Universidad Nacional Autónoma de México.Facultad de Estudios Superiores Zaragoza Laboratorio de Microbiología II Aislamiento de Bacteriófagos Grupo 1701 Equipo 12 Romo Estudillo Carolina Saldaña Lozano Ivette Lorena Vera Hernández Alberto Esteban VIRUS Son los seres más simples y pequeños que se conocen. Básicamente son moléculas de acido nucleico envueltas por una cubierta proteica. Carecen de organelos Son acelulares (no tienen organización celular). Pueden infectar bacterias CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS VIRUS Son parásitos intracelulares obligados. Metabólicamente inerte por si mismo. Sólo se replica dentro de células vivas. Constituidas proteínas. por ácidos nucleicos y Tiene la información para programar a la célula huésped y que sintetice varias macromoléculas específicas del virus. ESTRUCTURA VIRAL Material genético: ADN ó ARN, no ambos. Cápside: Envoltura proteínica que envuelve al ácido nucleico. Puede ser icosaédrica o helicoidal. Formado por Capsómeros: grupos de unidades proteicas individuales. Nucleico y cápside. Cubierta: En algunos casos existe: membrana lipídica que rodea a la nucleocápside . Nucleocápside: La unidad completa de Ác. . Espículas: En algunos virus se proyectan al exterior estas estructuras que son importantes en la replicación. Virión: La partícula viral entera. También se les denomina Peplómeros. son desnudos o envueltos.CLASIFICACIÓN DE LOS VIRUS Tipo de material genético. . Simetría Si de la cápside. Tamaño. TIPO DE ÁCIDO NUCLEICO Virus que contienen ADN Virus que contienen RNA . . Virus de ADN VIRUS TAMAÑO CUBIERTA SIMETRÍA Adenovirus 70-90 nm Sin cubierta icosaédricos Herpes simple de varicela 100-200nm cubierta icosaédrica Papillomavirus 45.55nm Sin cubierta icosaédrica Hepadnavirus (Hepatitis) 42 nm Con envoltura icosaédrica Parvovirus 20 nm Sin cubierta icosaédrica Poxvirus 230-40 nm Sin cubierta desconocida . Adenovirus Virus del papiloma Varicela Zoster . espigas Helicoidal Arbovirus dengue (fiebre amarilla) 45-50 nm Con envoltura Icosaédrica . sarampión.VIRUS RNA Virus Tamaño Cubierta Simetría Influenza virus 100 nm Con envoltura Helicoidal Paramyxovirid ae (paperas. parainfluenza) 150-300 nm Con envoltura Helicoidal Picornavirus 20-30 nm Ausente Icosaédrica Retrovirus ( VIH) 80-100 nm Con envoltura Icosaédrica Rabdovirus (rabia) 75-180 nm Con envoltura. Virus de la fiebre amarilla Virus de la hepatitis . POR LA SIMETRÍA DE LA CÁPSIDE . .Presencia o ausencia de una membrana viral que cubre a la nucleocápside. Virus desnudos Papovavirus Parvovirus Virus de RNA Reovirus Picornavirus . VIRUS ENVUELTOS . VIRUS ENVUELTOS . . Su acido nucleico puede ser ADN O ARN.BACTERIÓFAGOS (FAGOS) Son virus que infectan bacterias. La mayoría de los fagos están entre un rango de 24-200 nm de longitud. . . o cápside: proteica para el ácido Ácidos nucleicos: ADN ó ARN. no ambos Cola o tallo: tubo hueco por el cual pasa el material genético durante la infección Fibras del tallo y placa basal: unión de fagos a la célula. Cabeza cubierta proteger nucleico. Se agrupan en dos categorías: • Bacteriófagos virulentos. . • Bacteriófagos Temperados. Ejemplo T2 y T4 .VIRULENTOS Matan a todas la células infectadas y producen placas claras. ATENUADOS O TEMPERADOS No siempre matan a sus huéspedes y producen placas turbias. Ejemplo: λ y P1 . REPLICACIÓN DE VIRUS CICLO LÍTICO CICLO LISOGÉNICO . Ensamblaje Liberación . Fases del ciclo: Fijación o absorción Penetración Eclipse (Replicación del genoma vírico y síntesis de proteínas).CICLO LÍTICO El ciclo de multiplicación de los virus tiene lugar cuando el virión penetra en la célula hospedadora y utiliza la maquinaria replicativa de ésta para generar nuevas partículas víricas El virus se replica. llena la célula y para salir la lisa por explosión. . Fase de fijación o absorción: Las células hospedadoras tienen en sus membranas receptores específicos para los virus que las infectan. .Fase de fijación o absorción En todos los ciclos líticos de multiplicación viral se pueden distinguir las siguientes etapas: 1. uniéndose proteínas de la cápside o de la envoltura a éstos. Posteriormente. o por endocitosis. el ácido nucleico se libera de la cápsida rompiéndola. •Los virus envueltos funden su membrana con la de la célula hospedadora. en los virus que penetra la nucleocápsida entera. 2. . por el que inyecta el ADN. Fase de penetración: En función del tipo de virus. ya sea por penetración directa al perforar la membrana con enzimas hidrolíticos. que romperán dentro de la célula. •Los virus desnudos introducen toda la nucleocápsida en la célula. existen varias formas de penetración: •Los bacteriófagos originan un pequeño orificio en la membrana de la célula hospedadora. al ser englobados por la célula hospedadora en una vacuola. al contraerse su cola. con la enzima lisozima de su placa basal. Fase de penetración . enzimas etc) . El genoma vírico dirige el metabolismo de la célula hospedadora hacia la síntesis de los componentes víricos. Fase de replicación y síntesis de componentes virales: En esta fase no se detectan virus en el interior de la célula. utilizando todos los recursos de la célula hospedadora (materias primas. ATP. 3. nucleótidos. aminoácidos. ribosomas. Este procedimiento lo utilizan los virus envueltos. 4. 5. Fase de ensamblaje: Se ensamblan los capsómeros formando las cápsidas. a la vez que el ácido nucleico se pliega en su interior. . y que acaban separándose de la célula. en los que la envoltura membranosa es parte de la membrana de la célula en la que se reprodujeron. Fase de liberación: Los virus salen de la célula básicamente por dos mecanismos: •Por gemación: Inducen a la membrana celular a formar pequeñas vesículas en las que se introducen. junto a las enzimas que pueda llevar el virus. roto su membrana si la liberación ha sido masiva. Esta liberación de los virus puede causar la muerte de la célula hospedadora. o destruido su genoma. ya sea por haber agotado sus nutrientes. . •Aprovechando los mecanismos de exocitosis de la célula o provocando agujeros en la membrana por medio de enzimas líticas. quedando en forma de vida latente A este virus se denomina profago y a las células que lo contienen células lisogénicas.CICLO LISOGÉNICO Este ciclo también presenta las mismas etapas que el ciclo lítico. . donde además el ADN del virus se suma al ADN celular de modo que cada vez que la célula se duplica también lo hace el ADN viral. La replicación de su ácido nucleico está aparejada a la replicación del DNA de la célula huésped. El ADN del virus se inserta en el genoma de la célula huésped y no se produce proliferación del virus. pero sin manifestarse. . El profago puede liberarse y entrar en un ciclo lítico. . Originar transformaciones cancerosas Algunos mecanismo de resistencia. Pueden originar una serie de trastornos como: Inducir mutaciones. cuando los virus T2 se ponen en contacto con las bacterias les inyectan algunos materiales. El bacteriófago T2. . después de aproximadamente 20 minutos. es un virus que infecta a las células de la bacteria Escherichia coli. las células explotan (se lisan) y liberan una gran cantidad de nuevos virus. Resistencia de las bacterias a los antibióticos. . Como vectores de clonado para insertar ADN dentro de las bacterias y obtener como resultado bibliotecas genómicas. esto debido a que los fagos se encuentran presentes en el agua junto con las bacterias de esta enfermedad. Se pueden predecir los brotes de cólera.IMPORTANCIA Y APLICACIÓN DE BACTERIÓFAGOS Comprensión de las infecciones virales. La fagotipificación no se usa en el laboratorio clínico de rutina. La terapia fágica ha sido utilizada como una alternativa a los antibióticos para tratar infecciones bacterianas. sí se usa en los laboratorios de referencia con propósitos epidemiológicos. ya que eliminar bacterias es lo que los fagos hacen mejor. Es posible emplearlos potencialmente para destruir bacterias patógenas encontradas en alimentos. . Conocer las etapas de la replicación de los bacteriófagos.OBJETIVOS 1.Conocer e identificar un bacteriófago. 3. Llevar a cabo el manejo y aislamiento de bacteriófagos. . 2. un virus y el efecto de parasitismo intracelular que producen en una célula hospedera. MÉTODO . A. Aislamiento de Escherichia coli de diversas fuentes. Utilizar en el siguiente paso Tomar una asada y resuspenda en 2 mL de caldo tripticaseína De las colonias que hayan crecido aislar E. Una semana antes de la practica se debe realizar lo siguiente: Atrapar de 20 a 30 moscas Macerar las moscas en caldo BHI o caldo soya tripticaseína Sembrar en agar EMB e incubar a 37°C por 24 hras.coli en EMB . 01mL sembran en EMB Incubar a 37°C por 24 hras Aislar E.Aguas residuales como fuente: Obtener 45 mL de agua residual Tomar con un asa calibrada 0.coli EMB . tome una asada y resuspenda en 2 mL de caldo tripticaseína . hasta hacer una pasta Trasnferir la mezcla a un frasco esteril y adicionar mas caldo hasta acompletar 20 mL mas 2 mL del cald que contiene E.coli Mezcle suavemente e incube a 35°C por 24 hrs. Enriquecimiento del bacteriofago Adicionar a 20 o 30 moscas una pequeña cantidad de de caldo tripicaseina y macere con un pistilo.B. . Agua residual como fuente: Adicionar 15 mL de agua residuales a 5 mL de caldo nutritivo decaconcentrado en un frasco estéril Adicionar 2 mL de cultivo en caldo de E.coli Mezclar suavemente e incubar . Realizar diluciones * .Identificación de bacteriófagos Decantar enriquecimiento B y centrifugar Decantar el sobrenadante del centrifugado y filtre con ayuda de una jeringa y un filtro de disco Millipore. * Verter mezclas en cajas Petri con agar preformado.* .coli y 1 mL de caldo de fago.Fundir agar blando y mantener a 45 °C Adicionar 0.1 mL de caldo de E. habrá un tapiz bacteriano sobre el que a parecerán pequeñas áreas circulares claras las cuales corresponderán a las llamadas CALVAS o PLACAS DE LISIS (áreas de producción de fagos procedentes de la lisis de bacterias infectadas en esa área). .INTERPRETACIÓN Después de la incubación. . A.pdf http://biologiamedica.oa?id=69323749007 http://www.facmed. Microbiologia general.html http://docencia. Jorge.html .redalyc.mx/deptos/microbiologia/virologia/generali dades. 2 edición pp 577 Hans G. http://www.org/articulo.izt. mendez editores 3 edición pp 203. Editorial omega 7 edición.unam. microbiología y parasitología medica .blogspot.BIBLIOGRAFÍA A. Schlegel.mx/2010/09/los-virus-ciclo-litico-ylisogenico. Microbiologia y parasitología médica.uam. Pumarola.mx/ibs/HerenciaExtraCrom. Tay Zavala. Editorial Salvat. Rodriguez-Torres.