Trabajo de Investigación de cuerpo entero Optimización de la producción de un extracelular frío activo proteasa alcalina de Stenotrophomonas maltophilia MTCC 7528y su aplicación en la industria de los detergentes Biodetergentes se prefieren sobre los detergentes sintéticos convencionales en vista de su mejor limpieza propiedades, entrada de baja energía y la reducción de la contaminación. Los derivados de biodetergentes organismos mesófilos / termófilo y también detergentes sintéticos a base de peróxido requieren alta la temperatura óptima para su actividad. Por lo tanto, las enzimas activas en frío son muy útiles, ya que funcionan a menor temperaturas y no requieren el aporte de energía. El propósito de este estudio fue el optimización de la producción y purificación de la proteasa alcalina en frío activo a partir de una novela psychro-tolerante Stenotrophomonas maltophilia MTCC 7528 y su aplicación como un aditivo para detergentes para el frío lavar. Psychro tolerante a proteolítica bacteria S. maltophilia MTCC 7528 se aisló a partir del suelo de Glaciar Gangotri, Himalaya Occidental, India, que produce máximo proteasa (56,2 U / ml) a 20 ° C y pH 9,0 después de 120 h de incubación en condiciones de agitación (120 rev / min). La enzima purificada tiene un peso molecular de 75 kDa con la máxima actividad y estabilidad a pH 10 y 20 º C de temperatura. Se mostró una excelente compatibilidad con detergentes comerciales con mayor poder de limpieza a baja temperatura. La enzima elimina completamente la sangre y manchas de hierba y aumenta la reflectancia en un 26 y 23%, respectivamente. Detergentes a base de enzimas encontrar una amplia gama de aplicaciones en ropa y textiles industrias. Proteasa alcalina en frío activo de S. psychro-tolerante maltophilia puede ser un potencial componente para ser utilizado como un aditivo detergente para el lavado de frío que será beneficioso para ahorrar energía como que trabajan a temperaturas más bajas. Palabras clave: proteasas alcalinas, enzimas biodetergente, frío activos, lavar el rendimiento. INTRODUCCION Biodetergentes, también conocidos como productos químicos verdes, cuenta por alrededor de 30% de la producción total de la enzima en todo el mundo. Proteasa se usa en detergentes para eliminar la proteína basada manchas por hidrólisis en pequeños péptidos que son dispersarse fácilmente en el licor de lavado. En la actualidad, tiene microorganismos han reconocido que el frío-adaptado proporcionar un amplio potencial biotecnológico y la oferta numerosas ventajas económicas y ecológicas mas organismos mesófilos y termófilos y sus enzimas (Gounot, 1991; Margesin y Schinner, 1994; Brenchley, 1996; Gerday et al, 2000;. Soriano et al,. 2000; Margesin et al, 2002;. Soror et al, 2007).. En frío enzimas activas, tienen mayor eficiencia catalítica a baja temperaturas y se han aplicado en la biotecnología sólo muy poco en comparación con su mesofílico y contrapartes termófilas (Margesin et al., 2005). La aplicación de tales enzimas permite la reducción de la la temperatura y la reducción de los tiempos de procesamiento sin un pérdida de eficiencia, lo que conduce a ahorro de tiempo y energía el consumo. Por lo tanto, es deseable buscar nueva fuente de enzimas en frío activos con propiedades novedosas de tantas fuentes como sea posible. Si bien ha habido numerosos informes sobre las enzimas activas en frío producidos por microorganismos (Hamamoto et al, 1994;.. Hoshino et al, 1997; Kun-Hee et al, 1999;. Hoffmann y Decho, 2000; Huston et al, 2000;. Irwin et al, 2001;. Zeng et al, 2003),. muy poca información se ha publicado en los microbios de Gangotri regiones glaciares del Himalaya occidental que puede ser un hábitat ideal para los organismos adaptados al frío y sus enzimas. En este trabajo, reportamos la producción optimización, purificación y aplicaciones de frío-activa proteasa alcalina de Stenotrophomonas maltophilia MTCC 7528, una nueva bacteria psychro tolerante aislados del suelo del glaciar Gangotri. 15 min) y el sobrenadante se utilizó para el ensayo de proteasa. el caldo de los medios de comunicación era complementado con un nivel de tolerancia máxima de diferentes metales y se incubaron en condiciones óptimas durante 48 h. La cepa se cultivó en agar de leche descremada contenida (g / l): leche desnatada en polvo. Hg 2 + . extracto de levadura. 5. 10. 1 y Sulfato de magnesio 4 0. 100. KH 2 Correos 4 . 5. Las enzimas producida por las células bacterianas fueron representados en términos de unidades de actividad de la proteasa en el sobrenadante del cultivo y se midió según método estándar (Secades y Guijarro.000 x g. 10. 0. 5 ml cada una.6) y se incubaron a 15 ± 2 ° C en un incubador agitador refrigerado (100 rpm) durante 48 h.7 H 2 O. De los medios de comunicación inoculado a 1. Cu 2 + .2.5-1% en los medios de comunicación) se evaluaron en relación con el rendimiento de la enzima. y se almacena a 4 ° C (Baghel et al.. (1951) utilizando bovino albúmina de suero tal como una proteína estándar Optimización de las condiciones de fermentación Los métodos adoptados para optimizar los parámetros de crecimiento de frío activo producción de proteasa tuvo como objetivo evaluar el efecto de una sola parámetro a la vez y más tarde se manifiesta como condición estándar. India). 15 min) y la proteasa extracelular en el sobrenadante del cultivo celular libre se obtuvo por el sulfato de amonio Precipitación (Deutscher. peptona. pH (5-10) y el modo de Se optimizaron las condiciones de incubación estática y movimiento (120 rpm). 100. El precipitado de proteína fue disuelto en tampón de acetato de sodio 0. La fracción con máxima actividad de enzima se aplicó a la columna de DEAE-Celulosa (3 × 12 cm. genei Bangalore. El tiempo de incubación que varía desde 24 hasta 168 h y los efectos de diferentes inductores (BSA. Los cultivos de crecimiento se centrifugaron a 4 º C (10. La fracción con alta actividad de proteasa se concentró por liofilización (Liofilizador MSW137. . leche descremada. fue se centrifugó a 4 º C (10. 1990). 20 ml de cada uno) en el mismo tampón. caseína. 50 y 150 g / ml. Los metales pesados utilizados fueron co 2+ . Cd 2 + . 1999).000 xg. India el producido una extracelular frío activo proteasa alcalina. Zn 2 + y Cr 2 + a la concentración final de 50.02 M tampón de acetato de sodio (pH 5). se recogieron y analizaron para proteínas y enzimas actividad. equilibrada previamente con 0. Para evaluar el impacto de los metales pesados. albúmina de huevo a razón de 0. se incubaron a condiciones optimizadas. 2005) Producción de proteasa y ensayo de la enzima La producción de proteasa se llevó a cabo en un medio que contiene (g / l): glucosa. La cultura condiciones tales como la temperatura (4-45 º C). Chandigarh.MATERIALES Y MÉTODOS Las especies microbianas y el cultivo Una bacteria psychro tolerante a S. 25. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y los resultados son la media de tres conclusiones independientes. maltophilia MTCC 7528 fue obtenido de microbiano tipo cultura colección (MTCC).0% (v / v) con 24 h de edad de cultivo (OD 0. Todas las etapas posteriores se llevaron a cabo a 4 ° C. Actividad de proteasa con azocaseína (Sigma) como sustrato fue ensayada por el método modificado de Secades y Guijarro (1999). peptona. La concentración de proteínas se determinó por el método de Lowry et al. y se eluyó con gradiente lineal de diez De NaCl (0. 5 y agar. Total de 40 fracciones.05 M (pH 5) y se dializó frente al mismo tampón durante 24 h con 6-8 cambios. India). 15.01 en 30 min a 20 ° C. Macro Scientific Works.1-1 M. Extracción y purificación de la proteasa El caldo de fermentación. El pH del caldo tratado en autoclave se ajustó (pH 7) mediante la adición de Na esterilizada 2 CO 3 solución (20% w / v). Una unidad de actividad de la enzima se define como la cantidad que produjo un aumentar en un 420 de 0. respectivamente. India) ejecutar de forma simultánea. Compatibilidad enzimática y el análisis de rendimiento de lavado de proteasa alcalina para el lavado frío.5-3 h) a 20 º C y la actividad residual se determinó en comparación con el control (Sin detergente). La compatibilidad enzima Se estudió con detergentes comerciales.la incubación de la enzima sin sustrato a diferentes valores de pH (5 . India). Surf Excel y rueda (Hindustan Lever Ltd. la análisis de rendimiento de lavado de enzima bruta se estudió en blanco piezas de tela de algodón (5 x 5 cm) con manchas de sangre de pollo y de la hierba . Tris-HCl (pH 8) y glicina-NaOH (pH 9-11). Spectronics Corporation. utilizando un mini aparato de placa de gel (Bangalore Genei. Para determinar la estabilidad de la proteasa con los cambios de temperatura. Gelatina zimografía se realizó en losa de poliacrilamida gel que contenía SDS y gelatina (0. La banda de la actividad se observó como un área transparente incoloro agotamiento de gelatina en el gel sobre el fondo azul. por el método de Laemmli (1971). India). Las bandas de proteínas se visualizaron por tinción de la gel con azul de Coomassie y la masa molecular relativa de la proteína se calculó utilizando marcadores de proteínas estándar (Bangalore Genei. El efecto de los la temperatura se determinó mediante la realización de la prueba estándar procedimiento dentro de un rango de temperatura de 4-50 ° C. Los detergentes utilizados fueron Ariel y Tide (Procter and Gamble. New York). la enzima era pre-incubaron a diferentes temperaturas durante 3 h y la actividad enzimática se sometió a ensayo según el protocolo estándar. La solución se incubó con detergentes fijo concentración de la proteasa para diferentes intervalos de tiempo (0. Proteasa activa en frío (crudo) como un aditivo detergente se estudió por utilizando el método de Beg y Gupta (2003).. Además. SDS-PAGE y zimograma Se realizó la SDS-PAGE de la fracción liofilizada. La actividad enzimática residual en cada La exposición se midió por ensayo como estándar.11) durante 1 hora a 20 ± 2 ° C.Caracterización bioquímica de la proteasa purificada Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de proteasa y la estabilidad El pH óptimo para la actividad de la enzima se determinó mediante el uso tampones siguientes: fosfato de citrato (pH 5-6). India) y Nirma (Nirma Química. La estabilidad de la proteasa se determinó mediante la pre. La solución de detergentes (1% w / v) se llevó a ebullición durante 10 minutos para destruir cualquier proteasa ya presente (ensayo enzimático se realizó para comprobar la actividad).1%) como un co-polimerizado sustrato. fosfato de sodio (pH 7). Las mezclas de reacción se incubaron a 20 ± 2 ° C durante 30 min y la actividad respectiva se midió. El gel se analizó con un gel Sistema de documentación (Geneline. India). Adinarayana et al. Efecto de la temperatura de incubación y el pH de los medios de comunicación La temperatura tiene gran influencia en la producción de enzimas microbianas. Efecto de la agitación y diferentes sustratos La producción de enzimas se aumentó dos veces a partir de 18. La aislar utilizado caseína para la producción máxima de enzima (52. Los siguientes conjuntos fueron preparados: a) frasco que contiene agua destilada (100 ml) + paño sucias (con sangre y la hierba de savia. 2003. la leche descremada es la mejor sustrato para la producción de enzima adaptada al frío desde .6 U / ml). El uso de carbono y barato fuentes de nitrógeno son importantes. Concentrado hierba savia se obtiene de la maceración de fresco hierba (100 g en 100 ml de agua destilada) en un mortero y mano de mortero y filtrada mediante el uso de una gasa. puede ser aplicable para los fines industriales que tiene pequeña variación de temperatura en proceso. ya que pueden significativamente reducir el costo de producción de la enzima. que también se secreta en gran medida en la fase de crecimiento exponencial tardía (Dube et al.4 U / ml) seguido de leche descremada (46. Thangam y Rajkumar (2002) también reportado producción de proteasa en medio alcalino por Alcaligenes faecalis. Los matraces se incubaron durante 30 min (20 º C) y se enjuagaron con frío agua y luego se seca al aire. La producción de proteasa aumenta gradualmente y fue máxima (49 U / ml) a 120 h de incubación.. de forma independiente). India). La máxima producción de proteasa (56.2 a 45.7 Um / l en condiciones de agitación en comparación con condiciones imperturbable. Los resultados indicaron que la alta cantidad de enzima puede ser producido en entre el rango de temperatura de 15 a 25 ° C (Figura 2a). Sin embargo. La máxima producción de enzima era alcanzado a pH 9 (62. La reflectancia relativa de las piezas de tela fueron examinados para probar enzima la eficiencia de la eliminación de manchas. El rendimiento de lavado se analizó mediante el uso reflectancia digital de metro (Foto instrumentos eléctricos. pero fue dentro de un estrecho rango de pH.savia. Se permitió que las piezas de tela sucios para sentarse durante la noche y tomada en frascos separados. El pH de la cultura afecta en gran enzimáticos procesos y transporte de compuestos a través de la célula membrana. BSA (37.2 U / ml) a 120 h de incubación y 20 ° C (Figura 2b). 2003) RESULTADOS Y DISCUSIÓN Optimización de la producción de enzimas Efecto del tiempo de incubación Se observó el patrón de crecimiento y producción de enzimas de 168 horas en los medios de producción de la proteasa a 15 ± 2 º C (pH 7). Por lo tanto. Piezas de tela sin tratar manchados con la sangre y la hierba savia se tomaron como control (Beg y Gupta. Similar a muchas enzimas proteolíticas.2 U / ml) se obtuvo a 20 º C y totalmente inhibido en 45 ° C. La enzima la producción fue de crecimiento independiente (Figura 1). b) frasco que contiene agua destilada (98 ml) + paño manchado + 2 ml detergente de la rueda (1% w / v).6 U / ml) y se albúmina de huevo (26.3 U / ml). c) frasco que contiene agua destilada (96 ml) + paño manchado + 2 ml detergente de la rueda (1% w / v) + 2 ml de enzima en bruto. 2001. La producción de enzimas fue reforzada por Cu 2 + (126. La proteína de pellets obtiene después de 80% de saturación de sulfato de amonio fue disuelto en tampón de acetato de sodio y se cargó en una DEAE-celulosa columna pre-equilibrada con el mismo tampón.6%). mientras que Co 2 + (43.8%) y Cr 2 + (134. Purificación y caracterización de la proteasa La enzima se purificó parcialmente por solo paso de iones cromatografía de intercambio. El perfil de elución de la columna de DEAEcelulosa . Cd 2 + y Zn 2 + no tienen ningún efecto significativo pero mantener más de 50% de la producción de enzimas.5%) peor producción.diferentes cepas de la Antártida sea comunicada por Dube y colaboradores (2001) Efecto de iones metálicos Los metales pesados presentes en el entorno juegan un importante papel en el crecimiento de las bacterias. Los otros metales pesados tales como Hg 2 + . 1 a 1 M. pH 5).6 M) se concentró para su posterior aplicación.6 M Concentración de NaCl (Figura 3). 1975). La la actividad de la enzima no se vio afectada después de repetidas congelación y descongelación. Las proteasas de estas características y sus productores organismos pueden tener aplicaciones interesantes en procesos biotecnológicos. (2005) para purificarse proteasa de Pedobacter cryoconitis. Similar resultado se también obtenido por Margesin et al. lo que sugiere que la proteasa purificada era homogénea Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de proteasa y estabilidad La enzima era activa sobre el rango de pH de 7 a 11 con la actividad máxima a pH 10 hacia azocaseína. Los resultados que recomienda la enzima es proteasa alcalina. La actividad de proteasa fue aumentó de 4 a 20 º C después de que se ha rechazado. Cromatografía de intercambio iónico de DEAE-celulosa de sulfato de amonio precipitado con S. maltophilia sobrenadante de cultivo. La elución se realizó con gradiente de NaCl 0. y 84% de la actividad total de la enzima se manifiesta entre los pH 8 y 11 (Figura 4a).964 U / mg y migró como una sola banda en SDS-PAGE. El efecto de la la temperatura en la actividad de la proteasa se muestra en la Figura 4b. Era relativamente estable entre los intervalos de pH de 8 a 10 y retenido más de 93% de su actividad original (Figura 4a). . Precipitado dializada se aplicó a una columna (3x12 cm) equilibrada en acetato de sodio tampón (0. La temperatura óptima de 20 º C se retiene el 100% de actividad de la enzima y por lo tanto puede ser clasificado como en frío proteasa tolerante (Morita. Aproximadamente 55 veces la purificación de la enzima en bruto se logró con la actividad específica de 20. cromatografía expuesto que la proteasa se eluyó como un pico único bien resuelto de actividad de la enzima en 0. El material removido de la columna (fracción de 0. La actividad aumentó casi linealmente desde pH 6 a 10.02 M.Figura 3. La enzima fue estable a 20 º C junto con la actividad 85% entre 4 a 20 ° C (Figura 4b). Proteasa purificada a partir S. La actividad relativa se define como el porcentaje de actividad detectada con respecto a la máxima actividad de proteasa . Similar masas moleculares también se ha informado de otra proteasas alcalinas previamente caracterizados (Thangam y Rajkumar. La actividad proteolítica de la proteína banda fue confirmada por análisis de zimograma. Por interpolación. Similar resultados se obtienen también por otros trabajadores de diferentes cepas de Bacillus sp.. y la temperatura (b) en la actividad (♦) y la estabilidad (○) de la purificado proteasa. se espera una buena proteasa detergente ser estable en presencia de detergentes comerciales en baja temperatura para el lavado en frío. Estabilidad de la proteasa con detergente y lavado análisis de rendimiento a baja temperatura Además de pH. 2003. 2002). la masa molecular del polipéptido único cadena era 75 kDa. maltophilia expuesto tremenda estabilidad y compatibilidad con una amplia gama de localmente disponibles detergentes comerciales a 20 ° C (Figura 5a). pero a 60 ° C (Adinarayana et al.La masa molecular de la proteasa La masa molecular de la enzima se determinó en la base de su movilidad relativa a los patrones de proteínas en SDS-PAGE mediante el uso de sistema de documentación de gel. Era más estable con Figura 4. 2003). Beg y Gupta. Influencia del pH (a). 5 y 1. es evidente a partir de la figura 5b que la proteasa alcalina de S.7 y un 23. (A) de tela manchada con . maltophilia en la presencia de detergentes comerciales a pH 10 y 20 º C de temperatura.0 h de incubación (Figura 5a). (B) Lavado el rendimiento de la proteasa alcalina a partir de S. El presente análisis microbiano concluyó que aísla la proteasa alcalina a partir de S. puede ser recomendado que la suplementación de la frío-activa aislado proteasa alcalina a partir de S.. maltophilia exhibió alta eficiencia para la extracción de sangre y manchas de hierba a 20 º C y los aumentos la reflectancia en un 25. La capacidad de los microorganismos para crecer más amplia gama de temperatura los hace atractivos para los aplicaciones industriales y biotecnológicas (Kuddus y Ramteke. Cuando. más de Actividad de 65% se mantuvo con toda la probada detergentes. 2000). Sin embargo. Por lo tanto. maltophilia en combinación con detergente comercial (Rueda) a 20 º C. Estas propiedades indican las posibilidades de esta proteasa como un aditivo detergente para el lavado en frío para mejorar la la limpieza de las manchas proteínicas. (A) La estabilidad y compatibilidad de la proteasa alcalina de S. maltophilia MTCC 7528 podrían significativamente animar la limpieza de la manchas proteináceas que resulta en la remoción completa manchas a baja temperatura. El lavado con Figura 5. En comparación con la anterior resultados.«Detergente Wheel 'conserva la actividad 92 y el 87% después de 0. maltophilia MTCC 7528 es una proteasa activa en frío que es estables a pH alcalino y con detergentes comerciales. 2009). Conclusión La alta actividad de las enzimas a bajas y moderadas temperaturas ofrece potenciales beneficios económicos (Gerday et al. respectivamente (Figura 5b). incluso después de 3 h.2% de la sangre y la hierba manchas. (B) Tela manchada de sangre se lava con detergente solo. Por lo tanto. (F) Grass tela manchada savia lava con detergente y enzima. (E) Hierba savia manchado tela lavada con detergente solo. la reducción de la temperatura de lavado mediante el uso de frío-activa proteasa puede ahorrar mucha energía. (D) de tela manchada con la hierba savia. .sangre. (C) paño manchado de sangre lavó con detergente y enzima. detergentes también requiere una gran cantidad de energía en particular cuando hecho a alta temperatura debido a base de peróxido blanqueadores necesitan mayor temperatura para que funcione correctamente. El organismo también puede encontrar aplicaciones en biorremediación ambiental de los residuos proteínicos en las regiones frías.
Report "Biodetergentes se prefieren sobre los detergentes sintéticos convencionales en vista de su mejor limpieza"