Cromatografia líquidade alta eficiência Vantagens da HPLC Versatilidade Sensibilidade Resultados quantitativos Espécies não-voláteis e termolábeis Automatização Limitações da HPLC Alto custo do instrumento Alto custo de operação Falta de detector universal sensível Necessidade de experiência no seu manuseio HPLC x GC Fator GC HPLC Requisito p/ amostra volátil e termicamente estável solúvel na fase móvel Tipos de amostra gases, líquido e sólidos líquidos e sólidos Quantidade mínima detectável 10 -12 g (ECD) 10 -9 g (UV) Tempo de análise minutos até poucas horas minutos até muitas horas Pratos teóricos por coluna 2.000-300.000 500-25.000 Capacidade analítica até 200 componentes até 50 componentes Tempo de treinamento do operador cerca de 3 meses pelo menos 6 meses Comparação entre as características de GC e HPLC ESCOPO DA CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO Figura 28-1 Skoog p642 vp •espécies MM>10 4 : cromatografia por exclusão •espécies iônicas de baixa MM: cromatografia por troca iônica •espécies pequenas e polares, mas não-iônicas: métodos de partição (série homóloga) •espécies não-polares: cromatografia por adsorção (isômeros estruturais, hidrocarbonetos alifáticos) TROCA IÔNICA PARTIÇÃO ADSORÇÃO fase normal fase reversa EXCLUSÃO filtração em gel permeação em gel insolúvel em água solúvel em água não-polar iônico polar não-iônico POLARIDADE DO SOLUTO 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 m a s s a m o l e c u l a r aplicações Instrumentação para HPLC Fase móvel Injetor Instrumentação para HPLC Instrumentação para HPLC Características da fase móvel Ser de alto grau de pureza ou fácil purificação Dissolver a amostra sem decompor seus componentes Não decompor ou dissolver a fase estacionária Ter baixa viscosidade Compatível com o tipo de detector Polaridade adequada para permitir a separação dos componentes da amostra. Instrumentação para HPLC Sistema de bombeamento REQUISITOS: Pressões de até 6000 psi (~400 atm) Vazão contínua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos) Vazões de 0,1 a 10 ml/min (aplicações analíticas) e Controle de vazão e reprodutibilidade melhor que 1 % Inércia química: componentes resistente à corrosão Sistema de bombeamento Tipos de bombas: Pneumática Deslocamento Recíproca Bomba pneumática Vantagens: Baixo custo Livre de pulsações Desvantagens: Baixa pressão (até 2000 psi) Baixo volume Não permite gradiente Vazão depende da pressão de retorno e viscosidade da fase móvel Bomba de deslocamento Vantagens: Vazão independe da pressão de retorno e viscosidade da fase móvel Livre de pulsações Desvantagens: Baixo volume Não permite gradiente Bomba recíproca Vantagens: Pressão elevada (até 10 000 psi) Pequeno volume interno (35 a 400 µL) Permite gradiente Desvantagem: Fluxo pulsado Alto custo Instrumentação para HPLC Sistema de Injeção Loop de 0,5 a 500 µL Permite operar até 7000 psi Reprodutível Sistema de Injeção Instrumentação para HPLC Coluna Geralmente em aço inox Coluna de vidro reforçado (até 600 psi) Coluna empacotada Preço: > US$ 200.00 Pré-coluna Pequena e de constituição similar à da coluna analítica Retém: Material particulado Contaminantes do solvente Componentes da amostra que se ligam irreversivelmente à fase estacionária. Custo reduzido Instrumentação para HPLC Características de um detector Sensibilidade e seletividade adequada Ampla faixa linear Baixo volume interno Resposta Rápida Boa estabilidade e reprodutibilidade Não destruir a amostra Características de um detector Sensibilidade adequada Nem sempre é desejável alta sensibilidade A sensibilidade deve ser compatível com a concentração do analito na amostra. Características de um detector Seletividade adequada Detector seletivo: Permite detectar uma de duas ou mais espécies que co-eluam. Em geral, melhor linha base. Detector não seletivo: Uso universal Características de um detector Linearidade por várias ordens de grandeza Faixa linear é aquela região da curva de calibração que se ajusta bem a uma reta. Uma ampla faixa linear permite: maior comodidade no dimensionamento do volume de amostra. acomodar em uma mesma corrida cromatográfica picos referentes a espécies de concentrações muito diferentes. Características de um detector Baixo volume interno O volume do detector é a região do fluxo cromatográfico ao qual o detector responde. Grande volume alargamento dos picos registrados. Características de um detector Resposta Rápida O sistema de detecção deve idealmente apresentar um sinal que represente um exato instante de uma porção do caminho (volume do detector). Detector lento picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa. Características de um detector Boa estabilidade e reprodutibilidade Alta confiabilidade e facilidade de uso Não destruir a amostra para: Permite coletar o eluato Utilizar um segundo tipo de detector Detector por espectrofotometria UV- visível Detector por espectrofotometria UV-visível Detector por arranjo de diodos Detector por arranjo de diodos Detector por espectrofotometria UV- visível Princípio de operação Absorvância de luz na faixa UV-visível tipo Seletivo, depende de propriedades do composto Min. quanti. detetável (g/mL) 10 -9 Sensib. a temperatura Baixa Sensib. a vazão da f. móvel Não Útil com gradientes Sim Aplicabilidade Compostos que absorvem no ì selecionado Detector por fluorescência Detector por fluorescência Princípio de operação Excitação com luz produz emissão fluorescente tipo Altamente seletivo Min. quanti. detetável (g/mL) 10 -9 (excitação a laser: 10 -12 ) Sensib. a temperatura Baixa Sensib. a vazão da f. móvel Não Útil com gradientes Sim Aplicabilidade Compostos ou derivados que fluorescem Detector por índice de refração Detector por índice de refração Princípio de operação Mudança no índice de refração da fase móvel tipo Universal, depende de propriedade da f. móvel Min. quanti. detetável (g/mL) 10 -7 Sensib. a temperatura alta Sensib. a vazão da f. móvel Não Útil com gradientes Não Aplicabilidade Geral Detector eletroquímico Princípio de operação Oxidação ou redução em potencial fixo tipo Seletivo, depende de propriedades do composto Min. quanti. detetável (g/mL) 10 -12 Sensib. a temperatura Média Sensib. a vazão da f. móvel Sim Útil com gradientes Não Aplicabilidade Espécies que oxidam ou reduzem Detector por condutividade elétrica Detector por condutividade elétrica Princípio de operação Condutividade elétrica devida a presença de íons tipo Seletivo, depende de propriedades do composto Min. quanti. detetável (g/mL) 10 -8 Sensib. a temperatura Média Sensib. a vazão da f. móvel Sim Útil com gradientes Não Aplicabilidade Soluções aquosas com compostos iônicos Líquido líquido: liquido depositado fisicamente sobre uma superfície sólida. Ex: água sobre sílica ou alumina. Fase ligada: Ligações covalentes. Ex: Si-O- (CH 2 ) 17 CH 3 (RP-18). Cromatografia de partição Cromatografia de partição Mais de 90% das análises atuais são realizadas com fase ligada. Fase normal x Fase reversa Fase normal: fase estacionária polar; fase móvel apolar (n-alcanos, clorofórmio, acetato de etila); solutos neutros; |polaridade soluto | t. retenção; mecanismo retenção: adsorção CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL •Nos trabalhos pioneiros usou-se fases altamente polares, como água e trietilenoglicol adsorvidos sobre sílica ou alumina e solventes apolares, como hexano ou éter isopropílico, eram usados como fase móvel; por razões históricas, este tipo de cromatografia é chamado de fase normal •Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando a polaridade da fase móvel tem o efeito de diminuir o tempo de eluição Polaridade do soluto: a > b > c c b a tempo c b a tempo P o l a r i d a d e d a f a s e m ó v e l Partícula de sílica Fase Normal Si OH silanol livre •• Si-OH + R 3 SiCl Si-O-Si-(CH 3 ) 2 R + HCl Ciano (-C 2 H 4 CN) Diol (-C 3 H 6 OCH 2 CHOHCH 2 OH) Amina (–C 3 H 6 NH 2 ) R = Fase normal x Fase reversa Fase reversa: fase estacionária apolar; fase móvel polar (tampões, água, metanol, acetonitrila, THF); solutos apolares, não-iônicos; |polaridade f. móvel | t. retenção; mecanismo retenção: interações apolares com radicais da coluna. Fase estacionária Fase ligada Fase estacionária Fase ligada CROMATOGRAFIA POR PARTIÇÃO Si-OH + R 3 SiCl Si-O-Si-R 3 + HCl Si-O-SiR 2 soluto cadeias do hidrocarboneto (C 18 ) partição (solubilização) Obs. nas fases ligadas, tem-se também a possibilidade de adsorção do soluto devido aos sítios ativos (silanóis residuais) A sílica tem aproximadamente 8µM de grupos Si-OH por m 2 . A cobertura superficial por silanização esta limitada a 4 µM devido a efeitos estéricos. Os Si-OH restantes são prejudiciais causando alargamento das bandas devido a polarização da superfície. Principalmente na análise de analitos básicos. Reação com trimetilsilano (efeito estérico reduzido -CH3) minimiza o problema (encapados) CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA •Na cromatografia de fase reversa, a fase estacionária é apolar, um hidrocarboneto por exemplo (C18) e a fase móvel é relativamente polar (água, metanol, acetonitrila, etc) •Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando-se a polaridade da fase móvel aumenta-se o tempo de eluição Polaridade do soluto: a > b > c a b c tempo a b c tempo P o l a r i d a d e d a f a s e m ó v e l Separação isocrática e por gradiente A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou mistura de solventes). Se um solvente não propiciar uma eluição suficientemente rápida de todos os componentes, então pode ser utilizada uma eluição por gradiente. CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA •Na cromatografia de fase reversa, a fase estacionária é apolar, um hidrocarboneto por exemplo (C18) e a fase móvel é relativamente polar (água, metanol, acetonitrila, etc) •Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando-se a polaridade da fase móvel aumenta-se o tempo de eluição Polaridade do soluto: a > b > c a b c tempo a b c tempo P o l a r i d a d e d a f a s e m ó v e l Com base nas eluições isocráticas foi elaborado o gradiente a seguir. Pode haver várias formas de se separar um dado conjunto de analitos, entretanto algumas informações são essenciais para determinação do modo de operação ESCOPO DA CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO Figura 28-1 Skoog p642 vp •espécies MM>10 4 : cromatografia por exclusão •espécies iônicas de baixa MM: cromatografia por troca iônica •espécies pequenas e polares, mas não-iônicas: métodos de partição (série homóloga) •espécies não-polares: cromatografia por adsorção (isômeros estruturais, hidrocarbonetos alifáticos) TROCA IÔNICA PARTIÇÃO ADSORÇÃO fase normal fase reversa EXCLUSÃO filtração em gel permeação em gel insolúvel em água solúvel em água não-polar iônico polar não-iônico POLARIDADE DO SOLUTO 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 m a s s a m o l e c u l a r Desenvolvimento de métodos para separações em fase reversa A RP é adequada para separar misturas neutras de baixo peso molecular ou compostos orgânicos carregados. Se os isômeros não ficarem bem separados, é recomendada a cromatografia em fase normal, porque os solutos possuem interações mais específicas e mais fortes com a fase estacionária. Critérios para uma separação adequada 0,5 < k < 20 2 2 c m Ld t F = Se t m (t 0 ) não pode ser observado pode ser estimado por: L comprimento da coluna, d c diâmetro da coluna e F vazão Resolução > 1,5 (para quantificação) Otimização com um solvente orgânico A primeira mistura que deve ser tentada é acetonitrila (ACN) água. A ACN tem baixa viscosidade e permite detecção no UV baixo 190 nm. O metanol é a segunda escolha como solvente orgânico, maior viscosidade e UV 205 nm. O tetrahidrofurano (THF) é a terceira pois possui uma faixa de UV menos útil, é lentamente degradado pela oxidação e se equilibra mais lentamente com a fase estacionária. As condições gerais estão apresentadas na tabela a seguir: Otimização de dois ou três solventes orgânicos Otimizado 30 % ACN 70 % tampão Otimizar sistematicamente ACN : tampão 32% de THF Tentativa e erro 40 % MeOH 22% de THF nomógrafo Nomógrafo Separação por gradiente Volume de residência: volume no qual são misturados os solventes e o início da coluna. Variam de 0,5 a 10 ml em diferentes sistemas. Se o volume de residência for 5 ml numa vazão de 1 ml/min o tempo de residência t D é 5 minutos. Uma mudança de solvente iniciada em 8 minutos não alcança a coluna até 13 minutos. Medida de t D Inicialmente vimos separação de 8 analitos que necessitou de cerca de 120 minutos. Enquanto a força do solvente foi suficientemente baixa para resolver os dois primeiros pico 2 e 3 a eluição do último pico foi muito lenta. Para manter a resolução desejada, mas diminuir o tempo de análise foi selecionado o modo de gradiente segmentado. Os picos 1 a 3 foram separados com uma força de eluente baixa (B a 30%). Entre t = 8 e 13 min. B aumentou linearmente de 30 para 455 para eluir os picos do meio. Entre t = 28 e 30 min B aumentou de 45 para 80 % para eluir os picos finais. Use um gradiente se Use a eluição isocrática se 0, 25 G t t A > 0, 25 G t t A < Uma mistura de 14 compostos foi submetida a uma separação por gradiente RP, indo de 5 a 100 % de ACN com um tempo de gradiente de 60 min. A amostra foi injetada em t =tempo de residência . Todos os picos foram eluídos entre 22 e 41 min. a) A mistura é adequada para eluição isocrática ou por gradiente? b) Se a próxima corrida for um gradiente, selecione a porcentagem inicial e final de solvente e o tempo de gradiente. 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 Série1 41 22 0, 317 60 G t t A ÷ = = a) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 20 40 60 80 Série1 40 a 70 em 60 minutos b) Avaliar k, Rs para tentar reduzir o tempo Gravity Chrom. Tsvett, 1903 Flash Chrom. 1978 HPLC 1952 UPLC 2004 (TLC) Paper Chrom. E a História continua ... CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO – sólido líquido Si OH silanol livre Si OH silanol germinal HO Si OH silanóis associados Si OH soluto •• adsorção (pontes de H) CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA •sítios ativos mais comuns nos trocadores de cátions: grupo ácido sulfônico -SO 3- H + (ácido forte) e grupo ácido carboxílico –COO - H + (ácido fraco) •sítios ativos mais comuns nos trocadores de ânions: grupos amina terciária –N(CH 3 ) 3 + OH - (base forte) e grupos amina primária –NH 3 + OH - (base fraca) CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA Quando um trocador iônico de ácido sulfônico é colocado em contato com uma solução aquosa contendo o cátion C, o equilíbrio de troca estabelecido é o seguinte: x RSO 3 - H + + C x+ (RSO 3 - ) x C x+ + x H + sólido solução sólido solução analogamente, um trocador de ânions interage com o ânion A segundo a reação: y RN(CH 3 ) 3 + OH - + A y- (RN(CH 3 ) 3 + ) y A y- + y OH - sólido solução sólido solução CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA FASES MÓVEIS MAIS COMUNS: •soluções aquosas que podem estar tamponadas ou conter quantidades moderadas de um solvente miscível com água •força e seletividade são moduladas pelo tipo e concentração dos aditivos (sal e solvente) FASES ESTACIONÁRIAS MAIS COMUNS: •resinas de poliestireno entrecruzada com divinilbenzeno, na qual são ligados grupos iônicos •micropartículas porosas de sílica recobertas com filme do trocador CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA em colunas supressoras de eluente •escolha óbvia: detectores por condutividade que são altamente sensíveis, universais para espécies carregadas, respondem de forma previsível a mudanças de concentração; simples de construção e manutenção barata, fáceis de serem miniaturizados e comumente funcionam por longo tempo sem problemas •limitação séria: era necessária uma alta concentração do eletrólito (fase móvel) para eluir a maioria dos analitos iônicos em um tempo razoável; como conseqüência, a condutividade dos componentes da fase móvel tendia a sobrepujar a dos analitos, reduzindo acentuadamente a sensibilidade do detector CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA em colunas supressoras de eluente •o problema da alta condutância do eluente foi resolvido com a introdução da chamada coluna supressora de eluente, posicionada imediatamente após a coluna analítica de troca iônica •a coluna supressora é recheada com uma segunda resina de troca iônica que efetivamente converte os íons da fase móvel a espécies moleculares de ionização limitada, sem afetar os íons do analito REAÇÃO NA COLUNA SUPRESSORA •quando cátions (analito) estão sendo separados, freqüentemente é utilizado HCl como reagente eluente e a coluna supressora é uma resina de troca aniônica na forma de hidróxido •o produto da reação no supressor é água H + (aq) + Cl - (aq) + Resina + OH - (s) Resina + Cl - (s) + H 2 O REAÇÃO NA COLUNA SUPRESSORA •na separação de ânions (analito), eluentes comuns são carbonato ou bicarbonato de sódio e a coluna supressora é um trocador de cátions na forma ácida Na + (aq) + HCO 3 - (aq) + Resina - H + (s) Resina - Na + (s) + H 2 CO 3 O EFEITO DA SUPRESSÃO amostra: F - , Cl - e SO 4 2- eluente: NaOH coluna analítica: troca aniônica coluna supressora: troca catiônica NaF, NaCl e Na 2 SO 4 em NaOH HF, HCl e H 2 SO 4 em H 2 O Na + (lixo) H + (regenerador) tempo µ S F - Cl - SO 4 2- µ S F - Cl - SO 4 2- ruído SEM SUPRESSÃO SUPRESSÃO QUÍMICA contra- íons OH - H + O EFEITO DA SUPRESSÃO condutância do eletrólito (microSiemens, µS) (ì + + ì - ) C G = 1000 O concentração (mol/L) constante da cela (cm -1 ) condutância equivalente iônica (S.cm 2 /eq) Supressor-H + + NaOH Supressor-Na + + H 2 O exemplo eluente: 5 mmol/L ì Na+ = 50 S.cm 2 /eq ì OH- = 198 S.cm 2 /eq O = 10 cm -1 G = (50+198).5x10 -3 /10 4 = 124 µS G H2O = 0,05 µS O EFEITO DA SUPRESSÃO (ì + + ì - ) C G = 1000 O ì Na+ = 50 S.cm 2 /eq ì H+ = 380 S.cm 2 /eq ì F- = 55 S.cm 2 /eq ì Cl- = 76,3 S.cm 2 /eq ì 1/2SO42- = 79,8 S.cm 2 /eq O = 10 cm -1 G NaCl = (50+76,3).1x10 -3 /10 4 = 12,6 µS G HCl = (380+76,3).1x10 -3 /10 4 = 45,6 µS NaF, NaCl e Na 2 SO 4 em NaOH HF, HCl e H 2 SO 4 em H 2 O condutância da banda do cloreto aumenta 3,6 vezes após supressão após supressão exemplo analito: 1 mmol/L CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA regeneração das colunas supressoras •inconveniente do uso de colunas supressoras: necessidade de regeneração periódica (8-10h) para converter a coluna a sua forma original ácida ou básica •uso de duas colunas supressoras: enquanto uma das colunas é usada como supressora (retém Na + , supressor - Na + ), a outra é condicionada pela passagem do eluente (HX, supressor - H + ); quando a primeira coluna satura (7-12h), uma válvula dirige o fluxo para a segunda coluna e assim sucessivamente, e novamente o sistema pode ser usado por mais 7-12 h. •membrana supressora CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA membrana supressoras ELUENTE ELUENTE RSO 3 H RSO 3 H RSO 3 H RSO 3 Na RSO 3 Na RSO 3 Na canal externo membrana permeável canal do eluente resina de troca catiônica forte R = alquilbenzeno de cadeia longa tubo CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA membranas supressoras coluna analítica pré- coluna injetor reservatório do eluente SISTEMA DE REGENERAÇÃO coluna supressora (membrana) bomba para regenerante bomba para eluente detector RSO 3 Na RSO 3 H R = alquilbenzeno de cadeia longa RSO 3 H coluna de troca catiônica CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA em coluna única •equipamentos onde nenhuma coluna supressora é usada •abordagem depende de pequenas diferenças de condutividade entre íons eluídos e os íons do eluente •para amplificar essas diferenças são usados trocadores de baixa capacidade, tornando possível a eluição de espécies de baixa condutância equivalente •um pouco menos sensível e tem uma faixa mais limitada do que a cromatografia com coluna supressora CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO Resolução é baseada no tamanho efetivo dos componentes da amostra: •limite de permeação: abaixo do qual todas as moléculas de menor tamanho são igualmente difundidas dentro dos poros do material •limite de exclusão: acima do qual todas as moléculas são muito grandes para penetrar os poros •somente podem ser separadas as moléculas que se encontram dentro dos dois limites Fase estacionária Bioafinidade: fase estacionária: ligantes específicos; fase móvel: tampões; mecanismo de retenção: interações por bioafinidade (chave- fechadura); Aplicação: proteínas, hormônios, antígenos, anticorpos, ácidos nucleicos. Fase estacionária Colunas quirais: fase estacionária: ciclodextrinas, éteres de coroa; fase móvel: tampões, solventes polares, seletores quirais; Fase estacionária Colunas quirais: Colunas para HPLC Figura: colunas utilizadas para análise de preparações farmacêuticas segundo a USP XXV (n=35). Espectrometria de massa Ferramenta analítica capaz de medir a massa molecular de um ou mais compostos Composição elementar das amostras Estruturas de moléculas inorgânicas, orgânicas e biológicas Composição qualitativa e quantitativa de misturas complexas Estrutura e composição de superfícies sólidas Razões isotópicas de átomos nas amostras Watson, J.T., Introduction to mass spectrometry. 3 ed. 1997 1º espectrômetro de massa J.J. Thomson (1913) http://masspec.scripps.edu/MSHistory/histpers.php PARÁBOLA ESPECTROGRÁFICA Íons separados pelas suas diferentes trajetórias parabólicas em campos eletromagnéticos e a detecção era feita através de chapas fotográficas Espectrômetro de massa Introdução da amostra Fonte de íons Filtro de massas (m/z) Detecção Vácuo Diagrama em blocos de um espectrômetro de massas. http://www.asms.org geração de íons na fase gasosa a partir das amostras íons gerados na fonte são separados de acordo com sua relação m/z Quantificação dos íons que passam pelo filtro de m/z Diagrama em blocos de um espectrômetro de massas. local onde a amostra é exposta à fonte de inonização Electrospray (ESI) Principais características ocorre à pressão atmosférica; transferência de uma molécula carregada em fase líquida para a fase gasosa; técnica de ionização “suave” que permite que as interações não covalentes entre moléculas que estão em solução sejam preservadas na fase gasosa; amostras devem ser solúveis em solventes de baixo ponto de ebulição; [M+H] + ou [M-H] - ; moléculas com cargas múltiplas, [M+nH]n + , podem ser formadas por este método. Cole, R.B.; In: Electrospray Mass Spectrometry; John Wiley & Sons, New York, Inc Chinchester, (1997) Electrospray (ESI) Electrospray (ESI) 1- formação de um spray com gotículas altamente carregadas 2- as gotículas carregadas são liberadas através do Cone de Taylor 3- um gás nebulisador (N 2 ) auxilia na liberação das gotículas 5- a densidade de carga superficial aumenta até atingir o “limite de Rayleigh” 6- a gotícula explode os íons são direcionados ao contra eletrodo, que apresenta carga oposta, passam pelo analisador de massa e são detectados h t t p / / : w w w . w a t e r s . c o m Cole, R.B.; In: Electrospray Mass Spectrometry; John Wiley & Sons, New York, Inc Chinchester, (1997) 3- as gotículas vão tendo seus raios diminuídos http://www.acsu.buffalo.edu/~twood/nanospray.html Electrospray (ESI) O O H O OH O O O H O H O H O H O composto sai da coluna do HPLC, passa para a fase gasosa na fonte de ionização eletrospray e entra no espectrômetro de massas. Então a massa molecular (m/z) da espécie é registrada. Neste exemplo: Apigenina glicosilada (m/z = 431). Fragmentação Cela de colisão O O H O OH O O O H O H O H O H OH OH O O H O m/z 268 m/z 431 A seguir o composto é levado à cela de colisão, onde se fragmenta e gera (neste exemplo a apigenina) o restante do espectro de massas. 100 200 300 400 m/z 268 431 Apigenina Glicosilada Apigenina Determinação de resíduo de drogas em cédulas 3 mL de (9:1 (água: acetonitrila)), com 1% de ácido fórmico - 15 minutos de ultra-som. Injeção no LC/MS QTrap 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Time, min 0.0 5.0e4 1.0e5 1.5e5 2.0e5 2.5e5 3.0e5 3.5e5 4.0e5 4.5e5 4.7e5 I n t e n s i t y , c p s 8.24 11.25 2.18 5.93 Nicotina Lidocaína Cocaína Referências bibliográficas http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/index.html SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A. Princípios de análise instrumental. 5ª. Ed., 2002. COLLINS, C. H., BRAGA, G. L., BONATO, P. S. Introdução a métodos cromatográficos. WESTON, A., BROWN, P. R. HPLC and CE - principles and practice. 1997.