BALOTARIO DE LABORATORIO Normas de seguridad de trabajo de laboratorio. No fumes, comas o bebas en el laboratorio.Utiliza una bata y tenla siempre bien abrochada, así protegerás tu ropa. Guarda tus prendas de abrigo y los objetos personales en un armario o taquilla y no los dejes nunca sobre la mesa de trabajo. No lleves bufandas, pañuelos largos ni prendas u objetos que dificulten tu movilidad. Procura no andar de un lado para otro sin motivo y, sobre todo, no corras dentro del laboratorio. Si tienes el cabello largo, recógetelo. Dispón sobre la mesa sólo los libros y cuadernos que sean necesarios. Ten siempre tus manos limpias y secas. Si tienes alguna herida, tápala. No pruebes ni ingieras los productos. En caso de producirse un accidente, quemadura o lesión, comunícalo inmediatamente al profesor. Recuerda dónde está situado el botiquín. Mantén el área de trabajo limpia y ordenada. Normas para manipular instrumentos y productos Antes de manipular un aparato o montaje eléctrico, desconéctalo de la red eléctrica. No pongas en funcionamiento un circuito eléctrico sin que el profesor haya revisado la instalación. No utilices ninguna herramienta o máquina sin conocer su uso, funcionamiento y normas de seguridad específicas. Maneja con especial cuidado el material frágil, por ejemplo, el vidrio. Informa al profesor del material roto o averiado. Fíjate en los signos de peligrosidad que aparecen en los frascos de los productos químicos. Lávate las manos con jabón después de tocar cualquier producto químico. Al acabar la práctica, limpia y ordena el material utilizado. Si te salpicas accidentalmente, lava la zona afectada con agua abundante. Si salpicas la mesa, límpiala con agua y sécala después con un paño. Evita el contacto con fuentes de calor. No manipules cerca de ellas sustancias inflamables. Para sujetar el instrumental de vidrio y retirarlo del fuego, utiliza pinzas de madera. Cuando calientes los tubos de ensayo con la ayuda de dichas pinzas, procura darles cierta inclinación. Nunca mires directamente al interior del tubo por su abertura ni dirijas esta hacia algún compañero. (ver imagen) PRACTICA DE BIOLOGIA U.N.J.F.S.C Todos los productos inflamables deben almacenarse en un lugar adecuado y separados de los ácidos, las bases y los reactivos oxidantes. Los ácidos y las bases fuertes han de manejarse con mucha precaución, ya que la mayoría son corrosivos y, si caen sobre la piel o la ropa, pueden producir heridas y quemaduras importantes. Si tienes que mezclar algún ácido (por ejemplo, ácido sulfúrico) con agua, añade el ácido sobre el agua, nunca al contrario, pues el ácido «saltaría» y podría provocarte quemaduras en la cara y los ojos. No dejes destapados los frascos ni aspires su contenido. Muchas sustancias líquidas (alcohol, éter, cloroformo, amoníaco...) emiten vapores tóxicos. Símbolos de los reactivos usados en laboratorio, que indiquen sus características para su manejo en el laboratorio. INFORME Nº 01 MICROSCOPIA INTRODUCCION La biología celular se inició con la microscopia óptica. Una célula animal típica mide entre 19 y 20 µm de diámetro, es decir, unas veces menos que la menor partícula visible. Por esta razón, la disposición de buenos microscopios ópticos a principios de siglo XIX permitió determinar que todos los tejidos vegetales y animales son agregados de células (teoría celular de schleiden y shwann, 1838). Se considera que el primer microscopio compuesto fue construido por los holandeses H. Jansen y Z. Jansen en 1590. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA que llamó “células”. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. 1. modificar su trayectoria en presencia de campos eléctricos o magnéticos.004 nm a 100 kV frente a los 800-200nm de la luz).Definición de los siguientes términos: LIMITE DE RESOLUCIÓN: El límite de resolución de un microscopio óptico viene determinado por la longitud de onda de la luz con la que se ilumina el objeto. al estar cargados. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. encontró que esta estaba compuesta por una masa de diminutas cámaras. En 1665 Robert Hooke utilizando un microscopio óptico simple. Las lentes de los microscopios están dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. En nuestro caso podemos hacer uso de pañuelos que no dejen pelusa. examinó un corte de corteza. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . Recomendaciones Levantar y transportar el microscopio por el brazo. El límite de resolución puede disminuirse si emplea una radiación con una menor longitud de onda (l). El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra.N. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes.PRACTICA DE BIOLOGIA U. El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes. hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). en realidad sólo vió las paredes celulares. Por lo general se utilizan microscopios compuestos. que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. a mayor aumento mayor cantidad de luz. Cuando no se está utilizando el microscopio. El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio óptico.F.S. La ventaja que tienen los electrones sobre otras partículas de pequeña l es que los electrones son fácilmente acelerados mediante una diferencia de potencial y además es posible. Hoock y algunos de sus contemporáneos observaron células vivas.. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio. el objetivo y el ocular. Al finalizar el trabajo. hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación. que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. La cantidad de luz que ingresa por el condensador va ha depender del objetivo que estemos utilizando.J. El objetivo está compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado.C La invención del microscopio en el siglo XVII posibilitó la serie de descubrimientos posteriores de las mismas. Cuando se mira a través del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen real.000 veces. La longitud de onda efectiva de un haz de electrones fuertemente acelerados es muchos órdenes de magnitud menor que la de la luz visible e incluso que la de la luz ultravioleta (0. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al inicio y final de la sesión práctica. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Después de utilizar el objetivo de inmersión. ya que este tejido está muerto a la madurez y las células ya no tienen contenido. Mas tarde. montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio. Algunos microscopios ópticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2. . Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. Amplía la imagen de ésta.PRACTICA DE BIOLOGIA U.N. ya que se _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . Permite. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior. MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Puede ser monocular. CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.J. …. TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto. empleando el tornillo macrométrico.C PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO Sistema óptico OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador.S. ya debería estar en esas condiciones. cambiar los objetivos. DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular. REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos.F. al girar. FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. Amplía la imagen del objetivo. binocular. PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación. CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. Para realizar el enfoque: Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación. OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Sistema mecánico SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima.J.PRACTICA DE BIOLOGIA U. con un papel de óptica. hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio. aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES Al finalizar el trabajo. si desea enfocar otro campo. ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y. Si no se va a usar de forma prolongada. girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación. Si se ensucian. se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.C corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona. Por tanto. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen.F. mejor. Empleo del objetivo de inmersión: Bajar totalmente la platina. Mirando directamente al objetivo. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Después de utilizar el objetivo de inmersión. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Mirando. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver.S. hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio. ahora sí. cuando se observe algo nítida la muestra. pues se mancharía de aceite. a través de los oculares. Cuando no se está utilizando el microscopio.N. asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. Pasar al siguiente objetivo. adyacentes y cercanos. al acabar el curso. Depende principalmente de la apertura numérica de la lente y de la longitud de onda de la luz utilizada.0 para el aire. porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción. Es decir. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. si dos puntos distan 1cm uno del otro y yo los veo como un solo punto borroso (aparte de necesitar urgente un oculista) tendré menor poder resolutivo que alguien que los distingue por separado o que distingue perfectamente puntos que distan de 0. AN = n x sen θ n = índice de refracción del medio entre las lentes y la muestra (1. Si se derrama sobre ella algún líquido. Mantener seca y limpia la platina del microscopio.N.PRACTICA DE BIOLOGIA U. platina. Sin abocarnos demasiado a definir "apertura numérica" podemos decir que es un valor determinado. micrométrico. θ= ángulo formado por el eje óptico y los rayos de luz más externos que son captados por el objetivo PODER DE RESOLUCION: El poder resolutivo es la capacidad que tiene un microscopio (o el ojo humano. El poder resolutivo aumenta a medida que disminuye la distancia que separa dichos puntos. No hay que abusar de este tipo de limpieza. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular. entre otras cosas. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico.5cm entre si. es la capacidad para percibir detalles.) de percibir por separado dos puntos pequeños. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y.56 para el aceite de inmersión). revólver y condensador). encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos. El poder resolutivo del microscopio no guarda relación alguna con el aumento del mismo. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo. por el diámetro de la lente.S. APERTURA NUMÉRICA: expresión matemática que describe la forma en que la luz es concentrada por el condensador y captada por el objetivo.J. Vale decir. hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. limpiarla con un paño humedecido en xilol. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . etc.C En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. 1. Si se mancha de aceite.F. secarlo con un paño. lo que significa que la luz viaja 1. esto es debido a la diferencia que existe entre los índices de refracción del vidrio y del aire. por definición. denominados respectivamente convergente (o Greenough) y de objetivo común (o Galileo). mayor índice de refracción posee.¿Con que fin se usa el aceite de inmersión en microscopía? USO DEL ACEITE: En los momentos en que se realiza observaciones de muestras con objeto de inmersión 100X.. es necesario que los dos ojos observen la imagen con ángulos ligeramente distintos. 2. Para ello. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . de contraste de fases y el microscopio de fluorescencia MICROSCOPIO ESTEREOSCOPICO: El diseño de este instrumento es distinto al del diagrama de más arriba y su utilidad es diferente..33. pues se utiliza para ofrecer una imagen estereoscópica (3D) de la muestra. Entonces para poder solucionar este problema se utilizan los objetivos que contienen aceite para la transmisión de la luz completando el sistema con el uso de una gota de aceite de inmersión que se coloca entre el objeto y el cubreobjeto de manera que se igualen los índices de refracción.33 veces más despacio en el agua que en el vacío.J. Existen dos tipos de diseño.PRACTICA DE BIOLOGIA U.C INDICE DE REFRACCIÓN: Se llama índice de refracción a la relación que existe entre la velocidad de la luz en el vacío y su velocidad en cualquier otro material. el índice de refracción del agua pura (a temperatura ambiente) es 1. El aceite de inmersión utilizado es el aceite de cedro que tendrá por misión concentrar los rayos luminosos que llegan del preparado al objetivo logrando una mayor nitidez de la imagen.F.Explique el uso y el mecanismo de acción de los microscopios estereoscopico. Obviamente todos los microscopios estereoscópicos. Por ejemplo.S. deben ser binoculares (con un ocular para cada ojo). por lo que a veces se confunden ambos términos.N. y como ocurre en la visión binocular convencional. Cuanto mayor es la densidad de un material. 3. el aire que se encuentra entre el objetivo y el cubreobjeto provoca una distorsión de la imagen de la muestra. J.S. presenta algunas limitaciones en cuanto a modularidad (capacidad de modificar el sistema para poner accesorios) y la observación durante tiempos largos resulta fatigosa. *Aprender a usar correctamente el microscopio de disección.F. el contraste se debe a que los materiales distintos absorben diferentes cantidades de luz. Aunque es un diseño económico. Objetivos *Localizar y describir la función de cada parte del microscopio de disección. Este tipo de microscopios permite una distancias que van desde un par de centímetros a las decenas de ellos desde la muestra al objetivo. Sin embargo. (laminar) ni tampoco lo es que la luz pase a través de la muestra. El microscopio estereoscópico es apropiado para observar objetos de tamaños relativamente grandes. con los tornillos del enfoque mueva los objetivos tan abajo como sea posible y después vaya subiéndolos hasta que el objeto aparezca en foco. lo que lo hace muy útil en botánica. MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES: El microscopio de contraste de fases proporciona una imagen clara y detallada de células vivas sin teñir. Reconocimiento y uso del microscopio de disección Coloque en la platina del microscopio el objeto que va a estudiar. fundamentalmente en aplicaciones que requieren manipular el objeto visualizado (donde la visión estereoscópica es esencial).C El diseño convergente consiste en usar dos microscopios idénticos inclinados un cierto ángulo uno con respecto a otro y acoplados mecánicamente de tal forma que enfocan la imagen en el mismo punto y con el mismo aumento. muévalo hacia la izquierda y hacia la derecha. por ejemplo) como en medicina (microscopios quirúrgicos) e investigación. Las únicas diferencias estructurales entre un microscopio óptico ordinario y uno de contraste de fases son los _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA .N. mineralogía y en la industria (microelectrónica. Mientras examina al objeto.PRACTICA DE BIOLOGIA U. En un microscopio óptico ordinario. por lo que no es necesario modificar los objetos a ver. en el microscopio de contraste de fases se debe a los distintos índices de refracción entre las partes de los microorganismos y el fondo. potente y en el que las aberraciones resultan muy fáciles de corregir. En la fotografía se aprecia una concha de 4 cm de diámetro. F. Por tanto.PRACTICA DE BIOLOGIA U. Algunos fluorocromos se unen directamente a los microorganismos. no del microscopio.S. el contraste. Ésta es la propiedad que tienen algunos materiales de absorber luz de una determinada longitud de onda y devolverla con una longitud de onda mayor. Cuando se iluminan materiales fluorescentes con luz ultravioleta de longitud de onda corta (invisible). De forma similar. Algunos microorganismos. entre los que se incluyen algunas bacterias fotosíntéticas y algas. que en el segundo están dotados de unos anillos opacos especiales. intensamente brillante contra un fondo oscuro. este tipo de microscopia depende de una propiedad del propio espécimen. es una de las aplicaciones más importante de esta microscopia. El microscopio de contraste de fases se fundamenta en el hecho conocido de que las ondas de luz viajan a distintas velocidades en los materiales que poseen índices de refracción diferentes. El diagnóstico mediante anticuerpos fluorescentes. Los rayos se suman o se anulan unos a otros produciendo diferentes intensidades de luz y aumentando.C sistemas de las lentes del objetivo y del condensador. que es una consecuencia inevitable del fenómeno de interferencia.J. Sin embargo. la microscopia de fluorescencia puede utilizarse tanto para identificar como para observar microorganismos. El contraste de fases proporciona considerable detalle interno. en consecuencia. que genera el contraste MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA: En la microscopia de fluorescencia el contraste se aumenta por medio de la fluorescencia. dependiendo de que sus crestas lleguen al mismo tiempo o no. Se denomina interferencia al resultado de la combinación de rayos de luz de distinta fase. proteínas producidas por el sistema inmune capaces de unirse a microorganismos específicos. Las olas se suman o anulan unas a otras. son fluorescentes por sí mismos pero en la mayor parte de los casos hay que teñir con unos colorantes denominados fluorocromos. A diferencia de las microscopias de contraste de fases y de campo oscuro.N. devuelven luz visible. La mayor ventaja que ofrece la microscopía de contraste de fases consiste en poder estudiar el movimiento y las estructuras celulares internas. que mediante esta técnica no son distorsionadas por la fijación y tinción. Su inconveniente es que la imagen aparece rodeada por un halo de luz. el microscopio debe modificarse con filtros especiales para iluminar la preparación con luz ultravioleta de longitud de onda corta. Imaginemos las olas del océano viniendo hacía la playa desde diferentes direcciones. el microscopio de contraste de fases combina los rayos de luz procedentes del espécimen y los que llegan de sus alrededores. los rayos de luz que pasan a través del espécimen no se encuentran en la misma fase que los que pasan a su alrededor. o inmunofluorescencia. Otros han de unirse químicamente a anticuerpos. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . Por este motivo. F. sirve para todas las proteínas y péptidos cortos. más oscuro es el color.PRACTICA DE BIOLOGIA U.C INFORME Nº 02 BIOMOLECULAS 1. el cual en presencia de Cu2+ en solución alcalina forma un complejo color violáceo ya que reconoce los enlaces peptídicos de las proteínas.N.S. tornándose VIOLETA. Este reactivo es empleado en el análisis de glucosa en la orina. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA .Explique el mecanismo de acción de cada uno de los reactivos indicados para el reconocimiento de biomoléculas empleados en la práctica. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina. Por ejemplo cuando se calienta la urea a 180 celsius. para la determinación cualitativa de azúcar en la orina. La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta.000 ml de agua destilada. 173 g de citrato de sodio o potasio. REACTIVO DE BENEDICT: Solución de 17. no es específico para identificación de proteínas con dos o más enlaces peptídicos. Para que se de dicha reacción se necesitan dos o más uniones peptídicas para que se forme el complejo coloreado La reacción o prueba de BIURET es un método que detecta la presencia de compuestos con dos o más enlaces peptídicos y. Entre las múltiples posibilidades son muy comunes las reacciones de reducción del ion cúprico (azul intenso en medio alcalino) a ión cuproso (rojo ladrillo insoluble). por tanto.J. se descompone transformándose en un compuesto llamado "biuret". El reactivo del biuret (sulfato de cobre en una base fuerte) reacciona con los enlaces del péptido y cambia el color cuando entra en contacto con otra sustancia.3 g de sulfato de cobre cristalizado. REACTIVO DE BIURET: La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. Las aldosas y también las cetosas en medio alcalino son capaces de oxidarse a ácidos aldónicos con lo que pueden reducir determinados reactivos. Mientras más cantidad de proteína esté presente en la solución. debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del Nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. 200 g de carbonato de sodio en 1. del glúcido a investigar. Fundamento: La coloración producida por el Lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molécula de almidón.PRACTICA DE BIOLOGIA U. una verdadera reacción química. sin embargo. Mediante la reacción de Sudan III se puede observar la afinidad de este compuesto por tales moléculas. No es por tanto. del glúcido a investigar. El almidón en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol (yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta característico se forma un compuesto de inclusión que modifica las propiedades físicas de esta molécula.J. se torna color amarillo oscuro. la reacción es positiva.C REACTIVO DE LUGOL: Este método se usa para identificar polisacáridos.S. El Sudan III forma una suspensión heterogénea en agua o soluciones alcohólicas. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali. Poner en un tubo de ensayo unos 3 cc. Poner en un tubo de ensayo unos 3 cc. Reacción del Lugol: Este método se usa para identificar polisacáridos.F. El almidón en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol (disolución de yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta característico. apareciendo la coloración azul violeta. apareciendo la coloración azul-violeta. El almidón en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol (disolución de yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta característico. REACTIVO DE SUDAN III: Los ácidos grasos resultan del alargamiento de la molécula de acido acético por adición sucesiva de grupos CH2. Si la disolución del tubo de ensayo se torna de color azul-violeta. este compuesto es muy soluble en aceite separándose por tanto de la solución alcohólica si se añade un acido graso. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . La densidad del aceite es menor que la del alcohol etilico y por ello en la fase superior de una mezcla – aceite aparecerá un color rojo cereza. Fundamento: La coloración producida por el Lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molécula de almidón. REACCION XANTOPROTEICA La reacción xantoproteica es un método que se puede utilizar para determinar la cantidad de proteína soluble en una solución. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos. especialmente en presencia de tirosina. los cuales confieren características hidrofóbicas. empleando ácido nítrico concentrado. la reacción es positiva. una verdadera reacción química. No es por tanto. apareciendo la coloración azul violeta. sino que se forma un compuesto de inclusión que modifica las propiedades físicas de esta molécula. Si la disolución del tubo de ensayo se torna de color azul-violeta. Añadir unas gotas de lugol.N. sino que se forma un compuesto de inclusión que modifica las propiedades físicas de esta molécula. Añadir unas gotas de lugol. Reacción del Lugol: Este método se usa para identificar polisacáridos. S.8. todavía no determinados. y probablemente unidos a una proteína. como la de Biuret.F. Tecnica Tomar un tubo de ensayo y poner unos 3 cc. da las reacciones de las proteínas por investigación química (reacción xantroproteica).. Se obtuvo bajo forma cristalina. La prueba da resultado positivo en aquellas proteinas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos. Reaccion de Biuret La producen los péptidos y las proteínas. da una coloración violeta característica. algo soluble en el alcohol y muy soluble en el agua acidulada. de solución problema (clara de huevo ). insoluble en las grasas y en el éter. Por ende determina la presencia o no de proteínas. Cada átomo de Cu2+ reacciona con dos átomos de N y establece una resonancia de electrones con otros dos N formando un complejo color violeta y es así como podemos catabolizar una reacción anastrófica de la mayor enzima llamada octatriona.C Según las guías químicas es una reacción cualitativa.NH -)que se destruye al liberarse los aminoácidos. Opera a través del ion Cu2+ el que en reacción alcalina interacciona con los iones de N-3 de los grupos amino formando un complejo color violeta.PRACTICA DE BIOLOGIA U. de fórmula: que en contacto con una solución de sulfato cúprico diluída. La reacción XANTROPROTEICA es un método que se puede utilizar para determinar la cantidad de proteína soluble en una solución. su pH es de 4.5H2O. Para cuantificar se usa otra reaccción. mas no cuantitativa. Añadir 2cc. Calentar al baño maría a 100: C. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA .N. y se hace un análisis espectro fotométrico. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado. Reaccion Xantoproteica: Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali vira a un color anaranjado oscuro. por lo tanto requiere de la presencia de al menos en tetrapéptido para que de positivo. cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. Los reactivos utilizados son NaOH y SO4Cu. Enfriar en agua fría Añadir gota a gota una disolución de sosa al 40%.J. Tecnicas Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 cc. Añadir 1 cc. de albúmina de huevo. una sustancia extraída de las paratiroides de la vaca que tiene los siguientes caracteres: polipéptido compuesto de muchos aminoácidos.CO. A continuación 4 ó 5 gotas de solución de sulfato cúprico diluida al 1%. ya que se debe a la presencia del enlace peptídico (. contiene trazas de fierro y azufre. El espectrofotómetro se puede entonces utilizar para medir la intensidad del color que se produjo. de solución de hidróxido sódico al 20%. se forma una sustancia compleja denominada biuret. de HNO3 concentrado. pero no los aminoácidos. es destruida por los fermentos digestivos y por esta causa no se administra por la vía digestiva. Este test específico es para reconocer enlaces peptídicos. especialmente en presencia de tirosina. Si se forma un precipitado de color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro de plomo. Añadir 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5%. utilizándose el azufre de los aminoácidos. ENSAYO DE MOLISCH Este ensayo es un ensayo para el reconocimiento general de carbohidratos en el que los polisacáridos y disacáridos se hidrolizan con acido sulfúrico concentrado hasta monosacárido y se convierte en derivados de furfural o 5-hidroximetil furtural los cuales reaccionan con anaftol formando un color púrpura violeta. de solución de hidróxido sódico al 20%. ENSAYO DE BARFOED _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . de color rojo anaranjado. Calentar el tubo hasta ebullición. Cual es el mecanismo de acción del reactivo de salawinof.PRACTICA DE BIOLOGIA U. amarillo para la prolina e hidroxiprolina y café para la asparagina que tiene un grupo amino en la cadena lateral. formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenólico de la tirosina y las proteínas que la contienen.S.N. RECONOCIMIENTO DE PROTEINAS REACCIÓN DE MILLÓN El anillo fenólico tiene un compartimiento característico frente a las sales de Mercurio a pH ácido.F. forma el sulfuro de plomo. lo que nos sirve para identificar proteinas que tienen en su composición aminoácidos con azufre. Reaccion de los aminoacidos azufrados Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Tecnica Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 cc. Si el glucido que se investiga es reductor. Añadir 2 cc. Esta reacción también identifica los grupos alfa-amino libres presentes en péptidos y proteínas RECONOCIMIENTOS DE CARBOHIDRATOS REACCIÓN DE FEHLING Se basa en el carácter de los monosacáridos y de la mayoría de los disacáridos (excepto la sacarosa). Se basa esta reacción en la separación mediante un álcali.Indicar dos métodos adicionales para el reconocimiento de proteínas.J. 2. de color azul. REACCION CON LA NINHIDRINA El grupo alfa-amino de los aminoácidos forma complejos coloreados con la ninhidrina: violeta azuloso en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo amino es primario. carbohidratos y ácidos grasos. del azufre de los aminoácidos. de albúmina de huevo (clara de huevo). oxido de cobre. el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo.C Debe aparecer una coloración violeta-rosácea característica. se oxidara dando lugar a la reducción del sulfato de cobre. INFORME Nº 03 Y 04 OBSERVACION DE CELULAS Y ORGANELAS CELULARES 1.S. o sea. Por el contrario en el citoplasma que la rodea. también contiene ion cuprico que se reduce hasta oxido cuproso mas rápidamente con los monosacáridos que con los disacáridos.sacárida del azúcar y la posición en que se encuentren los posibles enlaces glicosídicos. RECONOCIMIENTO DE ACIDOS GRASOS SAPONIFICACIÓN Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose en los 2 elementos que la forman: glicerina y los ácidos grasos. que son las sales sódicas o potasitas de los ácidos grasos. coloreada. benceno.N. cuyas sales son de coloración azul. El grupo carbonilo de los hidratos de carbono es fácilmente oxidable por diversos reactivos. Estos se combinan con los iones Na o K del hidróxido para dar jabones. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . SOLUBILIDAD Las grasas son insolubles en agua. que concluye con la aparición de un precipitado marrón-rojizo. lo que origina turbidez en el medio de reacción. de rosa a rojo.PRACTICA DE BIOLOGIA U. MECANISMO DE ACCIÓN DEL REACTIVO DE SALAWINOF Se basa en la formación de un compuesto de color variable. por reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que por su menor densidad se sitúa sobre la de agua. di. cloroformo. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequeñísimas gotitas formando una “emulsión” de espacio lechoso. el colorante es reducido a su forma leucobase incolora. Como las cetosas se deshidratan mucho más rápidamente que las aldosas. Por el contrario. El agente oxidante suave más empleado en este tipo de reacciones es el catión Cu(II). En todos los casos. originando un color verde azulado.J. Es específico de hexosas. de la naturaleza mono-. ósea. ROJO NEUTRO: (cloruro de dimetildianofenacina. que mantiene al colorante en su forma oxidasa.Explicar el mecanismo de acción del verde janus y del rojo neutro.o poli. las grasas son solubles en los llamados disolventes orgánicos como el éter. puede distinguirse entre ellas por la velocidad de aparición de color.F. etc. formándose óxido cuproso. aunque el poder reductor de estos compuestos depende de la entidad que el grupo tenga en la molécula. este ión se reduce a Cu(I). xilol. que es transitoria. Es esta aparición la que indica que el glucido tiene carácter reductor. Las propiedades reductoras también son interesantes para identificar a azúcares. entre hidroximetilfurfural y resorcinol en medio clorhídrico.C ETA prueba permite diferenciar entre monosacáridos y disacáridos reductores. a igual concentración de azúcar. pues desaparece en reposo. rojo de toluileno) Este colorante es usado en los lisosomas por que reacciona con su fosfatasa acida además el pH es un factor que influye determinadamente en esta reacción en la que se produce una coloración rojiza Su formula es (CH3) 2NC6 H3 N2 C6 H2 CH3 NH2 ClH VERDE JANUS: (azocolante básico) Se utiliza para el reconocimiento de las mitocondrias a través de las reacción con su citocromo oxidasa. reacciona con el citocromo oxidasa de estas mitocondrias proporcionándole un color intermedio de verde azulado que mantiene a un colorante en su forma oxidasa o sea colorada en cambio en el citoplasma que las rodea dicho colorante es reducido a una forma simplemente incolora. se teñirá de azul-violeta el nucleolo. El resultado es una intensidad de color diferente en las células escamosas y el citoplasma.PRACTICA DE BIOLOGIA U.J. fácilmente visibles en las grandes motoneuronas. Como las denominadas tinciones de Nissl. papanicolau.F. COLORACIÒN AZUL DE TOLUIDINA (GRÁNULOS E NISSL): El Azul de Toluidina es un colorante catiónico perteneciente a los denominados colorantes de Nissl. 2. Difiere del efecto de color. por que tiñe organismos vivos.Explicar el mecanismo de acción de los colorantes empleados para observar las siguientes láminas fijas (epidídimo. el ergastoplasma y los grumos de Nissl se tiñen de color azul-violeta sobre fondo incoloro. de estómago o intestinal. y solución policrómica. algunas mucinas también se tiñen metacromáticamente de rojo púrpura. riñón. gránulos de nissl) COLORACIÒN DE VERDE JANUS (LÀMINA DE RIÑON): Es un colorante básico. Utilizan para reconocer las mitocondrias.C Es un colorante básico. ergastoplasma y grumos de Nissl de las células. por que tiñe organismos vivos.S. La solución EA65 se una especialmente en extendidos mucosos.N. Se emplea como colorante supra vital. 1b. El nucleolo. que utiliza la solución 1a.Policrómicas EA31 y EA50 para diagnóstico de cáncer. como esputo y secreción bronquial. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . En ginecología se prefieren las soluciones. COLORACIÓN DE PAPANICOLAU: La coloración estándar usada en diagnóstico de cáncer y para evaluar el ciclo hormonal es la Coloración de Papanicolau. se emplea como colorante supravital. Proceso de distribución de una célula por lisis de su protoplasma por un mecanismo de deshidratación al pasar el líquido intracelular a un medio externo. se hinchan. estando en un medio hipertónico ocurre Crenación (el agua sale hacia el exterior).PRACTICA DE BIOLOGIA U.J. o sea. O sea es un cambio de forma que muestra los hematíes cuando son sometidos a una solución hipertónica. ejerciendo presión contra las membranas celulares. hemólisis. la exposición a venenos de serpiente y con el empleo de prótesis _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . debido a la perdida de agua debida a un fenómeno de osmosis.C INFORME Nº 05 PERMEABILIDAD CELULAR 1. PLASMOLISIS: Es la reacción de la membrana citoplasmática respecto de la pared rígida suprayacente. hinchar): Determina el estado de rigidez de una célula. TURGENCIA: (Del latín turgere. CRENACIÓN: La crenación es le proceso por el cual las células se “secan”. De esto depende que una planta este marchita o firme. HEMOLISIS: Es la degradación de los hematíes con la liberación de la hemoglobina se produce normalmente final del hematíe pero puede desencadenar de forma patológica en diversas circunstancias como reacciones antígeno-anticuerpo.F. Los glóbulos rojos quedan “arrugados” con los bordes estrellados. es el fenómeno por el cual las células al absorber agua. alteraciones metabólicas del hematíe que acortan de forma significativa su periodo de vida y agresiones mecánicas como los que se producen en la hemodiálisis.Defina los siguientes términos: plasmolisis. turgencia. presión osmótica. las cuales se ponen tensas. cremación. Es el fenómeno inverso a la hemólisis..S.N. difusión. osmosis. PRACTICA DE BIOLOGIA U. en el que partículas materiales se introducen en un medio que inicialmente estaba ausente de ellas aumentando la entropía del sistema _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . es decir. Para una disolución de “n” moles en un volumen V la temperatura absoluta T. También produce la hemólisis. La presión osmótica es una magnitud que depende fundamentalmente de la (molar) de la disolución y. y es independiente de la naturaleza del disolvente y del soluto. o con una disolución mas diluida.N. a través de una membrana semipermeable que solo deje de pasar las moléculas mas diluida. Este fenómeno se conoce como ósmosis directa y la presión mínima necesaria para detener el flujo de disolventes puro a través de la membrana semipermeable es la presión osmótica. Si una disolución se pone en contacto con su disolvente. la presión osmótica P viene dada por la expresión: P=nRT/V donde R es la constante de los gases DIFUSIÓN: La difusión es un proceso físico irreversible.S. de la Tº.J. en menor extensión. a homogeneización del sistema no se puede realizar y tiene lugar un flujo neto de disolventes hacia la disolución mas concentrada.F.C cardiacas. PRESIÓN OSMÓTICA Es la misma presión necesaria para impedir el paso de las moléculas del disolvente puro hacia una disolución a través de una membrana semipermeable. es una propiedad coligativa. la dilución de la sangre mediante la administración intravenosa de cantidades excesivas de soluciones hipotónicas que determinan la hinchazón progresiva con eventual rotura del hematíe. tiene forma de un barril B tubular que atraviesa la bicapa lipídica y contiene un canal lleno de agua en su centro. el barril esta formado a partir de 16 cadenas antiparalelas de lamina B. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . su estructura fue determinada mediante cristalografía de rayos x . En la osmosis. 2.N. proceso que no requiere aporte energético es frecuente como forma de intercambio celular.F. tienen una lamina B en lugar de una hélice a como estructura transmenbranosa primordial. La difusión. Las porinas son poros no especifico.S. un disolvente (a menudo agua) se mueve desde una zona de baja concentración hacia una zona de alta concentración a través de una membrana semipermeable.¿Cómo ingresa agua desde el el medio extracelular al medio intracelular? Por Osmosis el agua pasa a la célula por medio de unos poros o canales proteicos. que pueden ser atravesados por pequeñas moléculas hidrofilicas. siempre también a favor del gradiente de concentración. La membrana permeable puede haber paso de partículas y disolvente. que se curvan lo suficiente como para formar una estructura cilíndrica.J. denominados acuaporinas. OSMOSIS: Es el paso de un componente de una disolución a través de una membrana que impide el paso del resto de los componentes de dicha disolución.PRACTICA DE BIOLOGIA U.C conjunto formado por las partículas difundidas o soluto y el medio donde se difunden o disolvente. Numerosos principios de la física y química intervienen en el fenómeno de la osmosis en animales y plantas. Las células animales se caracterizan por lo siguiente: 1. etc).Possen Glucógeno. encargados de transformar los Fotones de luz solar en energía química( ATP/ NAPDH2). Fotótrofas o Productoras. 3. carion= núcleo).Presentan Lisosmas funcionales para la Digestión intra y extracelular( endocitosis y exocitosis). isodiamétricas. salvo los Plastidos propio de las vegetales y el centrosoma propio de las animales. 2.Poseen un organelo no membranoso el áster formado por un par de centríolos. el sistemas de endomembranas y la división celular por Mitosis o Cariocinesis en células Somáticas o formadoras del cuerpo y por Meiosis las células germinales o gametas( óvulo y espermatozoide).Son Heterótrofas o Consumidoras. ya que al no poseer organelos membranosos. presentan un núcleo bien organizado formado por una doble membrana que separa el contenido nuclear del citoplasma considerada como la 2º barrera de permeabilidad selectiva entre el núcleo y el citoplasma. centríolos y Flagelos. incorporan los nutrientes de los alimentos que poseen otros seres vivos.Presentan una pared celular de naturaleza celulósica ( pared celular primaria y secundaria) que actúa como elemento de protección a la membrana plasmática y le da el aspecto de Céluloas geométricas( poliédricas. 5. flagelos ni centríolos. 4. pueden ser numerosas como en las células meristemáticas o bien ser 1 sola y ocupar el 90% de la cavidad o lúmen celular desplazando al sistemas de emdomembranas y el núcleo hacia la periferia. 5. Las células bacterianas se caracterizan por ser: 1.PRACTICA DE BIOLOGIA U. 2.F.Son Autótrofas. cromoplastos. los Plastidios y carecer de pigmentos Fotorreceptores( clorofila y carotemoides) son incapaces de sintetizar sus propios alimentos.C CELULAS VEGETALES Y ANIMALES OBSERVADAS DESDE EL MICROSCOPIO COMPUESTO Las células animales y vegetales son células Eucariotas( eu=verdadero.Células primitivas. proteínas). llamado tambien Centrosoma o centro celular encargado de formar las Fibras del Aparato del Huso Mitótico.Presentan organelos membransos de suma importancia los Plastidios( leucoplastos.Poseen Vacuolas muy desarrolladas. este último para la locomoción formado por fibrillas de tubulina múltiples. la denominación de áster es porque cuando la célula animal entra en Mitosis adquiere el aspecto estrellado parecido a un Sol o estrellas por las irradiaciones de Tubulina. con pared celulr no celulósica constituída por una variedad de ácidos _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA .Son células desnudas desprovistas de una pared celular. ya que por Fotosíntesis transforman sustancias de baja energía potencial como el CO2. Acrosómico o Acromático mediante las cuales los cromosomas quedan adheridos a las fibras por sus correspondientes Centrómeros. 4.S.No presnetan Cilios.N. lípidos. cloroplastos activos en la Fotosíntesis). sales minerales y el H2O mediante la intervención de la clorofila y otros pigmentos auxiliares o accesorios los Carotenoides en sustancias orgánicas de alta energía potencial. el único polisacárido que las células vegetales no sintetizan por Fotosíntesis. que serán utilizadas para la síntesis de moléculas orgánicas de mayor complejidad( azúcares. Las células vegetales se caracterizan por lo siguiente: 1.J. 4. 3. Las 2 células en común poseen la particularidad de presentar todos los organelos membransos y no membransos. la Carioteca o Envoltura nuclear.Presentan Cilios. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA .Presentan Cilios y flagelos para su locomoción o traslado formado por una sola fibrilla úncia.Si bien no presentan Lisosomas . verdes) Heterótrofas la mayoría y Quimiosintética solo aquellas bacterias que oxidan sustratos inorgánicos como sales minerles. 5.Si bien esto es correcto.No poseen organelos membranosos. 8. 4. este es el núcleo primitivo o rudimentario donde el único ADN esta compactado y plegado dentro del mismo. el espacio periplásmico ubicado entre la pared celular y la memn¡brana plasmática cumple funciones similares al de ellos. es decir. estructura única de las eucariotas. 7. carion= núcleo). ácidos. bases. las bacterias del Hierro. 9º Se dividen por Amitosis o división directa. 3. óxidos. entre ellos el Pteichoico y otros mas. en cambio. ejemplo. IMAGENES Célula fijada con KMnO4 D:Golgi pd:Plasmodesmos CW:Pared Célular N: Núcleo V: Vacuola Ch: Cloroplasto M:Mitocondria I: Espacio Intercelular Nu: Nucléolo Célula fijada con Os O4 Se observa nucléolo Cloroplastos despues de la división. del Azufr.S. falta por completo la Carioteca o Membrana nuclear. al microscopio electrónico presentan una región mas claar que el Citoplasma llamada Nucleoide. Saludos. no presentan un núcleo membranoso.C orgánicos que sintetizan ellas mismas.N. 6.PRACTICA DE BIOLOGIA U. 10.Las funciones de Endocitosis y Exocitosis estas ausentes.No presnetan Sistemas de Endomembranas o Sistema Vacuolar Citoplasmático. del Hidrógeno. en las eucariotas esta cadena oxidativa esta presente únicamente en las Mitocondrias ubicada en el lado interno de las Crestas Mitocondriales.No presnetan una verdadera organización nuclear de ahi el nombre de Procariotas( pro= falso. este sistema está integrado por la carioteca.F.Son Autótrofas solo las bacterias coloreadas( rojas.J. 2.La cadena oxidativa constituída por unos corpúsculos en forma de pequeós hongos con un tallo fino y ua cabeza ensanchada los Oxisomas esta asociada a la membrana plasmática. el único organelo que es comñun en ambas células son los ribosomas. salvo las bacterias coloreadas( verdes) que presentan un organelo membranoso parecido a los Plastidios de los vegetales superiores los Cromatóforos. los 2 retículos endoplásmicos( rugoso/ liso) y el complejo de Golgi. N. crecer.F. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . agua y luz solar (fotosínteis) lo cual los hace autótrofos (producen su propio alimento) . además. pero la célula vegetal cuenta. respirar. reproducirse.J. sólo tiene la membrana citoplasmática que la separa del medio.S. con una pared celular de celulosa. de interior sinuoso. Diferencias entre células animales y vegetales Tanto la célula vegetal como la animal poseen membrana celular.C Cloroplasto en división CW:Pared Célular M:Mitocondria Cloroplastos con almidón S: Almidón Cloroplastos con abundantes granas G: Grana P: Glóbulo de Grasa Célula animal y célula vegetal Las células son la porción más pequeña de materia viva capaz de realizar todas las funciones de los seres vivos. La célula vegetal contiene cloroplastos: organelos capaces de sintetizar azúcares a partir de dióxido de carbono. y la célula animal no los posee por lo tanto no puede realizar el proceso de fotosíntesis. Pared celular: la célula vegetal presenta esta pared que está formada por celulosa rígida. convierten los nutrientes en energía que utiliza la planta. que le da rigidez. etc. La membrana nuclear establece una barrera entre el material genético y el citoplasma. es decir. en cambio la célula animal no la posee. Las mitocondrias. células animales y células vegetales: En ambos casos presentan un alto grado de organización con numerosas estructuras internas delimitadas por membranas.PRACTICA DE BIOLOGIA U. Existen dos tipos de células con respecto a su origen. producir energía. S. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . La tinción de Gram o coloración Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias. la célula animal.C Una vacuola única llena de líquido que ocupa casi todo el interior de la célula vegetal. Las células vegetales pueden reproducirse mediante un proceso que da por resultado células iguales a las progenitoras. Las células animales pueden realizar un tipo de reproducción llamado reproducción sexual. sobre todo en muestras clínicas. los descendientes presentan características de los progenitores pero no son idénticos a él.PRACTICA DE BIOLOGIA U. que desarrolló la técnica en 1884. en cambio. Imagen comparativa entre célula animal y célula vegetal FUNDAMENTO Y TECNICA DE LA COLORACIÓN GRAM Tinción de Gram Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram. tiene varias vacuolas y son más pequeñas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram.J. este tipo de reproducción se llama reproducción asexual. Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).F. en el cual.N. y toman el segundo. por ejemplo.S. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Agregar acetona y/o alcohol y esperar entre 15 y 20s Enjuagar con agua. que se deja actuar durante un lapso determinado. el cual está presente para solubilizar el yodo.F. las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas. pironin B o hasta inclusive verde de malaquita.J. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas. OBJETIVOS Recoger muestras Hacer el extendido en espiral Dejar secar a temperatura ambiente Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox. En este método de tinción. mientras que las Gram positivas permanecen azules. como la safranina o la fucsina. Agregar lugol y esperar entre 30 segundos y 3 minutos Enjuagar con agua.C primera aproximación a la diferenciación bacteriana. mientras que los Gram negativos sí lo hacen. Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión Explicación El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas). y el color no se modifica al añadir éste. se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó. La safranina puede o no utilizarse. Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Al término del protocolo.) Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. safranina) Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. Enjuagar con agua. Los que fijan el violeta. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega. aún después de tratarlos con un decolorante. la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo. Algunos microorganismos retienen el colorante violeta. pardo Bismarck. se califican de grampositivos. como safranina. otros pierden con facilidad el primer tinte. no es crucial para la técnica. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram. ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste.PRACTICA DE BIOLOGIA U. fucsina fenicada diluida. y los que pierden la primera coloración y retienen la segunda.N. Habitualmente es un colorante de color rojo. sirve para realizar la decoloración. considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa. El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio). Todas las células gram positivas y gram negativas se tiñen de color azul-purpura. Enjuagar con agua. de gramnegativos. Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1-2 min Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas. podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. Basándonos pues. Los organismos Gram positivos no se decoloran. en la reacción Gram. que se deja durante el mismo tiempo que la anterior. . por consiguiente. El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos metilo en la molécula. y forma una barrera que la laca no puede atravesar. los gránulos de micelios propenden retener el colorante. de los tres grupos. tienen la facultad de reaccionar con ácidos y con bases. . Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente: El colorante básico entra al microorganismo. el tono más oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal). la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). los lípidos de la pared (más abundantes que en las células grampositivas) se disuelven por este tratamiento. R. lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos.C representantes más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. y la letra B. El mismo microorganismo. y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. Stearn (1923) basó la suya en una combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias.N. a base de sus datos experimentales. Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad.S. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo. En realidad. y quizá por otras causas. Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez. sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias.. La reacción de Gram no es infalible ni constante. 3B. pero es indudable la importancia general de la pared celular. Varias son las teorías emitidas para explicar el mecanismo de la tinción de Gram. se vuelve gram negativo. al combinarse con colorantes ácidos en soluciones ácidas y con los básicos en medio alcalino. violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina. Las proteínas y aminoácidos son cuerpos anfóteros. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . gracias a sus grupos amino y carboxilo. los mohos se tiñen con cierta irregularidad.PRACTICA DE BIOLOGIA U. en soluciones ácidas. Como los microorganismos contienen más de una proteína. . Según Stern y Stearn. comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico.F. puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio. donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. y el tinte más ligero. 2R. se refieren al número de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante. B. si sufre daño de la pared por una u otra causa. los microorganismos grampositivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior a la de los microorganismos gramnegativos. ese punto no tiene un valor preciso y definido. tonos azules.J. reaccionan con los ácidos. Así vemos que las células de plantas y animales superiores no conservan la primera coloración. etc. De igual manera. Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad. En las células gramnegativas. sino que constituye más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Teorías Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. La combinación con ambos tipos de colorante no se produce en el “punto isoeléctrico”. El alcohol o la acetona empleados para aclarar. y. Los nombres violeta de metilo 3R. La facultad de las células para tomar la coloración Gram no es propia de toda sustancia viviente. deducen las siguientes conclusiones: . 2B. Algunos autores objetan esta teoría. Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez. esto es. tratados con mordiente. estos microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros. y se considera como el mejor colorante primario para teñir por el método de Gram. Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular. en que la primera contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. . y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona. y el libre acceso del disolvente al complejo constituido.C . son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloración. por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular.N. Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son simples. Los microorganismos aparecerán teñidos después de tratarlos con violeta cristal. Libenson y Mcllroy. El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio.PRACTICA DE BIOLOGIA U. La pared celular de los microorganismos grampositivos. han comunicado que si la reacción grampositiva depende de que se forme una combinación compleja entre los componentes de la coloración de Gram y las proteínas de la pared celular. sería prácticamente impermeable al violeta cristal. consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. . hacer que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos. anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a tres horas. para invertir la reacción. la de los primeros no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la célula. de los microorganismos débilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar. sería de esperar que las bacterias desintegradas por medios físicos retuviesen este tinte. Gianni (1952) comprobó que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B. Técnica de la coloración gram Fijar un frotis Con la ayuda de un mechero. En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes básicos. a diferencia de la de los gramnegativos. . Sin embargo. dentro de la célula. parecen sustentar la opinión de que la reacción grampositiva consiste esencialmente en la formación. Por el contrario. la cual servirá para depositar la muestra contenida en el asa. flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un poco. ya que ese tratamiento no podría cambiar el carácter químico de los materiales de dicha pared. su efecto.S. los gérmenes grampositivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el Gram. Otra explicación de la reacción de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un núcleo gramnegativo. La pared celular de los microorganismos grampositivos y gramnegativos es permeable al violeta cristal. sobre todo. y el disolvente eliminará sin dificultad el complejo formado después del tratamiento con yodo. y cuya reacción se vuelve ácida en el curso del desarrollo. Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta tomar un poco de muestra. La materia grasa extraída de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microorganismos gramnegativos. proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . en general. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos. Ni los grupos sulfhidrilo ni las proteínas básicas han influido específicamente en el mecanismo del colorante de Gram. la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona. de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difícil de eliminar con el disolvente. Los resultados experimentales obtenidos con una difusión celular exenta de proteínas. sino más bien una débil combinación de sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas.F.J. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración Gram son oxidantes. Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa). respectivamente) Utilidades En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones: Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección. tiñen como gramnegativas: Mycobacterias (están encapsuladas) Mycoplasmas (no tienen pared) Formas L (pérdida ocasional de la pared) Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared. Nuevo enjuague Pasado el minuto correspondiente. se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1 minuto más. acetona o alcohol-acetona.N.C asa) sobre la lámina. Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante.S. el frotis se decolora con etanol al 75 %. aproximadamente de medio a un centímetro de espesor. De esta manera. hasta lograr que éste salga totalmente transparente. es decir. se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra.PRACTICA DE BIOLOGIA U. pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina. se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijación a las bacterias Decoloración Pasado el minuto de haber actuado el mordiente. se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra.J. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. El calor deseable es aquél en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina en posición inclinada hacia abajo. puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar. de tal forma que al terminar la extensión. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 °C. hasta que ya no escurra más líquido azul. Para realizar el lavado. Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra. etanol al 95 %.. tengamos como producto una espiral en la parte media de la lámina. teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama). procedemos a teñir nuevamente. Enjuague Al transcurrir el minuto. Tinción Con violeta cristal o violeta de genciana. como para lograr cubrirla por completo. se procede a enjuagar la lámina con agua. dejar actuar durante 1 minuto. Mordiente Una vez enjuagado el portaobjetos.F. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . hasta que ya no escurra más líquido azul Lavado y secado Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. El chorro debe ser un chorro delgado. Bacterias resistentes a la tinción Gram La siguientes bacterias de naturaleza grampositiva. ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación microscópica. Tinción de contraste Una vez que la lámina ya secó. utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra.. Pueden aparecer aislados después de la división celular (Micrococos). Pero por el contrario. no son susceptibles a la acción del solvente orgánico. La clave es el peptidoglicano.C Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. La membrana exterior está hecha de proteína. y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas. y más en la superficie.F. que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Si por el contrario. También pueden distinguirse los espirales.S. aparecer por pares (Diplococos). entonces se los designa vibriones. Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gram negativo Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano. o agruparse de manera irregular (Estafilococos). se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos. perdiéndose la coloración azul-violácea. o curvados.J. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente. sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos. lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo. formar cadenas (Estreptococos). Si se observan mayor número de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como la atmósfera de incubación. Los bacilos poseen forma alargada. además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática. y por lo tanto este complejo se escapa. III: Uso de antibióticos A pesar de la gran utilidad del la tinción de Gram. II: Errores del operador. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración. _____________________________________________________________________________ EAP/MEDICINA HUMANA . las Gram positivas. como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. fosfolípido y lipopolisacárido. este método debe ser valorado con precaución. [editar] Causas que alteran la tinción de Gram I: Edad de la bacteria.PRACTICA DE BIOLOGIA U. la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada. el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína) Por el contrario. Los morfotipos bacterianos identificados en la tinción de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. y manteniendo la coloración azul-violácea. Por lo tanto. por ella junto a la muestra deben teñirse controles con grampositivas y gramnegativas. al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos.N. A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esférica. ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana. se encuentra el ácido lipoteicoico. poseen forma de "coma". ya que la reacción puede variar según la edad de las células y la técnica empleada.