativação de um receptor hormonal? 6. Retinoblastoma. O cAMP (AMP cíclico) é um importante mensageiro secundário para muitos hormônios. Qual a característica de v-src que a torna uma proteína oncogênica. 15 . da Proteína Quinase A por cAMP 2. coli. Como se pode resolver este problema? 5. A partir de uma biblioteca de cDNA você isolou um cDNA completo que codifica para uma proteína que é um potente estimulador do sistema imunológico. Agora você deseja clonar este cDNA em um vetor de expressão para produzir grande quantidade desta proteína em E.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 Exercício 9. Você gostaria de analisar os níveis de expressão do gene que codifica a proteína A de um fungo em resposta ao estresse hipertérmico. se você quiser analisar simultaneamente os níveis de expressão de milhares de genes deste fungo na mesma condição. considerando as três fases de leitura. a) Por que deve ser feito o tratamento com fosfatase alcalina? b) Como você analisaria se a clonagem foi bem sucedida? c) A proteína de seu interesse afeta o crescimento das bactérias. Traduza a seqüência obtida. O cDNA possui nas suas extremidades sítios para enzima BamHI e você planeja cloná-lo no sítio de BamHI do vetor de expressão. Que metodologias poderia utilizar? Por outro lado. Como você faria para obter grande quantidade desta proteína recombinante? 16 . Tecnologia do DNA recombinante 1. qual seria a metodologia mais adequada? 4. O que aconteceria se durante a leitura do gel você tivesse omitido uma base? Como você faria para ter segurança absoluta da seqüência deste fragmento de DNA? 2. O que a diferencia a técnica de Southern blot da técnica de Northern blot? 3. Esta é sua primeira vez com experimentos de clonagem e você decide seguir cuidadosamente as instruções do manual de clonagem que recomenda que o vetor digerido deve ser tratado com fosfatase alcalina para remover o fosfato da extremidade 5’. A figura na página seguinte mostra o autorradiograma de um gel de sequenciamento de DNA pelo método de Sanger. Qual a diferença entre uma biblioteca genômica e uma biblioteca de cDNA? Explique como a presença de íntrons em genes eucarióticos complica a geração de produtos protéicos que eles codificam quando a expressão é feita em bactéria. Escreva a seqüência deste fragmento de DNA lendo o gel de baixo para cima. QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 G A T C 17 . QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 6. a partir de células de uma ovelha adulta. O gene completo (contendo todos os exons e íntrons) do hormônio de crescimento de ratos pode ser expresso em camundongos sob o controle de um promotor indutível por Cd2+. 8. cientistas europeus realizaram a clonagem de uma ovelha (Dolly). Compare este tipo de experiência com a obtenção de um animal transgênico. Há poucos anos. Como podem ser obtidos tais camundongos transgênicos? Quais as suas características? Como você explica o fato da expressão do gene do rato ser expresso perfeitamente em camundongos? 7. 18 . Planeje a obtenção de cabras transgênicas que possam produzir o hormônio de crescimento humano em seu leite. QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 ROTEIRO PARA AS AULAS PRÁTICAS 19 . O relatório individual deverá ser entregue no final de cada uma das aulas práticas. 4. 20 .QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 ROTEIRO PARA AULAS PRÁTICAS RECOMENDAÇÕES: 1. 3. para evitar desperdício e quebra. 5. Ao terminar a experiência passe água na vidraria utilizada e coloque-a no local indicado. Após preenchidas. Por razões de segurança não será permitido ao aluno frequentar as aulas sem avental. 6. vidraria e equipamentos disponíveis com cuidado. É PROIBIDO COMER. O relatório deverá ser feito de acordo com modelo ao final de cada protocolo experimental. Leia com detalhe o protocolo e preste atenção às instruções fornecidas antes de iniciar a experiência. BEBER E FUMAR NO LABORATÓRIO. 2. Procure utilizar reagentes. Mantenha sua área de trabalho organizada. Qualquer dúvida ou acidente peça auxílio às técnicas. USO DO AVENTAL NAS AULAS PRÁTICAS É OBRIGATÓRIO. às monitoras ou à professora. as respectivas folhas devem ser destacadas e entregues. 5 com NaOH) e mantida sob agitação vigorosa a 37°C até hoje pela manhã. 1. extrato de levedura 0. Secar bem o tubo. abrir e deixá-lo a temperatura ambiente por 5min. Material . 3. Remover a tampa e adicionar 0.coli HB101 que foi inoculada ontem no final da tarde em meio de cultura líquido esterilizado (meio LB: triptona 1%. Esta etapa deve ser realizada na capela de exaustão. 4. Tampar o tubo e ressuspender o precipitado de bactérias por inversão. seguida de extrações com solventes orgânicos (fenol/clorofórmio) para remoção de proteínas. Agitar suavemente por 10 min à temperatura ambiente.5%. Retirar o tubo do banho. com agitação manual suave. Procedimentos mais comuns para preparação de DNA genômico bacteriano consistem na lise das bactérias com a utilização de lisozima e/ou detergente.0 com HCl). Fechar o tubo e incubá-lo em banho-maria a 60°C por 10 min.7mL) da solução III (Clorofórmio:alcool isoamílico 24:1 V/V).015M. Coletar as bactérias pela centrifugação de 20mL da cultura a 5000rpm por 5 min. Adicionar igual volume (6. Descartar o meio de cultura em um frasco contendo Lisoform a 10 %.15M.1M – 0.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 EXPERIÊNCIA No. invertendo-o sobre papel absorvente. pH final ajustado para 7.1: EXTRAÇÃO DE DNA (E RNA) DE Escherichia coli. Adicionar 6mL da solução I (citrato de sódio 0. Na obtenção de DNA de alto peso molecular (molécula longa e fibrosa) devem ser tomados cuidados para se evitar sua fragmentação. NaCl 1%. quando a cultura foi transferida para a geladeira. NaCl 0. Os ácidos nucléicos são então precipitados com etanol na presença de concentrações relativamente altas de sal (0.1 frasco de Etanol no freezer -20 °C Procedimento Experimental Será utilizada uma cultura de bactérias E.5M). Fundamento Freqüentemente é necessária a purificação de DNA de alto peso molecular para sua manipulação e análise subsequentes. pH final ajustado para 7. 21 . Não pipetar com a boca! Fechar muito bem o tubo.7mL da solução II [Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) 10% (m/V)]. Balancear os tubos! 2.2 Tubos de ensaio médio - 1 Proveta de 50 mL - 1 cálice graduado - 1 bastão de vidro - 1 tubo de centrifuga - 1 recipiente de descarte c/ lisoforme - 10 mL de SDS 10% - 10 mL de NaCl 1% - 1 frasco de Clorofórmio c/ Álcool Isoamílico na Capela . Tomar uma alíquota e diluir em 1 mL de água.O. 7. Medir. Aquecer a 50oC.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 5.O. até completa dissolução. Remover delicadamente a fase aquosa (fase superior) com pipeta Pasteur de ponta grossa para uma proveta.280nm. 9.O. 6. "Enrolar" o DNA com uma pipeta Pasteur de ponta curva.260nm e D. 8. Centrifugar 5 minutos a 5000 rpm.O. Medir a D.260nm /D.O. por 10-20 minutos. Estimar a quantidade de DNA obtida assumindo que D. na mesma proveta.260nm (Densidade Óptica a 260nm) = 1 equivale a 50µg DNA/mL. 2 volumes de etanol resfriado a -20°C e adicioná-lo lentamente com pipeta Pasteur. Transferí-lo para um tubo de ensaio contendo 10mL de Solução IV (NaCl 1%). 22 .280nm e calcular a relação D. Identificar o tubo com o número do grupo. Estimar o volume e transferir para um cálice graduado. pela parede do cálice. Nomes dos Integrantes do Grupo: Data OBJETIVO DA EXPERIÊNCIA:_________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ RESULTADOS OBTIDOS :_____________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ 23 .EXPERIÊNCIA No.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 RELATÓRIO .1 Grupo No. 2. Por que é possível "enrolar" o DNA no bastão de vidro? 3.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 QUESTÕES: 1. o que observaríamos? Por que? 24 . 4. Qual a função do SDS. Se compararmos as medidas de absorção a 260nm e a 280nm da amostra de DNA obtida e de uma solução de DNA puro obtido a partir do mesmo volume inicial de cultura de bactérias. Cite dois cuidados importantes para o sucesso da experiência realizada. Clorofórmio: Álcool Isoamílico e Etanol nas etapas da purificação? Consultar tabela (no fim da apostila). Por que ocorre o efeito hipercrômico na desnaturação do DNA? 25 . Como você faria para obter DNA puro a partir dessa preparação que contém DNA e RNA? 7. Qual o espectro de absorção do DNA na luz ultravioleta.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 5. Como se compara com o espectro de absorção de albumina? 6. Várias técnicas são disponíveis para transformar uma bactéria. coli que normalmente é sensível tanto à ampicilina como à tetraciclina.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 EXPERIÊNCIA No. Transformação de bactérias que são sensíveis a um antibiótico. leva ao aparecimento de bactérias capazes de crescer em meio (líquido ou sólido) contendo estes antibióticos. ou seja. em resistentes. Usaremos o plasmídeo pBR322 (ver mapa abaixo). Procedimento Experimental 26 . Fundamento A técnica de transformação permite a introdução de plasmídeo em uma bactéria e sua manutenção como um elemento autônomo auto-replicativo. genes que codificam para proteínas que conferem resistência a ampicilina (ampr) e tetraciclina (tetr). Portanto a introdução de pBR322 em E. Da mesma forma. 2: TRANSFORMAÇÃO DE BACTÉRIAS COM PLASMÍDEOS CONTENDO GENES DE RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS. Note que a introdução de genes exógenos no sítio da enzima de restrição Pst I leva à perda da resistência à ampicilina. uma vez que este sítio está localizado na região ampr. coli) o pBR322 apresenta duas marcas genéticas. resistência a drogas) que podem ter valor seletivo no meio. Este plasmídeo pode conferir à bactéria hospedeira certas propriedades (por exemplo. Além da origem de replicação que permite sua propagação em bactérias (E. Na aula prática usaremos o método do CaCl2. será revelada através de plaqueamento (inoculação) de bactérias em placas de ágar contendo meio LB (meio rico de Luria Bertani) na ausência e na presença de antibióticos (ampicilina ou tetraciclina). Neste método as bactérias são submetidas a um tratamento num meio hipotônico contendo cálcio que as torna competentes para a transformação pelo DNA plasmidial. O plasmídio pBR322 é comumente usado para clonagem de genes inteiros ou de fragmentos de genes. clonagem no sítio da enzima Bam HI leva à perda da resistência a tetraciclina. 1 mL/tubo da suspensão de bactérias competentes para cada um de 2 tubos. 9. 3. 4. NÃO ABRA AS PLACAS DE ÁGAR ATÉ O MOMENTO DE USO. Transferir 25µl ou 250µl da suspensão para placas de ágar LB e LB-A (LB contendo ampicilina ou carbenicilina) previamente identificadas conforme a tabela abaixo. Transferir os tubos novamente para o gelo por 2 min. 5 min) e ressuspender em 1 ml do mesmo tampão (frio). Incubar em gelo por 15 min antes de dar o choque térmico (42°C por exatamente 90 segundos). Diluir a pré-cultura 1/10 em 10 ml de meio LB. coletar as bactérias por centrifugação (4000 rpm.5 contendo CaCl2 0. incubar à 37°C sob agitação até OD600nm =0. 8.1M. Após pelo menos 30 min no gelo estas BACTÉRIAS COMPETENTES podem ser transformadas. para evitar contaminação. As bactérias competentes para transformação foram preparadas a partir de uma cultura em fase exponencial do crescimento e através de sucessivas lavagens do precipitado de bactérias com uma solução de CaCl2 e mantidas congelads a -80oC. Incubar no gelo por 20 minutos. Número de colônias/ placa #1 Bactérias controle 25µL #2 Bactérias controle 250µL Placa LB #3 Bactérias transformadas 25µL #4 Bactérias transformadas 250µL 27 Placa LB-A . Ressuspender o sedimento de bactérias em 10 ml de tampão acetato de sódio (frio) 20 mM pH 6. Incubar as placas por __ h e contar as colônias formadas. 7. Como isto não será possível. Inocular 5 ml de meio LB líquido com uma colônia de bactérias HB101 (E. Coletar as bactérias (4000 rpm. 6. O outro tubo será usado como controle (bactéria apenas).3 (fase logarítmica de crescimento). coli) e incubar à 37°C até o dia seguinte sob forte agitação (200-250 rpm). 2. Transferir a cultura para o gelo. 1. manipule convenientemente o material estéril fornecido. Adicionar o DNA transformante (0. por uma hora. Espalhar as bactérias com o auxílio de uma alça de vidro.5 µg DNA de pBR322 em 10 µl de tampão 10 mM Tris pH 7. Para transformar. Adicionar 0. em banho-maria.9 ml/tubo de meio LB e incubar a 37°C sem agitação. 5.5 contendo 1 mM EDTA) a um dos tubos. 5min).QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 O ideal seria fazermos a experiência em condições estéreis. previamente flambada e em seguida resfriada na própria tampa da placa de Petri. 10. distribuir 0. Data OBJETIVO DA EXPERIÊNCIA:________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ RESULTADOS OBTIDOS: 1. em termos de n° de colônias/ug de DNA? _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ 28 .2 Nome: Grupo No. Número de colônias/ placa Placa LB Placa LB-A #1 Bactérias controle 25µL #2 Bactérias controle 250µL #3 Bactérias transformadas 25µL #4 Bactérias transformadas 250µL 2.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 RELATÓRIO . Qual a eficiência de transformação obtida.EXPERIÊNCIA No. Preencher a tabela com o número de colônias obtido em cada caso. 29 . Por que se usa cultura em fase exponencial de crescimento para obter bactérias competentes? 2. Qual o papel do choque térmico? 3. Por que as bactérias devem ser incubadas por 60 min a 37°C antes de espalhá-las em placas de ágar? 4.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 Nome: QUESTÕES: 1. Que utilidade teria esta técnica do ponto de vista biotecnológico? Dê um exemplo. coli é uma enzima indutível que hidrolisa β-D-galactosídeos. Retirar 0µL. mas na presença de β-galactosidase é convertido a galactose e orto-nitrofenol. Complete com água para um volume final de 100µL. 50µL e 100µL de cada cultura.7mL de tampão de ensaio (tampão fosfato de sódio 0.7. transferindo separadamente para 3 tubos Eppendorf previamente identificados. O orto-nitrofenol é amarelo e sua absorção pode ser medida a 420nm. Adicionar 50 µL de cloroformio.1M pH 7.E. Incubar os tubos em banho de água a 30oC por 5 min. Fundamento A β-galactosidase de E.coli CSH23 que foi semeada ontem no final da tarde em meio de cultura líquido esteril e mantida até hoje pela manhã. 3. 1. Adicione 0.0 contendo KCl 10mM. o IPTG (isopropil-tiogalactosídeo). A atividade desta enzima pode ser medida com substratos cromogênicos que quando hidrolisados dão origem a produtos coloridos. Agitar bem. Um exemplo é o orto-nitrofenil-β-D-galactosídeo (ONPG) que é incolor. Tomar uma alíquota da pré-cultura de bactérias e diluir em meio líquido na presença e ausência de IPTG (1mM) sob agitação vigorosa a 37°C até a cultura atingir D. 2. MgSO4 1mM e βmercaptoetanol 50mM). Esfrie as culturas no gelo por 20 min. -IPTG +IPTG - 50µ µl 100µ µl 50µ µl 100µ µl H2O 100µ µl 50µ µl - 50µ µl - T. Procedimento Experimental Será utilizada uma pré-cultura de bactérias E. 700µ µl 700µ µl 700µ µl 700µ µl 700µ µl Clorofórmio 50µ µl 50µ µl 50µ µl 50µ µl 50µ µl Cultura 30 . Altos níveis de β-galactosidase só são medidos em culturas crescendo na presença de lactose ou de um indutor não metabolizável.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 EXPERIÊNCIA No.O.600nm (Densidade Óptica a 600nm) = 0.3: INDUÇÃO DA β-GALAGTOSIDASE POR IPTG. mantendo-as no gelo. quando a cultura foi transferida para geladeira. Não descarte o restante das culturas. 9. Centrifuguar os tubos por 5 minutos na minicentrífuga. 5. Remover delicadamente o sobrenadante de cada tubo para a cubeta sem retirar o clorofórmio.O. 6.4mL de Na2CO3 1M.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 4. Interromper a reação adicionando 0. Enxaguar as cubetas com água entre a cada leitura. e faça a leitura da D.3 31 . 7.EXPERIÊNCIA No. Iniciar a reação pela adição de 200 µL de ONPG (4mg/mL) e incubar a mistura de reação em banho de água a 30oC por 10 min.coli e faça a leitura da D.O. Calcular a atividade de β-galactosidase das duas culturas: Atividade de β-galactosidase = 1000 × D.420 nm UNIDADES tempo (min) × volume (mL) × D. 8.600nm da cultura RELATÓRIO . Fazer uma diluição 1:10 das culturas de E.O.600nm (Densidade Óptica a 600nm).420nm (Densidade Óptica a 420nm).O. QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 Nome: Grupo No. Data OBJETIVO DA EXPERIÊNCIA:________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ RESULTADOS OBTIDOS :_____________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ 32 . O que você esperaria encontrar em um experimento semelhante utilizando uma cepa cujo genótipo é I-O+Z+? E no caso de uma cepa I+O-Z+? Proponha um experimento para distinguir entre estas cepas.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 Nome: QUESTÕES: 1. O que você pode concluir sobre o genótipo da cepa CSH23? 2. 33 . 24 EcoRI BglII 7 µL 2 µL 7 µL 2 µL EcoRI e XbaI 6 µL 2 µL BglII e XbaI 6 µL 2 µL sem enzima H2O Tampão da enzima (10X) Enzima (1 U) EcoRI e BglII 6 µL 2 µL 1µL 1µL 1µL / 1µL 1µL / 1µL 1µL / 1µL - Plasmídeo 10µL 10µL 10µL 10µL 10µL 10µL Volume total 20µL 20µL 20µL 20µL 20µL 20µL 10µL - 2.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 EXPERIÊNCIA No. Procedimento experimental A . obter seu mapa físico.12. 1. 3. A amostra está pronta para ser analisada em eletroforese em gel de agarose.11.16. Incubar a reação em banho maria a 37°C durante 60min.23 6.Digestão do DNA com enzimas de restrição Na experiência a ser realizada o DNA do plasmídeo será digerido com 4 enzimas de restrição diferentes. GRUPOS 1. .13. durante 15min. Misturar e centrifugar.8.7. Cada grupo (ver tabela abaixo) receberá um tubo Eppendorf contendo os componentes da reação com exceção do DNA plasmidial. 34 . ou seja. 150ng/10µL) no tubo.18. As enzimas de restrição comercialmente disponíveis costumam vir acompanhadas do tampão correspondente e instruções para realizar a reação.9. Transferir o tubo para um banho a 65°C. 4: DIGESTÃO DE DNA PLASMIDIAL COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO e ELETROFORESE DE DNA EM GEL DE AGAROSE Fundamento Preparações de DNA plasmidial ou cromossomal purificadas podem ser submetidas a digestão com enzimas de restrição para identificação e caracterização do DNA.19 2.1 M (Opcional). Retirar o tubo do banho e rapidamente colocá-lo em gelo.22 5.17.21 4. média e baixa). A escolha das enzimas de restrição deve ser baseada no mapa de restrição (quando disponível) ou opta-se pelo emprego de um conjunto de enzimas de forma a permitir a caracterização do DNA em questão. Interromper a reação pela adição de 1µL EDTA 0. As enzimas de restrição classificam-se em 3 gupos quanto a força iônica para a atividade (alta. 4.20 3. Adicionar a cada um dos tubos 5µL de tampão da amostra. 5. Acrescentar 10µL da solução de plasmídeo (DBQ1.Cada aluno deverá providenciar uma folha de papel monolog para construção do gráfico (Questão 3). Manter o tubo em banho de gelo.15.14.10. Misturar o conteúdo dos tubos por agitação e centrifugação rápida. 0% OBS: Serão montados dois géis com espaço para aplicação de até 14 amostras 1.25% p/v sacarose 40% p/v B. CUIDADO BROMETO DE ETÍDIO É CARCINOGÊNICO! Despejar sobre a forma para o gel previamente preparada. Cuidado para não tocar o tampão.5cm do fim do gel.4 -5 – 6 . EDTA 1mM pH 8.Padrão de tamanho . Tranferir o gel para o transiluminador e. EDTA 2mM pH 8).500mM* NaCl 500mM-1M* MgCl2 100mM DTT 10mM *(depende da enzima) Tampão da amostra Tris 10mM pH 8. Enquanto espera-se a dissolução da agarose. Aquecer em banho fervente e misturar até completa dissolução da agarose.7 . Ligar a fonte de eletroforese e aplicar aproximadamente 100V. incluindo a colocação do pente. utilizando óculos protetores.2 . 2.0 g de agarose. Adicionar tampão TBE à cuba de modo a cobrir o gel com menor volume possível.8 . Resfriar até 40°C (até conseguir segurar com as mãos) e acrescentar 5µL de uma solução de brometo de etídio 10mg/mL.9 – 10 – 11. Fracionamento do DNA em gel de agarose.25% p/v xileno cianol 0.19 – 20 – 21 – 22 – 23 –24 35 . Aplicar as amostras preparadas na experiência anterior.14 -15 – 16 – 17 – 18 . Deixar solidificar por pelo menos 30min. Fotografar o padrão de bandas observado com uma régua posicionada na lateral do gel. Interromper a eletroforese quando o corante azul estiver a 0. em seguida observar o gel sob luz UV. Adicionar 100mL de tampão TBE (Tris-borato 89mM.3 .12 GEL 2: 13 .Padrão de tamanho . 5.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 Tampão de digestão 10X Tris-HCl 100mM . Pesar 1. Preparo do gel de agarose 1. Retirar o pente e transferir o gel para a cuba. 6. 3. preparar a forma para o gel. OBS: Ordem de aplicação das amostras nos géis GEL 1: 1 . 4. azul de bromofenol 0. Data OBJETIVO DA EXPERIÊNCIA:________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ RESULTADOS OBTIDOS: :____________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ 36 .4 Nome: Grupo No.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 RELATÓRIO .EXPERIÊNCIA No. O tamanho pode ser estimado tomando-se por base a sua mobilidade em relação à de outros de tamanho conhecido. O gráfico da mobilidade em cm (M) contra o tamanho em pb (L) dará uma curva que pode ser usada para leitura do tamanho com relação a uma determinada mobilidade. a interpolação é muito mais precisa se a função puder ser encontrada em uma linha reta: gráfico de log L versus M. tamanho em pb). Faça um desenho do pQBQ indicando a posição dos sítios de clivagem para estas enzimas. Se o gel foi fotografado com uma régua ao lado.000 pares de base. Usando-se a mistura de padrões de tamanho em pb conhecida calcule o tamanho dos fragmentos obtidos da digestão do pQBQ com as enzimas utilizadas. é possível estimar o tamanho e a quantidade dos fragmentos de DNA.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 Nome: QUESTÕES: 1. Desenhe a reta utilizando papel monolog (eixo x. Géis de agarose podem ser usados para análise de fragmentos de DNA que tenham entre 70 e 800. Assim. 37 . Entretanto. Por que se utiliza EtBr (Brometo de Etídio) no gel e no tampão da eletroforese? 3. Por que se observam duas bandas no plasmídeo que não foi incubado com a enzima? 2. eixo y. mobilidade em cm. a mobilidade relativa pode ser lida diretamente da foto. 3N KOH. 37°C. uréia ss: estável ds: desnatura 1ária: estável 2ária: destruída Luz UV (260 nm) ss: absorve mais ds: absorve menos Absorve Calor ss: estável ds: desnatura (Tm) 1ária: estável 2ária: destruída + Nucleases Exonucleases + Endonucleases + + 38 .5N (brando) à frio Precipita Despurina Precipita Despurina Meio alcalino brando (0. isopropanol Precipita Precipita Agentes desnaturantes que quebram pontes de H ex.: formamida. 18h) ss: estável ds: desnatura Hidrolisa 2' e 3'nucleosídeos Solvente orgânico (cte dieletr.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DOS ÁCIDOS NUCLEICOS DNA RNA Força iônica baixa ("Salting in") alta ("salting out) Solubiliza Precipita Solubiliza Precipita Meio ácido 0.: etanol. < que da H2O) ex. Inibe transcrição. Liga-se à subunidade β de RNAP. impede ligação de aminoacil-tRNA neste sítio. Tetraciclina: Liga-se ao sítio A do ribossomo. Liga-se ao sítio A do ribossomo. Actinomicina D: Estrutura: 2 peptídeos + 3 anéis benzeno fenoxazona (ver p 715 Stryer). O fragmento A da toxina cataliza a transferência de ADP para EF2 (ADP-ribosilação) inativando este fator de elongação da cadeia polipeptídica.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 INIBIDORES DE TRANSCRIÇÃO OU DE TRADUÇÃO ANTIBIÓTICOS Rifamicina (Streptomyces) Rifampicina (sintética) Inibe iniciação da transcrição (impede a formação da la. Cloranfenicol: Só inibe a síntese de proteínas de procariotos e mitocôndira (não inibe a síntese protéica extramitocondrial de eucariotos). α-Amanitina (octapeptídeo cíclico) de um cogumelo (Amanita) Inibe RNAPII (muito) e III (um pouco. Análogo de aminoacil-tRNA. 39 . Ricina: Inativa a subunidade 60S dos ribossomos eucarióticos. mas não de procariotos (70S). TOXINAS Diftérica: Inibe síntese protéica. Liga-se a dsDNA impedindo que seja usado como template. impedindo a entrada de aminoacil-tRNAS. ligação fosfódieser) mas não inibe elongação da cadeia de mRNA. Inibe elongação. Foma ligação peptídica com a cadeia polipeptídica nascente (peptidil transferase). Alvo é EF2 que cataliza a translocação do peptídeo. Peptidilpuromicina: peptídeo liberado do ribossomo contendo puromicina ligada covalentemente ao Cterminal. Liga-se a RNAPII bloqueando a formação de mRNA ou de precursores de mRNA. Estreptomicina: Causa leitura incorreta do código genético. Cicloheximida: Inibe a formação dos ribossomos de eucariotos (80S). Anéis fenoxazona intercalam-se entre as bases nitrogenadas do RNA. Usado em tratamento de câncer. Extraída de Streptomyces. em maior concentração). Puromicina: Inibe tradução. QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 UUU UUC UUA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ile Ile Met Val Val Val Val UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG CÓDIGO GENÉTICO Ser UAU Tyr Ser UAC Tyr Ser UAA STOP Ser UAG STOP Pro CAU His Pro CAC His Pro CAA Gln Pro CAG Gln Thr AAU Asn Thr AAC Asn AAA Thr Lys Thr AAG Lys Ala GAU Asp Ala GAC Asp Ala GAA Glu Ala GAG Glu UGU UGC UGA UGG CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG Cys Cys STOP Trp Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly AUG é parte do sinal de iniciação e também é o códon para as metioninas internas à cadeia. 40 .
Report "BIOLOGIA MOLECULAR QUESTIONARIOS E PRATICAS"