3 Evaluación de la toxicidad de los suelosmediante bioensayos con semillas María del Carmen Cuevas Díaz, Joahana de la Luz Rosaldo Santiago, Jaime López Luna Introducción Las plantas son esenciales en los ecosistemas porque son las responsables de transformar la energía solar en energía química, al tiempo que absorben dióxido de carbono. De esta manera proveen de alimento y oxígeno al resto de los organismos. Además, las plantas son uno de los componentes más importantes de los ecosistemas terrestres porque proporcionan refugio y sitio de anidamiento para numerosos organismos, y participan de forma primordial en el reciclaje de nutrientes y en la estabilización de los suelos (Wang y Freemark, 1995). El daño a las plantas por los contaminantes puede afectar directamente a la estructura y la función de un ecosistema, al reducir la producción primaria, incrementar el lavado y erosión del suelo y degradar el hábitat de la vida silvestre. Los efectos letales de los contaminantes sobre las plantas pueden significar pérdidas ecológicas y económicas muy importantes; incluso los efectos subletales tienen un impacto significativo sobre la producción de alimentos y el desarrollo de la vegetación natural, e implicaciones adversas para los organismos pertenecientes a niveles superiores en la cadena alimenticia (Wang y Freemark, 1995). En los bioensayos de toxicidad con semillas se evalúan los efectos adversos de los contaminantes en el proceso de germinación y en el desarrollo de las plántulas durante los primeros días de crecimiento. Como respuesta se determina la inhibición en la germinación y de la elongación de la radícula y del hipocótilo. Es 87 importante destacar que durante la germinación y los primeros días de desarrollo ocurren numerosos procesos fisiológicos en los que la presencia de un compuesto tóxico puede interferir y alterar la supervivencia y el desarrollo normal de las plántulas. La división celular de los ápices radiculares puede afectarse, retardando el proceso de mitosis o alterando el proceso de alargamiento radicular, por lo que la fitotoxicidad de un compuesto puede ser determinada a través de la medición de dichas respuestas (Uribe, 2008). Algunas plantas son más sensibles que otras a los efectos de los contaminantes; sin embargo, se sabe que generalmente las comunidades vegetales son afectadas por los suelos contaminados con hidrocarburos del petróleo. Estos compuestos afectan en particular a las raíces y los brotes de plantas jóvenes (Adam y Duncan, 2002). Para el desarrollo de estas pruebas se han empleado diversas especies, tanto de importancia económica (ornamental o de cultivo), como ecológicas (nativas); sin embargo, el trigo (Triticum aestivum) y el sorgo (Sorghum vulgare) son las que han sido ampliamente utilizadas. En este capítulo está basado en los procedimientos de prueba recomendados por el protocolo 208 de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OECD, 1984), la guía OPPTS 850.4200 de la USEPA (1996a) y el ensayo de Uribe, 2008. Campo de aplicación Estas pruebas se pueden aplicar directamente a suelos contaminados con hidrocarburos (como el petróleo o diésel) o a suelos que han sido sujetos a algún tratamiento de remediación. También pueden ser aplicados a extractos de estos mismos suelos. Prueba de toxicidad aguda con extractos de suelo Fundamento del método Este bioensayo es una prueba aguda, con exposición a 14 días, en la que se exponen las semillas a varias diluciones de los extractos del suelo problema, y posteriormente se mide la inhibición de la germinación y del crecimiento temprano de las plántulas, y la producción de biomasa a través de las concentraciones efectivas 88 Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos El pH debe estar entre 6 y 8. Solución de hipoclorito de sodio al 5 %. de preferencia 99. Se puede utilizar blanqueador comercial. Pesar 10 g de 2. que contiene comúnmente 6 % de hipoclorito. E valuación de la toxicidad de los suelos mediante bioensayos con semillas 89 .5 % Agua destilada 2. 1 o 40 Pipeta graduada de 10 mL Regla graduada o vernier Matraz aforado de 500 mL Balanza analítica Cámara oscura con temperatura controlada Horno Reactivos Ácido bórico (H3BO3) con pureza > 98 %. Pesar 25 g de H3BO3. aforando y mezclando suavemente con agua destilada. depositar en un matraz y aforar a 1 litro con agua desionizada.5-cloruro de trifeniltetrazolio con pureza > 98 % Diclorometano grado HPLC Hipoclorito de sodio (NaClO) al 5 % o blanqueador comercial Sulfato de sodio anhidro (NaSO4) grado analítico Soluciones Solución de cloruro de trifeniltetrazolio al 1 %. adicionar 25 mL de NaClO y aforar con agua destilada. En un matraz aforado de 500 mL. agitando lentamente.5-cloruro de trifeniltetrazolio y depositar en matraz aforado de 1000 mL. Solución de ácido bórico.3.3.medias (CE50). las cuales representan las concentraciones de los extractos de suelo que ocasionan una inhibición del 50 % en cada una de estas respuestas. comparadas con la respuesta máxima observada en el control negativo. Material y equipo Cajas de Petri Contenedores de vidrio Pyrex de 150 x 75 mm Vasos de precipitados Pyrex de 125 y 300 mL Matraz Soxhlet Matraz volumétrico de 100 mL Papel filtro del No. 1000 mg/L. si se requieren 100 mL de extracto con una concentración de 1000 mg/L y se parte de una de una concentración de 10000 mg/L.. soya (Glycine max). Se adicionan 140 mL de diclorometano en el matraz balón. maíz (Zea mays). Las parrillas deben mantenerse a 55 °C. en oscuridad y ambiente seco. lenteja (Lens culinari) o jitomate (Lycopersicum esculentum). este concentrado sirve como solución para realizar las diluciones. El cartucho se coloca dentro de la columna de extracción del Soxhlet (USEPA. Finalmente se coloca en un frasco limpio y seco. se cuenta el tiempo para lograr un total de 6 reflujos por h durante 6 h. por ejemplo 0.1 1. Por ejemplo. se toman 10 mL de esta solución y se lleva a 100 mL con el disolvente empleado. 10. se usa la concentración mayor y de esta se preparan las diluciones. Organismos de prueba En estos bioensayos se utilizan semillas de trigo (Triticum aestivum). y se deposita en un cartucho de celulosa. sorgo (Sorghum vulgare). Se realiza una trituración hasta obtener partículas finas y homogéneas. Todas las semillas deben ser certificadas o de tipo orgánico. y así sucesivamente. Los extractos de suelo pueden ser preparados mediante la extracción con diclorometano empleando el método de Soxhlet. 1996b. Se le adiciona sulfato de sodio anhidro en relación 1:1 suelo:sulfato. no colocar al sol. 100. Para ello se mezclan de 5 a 10 g de suelo seco y triturado. con la finalidad de mejorar la extracción del hidrocarburo. estos deben guardarse en recipientes a prueba de humedad a 5 ºC.Extractos de suelo Se depositan 40 g de suelo en charolas de vidrio o aluminio para su secado a temperatura ambiente (25-30 ºC) durante 48 h. en función de las concentraciones deseadas y de la concentración existente en el suelo muestra. Se recupera el concentrado en un vial de 50 mL. Para ello. se pasa el matraz bola a un rotavapor y se evapora a sequedad. Finalizada la extracción. Se preparan cinco concentraciones del extracto de suelo en orden logarítmico. y de 4 a 5 perlas de ebullición para evitar proyecciones del disolvente por el calentamiento. Una vez determinada la viabilidad de los lotes de semillas. 90 Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos . 2006). Fernández-Linares et al. A partir del primer reflujo. De la solución de 1000 mg/L se toman 10 mL y se afora a 100 mL para obtener una concentración de 100 mg/L. Como control de calidad de las semillas debe realizarse una prueba de viabilidad antes de realizar los ensayos de toxicidad. 1985) modificado. particularmente las deshidrogenasas del ácido málico. como las de tomate. también llamado prueba rápida de germinación. 2007). consiste en probar en un periodo de 24 a 48 h la capacidad de germinación de un lote (más una réplica) de 50 semillas tomadas al azar.Preparación de las semillas Para desinfectar las semillas. Para llevar a cabo la prueba de viabilidad se siguen los pasos que a continuación se describen: 1 Se remojan 50 semillas de la especie seleccionada en agua destilada o en papel filtro humedecido con agua destilada durante 4 a 18 h a temperatura ambiente. ocurre la reacción de reducción en las células vivas y se forma un compuesto de color rojo (trifenilformazán) que indica la presencia de actividad respiratoria en las mitocondrias y. como las del maíz. luego se lavan con agua destilada y finalmente se colocan en un contenedor con agua destilada durante 15 min para eliminar los residuos del hipoclorito. Este método. Esta prueba se basa en la actividad de las enzimas deshidrogenasas. que el tejido es viable. En esta reacción los iones H+ son transferidos a la referida sal. Procedimiento Prueba de viabilidad Antes de realizar los bioensayos de toxicidad. que reduce la sal de tetrazolio en los tejidos vivos de las semillas. se deberá determinar la viabilidad de las semillas mediante el método químico de cloruro de trifeniltetrazolio (Moore.. Los tejidos muertos (no viables) no reaccionan con la solución y conservan su color natural (Russi et al. 2 Si se usan semillas grandes. Si son semillas más pequeñas. consecuentemente. estas se tiñen en un vaso de precipitados de 250 mL adicionando aproximadamente de 150 a 200 a mL de la solución de cloruro de trifeniltetrazolio. Cuando la semilla se sumerge en la solución de cloruro de trifeniltetrazolio. se utiliza un vaso de precipitado de 125 mL y se adicionan de 80 a E valuación de la toxicidad de los suelos mediante bioensayos con semillas 91 . estas se sumergen en la solución de hipoclorito de sodio durante 15 min. 3 Se lavan las semillas con agua corriente bajo un flujo reducido y posteriormente se observa el cambio de coloración en el embrión (figura 3. Moore. Este paso se repite para cada una de las 5 concentraciones 92 Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos . 1985. después 4 h de remojo Desarrollo de la prueba Previamente a la prueba. las semillas deben ser desinfectadas con hipoclorito de sodio.1. maíz y soya Sorgo Frijol Tiempo de imbibición o remojo 8 10 12 envueltas en toalla de papel húmedo. Se dejan reposar 2 h si son semillas pequeñas y hasta 24 h si son semillas grandes (tabla 3. 2007. 2008 Figura 3. Del Valle. Kameswara. Se coloca papel filtro en el interior de las cajas de Petri y se adicionan 2 mL del extracto de suelo.1) a una temperatura de 30 °C en la oscuridad (Moreno. Fuente: Moore. 1984.1. Tabla 3. trigo. conforme el procedimiento anteriormente descrito.100 mL de la misma solución.. 1985).1). Tiempo de imbibición con trifeniltetrazoilo. Semillas viables de trigo en las que se aprecia la tinción con trifenilformazán Semilla (h) Avena. et al. 2005). Una vez preparadas.2. sólo se adicionan 2 mL de agua destilada al papel filtro y se depositan las 15 semillas. así como un control positivo agregando 2 mL de la solución de ácido bórico (EC. Para determinar la producción de biomasa. Plántulas de trigo E valuación de la toxicidad de los suelos mediante bioensayos con semillas 93 .2). Se colocan 15 semillas de las especies seleccionadas en cada caja de Petri. se pesan las plántulas en una balanza analítica. se extraen las plántulas de las cajas de Petri. De la misma manera. deben evaluarse las variables de respuesta en todos los tratamientos. Con la regla o el vernier se mide la altura de las plántulas (longitud del hipocótilo) y la longitud de la radícula (figura 3. Para ello. dejando suficiente espacio entre ellas.. Figura 3. Cuando se observe que al menos el 65 % de las semillas en el control negativo han germinado y sus radículas muestran un tamaño de al menos 5 mm de largo. para lo cual previamente se colocan en cajas de Petri y se meten en la estufa a 75 °C durante 20 a 24 h para eliminar la humedad. todas las cajas de Petri deben ser colocadas en la cámara oscura a una temperatura controlada de 22 ± 2 °C.preparadas con el extracto de suelo. 2006). En el caso del control negativo. se prepara un tratamiento control con el disolvente empleado para preparar los extractos del suelo (Fernández-Linares et al. se consideran solo los efectos negativos. los bioindicadores. se elabora una curva dosis-respuesta donde se marcan los siguientes parámetros toxicológicos: la CE50 (concentración efectiva media). la germinación promedio de los tratamientos se establece como porcentaje en relación al control. la desviación estándar y el porcentaje de producción de biomasa y de elongación de la radícula y el hipocótilo de las plántulas de cada especie seleccionada. el cual se asume como 100 %. 94 Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos . Con estos datos se construye la curva dosis-respuesta y se calcula la CE50 utilizando el software libre Trimmed Spearman Karber Method (USEPA. por lo que se utilizan otros parámetros. 1977) para cada una de las especies seleccionadas. Dichos métodos se describen en el capítulo 2. 1999a. • El porcentaje de las semillas germinadas en cada especie..Cálculos Una vez que los datos han sido registrados. En este tipo de pruebas no se puede establecer con precisión la mortalidad (CL50) de una plántula. que indiquen otros efectos tóxicos. como germinación. Antes de ingresar los datos en el programa. La CE50 se calcula con el método Probit (USEPA. Los valores de la NOAEC y la LOAEC se obtienen estadísticamente mediante el análisis de comparación de medias por una prueba de Dunnett. se establece que el número total de individuos de prueba en el control y en cada concentración de los tratamientos equivale a 100 (100 %). puesto que el software disponible está diseñado para calcular concentraciones letales (CL50). como los ya descritos. 2004) o de Spearman-Karber recortado (Hamilton et al. Sin embargo.. Díaz-Baez et al. • El promedio. la NOAEC (concentración máxima en la que no se observan efectos adversos) y la LOAEC (concentración mínima en la que se observan efectos adversos). producción de biomasa y elongación de raíz y tallo. Para estandarizar los datos. se realizan los siguientes cálculos: • El porcentaje de viabilidad de cada especie seleccionada. 1999b). producción de biomasa y elongación radicular y del hipocótilo. Posteriormente. deben estandarizarse previamente. Parámetros toxicológicos Con los datos de germinación. que se obtienen calculando la disminución del porcentaje de germinación de los tratamientos con respecto al control (100-% de germinación con respecto al control). elongación de radícula e hipocótilo y cualquier otro bioindicador de toxicidad. y como dato de mortalidad de los tratamientos se ingresa la disminución del porcentaje de germinación con respecto al control. su origen y características. utilizando la prueba de Dunnett que compara cada uno de los tratamientos con el control.Se asume que no existe mortalidad en el control (equivale a cero).. que es la concentración máxima en la que aún no se observan efectos adversos. La concentración máxima que no sea estadísticamente diferente del control equivale al valor de NOAEC. Estos parámetros toxicológicos son de gran importancia porque se utilizan para calcular índices de riesgo. La concentración del tratamiento que sea estadísticamente diferente del control equivale a la LOAEC. dimensiones y cantidad de suelo utilizada. en donde la CE50 indicaría una disminución del 50 % de respuesta con respecto al control negativo. es decir a la concentración mínima en la cual se observa un efecto adverso. • Cualquier problema o desviación del protocolo E valuación de la toxicidad de los suelos mediante bioensayos con semillas 95 . Variedad de semilla o detalles de otras especies empleadas • Condiciones del crecimiento de la semilla • Tipo de contenedor. 1993): • Tipo de contaminante presente en el suelo problema y su control • Tipo de suelo. Se procede de la misma manera para producción de biomasa. Se puede consultar información toxicológica adicional en López-Luna et al. 2009. El valor de la CE50 calculado nos indicaría entonces la concentración a la cual el porcentaje de germinación disminuye un 50 % con respecto al control negativo. La NOAEC y la LOAEC se obtienen estadísticamente mediante el análisis de comparación de medias de los valores naturales (datos crudos). Reporte Para elaborar el reporte se recomienda incluir los siguientes puntos (ISO. y de la producción de biomasa Agua destilada y el disolvente empleado en la extracción Ácido bórico Pruebas directas de toxicidad aguda en suelo Fundamento del método Este bioensayo es una prueba aguda. de la elongación de la radícula y el hipocótilo. mientras que en la prueba de tratamientos múltiples se determinan las concentraciones efectivas medias (CE50).2. comparadas con la respuesta máxima observada en el control negativo. 96 Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos .Tabla 3. En la prueba de tratamiento único se determina si el suelo produce esta inhibición comparada con el control negativo. y posteriormente se mide la inhibición de la germinación. del crecimiento temprano de las plántulas y de la producción de biomasa. sorgo (Sorghum vulgare). Resumen de las condiciones recomendadas para las pruebas de semillas expuestas a extracto de suelo Duración de la prueba Temperatura Condiciones de iluminación Recipientes de prueba Cantidad de extracto de suelo requerida por réplica Especie de prueba Número de semillas por réplica Número de réplicas Respuesta a medir Control negativo Control positivo 14 días 22 ± 2 °C Oscuridad hasta germinación Cajas de Petri con papel filtro humedecido 2 mL Trigo (Triticum aestivum). las cuales representan las concentraciones del suelos problema que ocasionan una inhibición del 50 % en cada una de estas respuestas. en la que se exponen directamente las semillas al suelo problema (prueba de tratamiento único) o a sus diluciones (prueba de tratamientos múltiples). soya (Glycine max). maíz (Zea mays). con exposición a 14 días. lenteja (Lens culinari) o jitomate (Lycopersicum esculentum) 15 3 Inhibición de la germinación. 6 cm de ancho y 4 cm de altura Matraz volumétrico de 100 mL Papel filtro del No. E valuación de la toxicidad de los suelos mediante bioensayos con semillas 97 . aforar a 500 mL con agua destilada y mezclar. Pesar 25 g de H3BO3.5 cm y 5 cm de altura Cajas de Petri Cristalizadores de vidrio de diámetro de 15 cm y 7.Material y equipo Bolsas plásticas de 0.5 cm de altura.5-cloruro de trifeniltetrazolio de 98 % de pureza Hipoclorito de sodio (NaClO) grado analítico Soluciones Solución de cloruro de trifeniltetrazolio al 1 %.3. mezclar y aforar a 1000 mL. 1 o 40 Pipeta graduada de 10 mL Regla o vernier Balanza analítica Balanza granataria Cámara con temperatura y fotoperiodo controlados Criba de malla 10 con abertura de 2 mm Estufa Mortero Reactivos Acetona o diclorometano grado HPLC Ácido bórico (H3BO3) con pureza mayor al 98 % Agua destilada Agua tipo II Arena o suelo sin contaminar 2.015 m o frascos de vidrio Pyrex con diámetro de 5.05 X 0. Adicionar 10 ml de cloruro de trifeniltetrazolio en 500 ml de agua. mezclar depositando una barra magnética en el matraz Erlenmeyer y agitar durante 15 min. Solución de ácido bórico. o de 8 cm de largo. Solución de hipoclorito de sodio al 5 %. depositar en un matraz y aforar a 1 litro con agua desionizada. Tomar 25 mL de NaClO y depositar en un matraz aforado que contenga 100 mL de agua destilada. . Procedimiento Prueba de viabilidad Antes de realizar los ensayos de toxicidad. se debe probar la viabilidad de las semillas de las especies seleccionadas. Otra forma es realizar el bioensayo con el suelo contaminado y el suelo tratado (biorremediado) sin realizar mezclas. Posteriormente se tritura con un mortero para homogenizarlo y se criba para eliminar las piedras. estas se sumergen en la solución de hipoclorito de sodio durante 15 min. luego se lavan con agua destilada y finalmente se colocan en un contenedor con agua destilada durante 15 min para eliminar los residuos del hipoclorito. Se ajusta el contenido de humedad del suelo con agua destilada a un valor entre el 28 y el 30 % de la capacidad de campo. Para ello se pesan 30 g de suelo de las diferentes diluciones y se depositan en los frascos de vidrio (Meier et al. Se depositan 8 g de suelo en las bolsas de plástico. 75 y 100 %. Para las pruebas en las que se evalúan distintas concentraciones del suelo problema. el suelo se seca a temperatura ambiente. 1997). Preparación de las semillas Para desinfectar las semillas.Suelo Para las pruebas en las que solo se evalúa la toxicidad del suelo problema como tratamiento único. se recomiendan las mismas especies mencionadas anteriormente en este capítulo. este se mezcla con suelo similar al del sitio contaminado para obtener diluciones de 0. 98 Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos . 25. Cada tratamiento debe realizarse por triplicado. para facilitar el crecimiento de las plantas. Organismos de prueba Para las pruebas directas en suelo. 50. Para ello se sigue el procedimiento descrito con anterioridad en este capítulo. 3). acetona o dimetilsulfóxido) con arena (OECD. como OECD.3. El control positivo con ácido bórico debe emplearse cada vez que el lote de semillas sea nuevo. Figura 3. 1984 e ISO. Existen guías o protocolos. 2005). el control del disolvente (diclorometano. Posteriormente las bolsas o los frascos se incuban en la cámara oscura a una temperatura de 22 ± 2 °C hasta que se observa un 65 % de germinación de las E valuación de la toxicidad de los suelos mediante bioensayos con semillas 99 . en cada bolsa se deposita una semilla hasta completar un total de 15 por cada especie seleccionada (figura 3. También se prepara el control negativo con arena o suelo no contaminado (con aproximadamente un 3 % de materia orgánica) y agua destilada. se depositan 10 semillas por cada especie en los frascos de vidrio. Deben prepararse 3 réplicas por cada dilución (Sharifi et al. y el control positivo con arena adicionada de ácido bórico (EC. que no incluyen un compuesto tóxico de referencia.Desarrollo de las pruebas Para la prueba de tratamiento único. Preparación de los recipientes para la prueba con semillas de tratamiento único Para las pruebas de tratamientos múltiples. o en las pruebas del control de bioensayo que se realizan cada dos meses.. 1993. 2007). 2006). Un crecimiento de la radícula mayor a 5 mm se considera un indicador de la germinación. al finalizar la prueba. cuenta total bacteriana de 0/mL y valor máximo de materia de 0. Los parámetros toxicológicos se obtienen como se describió previamente. la desviación estándar y el porcentaje de producción de biomasa y de elongación de la raíz y el tallo de las plantas de cada especie Parámetros toxicológicos Con los datos anteriores se elabora una curva dosis-respuesta y se calculan los parámetros toxicológicos de la CE50. en forma manual con una pipeta graduada o mediante atomización. con la excepción de que los valores de concentración quedarán expresados como porcentaje de adición de suelo contaminado. se determinan los parámetros de producción de biomasa y de elongación del tallo y la raíz. hasta alcanzar el peso exacto del suelo (considerando el peso de la bolsa o el frasco). como cambios en la coloración o necrosis de las hojas. las plántulas se mantienen bajo un régimen de 16 h de luz y 8 de oscuridad. es decir. Después de este periodo. la elongación de la raíz y el tallo y la producción de biomasa. Cálculos Al término de la prueba se realizan los siguientes cálculos: El porcentaje de viabilidad de las semillas estudiadas El porcentaje de las semillas germinadas en cada especie seleccionada El promedio. Para ello. como se describió anteriormente en este capítulo. 1996a).1 mg/l) a cada bolsa o frasco. Dependiendo del ciclo de cada especie. se determina el porcentaje de germinación después de varios días. cada tercer día se adiciona agua tipo II (con una conductividad específica 1. la CE50 equivaldrá a la proporción (%) de suelo contaminado que provoca el 50 % de disminución de la germinación con respecto a un suelo control libre de contaminantes. la NOAEC y la LOAEC para la germinación.semillas del control negativo (Saterbak et al. Posteriormente. Diariamente se observan las plantas y se anota cualquier cambio que se aprecie. 2000). Durante toda la prueba es necesario mantener un contenido de humedad del suelo de 70 ± 5 % de la capacidad de campo (USEPA. y la NOAEC sería la propor100 Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos . La LOAEC sería la proporción de suelo contaminado mínima que genera un efecto adverso..0 umhos/ cm a 25 °C. 3. lenteja (Lens culinari) o jitomate (Lycopersicum esculentum) 10 De 3 a 4 Suelo no contaminado Ácido bórico de la toxicidad de los suelos mediante bioensayos con semillas 101 .) • Número de réplicas. comparando los tratamientos con un suelo control de características similares al suelo contaminado. familia. Resumen de las condiciones recomendadas para las pruebas de semillas expuestas directamente al suelo problema Tipo de prueba Temperatura Duración Tipo de contenedores Cantidad de suelo requerida por contenedor Organismo prueba Número de organismos por réplica Número de réplicas Control negativo Control positivo E valuación Directa en suelo 22 ± 2 ºC De 10 a 21 días en función de la especie Recipientes de vidrio de 4. número de semillas utilizadas en cada contenedor. contenido de humedad y capacidad de campo) antes. estación de cosecha. De la misma manera se procedería para producción de biomasa y elongación de raíz y tallo. sorgo (Sorghum vulgare).ción de suelo contaminado máxima que no genera efectos adversos. nombre común.5 cm de diámetro y 7 cm de altura o bolsas plásticas 30 g Trigo (Triticum aestivum). variedad. maíz (Zea mays). etc. especie. durante y al término de la prueba • Las características de las semillas de prueba (semillas certificadas u orgánicas. soya (Glycine max). condiciones de incubación y esterilización de las semillas • Los valores de humedad y pH del suelo registrados durante la prueba Tabla 3. Reporte Para elaborar el reporte se recomienda incluir los siguientes puntos: • El tipo de contaminante presente en el suelo problema y su concentración • Las características del suelo problema (pH. • Las plantas deben ser regadas según los requerimientos de su especie. así como baja variabilidad (CV < 30 %) en la elongación de la radícula y el hipocótilo. 102 Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos . se debe aumentar el número de réplicas para reducir el error. deben eliminarse los extremos. Observaciones La inhibición de la elongación de la radícula y el hipocótilo constituyen indicadores subletales muy sensibles para la evaluación de efectos biológicos en vegetales. se debe aumentar el número de semillas por réplica hasta un mínimo de 18 semillas germinadas. las más grandes y las más pequeñas. que aportan información complementaria a la proporcionada al estudiar el efecto en la germinación.Control de calidad El protocolo 208 de la OECD (1984) y la guía OPPTS 850. que deben ser lo más homogéneas posible en cuanto a tamaño. • El tamaño de los recipientes de prueba debe ser adecuado para permitir el crecimiento normal de las semillas. y utilizar solo la fracción de semillas de tamaño medio. debe repetirse la prueba. estableciendo seis concentraciones como mínimo (incluyendo aquellas en donde se encontró efecto adverso) y el control negativo. Si existe variación en elongación de la radícula o del hipocótilo en el control negativo. Si las semillas son de diversos tamaños.4200 de la USEPA (1996a) establecen que deben considerarse los siguientes aspectos durante estas pruebas: • Las pruebas de tratamientos múltiples deben contar con un mínimo de tres concentraciones y un control negativo. Debe garantizarse que la germinación ocurra a la temperatura óptima de la especie y probar si este proceso de da mejor en presencia o ausencia de luz. • Se debe sembrar por réplica como mínimo cinco semillas. Debe buscarse que las semillas que se usen en estas pruebas presenten un porcentaje de germinación mayor al 90 %. Si no es posible tener un lote de semillas con una germinación mayor o igual al 90 %. En el caso en que el control negativo no alcance más del 50 % de germinación. es decir. G.C. Díaz-Baez. http://www. (editora).. G. M. Method Development and Application Section. Hanson. 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