ÍNDICE Introducción Concepto Tipos de bandeo Bandeo C Bandeo G Bandeo Q Bandeo R Bandeos dinámicos Nomenclatura Bandas GTG Análisis de micro arreglo cromosómico Fundamento de la hibridación genómica comparada Hibridación genotípica comparada Dedicatoria Quiero dedicarle este trabajo A Dios que me ha dado la vida y fortaleza para terminar este proyecto de investigación, A mis Padres por estar ahí cuando más los necesité; en especial a mi madre por su ayuda y constante cooperación, por apoyarme y ayudarme en los momentos más difíciles. Introducción Desde una perspectiva histórica y en forma sucinta, los sistemas de identificación de los cromosomas humanos y varios métodos de bandeo detectadas en dicho segmento cromosómico. algunos aspectos moleculares implícitos en estas metodologías con el propósito de contribuir al esclarecimiento de los variados aspectos revelados por dichos métodos sobre las estructuras cromosómicas subyacentes. asimismo.cromosómico desarrollados en las últimas cuatro décadas. Finalmente. Se describen también los procedimientos analíticos desarrollados en nuestro laboratorio para el estudio de núcleos y cromosomas como así los resultados obtenidos sobre el análisis cuantitativo de la región subtelomérica y su probable relación con las aberraciones crípticas. generalmente imposibles de distinguir morfológicamente. Se relatan ámbitos y hechos acontecidos –varios de los cuales protagonizó el autor– que originaron la actual moderna citogenética estructural y molecular. se realiza un breve relato sobre las aplicaciones del bandeo cromosómico en el proyecto del genoma humano y su posible utilidad en los experimentos de síntesis artificial de núcleos celulares eucarióticos. y que consistente en . Se mencionan. Bandeo cromosómico CONCEPTO Técnica utilizada para diferenciar pares cromosómicos individuales. de particular significado en biología. productoras de retardo mental y malformaciones congénitas. que se incluye para eliminar las proteínas . En algunas especies los pares cromosómicos no pueden diferenciarse claramente considerando sólo sus componentes distintivos en sentido longitudinal. la combinación de ADN y otras proteínas que forman el núcleo. Consiste en someter a los cromosomas a desnaturalizaciones. y que corresponden a los distintos tipos de cromatina.usar tinciones diferenciales a lo largo de cada cromosoma. a digestión enzimática o a ambos. Bandeo C El bandeo C es una forma de bandeo cromosómico que tiñe los centrómeros. Los cromosomas se identifican en base a los patrones de bandas y la ubicación de los centrómeros. Esto hace que los cromosomas se tiñan con una serie de bandas claras y oscuras. de tal manera que se induce la aparición de zonas heterocromáticas con una distribución característica en forma de bandas. cada cromosoma se presenta con un patrón característico de bandas. o bandeo G. y la heterocromatina constitutiva. Queda condensada y tiñe oscuro. La heterocromatina es una variedad de la cromatina. En una especie dada. es un tratamiento de cromosomas que usa tripsina. que evidencian "bandas" transversales (oscuras y claras) a lo largo de los mismos. Cuando se tiñen. seguido de una tinción con colorante específico para ADN. en estos casos se debe recurrir a técnicas citológicas especiales para la tinción de los cromosomas. estas variantes de la cromatina presentan un tamaño y disposición constante La Tipos de bandeo tinción se utiliza para distinguir los 24 diferentes tipos de cromosomas humanos. incluso en las células de interfaz no dividida. Bandeo G La tinción de giemsa. Las bandas teñidas aparecen como bandas oscuras sobre fondos no teñidos. que son las regiones de ADN que se encuentran cerca de la mitad de un cromosoma donde dos cromátidas hermanas vienen en contacto más cercano. que son células que se preparan para dividirse. El resultado es un patrón de bandas de replicación temprana. entonces el bandeo R se emplea para brindar un contraste superior. que es la composición de dos nucleótidos en los lados opuestos de las hebras de ADN y conectados por un enlace de hidrógeno. Éstas se correlacionan aproximadamente a la composición de pares de bases. Bandeo Q El nombre de bandeo Q proviene del hecho de que utiliza mostaza de quina crina para teñir cromosomas. Cada par de cromosomas se tiñe con un distintivo patrón de bandas claras y oscuras. en un periodo temprano de la replicación.cromosómicas. Si las bandas G y Q se tiñen mal. el cromosoma se examina usando microscopía fluorescente. Las bandas T son las R que se tiñeron de manera más intensa. así como secuencias repetitivas de ADN. . Bandeo R Al tratar a los cromosomas antes de teñirlos. La técnica es útil para detectar heteromorfismos. con calor o productos químicos particulares. El giemsa se utiliza para teñir cromosomas y para identificar aberraciones cromosómicas. las bandas oscuras son llamadas bandas Q y corresponden muy de cerca a las bandas G. Es la inversa del bandeo C y tiñe las regiones no centroméricas. como la timidina tritiada. Si se hubiese añadido la timidina tritiada en un momento tardío de la replicación. Métodos dinámicos Se aplica sobre las células en cultivo. como reordenamientos y translocaciones. para que se vaya añadiendo al ADN. Algunas de las bandas mostrarán fluorescencia brillante y otras aparecerán oscuras. Después de esto. Las bandas oscuras son llamadas bandas G. preferiblemente a los centrómeros. las bandas coincidirían con las G. permitiendo así que las bandas se lean más fácilmente. Bandeo T Identifica un subgrupo de bandas R que están concentradas sobre todo en los telómeros. que suele coincidir con las bandas R. las bandas claras y oscuras que aparecen están invertidas. El bandeo G se utiliza a menudo en la detección de la malaria y otros parásitos. Uno de ellos es añadir isótopos radiactivos. que son variaciones normales en la apariencia de los cromosomas. Los cromosomas pueden ser visualizados utilizando diferentes métodos de tinción. Se denomina también bandeo de replicación debido a la relación existente entre el tiempo de incorporación del BrdU y el patrón de replicación. en el ADN durante la fase S del ciclo celular. los cromosomas pueden visualizarse utilizando distintos métodos de tinción que emplean colorante tales como el Giemsa o el naranja de acridina o utilizando anticuerpos específicos. Los bandeos dinámicos: se obtienen basándose en: técnicas que implican la incorporación de una base análoga. Cuando se incorpora BrdU durante la fase de replicación temprana se obtiene un patrón de bandeo R destacándose las regiones ricas en G-C. coloraciones con fluorocromos específicos aislados o combinados con colorantes no fluorescentes. contricciones secundarias. fracturas cromosómicas. Estos bandeos pueden ser a su vez clasificados en: técnicas de tinción diferencial.Los bandeos cromosómicos hacen posible que se tenga un mayor conocimiento acerca de la estructura cromosómica y de los reordenamientos que se producen en las distintas alteraciones tales como: fusiones y fisiones céntricas. duplicaciones. . bromo-desoxiuridina (BrdU). inverciones peri y paracéntricas. etc. Por otro lado si se incorpora la base análoga durante la fase tardía de replicación se obtiene un patrón de bandas G. y tinciones con anticuerpos fluorescentes. destacándose las zonas de predominio de secuencias A-T. métodos de tinción selectiva. gapss. Existe en ellos una relación con proteínas (histónicas y no histónicas) e interacciones ADN. translocaciones recíprocas y en tandem. Luego de realizada esta técnica. delecciones. Por otro lado permiten realizar estudios evolutivos de especies relacionadas entre si Los bandeos cromosómicos pueden clasificarse en morfológicos y dinámicos: Los bandeos morfológicos: se obtienen basándose en técnicas inherentes a la heterogeneidad de la cromatina.. RHG: Bandas R mediante desnaturalización térmica utilizando Giemsa. la técnica de detección empleada y la tercera. QFQ: Bandas Q por fluorescencia usando quinacrina. indica el tipo de bandeo utilizado. En todas las disciplinas siempre existen procedimientos de mayor uso que otros. RFA: Bandas R por fluorescencia usando naranja de acridina. el tipo de tinción. . GBG: Bandas G por incorporación de BrdU utilizando Giemsa. Nomenclatura de bandeos morfológicos. RBA: Bandas R por incorporación de BrdU empleando naranja de acridina. se emplea un código de tres letras: la primera. THG: Bandas T por desnaturalización térmica empleando Giemsa.En relación con la nomenclatura para descubrir los diferentes bandeos cromosómicos. RBG: Bandas R por incorporación de BrdU utilizando Giemsa. GTG: Bandas G por tratamiento enzimático con tripsina utilizando Giemsa. la segunda. así que en este modulo sólo hablaremos de las más bandas cromosomicas mas utilizadas en el cotidiano del ejercicio de la Citogenética. CBG: Bandas C por hidróxido de bario utilizando Giemsa. Nomenclatura de bandeos dinámicos. RB-AAu: Bandas R por incorporación de BrdU usando anticuerpos específicos unidos a partículas de oro coloidal. GB-AAu: Bandas G por incorporación de BrdU empleando anticuerpos específicos unidos a partículas de oro coloidal. La prueba de hibridización preferencialmente fue en las regiones centromericas de los cromosomas. telómeros y ADN satélite y en ocasiones constricciones secundarias como son los NOR’s. Después del descubrimiento de las técnicas de banda C se desarrolladas técnicas para cromosomas de mamíferos. en general estas localizaciones se conocen como centromerica e intercalar y la última categoría incluye todas las otras posiciones (Yunis y Yasmineh. Él fue el primero en sugerir que la coloración oscura del Giemsa coloreaba heterocromatina constitutiva causada por la preferencia del ADN altamente repetitivo durante la renaturalización (<biblio>). En este experimento.Banda C La técnica de Banda C fue descubierta por casualidad y originada en un experimento en donde ADN satélite marcado en ratón fue hibridizado in situ con cromosomas de raton. en un estudio en donde . el ADN del cromosoma fue desnaturalizado con NaOH y renaturalizado en buffer SSC. 1996) Esta banda se caracteriza por teñir aquellas regiones ricas en heterocromatina constitutiva que corresponden a secuencias de ADN altamente repetitivas. 1978). 1972 citado por Maclean y Vaughan. se encuentran principalmente en centrómero. Mientras en animales se utiliza NaOH para el paso de la desnaturalización. Los sitios hibridizados fueron detectados por autoradiografía usando coloración de Giemsa para cromosomas. Sin embargo también se noto que el Giemsa coloreo otras regiones en otros cromosomas (Fukui y Nakayama. Los sitios de los cromosomas que presentan heterocromatina constitutiva y que tiñen Banda C positiva son 1) en la región del centrómero 2) alrededor de la región organizadora nucleolar 3) cerca del sitio del RNA para 5S y 4) en la parte final de los cromosomas es decir la heterocromatina telomerica. el Ba (OH) 2 es usado para producir banda C en cromosomas de plantas siguiendo el método de Summer. En el campo de la investigación para aclarar que tipo de elementos son los que se remueven dentro del tratamiento de esta banda. con el 11 y el 12 de la misma especie. en muchas especies de animales domésticos se han encontrado complementos cromosómicos que por las técnicas convencionales de coloración no pueden ser ordenados completamente. 9 y X del cerdo. 1996). Por su parte. la detección de un gran número de aberraciones cromosómicas. la que presentaba una banda de mayor intensidad fue la H3 y H4. Lo anterior generó la necesidad de desarrollar técnicas de coloración denominadas de bandeo. 17. del ovino y del caprino. 16. estando presentes también las otras pero en menor cantidad (Burkhoder & Duezek. 15. o sea. 26 y 27 también del equino. Las técnicas de bandeo han permitido tanto en animales como en vegetales. 24. con la correspondiente definición comprometidos en el problema. En plantas esta técnica identifica las secuencias que contienen gran cantidad de ADN repetitivo. Por ejemplo en cultivos de centeno Secale cereale en hibridización in situ es utilizada para detectar zonas de ADN altamente repetitivo de las cuales solamente unas pocas colorean Banda C positiva (Fukui y Nakayama. y con gran parte de los cromosomas del bovino. característicos de cada cromosoma que permiten identificar los cromosomas sin ambigüedades (Henao y Gómez. la estandarización de las técnicas en Banda C han mejorado en su resolución y el método ha sido utilizado para la identificación de cromosomas. con los cromosomas 23. 1980) Para cromosomas de plantas. debido a la presencia de cromosomas con rasgos morfológicos muy similares. Bandas Ag-NOR de los componentes del complemento . con los cromosomas 14. aquellas que producen patrones constantes de bandas claras y oscuras. 1997).se analizó HCl 0. Esto sucede. 18 y 19 del equino. por ejemplo: con los cromosomas 8. 25. también.2 N el cual es una de las soluciones utilizadas para realizar tratamiento para banda C se encontró por medio de electroforesis la presencia de las 5 proteínas histónicas. el componente fibrilar. el componente granular.Durante la metafase estos están localizados generalmente dentro de la constricción secundaria (Howell 1982) Citado por (Fakan y Hernández-Verdun. Los espacios pueden ser transcritos. y la cromatina condensada asociada. es positiva siempre y cuando las Regiones Organizadoras Nucleolares hayan estado en actividad la interfase inmediatamente anterior al momento de . de las secuencias para ARN-r 18S y 28S intercalado con secuencias espaciadoras. su coloración es debido a la afinidad con el Nitrato de Plata. 1993) Este tipo de banda se debe específicamente a la presencia de las proteínas afines a la actividad transcripcional en los cistrones ribosomales (Henao y Gómez. El comportamiento del nucleolo en proliferación celular es llamado ciclo nucleolar. pero su transcripción nunca incluye un ribosoma maduro. se considera que el ciclo comienza cuando el nucleolo se organiza nuevamente seguido de las fases de la mitosis. 1982) Ante todo y de gran importancia es de anotar que esta banda es funcional.Se conoce como bandas Ag-NOR aquella que colorea las Regiones Organizadoras Nucleares (de ahí la nomenclatura NOR) en ocasiones son también llamadas Banda N. Usualmente se refiere a ADN ribosomal (ADN-r) como una repetición de genes con secciones en tamdem arregladas y agrupadas dentro de uno o varias regiones del set de cromosomas (Champman y may. el intersticio nucleolar. es decir el nucleolo no es una entidad nuclear individual (De la Torre y Jiménez-Martín. es decir. 1984) En eucariotas el organizador nucleolar consiste de múltiples repeticiones arregladas en tandem. (Goessens. 1997). 1986). el nucleolo esta compuesto por cinco componentes estructurales. se considera que el ciclo comienza en el momento en que en interfase este o no la decisión de entrar en proliferación o diferenciación. La Región Organizadora Nucleolar es el sitio en donde están localizados los genes de ADNr. el centro fibrilar. 1986). 1984 citados por Sanchez et al. Galetti et al. 1994) . 1981. el nucleolo crece durante la interfase. La variación intraespecífica puede ser usada para averiguar el origen maternal y paternal de los cromosomas en un individuo (Mellink et al. 1990). parece ser que las alteraciones en los NOR ocurren normalmente con relación a la diferenciación y evolución de las especies (Oberdorff et al. 1986 citado por Oberdorff et al. 1986 En un estudio sobre proteínas asociadas con los NOR’s se estableció que estas son no histonicas y son “argyrophilic” Las proteinas NOR están estrictamente localizadas dentro del centro fibrilar y el componente fibrilar denso del nucleolo interfasico (Fakan y Hernández-Verdun. pues tanto los cromosomas portadores de NOR como la posición en el cromosoma son usualmente diversos entre especies (Disney y Wright. Un análisis morfo-funcional de las Regiones Organizadoras Nucleolares teniendo en cuenta los ciclos circadianos demostró la relación directa del centro fibrilar (uno de los componentes del NOR) con la actividad nucleolar. 1990). La talla final del nucleolo maduro en el ciclo celular aparentemente no es una función estrictamente lineal del numero de genes ribosomales que el NOR posee (De la Torre y Jiménez-Martín.. 1999) “con la banda NOR se puede establecer el grado de variabilidad de los patrones inter e intra específicos entre especies y/o poblaciones. 1990). La diferencia en talla entre NORs homólogos ha sido descrita en varias especies de vertebrados (Miller et al. (Fakan y Hernández-Verdun. algunas veces el volumen es proporcional al incremento tanto del componente fibrilar y el granular. En general.. 1987. pero en mayor proporción de la acumulación del componente granular. antes basadas principalmente en datos morfológicos (Amemiya y Gold.realizar la banda.. Son varias las aplicaciones de las bandas NOR entre otras se tiene que: (tomado de Camacho. Ruiz el al.. 1990). Takai y Ojima. Esta variación interespecífica ha sido utilizada para probar hipótesis filogenéticas e inferir otras. 1977. es decir la banda se expresa en las metafases obtenidas cuando los genes de ADNr hayan sido transcritos. 1982). También se realizo técnicas de una banda N secuencial con hibridación in situ para identificar cromosomas con las la posición especifica de ADN. en términos generales. y como su nombre lo indica. es conocido como ASG (Acid-SalineGiemsa) y se constituye en la primera técnica de bandas G conocida. 1994)”. el método más usado en la actualidad es el conocido con el nombre de bandas GTC (bandas G por Tripsina usando Giemsa como colorante). En esta modalidad se logra la denaturación proteica mediante un tratamiento con 2XSSC (Solución Salina Citratada) caliente. se basa en un tratamiento que altera la estructura de las proteínas cromosómicas seguido de una coloración. Esta técnica que. El método de denaturación térmica descrito por Sumner et al.constituyéndose la actividad del NOR como una propiedad heredable cuyo tipo de transmisión puede ser mendeliana (Jotterand y Van Melle. 1982 citado por Mellink et al. Sin embargo. Se asume que el mecanismo por el cual se produce el patrón de bandeo G es porque el colorante interactua con las proteínas de cromosoma. En plantas se encontró también que el método servia no solo para localizar Regiones Organizadoras Nucleolares sino para identificar cromosomas en cereales. fue introducido por Seabright en 1971. de esta manera se permite una asignación directa de los sitios de hibridización con cromosomas individuales (Fukui y Nakayama. la metafase primero es identificada en sus patrones de bandas y después se destina para hibridización in situ así se puede recurrir a la misma célula en metafase. 1996) Bandas GTG Las bandas G deben su nombre al hecho de que en todas sus modalidades se emplea Giemsa para colorear los cromosomas. al parecer ricas . además los NOR activos muestran variación de generación en generación mientras los inactivos no (Zakharov et al. 1981). es la más usada en mamíferos. por permitir excelentes preparaciones permanentes sin requerir el uso de microscopio de fluorescencia. (1971). se basa en una digestión enzimática con Tripsina. además de encontrar una relación entre bandas C y Namda N lo cual fue clarificado por Schlegel y Gill. Por su parte en plantas los reportes son pocos. S. La técnica original se basa en una denaturación térmica selectiva en buffers de diversa naturaleza. que se presentan en segmentos de DNA de replicación tardía. con alto contenido de Adenina y Timina. el inverso (reverse) de las bandas G. que la extracción diferencial de proteínas ocurrida durante la fijación y los tratamientos de denaturación. y con relativamente pocos genes activos (Henao y Gómez. en términos generales. 1971). Se acepta. se estableció diferencias con los patrones obtenidos en banda C. se identificaron los cromosomas homólogos por los patrones de tipo de bandas oscuras y claras. y las G-negativas son R-positivas. y en grupos sulfhidrilo en las negativas (claras) (Verma y Babu. seguida por una coloración de cromosomas con Giemsa (Dutrillaux y Lejeune. además. se asume que depende de la denaturacióm selectiva que produce el . consideran que las bandas G oscuras corresponden con las cromómeras del paquiteno. e inclusive su existencia se ha puesto en duda. o sea. Aunque los resultados obtenidos son prometedores en este caso se hace necesario mejorar antes las técnicas antes de utilizarlas en la identificación de cromosomas en plantas (Fukui y Nakayama. se les denomina bandas RHG para significar que son bandas reversas obtenidas por calor usando Giemsa como colorante. mientras banda C positiva produce grandes bandas telomericas y algunas intersticiales Banda G produce más intersticiales que banda C negativa. juega un papel muy importante en la obtención de estas bandas. las bandas G-positivas son R-negativas. Respecto al mecanismo de producción de este patrón de bandeo. cereale al construir el cariograma después de tratamiento de banda G. Rooney y Czepulkowski (1987). 1989).en grupos disulfuro en las bandas positivas (oscuras). 1996) Bandas RHG Este patrón de bandas es. 1999) La banda G ha sido reportada en muchos grupos animales pero por ejemplo en varias especies de peces esta banda no resulta positiva pues al parecer muchos de ellos no poseen compartamentalizadión del ADN en isocoros quienes serian los responsables del bandeamiento. Sin embargo en un análisis de centeno. los cuales no causan enfermedades genéticas. como un desequilibrio cromosómico.calor en ciertas zonas del cromosoma. Los tipos de anomalías cromosómicas pueden incluir pequeñas reordenaciones cromosómicas. Una muestra del ADN del individuo a examinar y una muestra de ADN para control se disponen en un orden (arreglo) particular sobre un portaobjetos de vidrio. Sin embargo. las que resisten el calor. Análisis de Microarreglo Cromosómico Un análisis de microarreglo cromosómico (CMA. Luego se colocan los portaobjetos en un lector especial que mide el brillo de cada área fluorescente. las de mayor importancia son las bandas C y las bandas NOR. Estos cambios en los números de copias de ADN pueden representar cambios observados en la población general. Entre los tipos de microarreglos tenemos: . por su aporte tanto a la identificación cromosómica como a los estudios de heteromorfismos. por sus siglas en inglés) es un nuevo análisis que se utiliza para detectar desequilibrios cromosómicos a una resolución mayor que las técnicas cromosómicas estándar actuales o las técnicas FISH. es preciso resaltar la importancia de las bandas G y de las bandas R en la definición de los cariotipos de la mayoría de los animales de importancia zootécnica. Entre las múltiples técnicas de coloración diferencial conocidas hoy. algunos cambios en los números de copias pueden indicar una anomalía cromosómica. en este caso las bandas oscuras son las zonas ricas en Guanina-Citocina. o sea. al parecer asociadas con segmentos de DNA ricos en Adenina-Timina. 1999). A las muestras de ADN se añade colorante fluorescente. Verma y Babu (1989) describen el siguiente protocolo para estas bandas: (Henao y Gómez. o pequeñas supresiones de material cromosómico (monosomia). pequeñas duplicaciones de material cromosómico (trisomia). Este proceso busca identificar un cambio en el número de copias de ADN. pérdida o ganancia. Entre las técnicas selectivas. En este tipo de microarreglos se usan grandes porciones de ADN genómico que sirven como ADN inmovililizado en el plato y cada punto o spot de ese ADN representa una región cromosómica conocida. Una vez que los investigadores han establecido que un SNP se relaciona con una enfermedad de interés. pequeña variación genética que puede ocurrir dentro del ADN de un individuo. el material colocado en otros pozos puede diferir solamente en uno o en unos cuantos nucleótidos. una gran cantidad de ADN de la muestra se hibridizará en los puntos o spots del microarreglo que representan el gen involucrado. proveniente de tejido enfermo y tejido sano. pueden usar la tecnología para detectar quiénes . mientras que al utilizar muestra proveniente de tejido sano sólo un pequeño número se hibridizará en el mismo punto.Microarreglos que detectan ganancias y pérdidas de genes (pérdida de heterogenicidad) Ciertas pérdidas o ganancias cromosómicas están relacionadas con la progresión del cáncer y los patrones de estos cambios son importantes para establecer un pronóstico clínico. La técnica de Microarreglos de Hibridización Genómica Comparativa permite visualizar ganancias y pérdidas o cambios en el número de copias de un gen particular involucrado en determinada patología. Los resultados pueden ser visualizados en diagramas jerárquicos referidos como " modelos en árbol de progresión del tumor”. Si el número de copias del gen de interés están aumentadas. el ADN inmovilizado suele ser un único gen. Un tipo de secuencia que suele utilizarse para este tipo de análisis son los Single Nucleotide Polymorphism (SNP) o Polimorfismo de nucleótido único. Dicha diferencia en la cantidad de material hibridizado podrá reflejarse en fluorescencias disímiles y así será detectado por el escáner y por los programas de lectura. Microarreglos que detectan mutaciones en el ADN Cuando se utilizan los microarreglos para detectar mutaciones o polimorfismos en una secuencia génica. Con el uso de microarreglos y el análisis de sus resultados se podría predecir cuáles regiones cromosómicas contienen genes que inician y mantienen procesos tumorales. En este tipo de experimento se necesita ADN genómico derivado de una muestra normal para ser usado en la mezcla de hibridización. La mezcla a hibridizar contendrá ADN genómico marcado. El análisis digital de las metafases capturadas cuantifica La proporción de verde y de rojo en todos los cromosomas de manera que si existe una ganancia de material genético en una determinada región cromosómica se producirá un aumento de la fluorescencia verde a ese nivel.tienen o son susceptibles de tener la enfermedad. el ADN tumoral y el ADN normal han sido marcados con dos fluorocromos diferentes (por ejemplo. Previamente. ya que el ADN se puede obtener de tejido en parafina. Su aplicación al estudio de los tumores ha puesto de manifiesto que en la mayoría de las neoplasias hay alteraciones genéticas. Cuando el ADN genómico de un individuo se hibridiza con un arreglo cargado de varios SNPs. la HGC ha . Con ella se pueden conocer alteraciones numéricas (pérdidas o ganancias de material genómico). pero no la presencia de translocaciones recíprocas. mientras que si hay una pérdida de material genético se producirá una disminución de la fluorescencia verde y por tanto un aumento relativo de la fluorescencia roja. el ADN tumoral con un fluorocromo verde y el ADN normal con uno rojo) lo que permitirá su posterior identificación mediante un microscopio de fluorescencia. Esta técnica presenta la ventaja de no necesitar material en fresco. El cariotipaje posterior se realiza sobre la base de la tinción con DAPI de los cromosomas. La HGC ha sido la primera técnica combinada de citogenética e hibridación in situ fluorescente que ha permitido realizar un análisis global del genoma. Fundamento de la hibridación genómica comparada La HGC consiste en la hibridación competitiva entre ADN tumoral (test) y ADN normal (referencia) sobre metafases normales en presencia de un exceso de ADN Cot-1 humano. Estos puntos del microarreglo tendrán mayor fluorescencia y se demostrará que dicha persona es susceptible o tiene determinada enfermedad Hibridación genómica comparada En la HGC se produce la hibridación de ADN tumoral y ADN normal frente a cromosomas normales. el ADN muestra (target) se hibridizará con mayor frecuencia con los SNPs asociados al individuo a estudio. Puesto que las alteraciones en el número de copias de ADN de determinadas regiones tienen una gran importancia en la patogenia del cáncer. se ha utilizado en hemopatías malignas. Estos resultados. Otra aportación importante de la HGC al conocimiento De la patogenia de los linfomas ha sido la demostración de que la amplificación es otro mecanismo que causa sobreexpresión de la proteína bcl-2. sugieren que probablemente el SKY no es la técnica de elección para el estudio de casos con un resultado citogenético normal. Las neoplasias linfoides B representan el grupo más estudiado y más concretamente los linfomas no Hodgkin (LNH) en los que se ha demostrado que las amplificaciones constituyen una alteración más frecuente de lo que se suponía. se pensó que el SKY podría detectar alteraciones en los pacientes con neoplasias hematológicas pero que presentaban cariotipo normal. y que se asocian generalmente a linfomas agresivos. Lo importante es valorar qué tipo de estudio se debe utilizar en cada caso. Esto se aplica también al SKY. El cariotipo convencional permite analizar un mayor número de metafases y proporciona una descripción más exacta de las bandas implicadas en los reordenamientos.despertado gran interés en el estudio de las neoplasias. puesto que la HGC no requiere metafases de las células tumorales y no está afectada por la selección clonal inherente a los cultivos celulares. La . En conclusión. La HGC ha sido utilizada de forma más amplia en el estudio de los tumores sólidos que de las neoplasias hematológicas. entre otras razones por la dificultad que entraña obtener mitosis en los tumores sólidos. el SKY puede representar un importante instrumento en el análisis citogenético. Algunos trabajos recientes muestran que el SKY detecta alteraciones crípticas en un porcentaje muy bajo de estas muestras. y porque los reordenamientos no recíprocos y las amplificaciones génicas se producen con más frecuencia en ellos que en las neoplasias hematológicas. Cuando se desarrolló la técnica. añadido al ya conocido mecanismo de translocación. especialmente en casos con cariotipos complejos. que siempre se debe utilizar como un método complementario del análisis de bandas G. No obstante. junto con el hecho de que es una técnica laboriosa y cara. son complementarias unas de otras. Las distintas técnicas genéticas no se excluyen. si se sospecha que un bebé padece del síndrome de Down de trisomía 21 y se realiza una amniocentesis durante la gestación. Por ejemplo. La Hibridación Fluorescente In Situ (Su sigla en inglés es FISH) La hibridación fluorescente in situ es una técnica de laboratorio que determina cuántas copias de un segmento específico de ADN existen en una célula.capacidad de discernir de células leucémicas diferencias similares genéticas morfológica e entre poblaciones inmunológicamente está ayudando a establecer las bases para una revisión de la clasificación de neoplasias hematológicas. Los Estudios Cromosómicos De Bandeo Extendido Los estudios de bandeo extendido o de "alta resolución" implican el estudio de los cromosomas con una resolución más alta que la del análisis cromosómico estándar mencionado anteriormente. También se utiliza para identificar cromosomas con estructuras anómalas. de este modo. las células detectadas en el líquido amniótico pueden estudiarse a través de una hibridación fluorescente in situ. Los cromosomas están dispuestos de manera tal que se alargan un poco. La utilización conjunta de estas técnicas está aportando datos a una investigación dirigida a identificar factores pronósticos en estos pacientes. anomalías cromosómicas estructurales más pequeñas que no pueden ser vistas en un análisis de rutina. Este ADN se conoce como "sonda". En el laboratorio. Esto permite observar partes más reducidas del cromosoma e identificar. las sondas pueden detectar segmentos homólogos de ADN. se modifica químicamente un segmento de ADN y se lo marca de manera que pueda ser visto fluorescente (muy brillante) utilizando un microscopio especial. por lo que se pueden ver más bandas. Una sonda hecha para el cromosoma 21 puede . Cuando se las coloca en las células bajo ciertas condiciones. El estudio de hibridación fluorescente in situ no reemplaza un estudio cromosómico estándar. Se advierte la presencia de una pérdida de 7q tanto en metafase como en interfase.determinar la cantidad de copias del cromosoma 21 que el bebé posee. Cuando se utiliza la hibridación fluorescente in situ (su sigla en inglés es FISH) específicamente para buscar anomalías cromosómicas en esta zona. pero que varían de un cromosoma a otro. síndrome de Klinefelter) como en los tumores (trisomía 8 o monosomía 7 en leucemias agudas). Hibridación in situ fluorescente de doble color en un enfermo con leucemia aguda mieloblástica y pérdida en 7q. sino que lo complementa según el defecto congénito del que se trate. Las sondas centroméricas permiten identificar alteraciones de tipo numérico. que son específicas de cada centrómero. Con un microscopio especial. en donde la sonda detectó los tres cromosomas 21. "Telómero" es un término que se utiliza para describir los extremos de los cromosomas. El centrómero del 7 se observa en color verde y en color rojo está marcada una secuencia específica de 7q. se vería que las células del bebé con trisomía 21 contienen tres "marcas" o tres áreas brillantes. Las sondas usadas en la FISH se pueden clasificar en: Sondas que identifican una estructura específica y repetitiva del cromosoma Estas sondas hibridan con las secuencias α y ß satélite adyacentes al centrómero. La hibridación fluorescente in situ se puede utilizar para detectar anomalías cromosómicas estructurales (como las delecciones submicroscópicas) que se encuentran más allá de la resolución de los estudios cromosómicos de bandeo extendido. se la denomina " examen subtelomérico FISH”. especialmente monosomías y trisomías y otras aneuploidías tanto en las cromosomopatías (Síndrome de Turner.síndrome de Down. . 22)(q34. en el linfoma del manto (fig. donde BCL-1 se transloca a la región de la cadena pesada de las inmunoglobulinas. Sondas que hibridan con una única secuencia de ADN Estas sondas permiten sobre todo detectar reordenamientos estructurales de genes o de regiones cromosómicas concretas. 3.14)(q13. en la leucemia mieloide crónica o la t(11. La sonda específica del gen en la cadena pesada de las inmunoglobulinas se ha marcado en verde y la del gen de la ciclina D1 (BCL-1) en rojo. Para poder utilizarlas es necesario conocer a priori la región candidata a estudio en cada patología.q32). y c) el estudio de genes que se amplifican. 21) (p12. como la t (12. cromosomas marcadores. 14). Fig.) difíciles de identificar con la citogenética convencional. Se observa la presencia de fusión de ambos genes en los dos cromosomas derivativos y en el núcleo en interfase (flechas) Análisis de Microarreglo Cromosómico . Sus aplicaciones son: a) la detección de translocaciones cromosómicas tales como la t(9. Hibridación in situ fluorescente en interfase y metafase de un enfermo con linfoma del manto y t (11.Sondas que hibridan simultáneamente con múltiples secuencias del cromosoma Se denominan sondas de pintado cromosómico a aquellos fragmentos de ADN que se obtienen mediante separación cromosómica por citometría de flujo y se marcan directamente mediante DOP-PCR. q22) en la leucemia aguda linfoblástica B del niño. b) el estudio de pérdidas de genes concretos. como N-MYC en el neuroblastoma. etc. Sólo pueden utilizarse en metafase y sirven para detectar alteraciones estructurales (translocaciones. como el gen del síndrome de Prader-Willi. 3). con fusión de los genes BCR y ABL. es decir. se multiplican de manera considerable en el núcleo de la célula tumoral.q11). derivativos. o la pérdida de P53 en tumores. Un análisis de microarreglo cromosómico (CMA. o pequeñas supresiones de material cromosómico (monosomia). algunos cambios en los números de copias pueden indicar una anomalía cromosómica. por sus siglas en inglés) es un nuevo análisis que se utiliza para detectar desequilibrios cromosómicos a una resolución mayor que las técnicas cromosómicas estándar actuales o las técnicas FISH. pequeñas duplicaciones de material cromosómico (trisomia). pérdida o ganancia. los cuales no causan enfermedades genéticas. Los tipos de anomalías cromosómicas pueden incluir pequeñas reordenaciones cromosómicas. Sin embargo. Este proceso busca identificar un cambio en el número de copias de ADN. Una muestra del ADN del individuo a examinar y una muestra de ADN para control se disponen en un orden (arreglo) particular sobre un portaobjetos de vidrio. Los resultados pueden ser visualizados en diagramas jerárquicos referidos como " modelos en árbol de progresión del tumor" . Luego se colocan los portaobjetos en un lector especial que mide el brillo de cada área fluorescente. como un desequilibrio cromosómico. Estos cambios en los números de copias de ADN pueden representar cambios observados en la población general. Con el uso de microarreglos y el análisis de sus resultados se podría predecir cuáles regiones cromosómicas contienen genes que inician y mantienen procesos tumorales. La técnica de Microarreglos de Hibridización Genómica Comparativa permite visualizar ganancias y pérdidas o cambios en el número de copias de . Entre los tipos de microarreglos tenemos: Microarreglos que detectan ganancias y pérdidas de genes (pérdida de heterogenicidad) Ciertas pérdidas o ganancias cromosómicas están relacionadas con la progresión del cáncer y los patrones de estos cambios son importantes para establecer un pronóstico clínico. A las muestras de ADN se añade colorante fluorescente. una gran cantidad de ADN de la muestra se hibridizará en los puntos o spots del microarreglo que representan el gen involucrado. En este tipo de experimento se necesita ADN genómico derivado de una muestra normal para ser usado en la mezcla de hibridización. el ADN muestra (target) se hibridizará con mayor frecuencia con los SNPs asociados al individuo a estudio. En este tipo de microarreglos se usan grandes porciones de ADN genómico que sirven como ADN inmovililizado en el plato y cada punto o spot de ese ADN representa una región cromosómica conocida. Una vez que los investigadores han establecido que un SNP se relaciona con una enfermedad de interés. pueden usar la tecnología para detectar quiénes tienen o son susceptibles de tener la enfermedad. Esta técnica presenta la ventaja de no necesitar . mientras que al utilizar muestra proveniente de tejido sano sólo un pequeño número se hibridizará en el mismo punto. Microarreglos que detectan mutaciones en el ADN Cuando se utilizan los microarreglos para detectar mutaciones o polimorfismos en una secuencia génica. Estos puntos del microarreglo tendrán mayor fluorescencia y se demostrará que dicha persona es susceptible o tiene determinada enfermedad Hibridación genómica comparada En la HGC se produce la hibridación de ADN tumoral y ADN normal frente a cromosomas normales. La mezcla a hibridizar contendrá ADN genómico marcado.un gen particular involucrado en determinada patología. pequeña variación genética que puede ocurrir dentro del ADN de un individuo. Si el número de copias del gen de interés están aumentadas. Cuando el ADN genómico de un individuo se hibridiza con un arreglo cargado de varios SNPs. el ADN inmovilizado suele ser un único gen. Dicha diferencia en la cantidad de material hibridizado podrá reflejarse en fluorescencias disímiles y así será detectado por el escáner y por los programas de lectura. el material colocado en otros pozos puede diferir solamente en uno o en unos cuantos nucleótidos. Un tipo de secuencia que suele utilizarse para este tipo de análisis son los Single Nucleotide Polymorphism (SNP) o Polimorfismo de nucleótido único. proveniente de tejido enfermo y tejido sano. ya que el ADN se puede obtener de tejido en parafina. La HGC ha sido la primera técnica combinada de citogenética e hibridación in situ fluorescente que ha permitido realizar un análisis global del genoma. Puesto que las alteraciones en el número de copias de ADN de determinadas regiones tienen una gran importancia en la patogenia del cáncer. Con ella se pueden conocer alteraciones numéricas (pérdidas o ganancias de material genómico). puesto que la HGC no requiere metafases de las células tumorales y no está afectada por . pero no la presencia de translocaciones recíprocas. y porque los reordenamientos no recíprocos y las amplificaciones génicas se producen con más frecuencia en ellos que en las neoplasias hematológicas. El análisis digital de las metafases capturadas cuantifica La proporción de verde y de rojo en todos los cromosomas de manera que si existe una ganancia de material genético en una determinada región cromosómica se producirá un aumento de la fluorescencia verde a ese nivel.material en fresco. Previamente. la HGC ha despertado gran interés en el estudio de las neoplasias. mientras que si hay una pérdida de material genético se producirá una disminución de la fluorescencia verde y por tanto un aumento relativo de la fluorescencia roja. No obstante. el ADN tumoral y el ADN normal han sido marcados con dos fluorocromos diferentes (por ejemplo. entre otras razones por la dificultad que entraña obtener mitosis en los tumores sólidos. el ADN tumoral con un fluorocromo verde y el ADN normal con uno rojo) lo que permitirá su posterior identificación mediante un microscopio de fluorescencia. La HGC ha sido utilizada de forma más amplia en el estudio de los tumores sólidos que de las neoplasias hematológicas. El cariotipaje posterior se realiza sobre la base de la tinción con DAPI de los cromosomas. Su aplicación al estudio de los tumores ha puesto de manifiesto que en la mayoría de las neoplasias hay alteraciones genéticas. Fundamento de la hibridación genómica comparada La HGC consiste en la hibridación competitiva entre ADN tumoral (test) y ADN normal (referencia) sobre metafases normales en presencia de un exceso de ADN Cot-1 humano. J.W. y que se asocian generalmente a linfomas agresivos. [1] . Trends Genet. Springer Verlag. Capítulo 2. The molecular structure of centromeres and telomeres. Chromosome structure and the C-value paradox. Rev.G. Cell Biol. J. 1984. Genética. Boca RAton. K. se ha utilizado en hemopatías malignas. 1992. T.) 1988. Curr. FL.. Biochem. 1990. 4: 379384. Bibliografía Adolph. New York. Gall.C.H. Opin. Chromosomes and chromatin. Annu. Centromeres and telomeres. 53: 163-194. Cariotipo. 1981. Cell Biol. 1979. C.M. añadido al ya conocido mecanismo de translocación. Vols.la selección clonal inherente a los cultivos celulares. Las neoplasias linfoides B representan el grupo más estudiado y más concretamente los linfomas no Hodgkin (LNH) en los que se ha demostrado que las amplificaciones constituyen una alteración más frecuente de lo que se suponía. A. Stewart. J. Human and mammalian cytogenetics: an historical perspective. a special issue. E. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Otra aportación importante de la HGC al conocimiento De la patogenia de los linfomas ha sido la demostración de que la amplificación es otro mecanismo que causa sobreexpresión de la proteína bcl-2. 1-3. The functional organization of chromosomes and the nucleus. Forma y tamaño cromosómico. Hsu. Universidad Nacional de Córdoba (Argentina). 91:3-14 Blackburn. Szostak. (ed. 6:377-379 Price. CRC Press. and growth of vegetable cells (A. «The structure of yeast nucleic acid». Cell 98: 285–294. London: The Ray Society. ↑ Saltar a:a b Kornberg. and J. doi:10.. «Twenty-Five Years of the Nucleosome.1016/S0092-8674(00)81958-3 . (1999). "Memoir on the nuclei. 415–24. Adlard. J Biol Chem 40 (2): pp. Y. trans. Henfrey. Volver arriba↑ Nägeli C. in C. eds. formation. 1846. Reports and Papers on Botany. R.D. (1919). Fundamental Particle of the Eukaryote Chromosome». Lorch. Volver arriba↑ Levene P.).