I s o l e me n t d e ss o u c h e sd ’ a c t i n o my c è t e sp r o d u c t r i c e s d es u b s t a n c e sa n t i f o n g i q u e s I s o l a t i o no f a c t i n o my c e t e ss t r a i n sp r o d u c i n g a n t i f u n g a l s u b s t a n c e sA u t e u r : E l a r b i B o u s s a b e r , I s s a m Me f t a hK a d mi r i , L a h o u c i n eH i l a l i A b d e r r a o u f H i l a l i C a t é g o r i e:E n v i r o n n e me n t >B i o l o g i e S c i e n c e L i bE d i t i o n sMe r s e n n e:V o l u me4, N °1 2 0 8 0 1 I S S N2 1 1 1 4 7 0 6 P u b l i él e :2 0 1 2 0 8 2 7 www . s c i e n c e l i b . f r fr N° de téléphone : +212663697650 * RESUME Au cours des dernières années.20 %) ont montré une activité antifongique vis-à-vis d’au moins un champignon étudié. 25 (86. vingt-neuf souches d'actinomycètes ont été isolées sur trois milieux de culture choisis en fonction des données de la littérature (Olson. 1 ScienceLib Editions Mersenne : Volume 4 . ont été identifiées comme ayant un potentiel d’utilisation dans la lutte biologique. Les extraits des trois actinomycètes représentatifs ont montré une activité inhibitrice intéressante. E-mail : Larbi_boussaber@yahoo. Laboratoire d’agroalimentaire et santé. à partir d'échantillons de sol prélevés de forêt. à partir de trois écosystèmes marocains différents. BP. Abderraouf Hilali1. 1-Université Hassan premier. plus d’une centaine de bactéries. Faculté des sciences et techniques. L’usage des antifongiques microbiologiques en font des alternatives viables à la lutte chimique. *Auteur correspondant : Elarbi Boussaber. Settat (MAROC). surtout la souche SP13’ qui s’est révélée plus efficace et présente une intense activité antifongique. L’activité antifongique des souches d’actinomycètes isolées a été mise en évidence sur milieu de culture Bennett par deux techniques de diffusion sur gélose. Ainsi. 577. de dunes phosphatées et de décharge de poterie. Pourtant. Laboratoire d’agroalimentaire et santé. N ° 120801 ISSN 2111-4706 . Issam Meftah Kadmiri1. notamment les actinomycètes. Il apparaît donc nécessaire de s’orienter vers l’application de la lutte biologique contre les champignons phytopathogènes à l’aide de bactéries actinomycétales. BP 577. Le présent travail consiste donc à isoler des souches d’actinomycètes productrices de substances antifongiques. Les microorganismes sont actuellement considérés comme des agents très prometteurs pour assurer une protection phytosanitaire performante. En effet. leur emploi inconsidéré pourrait faire courir des risques aux consommateurs et déstabiliser dangereusement les écosystèmes. Bennett et GLM). les Champignons phytopathogènes ont été contrôlés principalement par l’utilisation des fongicides synthétiques d’origine chimique qui permettent de protéger les cultures et les récoltes contre ces organismes nuisibles. Lahoucine Hilali1.Elarbi Boussaber Isolement des souches d’actinomycètes productrices de substances antifongiques Isolation of actinomycetes strains producing antifungal substances Elarbi Boussaber 1. Faculté des sciences et techniques. Parmi les 29 souches d’actinomycètes isolées. Settat (MAROC). 1975 . have been identified as having potential for use in biological control. Among the 29 strains. The strains were isolated from samples collected from forest soil. lutte biologique. phytopathogenic fungi. phytopathogenic fungi were mainly controlled by the use of chemical fungicides to protect crops against these pests. 25 (86. La FAO estime qu’au moins 25% de la récolte mondiales des denrées agricoles est contaminée par les mycotoxines (Manfred et al. 17% étant provoquées par des bactéries et des virus. Thus. Microorganisms are currently considered as very promising for effective plant protection. 2000). N ° 120801 ISSN 2111-4706 . ABSTRACT In recent years. substance antifongique. including actinomycetes.. Nevertheless. Bennett. phosphate rock dunes and discharge of pottery. champignons phytopathogènes. Keywords: Actinomycetes. Indeed. The uses of microbial fungicides are viable alternatives to chemical control.20%) have shown antifungal activity with at least a studied fungus. which lead to adverse impacts to the health of terrestrial and aquatic ecosystems. It therefore appears necessary to move towards the application of biological control fungi phytopathogenes using a bacteria. especially the strain SP13' which was more effective and showed intense antifungal activity. Antifungal activity of the strains of actinomycetes isolated has highlighted on medium Bennett by two techniques of diffusion on agar. the regular use of fungicides can potentially pose a risk to the environment.Elarbi Boussaber Mots-clés : Actinomycètes. 1980 . biological control. Emond 2 ScienceLib Editions Mersenne : Volume 4 . 83% des maladies des plantes sont dues aux champignons. and GLM). INTRODUCTION Les champignons sont les principaux microorganismes responsables des pertes en agriculture. more than a hundred of bacteria. Rhizopus stolonifer est un champignon phytopathogène responsable d’une maladie connue sous le nom de moisissure chevelue de certaines plantes (Dennis. The present work aimed to isolate strains of actinomycetes producing antifungal substances from three different Moroccan biota. twenty-nine Actinomycete strains have been isolated on three media selected among the most frequently cited in the literature (Olson. Three actinomycetes extracts showed interesting inhibitory activity. antifungal substance. Daubeny et al. particularly if residues persist in the soil or migrate off-site and enter waterways. sont les plus prolifiques de tous les micro-organismes en tant que producteurs de molécules à activités biologiques. etc. Le but de ce travail est de chercher à isoler des souches d’actinomycètes productrices de substances à activité inhibitrices contre des champignons phytopathogènes à partir des échantillons de sol prélevés de trois écosystèmes de paramètres physicochimiques différents. d’une part. la pêche et la poire (Ogawa et al. 2007). 1987 . 3 ScienceLib Editions Mersenne : Volume 4 . Snowdon. Fusarium culmorum est un agent phytopathgène responsable de divers symptômes tels que fonte des semis. en particulier chez les céréales (Wiese. Environ 75% des antibiotiques découverts entre 1971 et 1980 appartiennent aux actinomycètes (Iwai et Takahashi. Wilson et al. dans le but de découvrir des taxons originaux et par-là de nouvelles molécules biologiquement actives. 1992). poires et coings) (Roussel et al. Pour ces raisons. la lutte chimique génère des impacts négatifs énormes sur l’environnement et. 2004). 1996). 1964). Ces maladies ont été contrôlées principalement par l’utilisation des fongicides synthétiques d’origine chimique.Elarbi Boussaber et al. N ° 120801 ISSN 2111-4706 . la carotte. Cependant. Penicillium digitatum est un agent de pourriture des fruits. fusariose de l'épi. 1977). pourriture racinaire. la prune. Il est connu comme étant la pourriture verte des oranges et citrons (Taqarort et al. Penicillium expansum est une espèce de champignon microscopique responsable de la pourriture des fruits (surtout pommes. chez de nombreuses espèces de plantes mono et dicotylédones. C'est l'un des champignons responsables de la pourriture sèche du tubercule de la pomme de terre (Booth et Waterson. d’autre part. la pomme. ce travail s’inscrit dans le cadre de la recherche des molécules antifongiques capables de jouer un rôle important dans la lutte biologique contre ces champignons. pourriture de la tige. en particulier la fraise. 1963 . l’utilisation intempestive. Les actinomycètes (bactéries dont la croissance donne lieu à des colonies constituées de filaments). 1990). Ces molécules sont souvent recherchées à partir des microorganismes isolés d’échantillons prélevés de différents écosystèmes. inconditionnelle et irrationnelle des fongicides chimiques provoque le développement de la résistance chez les champignons phytopathogènes. surtout les agrumes. 1984)] sont mesurées dès l’arrivée au laboratoire. Les propriétés physicochimiques des trois échantillons [pH (pochon et Tardieu 1962). 1997 .ml1 ) (Davet et al. 2006 et Kitouni. 0. Hilali.1g de CaCO3 et incubé à 28°C pendant sept jours dans une atmosphère saturée d’humidité (Cavalla et Eberlin. après avoir retiré les pierres et racines. Après coloration de Gram. puis. Après agitation au vortex pendant 10 min (Hilali et al. repiquées par la méthode des stries sur les mêmes milieux de culture utilisés pour l’isolement et purifiées sur le milieu de Bennett exempt d’antifongiques et d’antibactériens (Bastide et al. 2002). 1996) et humidité (Demeo. Cette dernière opération est répétée jusqu’à obtention de souches pures (Cheraiti et al.l-1) stérile a été préparée à partir de chaque échantillon. 2007). Après incubation à 28°C de deux à trois semaines. après avoir écarté les cinq à dix premiers centimètres de la couche superficielle du sol. décharge de poterie de Boujad et dune phosphatée d’Oued-Zem) situés dans la région Chaouia Ouardigha au centre du Maroc. 2012) puis.1 ml de chaque dilution est ensemencé à la surface des boites de Pétri contenant l’un des trois milieux de cultures (Olson. purification et conservation des actinomycètes Une série de dilutions de 10-1 à 10-5 dans de l’eau physiologique (NaCl 9g. Actidione 40µg. les colonies se rapprochant par leur aspect macroscopique aux actinomycètes ( Hilali.ml-1. Les trois échantillons de sol ont été prélevés selon la technique de Pochon Tardieux (1962) qui consiste à prélever à l’aide d’une grande spatule stérile. d’une part.ml-1. conductivité (Rodier. salinité. à 4 °C sur 4 ScienceLib Editions Mersenne : Volume 4 . 50g de l’échantillon trié sont placés dans un flacon stérile et transportés au laboratoire. N ° 120801 ISSN 2111-4706 . 100g de terre et les déposer sur une feuille d’aluminium stérile . 1994). Bennett et GLM) additionnés ou non d’antifongiques et d’antibiotiques (Anphotéricine B :75µg. puis. 2006) sont observées au microscope (Grossissement x 100) à l'état frais. seules les souches à coloration de Gram positive et d’aspect filamenteux sont dénombrées. analyse et traitement des échantillons Les prélèvements des échantillons ont été effectués durant les mois de Novembre et Décembre à partir de trois sites différents (Forêt de Settat. 1g de chaque échantillon de sol est séché à l’air puis mélangé avec 0. 1986)... conservées. Acide nalidixique : 10µg.Elarbi Boussaber MATERIEL ET METHODES Prélèvement. Isolement. 2005. 2005).culmorum aux extraits d’actinomycètes. de P. on note s’il y a eu lieu ou non croissance du champignon (Thibodeau et al. contenant 2%. de P. 2007). Activité antifongique des souches d’actinomycètes isolées L’activité antifongique des actinomycètes isolés vis-à-vis des quatre champignons concernés. trois isolats (SP13’. digitatum et F. expansum et de F. P. 2002) et. 2002) Dans les deux techniques. Les surnageants sont utilisés directement pour réaliser les tests de sensibilité (Bastide et al. expansum. 2002). 10% et 15% du surnageant à tester. (R. Le diamètre des zones d’inhibition sont mesurés en millimètre du bord de la souche actinomycétale ou du cylindre d’agar à la limite de la zone où il n’y a pas inhibition du microorganisme cible (Badji et al. N ° 120801 ISSN 2111-4706 . d’autre part. les boites de Pétri sont incubées à 28°C pendant 48 heures. 5 ScienceLib Editions Mersenne : Volume 4 . P. 1971 . selon leur importance à inhiber la croissance des phytopathogènes pour faire les tests de sensibilité. Après 48 à 72 heures d’incubation. Après incubation des milieux ensemencés par les souches concernées à 28°C dans un bain d'eau agité pendant huit jours. Parmi les souches actives.. Olson et GLM) par deux techniques de diffusion en gélose : La technique de la double couche (Shomura et al. 5%. Boughachiche et al. 1986) Un milieu gélosé. culmorum) qui sont des souches de la collection de l’Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) de Settat. 1979) et la technique des cylindres d’agar (Ichikawa et al. est ensemencé une fois refroidi avec les spores de champignons dont on veut évaluer la résistance. SPO3 et SFr3’) ont été choisis. Potato Dextrose Agar (PDA) fraichement préparé. a été effectuée sur trois milieux (Bennett. stolonifer. à -20°C en suspension en présence de glycérol à 20% (v/v) (Kitouni..Elarbi Boussaber des géloses inclinées avec un repiquage tous les deux mois (Hilali et al. Les souches d'actinomycète concernées ont été cultivées en trois fioles d'Erlenmeyer de 500ml contenant chacune 100ml du milieu dont la composition (sauf l'agar) est identique au milieu utilisé dans les tests d’activité. digitaum.stolonifer. Tests de sensibilité de R. 50ml de chaque culture sont centrifugés à 5000 tr/min pendant 20min. Lee et Hwang. N ° 120801 ISSN 2111-4706 .23 Salinité 0. Lieu de prélèvement Sol de décharge de poterie Sol de forêt Sol phosphaté Code SP SFr SPO pH 8.Elarbi Boussaber RESULTATS ET DISCUSSION Analyse physicochimique des échantillons Tableau 1: Propriétés physicochimiques des échantillons.AB : milieu de culture avec antibiotiques6 ScienceLib Editions Mersenne : Volume 4 . D’après Lee et Hwang (2002).3 7.15 Conductivité µs.09 0. MC. ET: échantillon traité.SAB: milieu de culture sans antibiotiques. Isolement des actinomycètes à partir des échantillons de sol Après 7 à 21 jours d’incubation à 28 °C.11 7. Figure1: Evolution du nombre de colonies d'actinomycètes dénombrées selon le milieu de culture -ENT : échantillon non traité. le taux d’humidité de tous les échantillons est élevé (supérieur à 13).cm-1 465 200 309 Humidité 20 14 20 Le tableau 1 montre que l’échantillon prélevé de la décharge de poterie est caractérisé par un pH alcalin et une conductivité élevée par rapport aux autres échantillons. ceci est expliqué par la période des prélèvements qui ont été réalisés durant la saison pluvieuse.22 0. le dénombrement des colonies d’actinomycètes sur les trois milieux de culture complémentés ou non en antibiotiques et antifongiques a conduit aux résultats rassemblés dans la figure1. MC. préalablement. Le milieu d’Olson est moins riche en substances organiques et contient du trouvent les actinomycètes. Les souches SP13’. d’oú il en ressort que 86.Elarbi Boussaber Le traitement des échantillons de sol par le CaCO3 et l’addition des antibiotiques dans les milieux de culture font augmenter le nombre de colonie sur tous les milieux utilisés. Les résultats obteus sont rassemblés dans les tableau 2 et 3. Propionate de sodium qui agit comme antifongique (Hilali. on sélectionne le développement des actinomycètes. 2006). ce qui favorise la croissance des bactéries parmi lesquelles se Activité antifongique des souches d’actinomycètes isolées L’activité antifongiques des souches d’actinomycètes isolée a été mise en évidence sur le milieude culture Bennett par la technique de la double couche et la technique des cylindres d’agar. le milieu GLM est riche en matières organiques. Or.20% des actinomycètes présentant une activité inhibitrice vi-à-vis d’au moins un des quatre champignons étudiés. on constate que le plus grand nombre de colonies a été enregistré sur le milieu d’Olson. en traitant les échantillons et en complémentant ces milieux en antibiotiques. ce qui favorise le développement de tous les microorganismes. le plus grand nombre de colonies d’actinomycètes dénombrées a été enregistré sur le milieu GLM. ont montré une activité antifongique interessance. SPO6 et SFr3’ qui ont été isolées successivement de la décharge de poterie. Cela revient à la composition des milieux de culture. Nombre de souches Nombre de souches d'actinomycètes d'actinomycètes isolées actives 19 5 5 29 7 Lieu de prélèvement Décharge de poterie Sol phosphaté Sol de forêt Total Code SP SPO SFr 16 5 4 25 ScienceLib Editions Mersenne : Volume 4 . lorsque les échantillons ont été. du sol phosphté et du sol de forêt. traités et le milieu de culture a été additionné d’antibiotiques. Quand les échantillons ne sont pas traités et/ou le milieu de culture n’est pas complémenté en antibiotiques. Tableau 2 : cliblage initiale des souches d’acctinomycètes isolées. N ° 120801 ISSN 2111-4706 . Elles ont été choisies donc pour effectuer les tests de sensibilité des champignons étudiés. cependant. 75 SPO2 12 0 3 0 3.75 Sol SPO3 15 13 4 7 9.expansum F.5 SP6 15 0 8 17 10 SP8 12 0 3 15 7. 8 ScienceLib Editions Mersenne : Volume 4 .25 SP6’ 8 1 15 3 6.33 SP14’ 0 0 0 0 0 SFr1’ 16 12 6 3 9.33 NT : Non testé Ces valeurs représentent les moyennes des diamètres des zones d’inhibition obtenus par les deux techniques utilisées pour la mise en évidence de l’activité antifongique.5 Sol de décharge de SP3’ 9 9 7 10 8.75 phosphaté SPO4 0 5 0 0 1.Elarbi Boussaber Tableau 3 : Activité antimicrobienne des souches d’actinomycètes isolées Diamètres des zones d’inhibition en mm Lieu de Moyenne Isolats prélèvement R.culmorum P.66 SP10’ 4 10 14 4 8 SP11’ 6 0 16 6 7 SP12’ 0 0 0 0 0 SP13’ 14 15 NT 17 15.25 SFr5’ 0 0 0 0 0 SPO1 7 5 3 0 3.digitatum en mm SP1 10 0 8 10 7 SP2 10 1 8 14 8.25 Sol de forêt SFr3’ 11 18 10 0 9.5 SP9 10 9 0 1 5 SP1’ 13 0 0 0 3.75 SFr4’ 0 0 7 10 4.25 SPO6 NT 9 10 15 11.33 SP8’ 0 14 NT 6 6. N ° 120801 ISSN 2111-4706 .75 SP4 0 0 0 10 2.25 SP2’ 0 6 0 4 2.25 SP3 7 1 12 15 8.25 SFr2’ 7 3 0 3 3.75 SP7’ NT 0 2 5 2.75 poterie SP4’ 3 5 0 5 3.stolonifer P. culmorum.expansum P.culmorum aux extraits d’actinomycètes. Tableau 4 : Effets des extraits d’actinomycètes sur la croissance des champignons étudiés R. Le tableau 4 présente les tests de croissance des quatre champignons.: inhibition totale de la croissance. expansum et de F. . de P.digitatum alors qu’à une concentration de 5%. 10% et 15% il inhibe la croissance successivement de P.expasum. R. digitaum.Elarbi Boussaber Tests de sensibilité de R. CONCLUSION Cette étude a consisté à isoler et sélectionner des bactéries actinomycétales productrices de substances antifongiques à partir des échantillons de sol prélevés de différents écosystèmes 9 ScienceLib Editions Mersenne : Volume 4 . La croissance de ce dernier est inhibée par les trois surnageants d’actinomycètes à une concentration de 15% de SPO6 et de SFr3’ et à une concentration de 10% de SP13’.digitatum F. Celui-ci apparait donc comme le plus prometteur pour lutter contre ces quatre champignons phytopathogènes.stolonofifer P. après une incubation de 24 à 72 heures à 28 °C dans des milieux gélosés contenant différentes concentrations des surnageants des souches d’actinomycètes représentatives. Le surnageant de l’isolat SFr3’ semblait stimuler la croissance P. Tous les extraits d’actinomycètes étudiés ne sont pas efficaces à une concentration de 2% pour inhiber la croissance des quatre champignons.culmorum Composition du 2% 5% 10% 15% 2% 5% 10% 15% 2% 5% 10% 15% 2% 5% 10% 15% milieu de culture PDA + Surnageant du + + + + + + + SP13’ PDA + Surnagent du + + + + + + + + + + + + SPO6 PDA + Surnagent du + + + + + ++ ++ + + + SFr3’ Témoin (PDA + + + + seul) + : Croissance normale . N ° 120801 ISSN 2111-4706 . stolonifer. de P.stolonifer et du F. L’effet des extraits d’actinomycètes sur la croissance fongique dépend de la concentration du surnagent et du champignon testé. ++ : Croissance forte . Parmi l’ensemble des souches isolées. salins. 10 ScienceLib Editions Mersenne : Volume 4 . on peut conclure que les actinomycètes sont d'excellents candidats producteurs de substances capables de fournir une alternative écologique fiable. production d’hormones végétales. il serait intéressant de : Identifier les trois souches qui ont montré une large et forte activité antifongique . trois d’entre elles (SP13’. ce qui incite à orienter la recherche de substances bioactives à partir des bactéries actinomycétales vers l’exploitation des écosystèmes inhabituels (pollués. A la lumière de ces résultats. 2009) pour améliorer la croissance des plantes (le surnageant de SFr3’ a favorisé la croissance de P. Cependant pour valoriser ces résultats. la première consiste à utiliser les actinomycètes comme moyen de lutte biologique contre les maladies végétales d’origine fongique (les surnageants des actinomycètes étudiés ont inhibé la croissance des champignons phytopathogènes). qui a montré une forte activité antifongique.). digitatum).) (Beaulieu et Lerat. arides etc. induction des mécanismes de défense chez les végétaux etc. La souche Sp13’. stolonifer. de P. Optimiser des paramètres culturaux afin d’améliorer la production d’antifongiques . N ° 120801 ISSN 2111-4706 . et la deuxième consiste à exploiter les autres propriétés physiologiques des actinomycètes (sécrétion d’enzymes. a été isolée d’un écosystème pollué ayant un pH alcalin et une salinité élevée par rapport aux autres écosystèmes. Identifier et caractériser le principe actif des souches d’actinomycètes représentatives et évaluer leurs effets au champ ou en entrepôt afin de les utiliser comme fongicides biologiques ou comme stimulateurs de la croissance des plantes. SPO6 et SFr3’) ont présenté une importante activité inhibitrice vis-à-vis de quatre champignons phytopathogènes. Les résultats obtenus à partir des tests de sensibilité de R. de P. digitaum.expansum et de F. efficace pour le bio-contrôle de ces champignons phytopathogènes.culmorum aux extraits d’actinomycètes pourraient être exploités de deux manières.Elarbi Boussaber marocains. 49-53. Ind.. J. 5-10.. Isolement de nouvelles souches d’actinomycètes productrices de substances antifongiques à partir du milieu naturel marocain. Emond G et al. 3e édition corrigée..Faculté des sciences (Maroc). Pepin H.A. 211-219. Isolement des souches d’actinomycètes productrices de nouvelles molécules antifongiques.. 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