Apostila Pratica2012

1UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” Departamento de Ciências Biológicas ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS BIOQUÍMICA PROF. DR. DANIEL SHERER DE MOURA PROFA. DRA. HELAINE CARRER PROF. DR.LUIZ ANTONIO GALLO PROF. DR. LUIZ CARLOS BASSO PROF. DR. MURILO MELO Piracicaba - SP 2012 2 SUMARIO ASSUNTO Normas para redação do relatório de aulas práticas de Bioquímica Colorimetria e Espectrofotometria Determinação de Açucares Redutores Cromatografia em Papel de Filtro Determinação de Proteínas (reação do biureto) Determinação da Constante de Michaelis (Km) e da Velocidade máxima (Vm) de uma Enzima. Reação de Hill (Fotólise da água) Redutase de Nitrato em Plantas Listas de Exercícios 30 34 37 40 03 04 10 21 27 pg 3 NORMAS PARA REDAÇÃO DO RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA LCB 208 (OPCIONAL) A forma para se redigir o relatório deve ser respeitada, uma vez que a avaliação do mesmo é feita de acordo com esta orientação. Assim todo relatório devera conter os seguintes itens: CAPA Devera ter: Nome da ESALQ. Depto de Ciências Biológicas Relatório de aulas práticas de Bioquímica Título da aula (numero da aula) Nome e número dos alunos Data (d/m/a) OBJETIVOS INTRODUÇÃO Comentário da aula, incluindo comparativamente fundamentos químicos da metodologia empregada REVISÃO DE LITERATURA Aspectos teóricos e informativos do assunto da aula pratica encontrados na literatura MATERIAL E MÉTODOS (PROCEDIMENTOS) Descrever os procedimentos executados em aula, inclusive as modificações propostas pelo professor RESULTADOS E DISCUSSÃO Colocar em tabelas os resultados obtidos, gráficos, etc. As reta padrão somente serão aceitas se forem feitas em papel milimetrado. Comentar os resultados comparando-os com os da literatura CONCLUSÃO Comentar quais as conclusões da aula pratica. Ser claro e objetivo nas conclusões. Algumas poucas linhas são suficientes. Esclarecer se os objetivos propostos foram atingidos ou não. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA os 4 Aula Pratica Nº 1 : COLORIMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA 1. OBJETIVOS Dosagens de espécies químicas mediante a absorção de luz. 2. FUNDAMENTOS A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento analítico através do qual se determina a concentração de espécies químicas mediante a absorção de energia radiante (luz). A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatória, caracterizada pelos diversos comprimentos de onda (λ, expressos em µm ou nm) e que apresenta a propriedade de interagir com a matéria, sendo que parte de sua energia é absorvida por elétrons da eletrosfera dos átomos constituintes das moléculas. Uma solução quando iluminada por luz branca, apresenta uma cor que é resultante da absorção relativa dos vários comprimentos de onda que a compõem. Esta absorção, em cada comprimento de onda, depende da natureza da substância, de usa concentração e da espessura da mesma que é atravessada pela luz. Figura 1: Espectro de radiação eletromagnética, com destaque para a região do visível. 5 Tabela 1 – Comprimento de onda aproximado das cores Cor Comprimento de onda (nm) Ultraviolet <400 a Violeta 400-450 Azul 450-500 Verde 500-570 Cor Amarelo Alaranjado Vermelho Infravermelho Comprimento de onda (nm) 570-590 590-620 620-760 >760 Figura 2: O espectro de radiação eletromagnético e sua comparação com objetos A Lei de Lambert-Beer: A lei diz que a absorbância é proporcional à concentração da espécie química absorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relação linear entre absorbância ou densidade ótica e concentração, e de uma relação logarítmica entre transmitância e concentração. b Io I = log 100 T Ab = log 100 .log I / Io = log Io / I A Transmitância ou Transmissão (T%). temos que : I 100 = T Io portanto.O.log T = . corresponde a: I Io I T = 100 Io 100 T I como. = K. Io T = 100 Io . log I logo.log T Ab = 2 – log T Fotocolorímetro: Figura 3 : Esquema de um fotocolorimetro (espectrofotômetro) .6 c= concentração da espécie química absorvente b= espessura atravessada pelo feixe luminoso Io= intensidade de luz incidente I= intensidade de luz emergente (transmitida) I < Io Io Ab = D.b.c = log I (absorbância ou densidade ótica) A = . 590. 565. 500. Procedimento: A. 580.Estante com tubos de ensaio 3. Usando água destilada como referência. 490. 440.7 3. 620. 520. MATERIAL E MÉTODOS 3.2. 440.Azul de Bromofenol : Concentração: ______ 3.Alaranjado de Metila: Concentração: ______ .Pipetas de 5 mL graduadas .) do Alaranjado de Metila ( nos seguintes comprimentos de onda: 400. 650 e 700 nm) e o Azul de Bromofenol (nos seguintes comprimentos de onda: 400. Reagentes . 660 e 700 nm) Figura 4 – Exemplo de espectro de absorção de uma amostra . 420. 520. 540.Espectrofotômetro com cubetas . 600.1. 460. Coleta de dados para a construção do espectro de absorção do Alaranjado de Metila ou do Azul de Bromofenol (um composto para cada grupo). Equipamentos e Vidrarias . 480.O. efetuar as leituras de Absorbância (ou D.3. 550. Abs . de acordo com o corante escolhido pelo grupo: CORANTE: ALARANJADO DE METILA Leitura Absorbânc λ (nM) T(%) ia 400 420 44 460 480 500 520 550 600 650 700 CORANTE: AZUL DE BROMOFENOL Leitura λ (nM) T (%) 400 440 490 520 540 565 580 590 620 660 700 Absorbânci a Utilizando os dados da tabela acima preparar um gráfico ( x = comprimento de onda nm )e (y = leitura em absorbância).8 Preencher os dados da tabela 1 abaixo. encontrando qual o comprimento de onde refere-se ao pico de absorção do corante usado em aula. Tabela 2: TUBO ÁGUA CORANTE CONCENTRAÇÃ TRANSMITÂNCI ABSORBÂNCIA O OBTIDA A (Abs ou D. Completar a tabela 2 calculando as concentrações do corante diversos tubos nos 4. Tabela de leitura do corante completando os valores de absorbância através de tabela ou cálculo.9 λ Qual o comprimento de onda correspondente ao pico de absorção do seu corante? ____________nm B.2.) * (No) (mL) (mL) (µg/mL) (T%)** 0 1 2 3 4 5 6 5 4 3 2 1 0 5 Encontrar no gráfico * Alaranjado de Metila ou Azul de Bromofenol ** Leituras efetuadas no comprimento de onda que corresponde ao pico de absorção do composto (λ max).3. Apresentar o valor da concentração do corante no tubo 6 mediante interpolação da leitura de Transmitancia (T x concentração) e Absorbância (Abs x concentração)no gráfico. a qual deverá ser determinada através da Lei de Lambert-Beer. o tubo no 6 estará contendo solução do corante com concentração desconhecida. Abs Transmitância . 4.O. Construir um gráfico da Absorbância (Abs) em função do comprimento de onda (λ) e determinar o pico de absorção (λmax) do composto estudado. Demonstração da Lei de Lambert-Beer: Preparar 6 tubos de ensaio (enumerados de 0 a 5) conforme o quadro que se segue (Tabela 2).1. RESULTADOS A SEREM APRESENTADOS NO RELATÓRIO: 4.O. 4. 4.4.) ou Absorbância (Abs) em função da concentração da espécie química absorvente e um terceiro gráfico apresentando as variações de Transmitância em função da concentração. 0 1 2 3 4 5 mL 4. Construir um segundo gráfico apresentando as variações de Densidade Ótica (D.5. BIBLIOGRAFIA Listar as referências bibliográficas utilizadas para preparar o relatório. . 6. 2003 439 pg. Métodos de Laboratório em Bioquímica – Adelar Bracht e Emy Luiza IshiiIwamoto. Atheneu 1999. Fundamentos de Bioquímica Experimental . ANÁLISES DOS RESULTADOS E CONCLUSÕES Discutir os resultados e listar as conclusões obtidas durante os experimentos realizados em classe.10 Concentração Concentração 5. Ed.Jose Raul Cisternas. Manole. Ed. 276 pg. Jose Varga e Osmar Monte. ....Crianças . músculos e dentes fortes. INTRODUÇÃO O Leite: O leite é uma combinação de diversos elementos sólidos em água... . suas distribuições e interações são determinantes para a estrutura. 2. Para que se tenha boa saúde e crescimento normal é indispensável tomar leite todos os dias....Facilita a digestão. alimentação (plano de nutrição e forma física da ração)...... As micelas de caseína e os glóbulos de gordura são responsáveis pela maior parte das características físicas (estrutura e cor) encontradas nos produtos lácteos.......... de modo que a relação entre eles é muito estável.Contribui para a formação dos ossos.. propriedades funcionais e aptidão do leite para processamento... Uma redução substancial da concentração de lactose ou dos sólidos totais poderia levantar suspeitas de adição fraudulenta de água... Outros fatores que podem interferir na composição do leite são: raça das vacas. jovens e adultos... nas fábricas....... 2 a 3 copos por dia . devendo ser tomado pelas crianças. O leite..... aproximadamente 87%. O leite é o alimento mais completo de que se pode dispor.. o conteúdo de proteína é maior e o de lactose encontra-se reduzido....... menos a água e a gordura.....Aumenta a resistência às doenças infecciosas.... OBJETIVO Quantificar o teor de lactose em amostra de leite pelo método de SomogyNelson.Adultos . Nesse caso.Ajuda o crescimento. após a ordenha... ocorrem alterações das propriedades físicas do leite. facilmente detectáveis em laboratório.. embora traga todos esses benefícios. cada uma delas feita por um ou mais . Esses elementos... . no transporte e na sua conservação posterior: na usina de beneficiamento.. Os termos sólidos totais (ST) ou extrato seco total (EST) englobam todos os componentes do leite exceto a água. Os elementos sólidos representam aproximadamente 12 a 13% do leite e a água. ... . Por sólidos não gordurosos (SNG) ou extrato seco desengordurado (ESD) compreendem-se todos os elementos do leite.... Os principais elementos sólidos do leite são lipídios (gordura)... ... poderá também causar muito mal se não tiver o necessário cuidado com ele durante a ordenha. ... no comércio e na distribuição.Regula o sistema nervoso... sais minerais e vitaminas. manejo e intervalo entre as ordenhas..11 Aula Pratica Nº 2 : DETERMINAÇÃO DE AÇUCARES REDUTORES (MÉTODO DE SOMOGY & NELSON) 1... 4 a 6 copos por dia O leite faz bem à saúde porque: .......... 3 a 4 copos por dia .....Desperta o apetite. A composição do leite pode variar de acordo com o estágio de lactação: no colostro. Os componentes do leite permanecem em equilíbrio...... proteínas....Ajuda a pessoa a se conservar alegre e disposta para o trabalho..Senhoras em gestação ou amamentação..... nas seguintes quantidades: .. carboidratos.. O conhecimento dessa estabilidade é a base para os testes que são realizados com o objetivo de apontar a ocorrência de problemas que alteram a composição do leite. produção de leite e infecção da glândula mamária... Definição do leite Há diversas definições do leite. temperatura ambiente.......... .. 4. levemente ácido.50 1.......55 17..12 estudiosos do assunto e considerando o leite sob determinado ponto de vista.. 3. Geralmente forma uma camada de gordura na superfície quando deixado em repouso..23 5......... No entanto.50 Búfala 0. olfato e paladar.............Sais Minerais. Sabor: levemente adocicado e agradável.41 90....... Para o nosso caso vamos considerar apenas uma definição.. meio amarelada. 87..Proteínas..Extrato seco (ou sólidos)..75 O leite.....70 4.....98 Jumenta 0..... sob o ponto de vista higiênico: “Leite é o produto íntegro da ordenha total e sem interrupção..... 0.................70 3. principalmente de queijos.. isto é.. Odor: suave..55 7....75% O extrato seco é constituído dos seguintes elementos: .....034 1.80 5.....50 4.86 1. devendo ser ordenhado e acondicionado em condições higiênicas e sem conter colostro”.038 1....Água.80 5...88 1.. Colostro O colostro é o leite produzido nos primeiros dias após o parto..98 3....... descansada......... e nem no fabrico de produtos de laticínios..031 0......52 1.. não pode deixar de ser dado aos bezerros recémnascidos.. em condições normais.. Caractesrísticas organolépticas Entende-se por características organolépticas do leite o que se pode perceber pela visão.90 2.. 3............45 82.00 3.......70 6.... o cheiro e o sabor do leite.....05 87.....80% ..56 Ovelha 0..Lactose (açúcar).18 Égua 11......... Com estes três sentidos pode-se observar o aspecto.54 80.........80% .. e lembra mais ou menos o animal que o produziu....................25% .79 Vaca 0.. COMPOSIÇÃO DO LEITE DE DIFERENTES ESPÉCIES Espécies Densidade Água Minerais Proteínas Gordura Lactose Extrato seco Sais Mulher 0. a cor.. Cor: cor branca.80 1. O leite bom tem: Aspecto: líquido. pois sua composição especial protege a saúde do animal e é um bom laxativo.25 2......65% A composição do leite pode variar de acordo com os seguintes fatores: a) Raça ......030 87...46 19.... Tem composição diferente do leite normal e não deve ser usado na alimentação humana...........12 88..........00 5. de uma fêmea leiteira sadia..Gordura.033 1...032 1.................20 6.. bem alimentada.. 12....50 4....65 1.20 Cabra 0.80 11..50 4........ tem em média os seguintes componentes: ... homogêneo (bem misturado)..95 12....50% ........031 88.............50 2.........18 4....30 5.59 9.... limpo (não contém substâncias estranhas). É o que se chama de desnate do leite. Desse modo. dentre outros fatores. bem distribuídos. D.. A matéria gorda do leite forma uma emulsão relativamente estável. K). b) Fabricação de creme de mesa.5 e 5. etc. que apresenta alta qualidade nutricional e é muito importante na fabricação dos queijos. A caseína é produzida pelas células secretoras da glândula mamária e . Existem vários tipos de proteína no leite. A principal delas é a caseína. Cada glóbulo é envolvido por uma camada formada por um componente da gordura denominado fosfolipídio. maior será a de proteína. d) Fabricação de creme chantity. A gordura se separa em forma de creme. em razão de diferenças entre raças. isto porque é mais leve que os outros componentes do leite. retirando-se a nata que sobe à superfície quando o leite fica em repouso. A batedura do creme resultante do desnate do leite. GORDURA : é o componente que dá ao leite cor amarelada. rompe a membrana protetora e permite a união dos glóbulos para formar a manteiga . c) Fabricação de queijo. A água comum é igual a água do leite em todos os sentidos. e) Fabricação de sorvetes. PROTEÍNAS As proteínas representam entre 3% e 4% dos sólidos encontrados no leite.. como os carotenóides (provitamina A). que 1 milímetro cúbico de leite contém 1 a 5 milhões de glóbulos. Emprego industrial da gordura: a) Fabricação de manteiga. que dão ao leite sua cor amarelo creme. colesterol e outras substâncias solúveis em gordura. A gordura do leite está presente em forma de pequenos glóbulos em suspensão na água. praticamente provado quando se dissolve leite em pó na água e se obtém o leite líquido com algumas modificações pequenas nos sólidos. através de máquina denominada desnatadeira. Os glóbulos são cobertos por uma membrana protetora. Isso significa que quanto maior a percentagem de gordura no leite. com a raça e é proporcional à quantidade de gordura presente no leite. que são formados por ácidos graxos ligados ao glicerol. suspensos ou emulsionados os demais componentes. estágio da lactação e de acordo com a alimentação dos animais. ou pelo processo do desnate.3%. A gordura pode ser retirada do leite por processo natural. A fração de gordura do leite serve de veículo para as vitaminas lipossolúveis (A. onde se encontram dissolvidos. constituída por glóbulos de pequenos diâmetros. A porcentagem de proteína varia. A gordura é um dos componentes mais ricos do leite. a gordura do leite é mantida na forma de suspensão. A concentração de gordura no leite varia geralmente entre 3. E. Isto é.13 b) Período de lactação c) Alimentação d) Saúde e) Período de cio f) Idade g) Características individuais h) Clima i) Espaço entre as ordenhas j) Estação do ano Descrição dos componentes Água: é o componente que existe no leite em maior quantidade. Essa camada forma uma membrana que impede a união de todos os glóbulos. A maior parte da gordura do leite é constituída de triglicerídios. Em muitos casos a fermentação da lactose com a acidificação do leite é um fenômeno devidamente controlado e dirigido. pois são elas as principais formadoras de massa branca quando o leite coagula. atraindo a água do sangue para equilibrar a pressão osmótica na glândula mamária. é solúvel na água. mas pelo calor e pelos ácidos. e é manipulado para fabricar queijos. ocupa lugar de maior destaque. fermentação lática e pela coagulação com auxílio de coalhos (enzima) e ácidos-fermento lático. No leite a acidificação natural é um fato de observação corrente. A caseína não é facilmente alterada pelo calor. que são agrupamentos de várias moléculas de caseína junto com cálcio. etc. caseína propriamente dita e leite em pó associado a outros componentes do leite. Este soro é aproveitado para fazer ainda outro queijo. A gordura e a caseína têm importância fundamental para a manufatura de vários derivados lácteos. conseqüentemente..Caseína (maior parte). depende da quantidade de lactose secretada na glândula mamária. denominada também de lacto-albumina.0%. A importância industrial da caseína está na: fabricação de queijos. CARBOIDRATOS O principal carboidrato do leite é a lactose. sendo que representam a maior concentração de elementos sólidos dos queijos. É um dos componentes mais úteis do leite. Entretanto. obtido pelo aquecimento do soro e adição de ácido lático. Portanto. As proteínas do leite são formadas de: . o volume de leite produzido pela vaca. porém. Controla o volume de leite produzido. isto é.. As proteínas existentes no leite apresentam-se nas seguintes percentagens médias: 3. mas em pequenas quantidades. Cerca de 95% da caseína total do leite está nessa forma. Industrialmente. A lactose é o açúcar do leite. É produzida pelas células epiteliais da glândula mamária e é a principal fonte de energia dos recém nascidos. menos sujeito a variações. As micelas de caseína junto com os glóbulos de gordura são responsáveis por grande parte das propriedades relativas à consistência e à cor dos produtos lácteos.Albumina e globulina. Estas percentagens são muito mais fixas que as referentes a gordura. A albumina. o que faz a caseína precipitar e formar coágulos. A concentração de lactose no leite é de aproximadamente 5% (4. Quando se fabrica queijos. A quantidade de água do leite e. Além da lactose. fósforo e outros sais.2%). é a responsável pelo gosto adocicado do leite. sendo praticamente o único que nele existe e se apresenta no leite de todos os mamíferos. lacto-albumina 0. a fermentação da lactose. A lactose compreende aproximadamente 52% dos sólidos totais do leite desnatado e 70% dos sólidos encontrados no soro do leite. permanecendo bastante estável quando o leite é pasteurizado.7 a 5. não se coagula pelo coalho. fermento lático ou ainda soro ácido a 90ºD. Um número elevado de microrganismos transforma a lactose em ácido lático. É um dos elementos mais estáveis do leite. As proteínas dão ao leite a cor esbranquiçada opaca. A caseína é formada por uma solução coloidal constituindo-se na maior parte de matéria azotada do leite. Uma molécula de lactose transforma-se em 4 moléculas de ácido lático. a Ricota. . há rompimento da estrutura das micelas. É fácil de se conhecer as proteínas do leite. podem ser encontrados no leite outros carboidratos.5%. a albumina sai junto com o soro. é aproveitado na indústria de laticínios para obtenção de diversos produtos . como a glicose e a galactose.14 encontra-se organizada na forma de micelas. por ação microbiana. quando ocorrem mudanças na acidez do leite. Obtém-se a caseína propriamente dita: pela precipitação natural do leite. mas esta é rapidamente oxidada na presença de cobre em um produto biologicamente inativo. c) em laboratórios de microbiologia – meios de cultura. caseínas e etc. está presente no leite numa proporção em torno de 1 mg por litro. Vitamina B4 desempenha ação co-fermento na fermentação lática. O leite é uma fonte importante de vitamina C (ácido ascórbico). na formação de ossos e dentes. São encontradas no leite as seguintes vitaminas: a) Vitamina A A vitamina A é relativamente abundante no leite. O leite é uma importante fonte de vitaminas. O conteúdo de ferro é baixo. Vitamina B2. c) Vitamina C O leite constitui a fonte mais rica de vitamina C de origem animal. ácido lático. mas o seu teor é muito variável. na produção dos aromas característicos na manteiga pela formação de diacetil. em quantidades que exercem um papel fisiológico importante. potássio e magnésio. Vitaminas B6 e B12 são outros componentes do complexo B presentes regularmente no leite.15 derivados do leite: iogurte. Daí a necessidade de se alimentar as crianças com maior quantidade de leite.. enquanto outras se associam com a parte aquosa. Dentre as últimas. Sais minerais: no leite existem principalmente fosfatos. b) Complexo B Vitamina B1 existe no leite em proporções variáveis. as outras são encontradas em quantidades pequenas. os quais 75% das necessidades humanas desta vitamina. carbonato de sódio. b) preparo de produtos farmacêuticos. encontra-se . citratos. queijos. desempenha papel importante nas fermentações. A ação fisiológica dos diferentes sais do leite é importante. Entretanto. principalmente do fosfato de cálcio. Mais de dez vitaminas diferentes do complexo B são encontradas no leite. cálcio. algumas se associam com a gordura (A. cerca de 750 miligramas por litro. quantidade que cobre boa parte das necessidades humanas. Emprego industrial da lactose: a) preparo de leite maternizados. tendo como função básica a alimentação verde fornecida ao gado (pastagem). As vitaminas do complexo B são produzidas no estômago composto (rúmen) dos animais. SAIS MINERAIS E VITAMINAS O leite é uma fonte excelente da maioria dos sais minerais necessários para o desenvolvimento dos indivíduos jovens. Por isso. O cálcio e o fósforo do leite apresentam alta disponibilidade. d) na fabricação de queijos (como componente natural do leite). leite acidófilo. requeijões. E e K). com exceção da vitamina B2 (riboflavina). D. Vitaminas: o leite constitui uma larga fonte para fornecimento de vitaminas necessárias ao organismo. o leite é a melhor fonte de cálcio para o crescimento do esqueleto dos indivíduos jovens e para a manutenção da integridade dos ossos dos adultos.. em parte porque se encontram associados à caseína. estritamente associada à gordura. estão as do complexo B e a vitamina C. riboflavina. 16 nele na proporção de 10 a 20 mg por litro.000 vezes. . Permite uma refrigeração a temperaturas mais baixas. a ordenha deve ser mecânica. A irradiação do leite pelos raios ultravioleta aumenta extraordinariamente o seu teor de vitamina D. ou bovino é largamente utilizado na alimentação humana. Quanto a composição. não é muito rico nesta vitamina. entre 3. Em verdade a diferença. onde é aquecido até 70-75 graus Celsius e depois resfriado. Classificação do Leite . até 1. pode-se afirmar que o leite normal conta com todos os elementos vitamínicos necessários a uma boa nutrição. de modo geral. queijo e derivados. Leite tipo C A ordenha pode ser manual ou mecânica e as vacas ficam soltas no pasto. Assim como no leite tipo A. Leite tipo B As vacas permanecem em estábulos. Esse processo denomina-se pasteurização. asna e égua). A mecanização contribui para a excelência na extração do leite tipo B. O local de armazenamento é mais sofisticado do que o tipo C. d) Vitamina D O leite. O leite é armazenado em abrigos rústicos.Categorias de leite animal comercializado Leite tipo A Ordenha de leite mecânica Leite in natura. o que ajuda na manutenção das condições de higiene. e) Vitamina E Se encontra associada à gordura do leite. está na quantidade de gordura e proteínas constantes no leite tipo B. O tipo A tem mais gordura e menos proteína que o tipo B. mas em quantidade insuficiente para atender as necessidades humanas de 1 mg diariamente f) Vitamina K Tem sido encontrada em quantidades variáveis. As usinas utilizam o restante para produzir manteiga. O leite tipo A dura mais que o tipo B por ter uma quantidade menor de bactérias. é retirado pela ordenha mecânica e vai direto para um tanque. mas é comum estar presente no leite. cabra e ovelha). em seguida vai para a máquina embaladora. e rico em vitamina A e cálcio. Assim. pois contém apenas 1 a 2 miligramas por litro. Considera-se que as necessidades alimentares são de umas 10 miligramas. antes de seguir para a usina onde será embalado. Os dois são praticamente integrais. Variedades de leite • De vaca. As necessidades humanas são de 50 a 70 mg por dia. Leites albuminosos – leite em que a proporção entre a albumina e globulina é quase igual à caseína (mulher. Tipos de Leite: Leites caseinosos . a diferença entre o A e o B é bem pequena.leite em que a quantidade de caseína é muito superior às quantidades de albumina e globulina (vaca. mas refrigerados. Uma dieta exclusivamente láctea pode assegurar perfeito desenvolvimento aos mamíferos por períodos relativamente longos.5 a 4ª graus centigrados. Apresenta um teor de gordura de aproximadamente 3%.000 a 2. O leite humano contém de 6-8% de lactose e o de vaca. É fracamente doce.72 0.30 * Sólidos desengordurados Fonte : HARRIS & BACHMAN.80 8.74 0. de 4-6%. A levedura não a . Esta é hidrolisada pela ação da lactase. Composição média (%) do leite de diferentes raças de bovinos leiteiros. Os açúcares são formados por unidades chamadas sacarídeos.4 glucose) é um tipo de glicídio. De cabra. Entre os humanos.70 Sólidos* 8.40 3. sendo o tipo de leite mais consumido no mundo. De égua.00 3. muito comum no Nordeste brasileiro.40 4. • Tem características variadas dependendo da idade gestacional do recém-nascido e cronológica do recém.20 3.17 • • • • De búfala. muito apreciado entre os beduínos. Leite humano Designa-se por leite materno o leite produzido pelas mulher e que é utilizado para alimentar os bebes.90 8.68 0. isto é.75 9.96 4. De camela.00 Cinzas 0. A lactose é formada por duas dessas unidades.60 3. É o açúcar presente no leite e seus derivados. sendo. A "descida" do leite pode demorar até uns quatro dias e é conhecida como apojadura. O leite materno é a primeira e principal fonte de nutrição dos recém-nascidos até que se tornem aptos a comer e digerir os alimentos sólidos.81 5. Raça Ayrshire Pardo Suiço Guernsey Holandês Jersey Gordura 3.68 0. contendo pouca gordura e mais imunoglobulinas. 1988.87 5. utilizada na fabricação da bebida Kumis. portanto. uma beta-galactosidase sendo considerada portanto como um beta-galactosídeo.30 3. • • • FUNDAMENTO DO MÉTODO Química do leite Açucares redutores: Os açúcares redutores possuem grupos aldeídos e cetonas livres na cadeia e são chamados redutores por atuarem como agentes redutores. é bastante comum que a mãe tenha pouco leite logo após o parto.40 Proteína 3. é o chamado colostro.20 3. muito apreciado e mais gorduroso que o leite bovino. possui grande quantidade de imunoglobulinas (=anticorpos).que sofrem oxidação (doam elétrons). consumida na Ásia Central.nascido e da duração da amamentação em si. Tabela 2.60 Lactose 4.90 3.89 8. principalmente se for seu primeiro filho. um dissacarídeo. povo nômade do norte de África.08 4. É produzido pela mãe de um recém-nascido prematuro ou não. a glicose e a galactose. Lactose (Galactose β-1. Açúcares não redutores (como a sacarose) possuem esses grupamentos interligados e tornam-se redutores a partir do momento em que sofrem hidrólise(quebra). Nos primeiros dias de idade o leite tem características bem diferentes. a enciclopédia livre. No entanto. é: 4-O-β-D-galactopyranosyl. As estruturas moleculares da α. No leite. A Lactose é o hidrato de carbono mais importante no leite da maioria de espécie. A Lactose é conhecida também como o açúcar de leite. mas pode ser adaptada para fazê-lo. ou a partir dos derivados do leite tais como o soro do queijo ou do filtrado da ultrafiltração. assim como diarréia (por afetar a osmolaridade do intestino delgado). Na ausência de lactase. a lactose é produzida do leite de Bovídeos somente. Na maior parte dos mamíferos. e originando por isso náuseas e vómitos. É biossintetizado na glândula mamaria. O nome químico oficial da lactose. Ambos os isômeros mudam entre si continuamente. tornando-se por isso uma fonte de alimento abundante para a flora intestinal (que então começa a crescer descontroladamente). Lactobacilos a transformam-na em ácido lático. a concentração. algumas populações humanas desenvolveram a capacidade de continuarem a sintetizar a lactase durante toda a vida. A velocidade da mutarrotação é determinada por fatores tais como a temperatura. D-glucopyranose α/βisomeros. Origem: Wikipédia. O leite de Bovídeos contem 45 a 50 gramas de lactose por o litro. e o pH da solução. Na temperatura ambiente. desde a domesticação do gado. o equilíbrio resulta em uma relação de 40% α-lactose . a lactose se encontra em duas formas isoméricas denominadas de αe β-lactose.18 fermenta.e da β-lactose diferem na orientação de um hidrogênio e em um grupo hidroxila no átomo de carbono 1 (na molécula da glicose). a enzima responsável pela sua hidrólise (a lactase) só é sintetizada durante o período de aleitamento. A Lactose é o primeiro e único hidrato de carbono que o filhote de mamífero (seres humanos inclusive) consome em quantidades significativas. As concentrações no leite variam fortemente com a espécie. como encontrado freqüentemente em manuais tais como o Pharmacopoeia. Este fenômeno é chamado mutarrotação. As soluções de Lactose procuram o estado do equilíbrio entre as formas α e β. a lactose não pode ser digerida. Industrialmente. b) Acrescentar em cada tubo 1. o óxido cuproso reage com o anion arseno-molibdato do reativo de NELSON produzindo um composto de coloração azul (óxidos de molibdênio. Antes da reação quantitativa. Adicionar 100 ml de NaOH 1N.Pipetas 3. Adicionar 180 gramas de sulfato de sódio anidro e completar a 1 litro. adicionar 26 ml de ácido sulfúrico concentrado.Sulfato de zinco 5% . A lactose. Completar o volume a 10 mL. Equipamentos e vidrarias . .19 e 60% de β-lactose aproximadamente. tabletes.na morfologia dos cristais e na solubilidade. cápsulas e saquinhos secos do pó (Sachets). Adicionar 0. . Há muitas razões para esta popularidade. Manter em repouso em frasco escuro durante 2 dias antes de uso. MATERIAL E MÉTODOS 3. 0. tais como suas propriedades no estado sólido.1.0 mL da solução padrão de lactose contendo (100 microgramas/mL = 100 µg/mL) e completar o volume a 1.2. 3.Reativo de Nelson: dissolver 25 gramas de molibdato de amônio em 450 ml de água destilada. mediante precipitação de interferentes com Ba(OH)2 e ZnSO4. Dentro de certos limites. .Balão volumétrico de 100 mL . Mo2O3.4. O fato de que dois isomeros da lactose existem e que diferem na estrutura molecular tem efeitos profundos em várias propriedades da lactose. reduz o íon cúprico do reativo de SOMOGYI a óxido cuproso. Guardar em frasco escuro a cerca de 37oC.6. relativamente barata. 0. A Lactose é um dos excipientes mais extensamente usados na indústria farmacêutica. Filtrar antes do uso. por que a lactose é inerte. 80 ml de CuSO4. Estas formulações bem sucedidas incluem inalantes. Gotejar.Banho-maria (ebulição) . sob agitação constante.0 mL do REATIVO DE SOMOGYI e agitar.8 e 1.Estante com 8 tubos de ensaio e 2 tubos de centrífuga . Em seguida. Esfriar em água corrente.Centrífuga de mesa . a amostra de leite deve ser desproteinizada e clarificada. Cuidadosamente.0 mL com água destilada. dissacarídio redutor. Adicionar 3 gramas de arseniato dibásico de sódio dissolvido em 25 ml de água.Espectrofotômetro .Padrão de lactose: dissolver 0.0 ml do REATIVO DE NELSON e agitar.100 gramas de lactose pura em um litro de água. 33. não tóxica e a lactose tem uma longa história de ser aplicada em milhares de formulações bem sucedidas mundialmente.3N . c) Adicionar 1.Reativo de Somogyi: dissolver 28 gramas de fosfato monoácido de sódio e 40 gramas de tartarato duplo de sódio e potássio em 700 ml de água. Reagentes . com λmax = 540 nm). Reta Padrão a) Tomar 6 tubos de ensaio e numerá-los de 0 a 5.Hidróxido de bário 0. Deixar em repouso por 2 dias e filtrar. a intensidade da coloração azul é diretamente proporcional à quantidade de lactose na amostra.5H2O a 10%. Deixar em banho-maria fervente por 10 minutos. em meio alcalino e a quente. Esta solução conterá 100 µg/ml.2. 0. adicionando 7 ml de água destilada. 0. 0 1.(10 t. mL) (T%) 7 mL 7 mL Absor Δ b. 3.0 1. b) Transferir 1 mL (com pipeta volumétrica) da solução diluída de leite para tubo de centrífuga.(g/ 100 mL = %) Leite Ambient e Leite Geladeir a 4.0 1.6 0.5. fazendo-se a interpolação na reta padrão obtida no item acima.3. (10 t.0 Banho Maria ( min. Preparo das amostras de leite Cada grupo receberá 2 amostras de leite: uma armazenada em geladeira e outra mantida à temperatura ambiente. a) Transferir 1 mL (com pipeta volumétrica) da amostra de leite para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água destilada.0 mL de hidróxido de bário 0.4.3N. 4.0 1.0 Completa Transmi r Vol. Agitar. Somogy (mL) 1. Somog y (mL) Banho Reat. Maria Nelso (min) n (mL) Compl.0 1. Agitar bem. Expressar os resultados em g/100 mL de leite (%). Nelso n (mL) 1.6 0. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos (3. Transmi Vol.0 1. ) 10 10 Reat. Efetuar a remoção dos interferentes pela adição de 1. 0 1 2 3 4 5 1.1.4 0. mL) (T%) Absor ∆ b. Colocar no gráfico os resultados de concentração de lactose encontrados.000 rpm).0 7 7 7 7 7 7 mL mL mL mL mL mL 0 3. Determinar os teores de lactose nas duas amostras de leite utilizando os dados de Δ Absorbância.0 Reat. Obtida (µg/mL ) Reat. Preencher a tabela abaixo: TUBO ÁGUA (No) (ml) Lacto se (mL) Conc.0 1.0 1. preparando as amostras como segue na tabela abaixo: TUBO Volu me (mL) 1.8 0. Construir um gráfico com as concentrações de lactose na abscissa (µg de lactose por tubo) e as leituras de Absorbância dos padrões (tendo subtraído o valor da leitura da prova em branco.0 1.20 d) Fazer leitura em espectrofotômetro em 540 nm.2. 4. RESULTADOS 4. Absorb.0 0.0 10 10 10 10 10 10 1. na ordenada.0 1.0 1.0 1.2 0. Concentra ção. Determinação do teor de lactose no leite Determinar os teores de lactose nas duas amostras de leite.8 1. Completar a 10 mL adicionado 7 mL de água destilada. observar que a amostra de leite analisada foi diluída 1:100.4 0. ou seja do tubo no 0).0 1.0 1. Absor b.2 0 0 0. . Agitar.0 mL de ZnS04 a 5% (agitar) e acrescentar 1. 2002. Roberto N. 2003.729-734. Assis. Métodos de Laboratório em Bioquímica – Adelar Bracht e Emy Luiza IshiiIwamoto.Monteiro. Cristina Czelusniak e Alessandro Nogueira. Silva. 37 (5) p. Cienc. 337-341. Jose A. 3 – Indique através de cálculos como foram preparadas as soluções: . Costa. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS a. Determinação de açucares redutores e totais em alimentos: comparação entre método colorimetrico e titulometrico. Daniel I.S. Wosiacki. Junior Método de determinação de açucares redutores aplicável no sistema de pagamento de cana de açúcar. Alim. V.4 Fazer os cálculos escritos no espaço abaixo: 5. Isejima. Ed. G.B. Pesq. Demiate. Atheneu 1999. N. Ivo M. 2003 439 pg. Asquieri Comparação de métodos para determinação de açucares redutores e totais em mel. 276 pg. Discutir os resultados obtidos de acordo com a concentração de lactose encontrada nas amostras de leite mantidas em temperatura ambiente e refrigerada. Soil Science 8(1) p. Elaine M. 23(3) p.X. Eduardo R. Joana D. Manole. Os resultados obtidos foram os esperados? b.21 4. Valdirene. Ed. Agropec. Fundamentos de Bioquímica Experimental . Questionário: 1 – Qual foi a finalidade deste trabalho pratico? 2 – Cite algumas aplicações da metodologia empregada neste trabalho pratico. Elisa M. Tec. Jose Varga e Osmar Monte. 65-78. Qual ou quais as razões para que os resultados da concentração de lactose no leite mantido na temperatura ambiente e refrigerada não serem iguais? Como a temperatura afeta a qualidade do leite? 6. Alcanfor.Jose Raul Cisternas. 2002. Brasil. BIBLIOGRAFIA USADA Listar as bibliografias utilizadas para preparar o relatório (opcional). Os principais métodos cromatográficos são: cromatografia em papel (CP). o efeito desta partição entre a fases móvel e estacionária possibilita a transferência do soluto do seu ponto de aplicação no papel. por um percurso de distância adequadamente escolhida. arrastando os componentes da amostra. Sendo o mais importante o equilíbrio entre a fase estacionária e a mistura. uma amostra líquida flui por uma tira de papel adsorvente disposto verticalmente. O método que utiliza diversas técnicas que tem como objetivo principal a separação de substâncias de uma mistura. a fase estacionária é uma camada fina formada por um sólido granulado (sílica. de pesquisa e de ensino. atuando como suporte inerte contendo a fase estacionária aquosa (polar). Todas as técnicas cromatográficas utilizam uma fase estacionária e uma fase móvel. Quando a fase móvel alcança uma seção do papel que não contém soluto. os componentes da amostra se separam e são assinalados pelo sistema detector na seqüência: do primeiro componente menos retido. alumínio ou outro suporte inerte. através do qual permite separar constituintes de uma mistura devido à sua distribuição por duas fases uma estacionária (fixa) e outra móvel. A medida que o solvente contendo o soluto flui através do papel. Neste tipo de cromatografia. . Com o fluxo contínuo de solvente. ao último componente mais retido pela fase estacionária. poliamida. cromatografia de camada delgada (CCD). O papel é composto por moléculas de celulose que possuem uma forte afinidade pela água presente na mistura de solvente. muito utilizado em laboratórios industriais. uma partição deste composto ocorre entre a fase móvel orgânica (pouco polar) e a fase estacionária aquosa. etc. CAMADA DELGADA Na cromatografia em camada delgada (TLC). com fins analíticos ou preparativos.22 Aula Pratica Nº 3 : CROMATOGRAFIA EM PAPEL DE FILTRO Introdução: Cromatografia. parte do soluto deixa o papel e entra na fase móvel. só que agora o soluto é transferido da fase móvel para a fase estacionária. para um outro ponto localizado a alguma distância do local de aplicação no sentido do fluxo de solvente. Desta forma. A polaridade do solvente deverá ser de acordo com a substância que se deseja separar. CROMATOGRAFIA EM PAPEL: A cromatografia em papel (CP) é uma das técnicas mais simples e que requer menos instrumentos para sua realização. mas muito pouca afinidade pela fase orgânica. Após transitar pela fase estacionária. alumina. cromatografia gasosa (CG) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A fase estacionária é formada de um material escolhido para reter de forma diferenciada os componentes da amostra que se deseja separar. A escolha do processo a usar depende do tipo de equilíbrio estabelecido entre as fases estacionária e móvel e a mistura que se quer separar. Deixa-se a placa secar e. A cromatografia é um processo de separação de análise qualitativa. Pequenas gotas de solução das amostras a serem analisadas são aplicadas em um ponto próximo ao extremo inferior da placa. porém é a que apresenta as maiores restrições para sua utilização em termos analíticos.) depositado sobre uma placa de vidro. Esta separação resulta das diferenças de velocidade dos componentes arrastados pela fase móvel devido às diferentes interações com a fase estacionária. então se coloca a mesma em um recipiente contendo a fase móvel (solvente ou mistura de solventes). A fase móvel é o material que se desloca pela fase estacionária. o fenômeno de partição ocorre novamente. i. consiste de um campo elétrico (200 . A diminuição do valor da corrente de fundo é sinal de impureza. O comprimento e o diâmetro da coluna a ser usada irá depender do material a ser analisado. De acordo com o aparelho.i.300 v) e uma chama onde a amostra é queimada. Deixa-se secar a placa após o deslocamento da fase móvel sobre ela.i. 3) detector de captura de elétrons (DCE). denominado gás de arraste. o solvente começa a molhar a fase estacionária e sob por capilaridade. 5) detector fotométrico de chama (DFC) apresenta alta estabilidade para compostos sulfurados e fosforados.0 m. Como fase móvel é utilizado um gás. derivados de petróleo etc.15 a 0. Neste detector há uma fonte de radiação beta em corrente constante.0 a 100. separando as substancias presentes na amostra através das diferenças de solubilidade e volatilidade. O gás de arraste passa com uma amostra onde há substituição de um elétron por um íon negativo. aumentando a corrente nos eletrodos. tungstênio (W). consegue-se detectar cerca de 10-12 g do composto por mL de solução. mas na maioria das vezes elas são espirais. pois esta é altamente inerte e flexível. Filtros .23 Como somente a base da placa fica submersa. A pureza do gás de arraste interfere no resultado. a análise.0 a 3. vazamento da fonte. Já. Os gases mais utilizados são o hélio (He). juntamente com a condutividade térmica são registrados.) de cerca de 1. Essa sensibilidade permite que pequenas quantidades de amostra possam ser analisadas. Conforme o gás passa pelos filamentos há transferência de calor e. o que diminui a corrente elétrica. as colunas variam de formato. que quanto maior seu valor maior é a sensibilidade do detector. O gás de arraste com a amostra é comparado com o gás de arraste puro (corrente de fundo). inorgânicos. o tempo da passagem do gás. possibilitando a análise de várias substâncias em uma mesma amostra. gás N2 ultrapuro. hidrogênio (H).0 a 100. de 5.0 a 4. usado para compostos orgânicos.0 m. níquel (Ni) ou Pt . Esta análise é feita comparando-se o gás de arraste puro (que passa por um conjunto de filamentos) com o gás de arraste com a amostra (que passa por outro conjunto de filamentos). variando de 0.75 mm e comprimento de 10. sujeira ou coluna mal condicionada. O gás de arraste usado é o N2 livre de H2 e O2. enquanto que as colunas recheadas preparativas apresentam d.0 mm. acusando impurezas na ordem de partes por milhão (ppm) ou partes por bilhão (ppb). A fase estacionária da cromatografia gasosa é um material. A fase estacionária líquida é um líquido pouco volátil que recobre um suporte sólido. A combustão resulta em radicais livres que são ionizados pelo campo elétrico. onde os compostos separados são detectados. 2) detector de ionização de chama (DIC). CROMATOGRAFIA GASOSA A cromatografia gasosa (CG) é uma técnica com poder de resolução excelente. sendo as mais utilizadas as de sílica fundida. As colunas cromatográficas utilizadas podem ser de níquel. que transporta a amostra através da coluna de separação até o detector. nitrogênio (N) e argônio (Ar). efetuando-se assim. que propicia a separação da mistura através de processos físicos e químicos. Dependendo do tipo de substância a ser analisada e do detector empregado. Os detectores são dispositivos que transformam as variações na composição do gás de arraste em sinais elétricos. utilizados apenas para compostos orgânicos com baixa sensibilidade para formaldeído e ácido fórmico. possibilitando a injeção de maior volume de amostra. A revelação da placa é feita com a aplicação de um reativo que de cor às substâncias de interesse. Como o He é de difícil obtenção e alto custo é pouco utilizado no Brasil. As colunas recheadas analíticas possuem diâmetro interno (d. isto é. Existe diferentes tipos de detectores: 1) detector de condutividade térmica (DCT). Os DCT possuem dois ou quatro filamentos de platina (Pt). os quais são aquecidos por corrente elétrica.0 mm e comprimento de 1. usado principalmente na detecção de pesticidas e drogas. Há uma combustão no campo elétrico com emissão de luz de diversos comprimentos de ondas. as colunas capilares têm d. líquido ou sólido.W. aço inox ou de vidro. mas existem detectores que apresentam ampla faixa de aplicações. A fase móvel da CLAE deve ser um solvente que respeite algumas características impostas por esse método analítico.Cromatografia de adsorção Nesta a fase estacionária é sólida e a fase móvel pode ser líquida ou gasosa. A fase móvel deve ser compatível com o detector empregado e. recebendo o nome de cromatografia líquida por que a sua fase móvel é um solvente. Esta fase deve ter alto grau de pureza ou ser de fácil purificação. Este tipo de detector pode detectar quantidades de ordem picograma. onde o sinal do detector é diretamente proporcional à concentração do soluto. Este processo é baseado na diferente solubilidade dos componentes da mistura nas duas fases líquidas. . Embora existam vários solventes. Como fase estacionária utilizam-se sólidos ou semirígidos. A resposta deste detector é moderada. três deles são mais utilizados: água. Os detectores de fluorescência. Quanto aos detectores. ODS). cujas partículas porosas esféricas ou irregulares apresentam diferentes diâmetros e suportam pressão até 350 bar. É um método utilizado para separação de espécies iônicas ou macromoléculas e compostos termolábeis. diâmetro e pelo material de recheio. os quais acompanham continuamente a diferença no índice de refração entre a fase móvel pura e o efluente que sai da coluna contendo os componentes da amostra. coluna cromatográfica. Não são versáteis. para que se possam fazer análises de alta sensibilidade. As colunas geralmente utilizadas são: octadecil (C18. utilizados como método de detecção específica. A capacidade da coluna é determinada pelo comprimento. Os detectores mais usadas na CLAE são os fotométricos. selecionando as de interesse. são sensíveis para substâncias que fluorescem. O gás de arraste é o N2 e da chama é o H2 com ar ultrapuro e seco. A sensibilidade de um detector é determinada a partir da relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que gera este sinal. B. pois as impurezas podem interferir na detecção do analito por ultravioleta (UV). metanol e acetonitrila. Esta baseia-se nas diferentes afinidades adsorventes da superfície da fase estacionária pelas moléculas da substância a separar. A linearidade é a faixa linear do sistema. A principal característica é que a fase móvel dissolva a amostra sem qualquer interação química entre ambas. Os componentes de um cromatógrafo líquido são: bomba. baseados na absorbância no ultra violeta e no visível.A pureza dos reagentes deve ser na ordem de partes por trilhão (ppt). A coluna cromatográfica é feita de um material inerte que resiste a todas as pressões em que ela vai ser usada. também possuir polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra. RP18. ou universais. RP8). CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE ou HPLC) se desenvolveu muito nos últimos anos.Cromatografia de partição Nesta fase a fase estacionária é líquida. não existe um que apresente todas as propriedades para que ele seja ideal para CLAE. octil (C8. Técnicas cromatográficas: A. Também são utilizados detectores por índice de refração. em especial as que tenham enxofre (S) e fósforo (P). detector e o registrador. geralmente de ordem micrograma.24 eliminam as radiações desnecessárias. CN (cianopropil) e NH2 (amina). ou por uma fase líquida no caso da cromatografia de partição. De preferência até uns 2 a 3 cm do bordo superior. Os tipos de câmara cromatográfica variam de tamanho e forma. Mais orientações a respeito serão fornecidas pelo professor durante a aula. b) o solvente não deve correr até o bordo superior do papel (cuidado com o número de horas de processamento) e nem tampouco uma pequena distância. sobre o qual distribuímos as “manchas” de solutos. Alguns cuidados que devem ser tomados: a) antes de ser iniciar o processo cromatográfico. Dentro da coluna encontra-se a fase estacionária constituída por um enchimento sólido no caso da cromatografia de adsorção. A fase móvel é líquida em ambos os casos. onde os cromatogramas são desenvolvidos. Encontra-se bastante divulgada devido à sua facilidade experimental e ao seu baixo custo. ou seja. colocada sobre um dos lados de uma placa de vidro ou metal. Usualmente. por onde sai o líquido (eluído).consta de papel devidamente tratado. sendo esta constituída pelo líquido absorvido no papel.25 Cromatografia em camada fina (plana) (TLC): a retenção das substâncias deve-se à adsorção sofrida na superfície da fase estacionária. Cálculo de Rf ( Fator de Retenção) Imaginemos o seguinte diagrama limite até onde o solvente atingiu sentido em que o cromatograma foi desenvolvido a’ b’ c’ d’ x .é a linha traçada. hermeticamente fechados. uma móvel e outra estacionária. trabalha-se com papel Whatmann. no qual fizemos “manchas” de soluções padrões ou de soluções problemas. mono e bidimensional. Cromatografia em papel (plana): a retenção das substâncias é devida à partição das duas fases líquidas. desde as mais bem trabalhadas. já deve estar saturada de seus vapores. até a um simples tubo de ensaio ou proveta. com a devida especificação (número 4 por exemplo). a câmara. b) Câmaras cromatográficas são os recipientes. Este é o tipo que será utilizado na aula prática. c) Linha básica . Cromatografia em coluna: utiliza-se uma coluna de vidro aberta na parte superior e munida de uma torneira na extremidade inferior. vertical e horizontal. As modalidades de cromatografia em papel são as mais variadas possíveis. cortando de acordo com as dimensões da câmara onde será colocado. Para efeito de facilidade vamos enumerar alguns termos de uso corrente: a) Cromatografia . geralmente a três centímetros do bordo inferior do papel. contendo a mistura de solvente. Temos cromatografia ascendente e descendente. visto que há contaminação com aminoácidos da mão.26 c’ a b c d linha básica Chama-se de Rf a relação existente entre a distância percorrida pelo soluto (até o centro da mancha). c) Detectores especiais PARTE PRÁTICA 1) Preparação do papel de filtro Examinar a câmara cromatográfica e planejar as dimensões do papel. Teoria sobre Rf (equação de Martin e Synge) Chama-se de Rf a relação: Al Al + a As onde: a = coeficiente de partição As = área ocupada pelo soluto na fase estacionária Al = área ocupada pelo soluto na fase móvel Solventes usados em cromatografia: De acordo com as substâncias a serem cromatografadas.3% em álcool (usado nesta aula) Para ácidos orgânicos pulveriza-se o papel com a seguinte solução: 1g de xilose + 3 ml de água + 1 ml de anilina + 100 ml de álcool metílico.ento de onda ao nível do U. utilizamos solvente os mais diversos Fenol . açúcares etc. pela distância total percorrida pelo solvente. ácido glutâmico. Benzol: butanol: Piridina: H2O (5: 3: 3: 1) Existem basicamente três modos de revelação a) Pelo uso da luz ultra-violeta: empregado quando os compostos possuem núcleo que revelam o comprim. Cada grupo montará um cromatograma.V. Butanol: H2O (4: 1: 1) Também empregado na cromatografia de aminoácidos. Para aminoácidos pulveriza-se o papel com solução de ninhidrina a 0. 2) Padrões de aminoácidos: arginina. leucina e prolina . Pode-se inclusive adicionar 40 mg de 8-hidroxiquinolina de 1 ml de NH4OH concentrado por 100 ml de solvente. Assim: Rfa = a’/x Rfb = b’/x Rfc = c’/x Rfd= d’/x Os valores de Rf fornecem uma orientação quanto à distribuição dos solventes ao longo do papel.Água (80: 20) Usado para cromatografia de aminoácidos. b) Uso de reagentes: comumente utiliza-se para açúcares e imersão na seguinte solução: 1 ml de anilina + 1g de difenilamina + 100 ml de acetona + 10 ml de H2PO4 a 85%. Tome muito cuidado para não tocar o mesmo com os dedos. Quais as aplicações da metodologia da cromatografia? . Montagem do cromatograma Traçar numa linha básica a 3 cm da base do papel e deixar 2 cm de bordadura Distribuir as soluções a serem analisadas no papel dentro nos pontos marcados Em seguida fazer manchas de área aproximada de 0. B. e d D. Qual aminoácido apresentou menor Rf e porque? 5. marcar o centro das manchas A. Qual aminoácido apresentou maior Rf e porque? 4.01 M e guardá-los no congelador. B.3% em solução alcoólica. Cada grupo receberá três padrões diferentes com a finalidade de comparar estas três manchas com as produzidas pela amostra problema (esta será fornecida pelo professor). Escrever quais os aminoácidos estudados em classe e a coloração deles na reação com ninidrina 2.27 Preparar padrões de aminoácidos 0. Os aminoácidos apresentaram coloração diferente? Porque? 6. d B. Front Mistura aa1 aa2 aa3 3 cm aa 4 Deixar o cromatograma correndo até que o solvente atinja uns 2 ou 3 cm abaixo do bordo superior do papel Em seguida retire-o e deixe secar.5 cm2 utilizando um volume de 40-50 microlitros usando micropipetas. Verificar as distâncias d A. Calcular os Rfs dA Rfa = Rfb = x RESULTADOS E DISCUSSÃO dB x 1. d C. Medir a distância da linha básica até o “front”(x) . C e D. Levar o cromatograma à estufa à temperatura de 60 . que vão desde a linha básica até o centro de A.65oC até aparecimento de manchas coloridas Determinação do Rf: Marcar o limite até onde o solvente atingiu (front). Após a secagem pulverizar ninidrina a 0. C e D. Quais aminoácidos estão presente na mistura? 7. Apresentar Rf dos aminoácidos utilizados no experimento 3. Secar as manchas conforme instruções dadas pelo professor Adaptar o cromatograma à câmara tomando sempre o cuidado de não tocá-lo com os dedos. São Paulo:Edgard Blücher. G.64.2.S. 6. 1ª. Ed. n. jul. CIOLA R.28 BIBLIOGRAFIA NOÇÕES BÁSICAS DE CROMATOGRAFIA Terezinha Bonanho Peres Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Proteção Ambiental-Instituto Biológico . p.H. R.1998. 1973./dez.. São Paulo. Campinas: Editora UNICAMP.1995. Introdução à cromatografia em fase gasosa. Introdução a métodos cromatográficos. P.. São Paulo: Edgard Blücher. C.. BRAGA. CIOLA. Ed. .L. v.227-229. BONATO. Fundamentos da cromatografia a líquido de alto desempenho HPLC. 2002 COLLINS. 1 N 3. FUNDAMENTO DA METODOLOGIA As proteínas podem ser dosadas em diversos materiais biológicos por várias metodologias.5 g de CuSO4.5H2O e 6g de tartarato duplo de sódio e potássio. PROCEDIMENTO ANALÍTICO 1. 300 mL de NaOH 10% e completar a 1 litro. que é utilizada para a caracterização de proteínas. Transferir 1 ml de leite (pipeta volumétrica) para tubo de ensaio e completar o volume com 9 ml de água destilada (esta solução corresponde ao leite diluído 1:10). A reação do “Biureto”. Juntar. Agitar bem. pode ser empregada para a quantificação das mesmas mediante a colorimetria.29 Aula Pratica Nº 4 : DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNAS NO LEITE (PELA REAÇÃO DO BIURETO) 1. O fundamento da metodologia se baseia no fato de que as proteínas formam um complexo com o íon cúprico (Cu++) em meio alcalino. A reação é positiva para peptídios constituídos de no mínimo de três aminoácidos. e tal complexo apresenta um pico de absorção a 540 nm.5g de caseína em 500 mL de NaOH 0. Padrão de Caseína (5 mg/mL) dissolver 2. sob agitação. . Tal complexação também ocorre com o biureto (H2N-CO-NH-CO-NH2). dissolvê-los em água destilada completando o volume a aproximadamente 500 ml. MATERIAL E MÉTODOS: Equipamentos e Vidrarias: ESPECTROFOTÔMETRO (540 nm) Estante com 7 tubos de ensaio 1 pipeta graduada de 5 mL 2 pipetas graduadas de 10 mL Reagentes: Reagente do Biureto Pesar 1. (Figura 1) Figura 1: Complexo de cor violeta (púrpura) 2. daí o nome da reação. M. RESULTADOS E DISCUSSÃO: 1. 6-7. Official methods of analysis of AOAC International. 72. agitar os tubos e deixar em repouso por 30 minutos.5 2. Analytical Biochem. 3. p..0 0. Association of Official Analytical Chemists. Gaitheersburg.30 2. Interpolar o valor de leitura da amostra de leite diluído e calcular a concentração de caseína no leite expressando o valor em mg/100 mL de leite.0 2. Após a adição do reativo do Biureto.0 1. Completar tabela 2.5 3. 5. . Determinar o valor da concentração de caseína no leite através do gráfico e dar o resultado em mg/100mL de leite 4. O quê ocorre com a caseína do leite quando o valor de pH fica abaixo de 6. Em 7 tubos de ensaio. Discutir o valor encontrado em relação ao valor nutricional do leite. pipetar os componentes conforme o quadro abaixo.5? ∆ ABSORB. 1997.0 3.5 1 mL (1:10) leite 0.5 2. 39. BIBLIOGRAFIA AOAC. p. BRADFORD. M. 16th ed.0 2. 5. ncia 540 nm (%) ∆ ABSORB. 248-254.5 diluído x 5 5 5 5 5 5 5 0 4. Cap. Com os dados obtidos dos tubos 0 a 5.0 1. CASEÍNA CASEÍNA REATIVO (6 mg/mL) (mg/tubo BIURETO ) Transmitâ ABSORB. A coloração púrpura formada á indicativo da presença de proteínas. TUBO (NO) ÁGUA DESTIL. 1976. fazer um gráfico em papel milimetrado contendo no eixo Y os valores de ∆ Absorbância ou ∆ Leitura e no eixo X as concentrações de caseína expressas em mg/tubo. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein dye binding. 6.5 1. 4. Gráfico com os valores de absorbância (y) e concentração (x) 3. v. Fazer leitura de Transmitância a 540 nm em espectrotofômetro e converter em Absorbância com auxílio de tabela (Ab = 2 .log T). 540 nm 0 1 2 3 4 5 6 4. enumerados de 0 a 6. (540 nm) Concentração (mg/tubo) 6. 1994. 197-204. 2.31 LAEMMLI. 14. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bactiophage t4. p. RAGHUNATH.STRYER . 9.Harcourt Brace College Publishers. AMMU.Bioquímica: Aspectos Gerais .Biochemistry . 1995. K.Ed. NELSON & COX . VOET & PRATT – Fundamentos de Bioquímica – Artmed Editora. São Paulo.Molecular Activities of Plant Cells. K. 1985. New York.VOET. 2000.Bioquímica . Oxford. Ateneu.Bioquímica Celular .. 1995. p. BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA Livros textos 1.Principles of Biochemistry . SANKAR.VOET & VOET .V. v.SMITH. Worth Publishers.4a ed...Introdução à Bioquímica . São Paulo. 2.Editora Sarvier. v. n.Biochemistry .RAWN . 11. GUAZZINELLI & MARES-GUIA . São Paulo.Biochemistry . Nature. Rio de Janeiro.VIEIRA.Guanabara . 3. 227. New York.LEHNINGER. 12.2a ed. 5. HANDLER & SMITH . 10.CAMPBELL . 680-685. .Bioquímica Mamíferos . 4. Rio de Janeiro.Editora Fundação Calouste Gulbenkian.LEHNINGER – Princípios de Bioquímica . 1970. New York. Sci. HANDLER & WHITE . Madrid. 1993. 1999. Editora Reverté. K. HILL.Neil Patterson Publishers . LEHMAN.. J. 7.Koogan.Black Well Scientific publications.R. São Paulo.Editora Edgard Blucher .CONN & STUMPF . Biochemical and nutritional changes in fish proteins during drying. 6. U.Bioquímica Animal .WHITE..CAMPBELL – Bioquímica – Artmed Editora.John Wiley and Sons.CORREIA . LEFKOWITZ. 1995. M.ANDERSON & BEARDALL .Burlington.São Paulo.Editora Guanabarana Koogan. 13. 3a ed. T. North Carolina 8. Food Agric. 67. DEVADASAN. 2. na sua grande maioria. Observe que a enzima é devolvida ao meio na mesma proporção em que foi utilizada na reação à esquerda. com essas considerações. e a levedura acaba excretando a invertase (sendo. que é a concentração de substrato necessária para se atingir metade da velocidade máxima da reação catalisada pela enzima em questão. Assim a levedura (Saccharomyces cerevisiae). S é o substrato. mediante o estudo cinético da reação. Um modelo da reação onde a enzima interage com o substrato está fornecido abaixo: E+S ES E+P onde E é a enzima. . pode-se determinar a quantidade correspondente (µg) sacarose hidrolisada. Michaelis e Menten. ES é o complexo enzima-substrato e P é o produto da reação. tornando a velocidade das mesmas compatíveis com as exigências metabólicas. A enzima escolhida para este estudo é justamente a invertase da levedura que catalisa a hidrólise da sacarose para produzir glicose e frutose: C12H22O11 + H2O sacarose água C6H12O6 + C6H12O6 glicose frutose Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (µg) de açúcar redutor formado. pois. por intermédio da "invertase" hidrolisa a sacarose resultando numa mistura equimolecular de glicose e frutose. desenvolveram a expressão de velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e desta forma puderam descrever o comportamento de diversas enzimas. OBJETIVOS Determinar os parâmetros Km e Vm da enzima invertase utilizando a sacarose como substrato. catalisadas enzimaticamente. V = Vmáx * [S] KM + [S] onde [S] é a concentração do substrato e Vmáx é a velocidade máxima da reação.32 Aula Pratica Nº 5 : DETERMINAÇÕES DA CONSTANTE DE MICHAELIS (Km) E DA VELOCIDADE MÁXIMA (Vm) PARA A INVERTASE DE LEVEDURA 1. uma exoenzima) para a hidrólise ocorrer fora da célula de levedura. A membrana plasmática é impermeável à sacarose. FUNDAMENTOS As reações químicas conduzidas pelos organismos vivos são. Podemos determinar a afinidade de determinada enzima pelo substrato da reação que catalisa utilizando um valor KM. em mol (de produto formado) por unidade de tempo. por um cálculo estequiométrico simples. açúcares esses que são absorvidos pela célula. resultando em diferentes velocidades de reação enzimática. No presente experimento a invertase será obtida de levedura de panificação (fermento Fleischmann) e adicionada à sacarose (açúcar não redutor). permitindo. Para tal se colocará a enzima frente à diferentes concentrações de substrato (sacarose). determinar graficamente os valores de Km e Vm para a reação enzimática da levedura.edu/courses/genomics/2004/bossie/mfyg. cuja hidrólise resulta na formação de açúcares redutores (glicose e frutose) que serão estimados pela reação de Somogyi-Nelson.html Figura 4: Hidrólise da sacarose catalisada pela invertase. Imagem de levedura (Saccharomyces cerevisiae) da University of Kent Biosciences.33 Figura 2: Saccharomyces cerevisiae Figura 3. http://www. MATERIAL . Tanto a glicose quanto a frutose são açúcares redutores. mediante um tratamento matemático adequado.davidson. 3.bio. 2.0 de contendo 100 ug de glicose ÁGUA Incubar os tubos (exceto o tubo no 7) a 37oC.34 3.2 pipetas graduadas de 2 mL (por grupo) .5 mM = 4.1. Reação para dosagem de açúcares redutores.4 0.5 0.5 1. os quais podem ser determinados pela reação de Somogyi-Nelson.5 mM 0.0 2.Substrato (sacarose 12.2 0.5 0.1 pipeta volumétrica de 1 mL (por grupo) .5 mL de água destilada). Reagente .1.5 mL padrão INVERTASE DILUÍDA 2.5 1.1 pipeta graduada de 1 mL (por grupo) .Reagente de Nelson . Ferver os tubos em banho-maria por 10 minutos. Equipamentos e Vidrarias . adicionar 20 mL de água destilada e deixar em estufa a 37 oC por 30 minutos agitando casualmente.5 0.4 0.Estante com 8 tubos de ensaio (por grupo) . para que a invertase catalise a hidrólise da sacarose. agitar novamente a fazer leitura a 530 nm.0 2.0 0.2 1. Agitar.27 g/L) 4.3. enumerados de 0 a 7.000 x g por 15 minutos recolhendo o sobrenadante que contém a enzima invertase. completar o volume a 10 mL (adicionando 5. pipetar os volumes (em mL) das soluções conforme indica o quadro que se segue: TUBO (NO) 0 1 2 3 4 5 6 7 SACAROSE 12. por 15 minutos.6 0.5 0.8 1. . Tão logo termine o período de incubação acrescentar 1 mL do reativo de Somogy (a reação enzimática é paralisada pela desnaturação da invertase. quer pela ação do Cu++ ou pela alcalinidade do reagente).Centrífuga e banho-Maria para dosagem de açúcares redutores 3.0 0.5 0.8 0.6 2. Extração da enzima Transferir 4 g de fermento de panificação para tubo de centrífuga. 4.Espectrofotômetro . 4. resfriá-los e juntar 1 mL do reativo de Nelson. Centrifugar a 1. Ensaio enzimático Em 8 tubos de ensaio.5 mL) .2. Fazer uma diluição de 1:100 ou 1:200 (a critério do professor).0 0.Padrão de açúcar redutor (100 ug de glicose por 2. PROCEDIMENTO 4. resultando na formação de glicose e frutose (açúcares redutores).4 g de fermento prensado tipo Fleischmann .Reagente de Somogyi . Physiological and Biochemical factors which control the assimilation of inorganic nitrogen supplies by plants. Manole 1ª Ed. ** V = velocidade de reação enzimática expressa em µg (micrograma) de glicose (açúcar redutor) formado por hora. & D.). Current Topics of Bioenergetics. R. 1967. 5. Nitrate reductase activity in corn seedling as effected by light and nitrate content of nutrient media. FLESHER. New York.1. Determinar analiticamente os valores de Km e Vmáx e discutir os seus significados bioquímicos. 2003 AVRON. HEWITT. Transformar as leituras de densidade ótica em quantidades de açúcar redutor 3.H. "Mechanism of photoinduced electron transport in isolated chloroplasts". HAGEMAN. Ed. ANÁLISES DOS RESULTADOS E DISCUSSÃO Coletar os dados. Calcular as velocidades de reação (V) para cada tubo. organizando-os conforme o quadro que se segue. in D. 35: 700-708 (1960). [S]* V** 1 1 ∆ D. PARA O RELATÓRIO: 1. (NO) 530 nm 530 nm 530 nm [S] V 0 0 mM 1 2 mM 2 4 mM 3 6 mM 4 8 mM 5 10 mM 6 7 * [S] = concentração de substrato (sacarose) no meio de reação enzimática expressa em milimolaridade mM. Sanadi (ed.O.R. M. Tabela 1: Determinação de (S) e (V) e 1/(S) e 1/(V) para a invertase TUBO T% D. Plant Physiology. Academic Press. Explique o que ocorre nos tubos 0 e 6 comparando os resultados obtidos no experimento.. E.J. In . Com os dados construir os gráficos V em função de [S] e 1/V em função de 1/[S]. BIBLIOGRAFIA ADELAR BRACHT E EMY LUIZA ISHII-IWAMOTO Métodos de Laboratório em Bioquímica. 12.O.35 5. 4. Preencher a Tabela 1 2. p. Experiments and Methods Biochemistry. D. 1958. H.G. New York. WHARTON. M. 1970. Rio de Janeiro. G. JACOBS.. Inc. 313p. 350p. Ao Livro Técnico.78-103.E. The Chemical Analysis of Foods and Food Products. Leeds. MARTELLI.. R.A Laboratory Manual. M. in .L. Rio de Janeiro. e TASTALDI. E. McMillan Publishing Co. & PANEK. BACILA. Técnicas e Experimentos de Bioquímica. Inc. 1972. G. & Mc CARTY. H. 112p. Un. New York.B.A. 970 p. New York. 1968. 1972. Bioquímica Experimental. Kirkby (ed. 522 p. LITWACK.C. A.36 "Nitrogen Nutrition of the Plant". Editora Guanabara Koogan. Van Nostrand. 1960. Experimental Biochemistry .). VILLELA. p.D. John Wiley & Sons.. em 1937. escuro NADPH + H+ + ATP + CO2 NADP+ + ADP + Pi + C(H20) cloroplastos Hill. que necessariamente não precida ser o CO2. pretendia a redução do C02 ao nível de carboidrato. que na forma oxidada é azul (com λ max ao redor de 540 nm) e na forma reduzida é incolor. não conseguiu o seu intento. No presente experimento será utilizado como aceptor de elétrons (reagente de Hill) um indicador de óxido-redução. OBJETIVOS Avaliar a habilidade metabólica do cloroplasto de promover a fotólise da água. o que permite o acompanhamento da reação fotoquímica mediada por cloroplastos isolados de espinafre. ocorrendo a fotólise da água acoplada com as produções de NADPH+H+ (fotorredução) e de ATP (fotofosforilação). Por dificuldades técnicas.6-diclorofenolindofenol. conforme a equação abaixo. 2. . que ocorre no interior do cloroplasto. compreende 2 etapas: a) Fase luminosa: dependente de luz. FUNDAMENTOS O processo fotossintético. o primeiro passo na sequência de reações da fotossíntese. mas chegou a demonstrar a habilidade de cloroplastos isolados de reduzir outros compostos em um processo acoplado à fotólise da água com evolução de 0 : 2 luz +3 + H 0 +2 + 2H+ + ½02 2Fe 2 2Fe cloroplastos Assim a produção fotoquímica de oxigênio exige a presença de um aceptor de H+ e/ou elétrons. o 2. limitadas pela época.37 Aula Pratica Nº 6 : REAÇÃO DE HILL (FOTÓLISE DA ÁGUA) 1. luz NADP+ + ADP + Pi + H20 NADPH + H+ + ATP +½02 cloroplastos b) Fase escura: não depende de luz e corresponde à redução do CO 2 ao nível de carboidrato às expensas do NADPH+H+ e ATP. tentando desvendar o processo fotossintético empregando cloroplastos isolados de espinafre. 38 3.5 0.5 3 0.35 M.1.35M . 4.Tampão fosfato 0. Reagentes .35 M (adicionados aos poucos) como extrator. (3000 rpm) d) Ressuspender os cloroplastos lavados em 10 ml de tampão fosfato 0. c) Centrifugar por 2 minutos a 200 x g. b) Filtrar o homogeneizado em gase.2. . PROCEDIMENTO 4.5) contendo sacarose 0.5 (ferver 3’) 3 0.0) repetindo a operação 4 vezes.1. Equipamentos e Vidrarias Tubos de ensaio (4 por grupo) Centrífuga de mesa com tubos (10 ml) Banho de gêlo Almofariz com pistilo (1 para cada grupo) Lâmpada de 100 W (2) Folha de alumínio Banho maria (100oC) 3.35 M . 3 e 4 são expostos à luz de lâmpada (100 W) durante 1 minuto (o tubo nº 3 protegido da luz) e faz-se a leitura de absorbância (D.5 Os tubos 2. Extração dos Cloroplastos a) Picar 5 g de folhas de espinafre e homogeneizar em almofariz usando areia lavada como abrasivo e 10 ml de sacarose 0. (1300 rpm) desprezar o precipitado e centrifugar novamente o sobrenadante por 7 minutos a 1000 xg.Sacarose 0. MATERIAL 3.5 3 1.5 3 (+ ác.Ácido ascórbico (cristais) 4. ou algodão. Ensaio Preparar 4 tubos de colorímetro conforme o quadro que se segue: SUSPENSÃ O CLOROPLA STO (mL) TAMPÃO FOSFATO (mL) TUBOS 2.5) contendo sacarose 0.2.05 M (pH= 6.6-diclorofenol indofenol (16 mg/100 ml) . Manter em banho de gelo até o momento do uso.5 ajustar o “zero”do aparelho 0.5 ler imediatamente ler imediatamente e cobrir com folha de Alumínio 4 1.2.ascórbico ) 1.6-DCF (mL) OBSERVAÇÕES 1 2 3 1.05 M (pH = 6. A. Sanadi (ed. New York.R. Plant Physiology.E. 1967. 1970. & PANEK..). 112p. LITWACK. 1960. New York. BACILA. in D. Leeds.. Rio de Janeiro. Nitrate reductase activity in corn seedling as effected by light and nitrate content of nutrient media. R. 1973. A. Inc. TASTALDI. Experimental Biochemistry . 1968.39 5. Current Topics of Bioenergetics. 3 e 4 durante as leituras. VILLELA.. d) Quais tubos ocorre fotossíntese? Porque? e) Quais tubos não ocorre a fotossíntese? Porque? BIBLIOGRAFIA: ADELAR BRACHT E EMY LUIZA ISHII-IWAMOTO Métodos de Laboratório em Bioquímica. M.1. Ao Livro Técnico. ANÁLISES DOS RESULTADOS Anotar as leituras obtidas e fazer um gráfico Discutir os resultados: a) Qual a função do ácido ascórbico? b) Qual a função do 2. New York. & Mc CARTY.B. Técnicas e Experimentos de Bioquímica. 350p. 970 p. HAGEMAN. Experiments and Methods Biochemistry. WHARTON.J. John Wiley & Sons.). in . p. H. HEWITT. McMillan Publishing Co. Rio de Janeiro.. Manole 1ª Ed.C.L. JACOBS. Bioquímica Experimental. E. 2003 AVRON. Koogan. Physiological and Biochemical factors wich control the assimilation of inorganic nitrogen supplies by plants. 313p. Inc. 1958.D. New York. G. R. H. 12.A Laboratory Manual.H. The Chemical Analysis of Foods and Food Products. MARTELLI. Un.6 DCF? c) Descreva o observado nos tubos 2. M. E. Kirkby (ed. 552p. M. & D. 35: 700-708 (1960). FLESHER. Academic Press. "Mechanism of photoinduced electron transport in isolated chloroplasts". D. 1972. G. Van Nostrand. p.78-103.. Ed. In "Nitrogen Nutrition of the Plant".G. é transformado em amônia (NH3) pela "redutase de nitrito.pela enzima "redutase de nitrato"e a seguir o NO2. NO3. OBJETIVOS Verificar a habilidade de tecidos vegetais de reduzir o nitrato. MATERIAL 3. FUNDAMENTOS O nitrato (NO3-) é a forma nitrogenada mais abundante no solo e as plantas desenvolveram mecanismos bioquímicos para a sua utilização. 2.40 Aula Pratica Nº 7 : ANALISE DA REDUTASE DE NITRATO EM PLANTAS 1.4) . Também tem sido utilizada na avaliação da nutrição nitrogenada em diversas culturas. A amônia é posteriormente assimilada resultando nos compostos orgânicos nitrogenados.05% . 3.1.+ NADH + H+ (nitrato) (redutase) NO 2 - + NAD+ + H O 2 (nitrito) A atividade da enzima pode ser estimada pela quantidade de N02formada que é colorimétricamente dosada mediante reação com sulfanilamida e ∝-naftilenodiamino. o primeiro passo na utilização metabólica dessa forma nitrogenada. A redutase de NO3 é estimulada pela luz e há indícios de que a atividade da mesma esteja relacionada com a capacidade de certas plantas em acumular mais proteínas.Sulfanilamida 1% em HCl 12 N . Reagentes .2. Equipamentos e Vidrarias Espectrofotômetro Banho-Maria (37oC) Perfurador (0.é reduzido a NO2.Padrão de NaNO2 10 µM . avaliando-se ainda o efeito da luminosidade.5 cm de diâmetro) Pinças Estante com tubos de ensaio (8 tubos por grupo) 5 pipetas graduadas de 5 ml (por grupo) 3.Substrato tamponado (KNO3 200 mM em tampão fosfato 50 mM pH= 7. o que tem sugerido o melhoramento genético monitorado pela medida da atividade enzimática. gerando um complexo colorido (diazo composto) com λ max em 540 nm. Para tal o NO3.∝-naftilenodiamino 0. transferindo para tubos de ensaio. R.).1. Academic Press. b) Incubar com 5 mL de substrato tamponado a 37oC por 1 hora. d) Agitar. c) Paralizar a reação enzimática pela adição de sulfanilamida 1% em HCl 2N e a seguir adicionar 1 ml de ∝-neftilenodiamino 0. 1967. Current Topics of Bioenergetics. M. "Mechanism of photoinduced electron transport in isolated chloroplasts". aguardar 5 minutos para a reação cromogênica. FLESHER.5 cm de diâmetro). h -1). Discutir os resultados: 1. RESULTADOS e DISCUSSÃO Com os dados obtidos estabelecer a reta padrão (leituras na ordenada contra concentrações de N02. g-1 . NaNO2 10 µM SULFANI LAMIDA Δ Abs ∝NAFTILEN LEITURA t Abs O DIAMINO % 540 nm 540nm 540 nm 0 1 2 3 4 5 6 7 5 mL 4 mL 3 mL 2 mL 1 mL 0 mL 5 mL folha Escuro 5 mL folha Claro 1 1 2 3 4 5 0 0 mL mL mL mL mL mL 1 1 1 1 1 1 1 mL mL mL mL mL mL mL 1 1 1 1 1 1 1 ml ml ml ml ml mL mL 1 mL 1 mL 5. remover os discos por filtração e efetuar a leitura em fotocolorímetro com filtro no 54.H. Nitrate reductase activity in corn seedling as . New York.R. 12. 2003 AVRON. & D. Ed. Sanadi (ed. HAGEMAN. Porque a diferença encontrada entre os resultados das folhas mantidas no claro em relação as folhas mantidas no escuro? 2. PROCEDIMENTO a) Pesar 100 mg de discos foliares (0. Manole 1ª Ed. p.41 4. mantendo os tubos ao abrigo da luz (envoltos em folhas de alumínio). expressando os valores em µmoles de nitrato reduzido por hora por g de tecido foliar fresco (µmoles.na abscissa) e mediante interpolação na reta calcular as atividades de Redutase de Nitrato. e) Paralelamente fazer reta padrão fazendo-se reação conforme a tabela que se segue: TUBO NO H2O DEST.05%. Qual a importância da luz no processo de redução do Nitrato? REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ADELAR BRACHT E EMY LUIZA ISHII-IWAMOTO Métodos de Laboratório em Bioquímica. de folhas iluminadas e de folhas mantidas ao abrigo da luz. in D.. 78-103. 1958. Physiological and Biochemical factors wich control the assimilation of inorganic nitrogen supplies by plants.C. M. Inc. VILLELA. R. 970 p. G.J. H. New York. E. TASTALDI.D. in . McMillan Publishing Co. 112p. LITWACK. Kirkby (ed. D. media.B. 1968. & Mc CARTY. Experiments and Methods Biochemistry. 350p..G.). H. Van Nostrand. A. Ao Livro Técnico. & PANEK. Experimental Biochemistry .A Laboratory Manual.. The Chemical Analysis of Foods and Food Products. John Wiley & Sons. M. Koogan. New York. G.E. Un. 313p. 1970.L. 552p. Plant HEWITT. BACILA.. MARTELLI. 1973. Inc. Rio de Janeiro. New York.. Bioquímica Experimental. Rio de Janeiro. Técnicas e Experimentos de Bioquímica. JACOBS. WHARTON.A. p. Leeds. E.42 effected by light and nitrate content of nutrient Physiology. 1960. 1972. In "Nitrogen Nutrition of the Plant". 35: 700-708 (1960). Esquematize as três macromoléculas e fale de suas funções. α e β 3.Diferencie os polissacarideos amido. 5. dando sua importância.Explique resumidamente: (1) Como se faz a numeração da cadeia de um monossacarídeo.Que são ácidos graxos saturados.L.O que ocorre na rancificação oxidativa? Qual o papel dos antioxidantes? Cite exemplos. Citar as funções dos lipídeos nos seres vivos.O que são N-glicosideos.Escreva a relação entre ponto de fusão e solubilidade quanto ao peso molecular. o-metílicos.Quais os componentes estruturais de uma cera e o tipo de ligação entre elas? 17. 13. Dê exemplos. 9. 8. frutanas e hemicelulose? 10.L. maltose. 14.Escreva as fórmulas de: sacarose.A molécula de D-β. (2) Diferencie posição D.Qual a importância do índice de saponificação e índice de iodo (em relação ao peso molecular e grau de insaturação) nos ácidos graxos .O que são ligações glicosídicas dos tipos a ( α 1.Como se dividem os polissacarideos? Dê exemplos.(+) e (—).Escreva a fórmula cíclica (projeção) dos principais monossacarideos (hexoses). 18. glicogênio e celulose quanto às ligações glicosídicas.Citar as características necessárias para que uma molécula funcione como sabão ou detergente.43 QUESTIONÁRIO 1 ASSUNTO: CARBODRATOS E LIPIDEOS 1. 15. 16.Quais as funções dos triglicerídeos? Que tipo de ligação existe? 19. gorduras e óleos. 6. 20. lactose e celobiose. açúcares-alcoóis e amino-açúcares 111.4)? 7. estrutura e grau de insaturação de lipídeos.O que são dextranas. 12. Considere as posições D. insaturados e poliinsaturados?.α-glucose? 4.4) e a (β 1.Defina ligação hemicetal demonstrando um exemplo através de uma cetose e uma aldose (ciclo hexose).Testosterona e Progesterona pertencem a que classe de lipideos? Porque? .Qual a função dos fosfolipideos? Escreva um exemplo. 2.glicose difere em que de uma molécula de D. O que são coenzimas ? de exemplo QUESTIONARIO 3 1) Escreva graficamente a comparação entre as energias de ativação de uma reação catalisada e de uma reação não catalisada.44 QUESTIONARIO 2 1. 6.. Citar os tipos de ligação responsáveis pelas estruturas secundaria e terciária da proteína 9. 11. Qual o conceito de”sitio ativo’? 14. terciária e quaternária de uma proteína? 8. secundaria. 11) Qual a relação entre abate de animais e descanso? 12)0 que significa formação de ATP a nível de substrato? . 4. Porém na célula a reação se desloca no sentido da degradação da frutose.O que vem a ser velocidade de uma reação enzimática? 12. Explicar o que significa ponto isoelétrico de um aminoácido. Representar a ligação peptidica. 15.Qual o efeito do pH em uma reação enzimática? 19.Escreva graficamente a comparação entre as energias de ligação de uma reação catalisada e uma reação não catalisada. Definir proteína simples e conjugada. De exemplos. e que agentes causam esta desnaturação? 10. 5 . Qual a explicação de Michaelis Mentem para o modo de ação de uma enzima? 13. Cite dois exemplos de cada classe 3 Escrever a reação entre dois aminoacido. 2) Qual o conceito de “sitio ativo”? 3) Qual o significado da constante de Michaelis e Menten? 4) O que é glicólise? 5) Localização celular da glicólise. 6) Qual a relação entre insulina e glicólise? 7)A frutose pode ser utilizada na glicõlise? 8) A aldolase apresenta K-equilibrio 9 x 104.Escreva as classificações dos aminoácidos de acordo com a cadeia lateral. Por quê? 9)Qual o efeito da adrenalina sobre a glicólise? 10) Explicar o balanço de ATP no processo da glicólise. identificando a ligação peptidica.Q que é cofator enzimático? 20. Qual o efeito da temperatura em uma reação enzimática? 18. 2. 7 O que vem a ser a estrutura primaria. O que vem a ser desnaturação de uma proteína.Que vem a ser inibidor competitivo e não competitivo? 16.O que é uma enzima alosterica? 17. Citar a carga de um aminoácido abaixo e acima de seu ponto isoeletrico. O que vem a ser glicólise? 2. 24)Como você pode determinar. 23)Destacar a importância de elementos minerais no ciclo das pentoses. Quais os substratos e os produtos do metabolismo anaeróbico dos carboidratos? 5.45 13)0 que é gluconeogênese? 14) Qual a importância da gluconeogenese? 15) Como pode ser utilizada a fermentação alcoólica para a produção de glicerol? 16) Mecanismo de formação do glicerol. Qual o rendimento energético obtido por uma célula muscular ao degradar anaerobicamente a glicose? Por que este rendimento é superior quando se utiliza glicogênio como substrato? Dados: ATP ADP + Pi. O que vem a ser “balanço de coenzimas” e por que ele é nulo em anaerobiose? 4. 21) No que consiste o ciclo das pentoses? 22) Comparar glicólise com ciclo das pentoses. 19) Qual a importância do ciclo das pentoses? 20) Localização celular do ciclo das pentoses.000 cal/mol) C6H1206 2C3H603 (AG=-47 . Em que região da célula se processa a glicólise e qual a sua finalidade? 3. se um tecido está realizando glicólise ou ciclo das pentoses? 25) Porque há necessidade do ciclo de Krebs para a oxidação do acetil-CoA? 26) Quais os produtos do ciclo de Krebs? 27) Quais são as enzimas regulatórias do ciclo de Krebs? 28) Qual o significado do ciclo de Krebs? 29) Quais os inibidores do ciclo? 30) Que significa cadeia respiratória? 31) Qual a produção de ATP através da oxidação total de uma molécula de glicose? 32) Quais os venenos respiratórios? 33) Que composto é o último aceptor de eletrons na cadeia respiratória? 34) Qual a diferença entre ATP e GTP ?’ QUESTIONARIO RESPIRATORIA) 4 (GLICÓLISE. na prática. CICLO DE KREBS E CADEIA 1. (AG=-8. O que vem a ser “malte” e qual a sua função na produção de etanol a . 17) Quais as diferenças entre glicólise e fermentação alcoólica? 18) Destacar a importância da nicotinamida (vit. do complexo B) na glicólise.000cal/mol) 6. O-CO . Como a célula efetua a dessaturação dos ácidos graxos? Como ela está relacionada com a aclimatação de certas plantas em ambientes mais frio? .Qual a vantagem da membrana interna da mitocôndria se apresentar enrugada? 16. ensilagem.Como se explica a ação tóxica do cianeto na Cadeia Respiratória? QUESTIONÁRIO 5: VIA PENTOSE FOSFATO.Quais as funções da Cadeira Respiratória? Onde ela se processa e por que a mesma está acoplada ao Ciclo de Krebs? 11 Qual a diferença entre “veneno respiratório” e “desacoplador da fosforilaçâo oxidativa”? 12. picles. 2. etc.) ao se propiciar a fermentação lática? 9.CH3 7. METABOLISMO DOS TRIGLICERIDIOS.46 partir de cereais? 7. Quais as finalidades da via pentose fosfato e em que região da célula ela opera? 3. 4. Cite duas diferenças e duas semelhanças entre glicólise e via pentose fosfato. Qual a importância energética quantitativa e qualitativa dos triglicerídios de nossa dieta? 5. por que? 13.O .Quantos ATPs são produzidos pela combustão biológica completa do acetilCoA. O que resulta da beta-oxidação dos ácidos graxos? Onde ela se processa e quais os destinos dos seus produtos? 6. Quantos ATPs seriam obtidos por uma célula ao oxidar completamente o triglicerídio abaixo estruturado? CH2. Comparando-se as glândulas mamárias e o músculo esquelético em quais desses tecidos predomina a via pentose fosfato? Justifique. piruvato.Qual a diferença entre “fosforilação oxidativa” e “fosforilação ao nível de substrato”? Qual a mais significativa em condições de aerobiose. iogurtes. lactato e etanol? 15. METABOLISMO DEGRADAT1VO DAS PROTEINAS E AMINOÁCIDOS E EXCREÇÃO DO NITROGÊNIO.Como se explica a ação tóxica do flúor acetato (principio tóxico de algumas plantas) sobre o Ciclo de Krebs? 17. idem para os tecidos vegetais jovens e maduros. Em que se fundamenta a conservação de alimentos (coalhadas. 1.(CH2) 14 .(CH2)13. (∆ G°=-686.000 cal/moI) 14. Qual o rendimento energético obtido por uma célula ao oxidar completamente a molécula de glicose? Quantos ATPs são produzidos pela fosforilação oxidativa e quantos pela fosforilação ao nível de substrato? Dados: C6H1206 C02 + H2O . Quais as funções do Ciclo de Krebs? Onde ele se processa? 1O.CH3 CH-O-CO-(CH2)14-CH3 CH2. Qual a vantagem do abate de animais descansados à luz do metabolismo anaeróbico nas células musculares? 8.CO . Quais parte 2. Por que animais com habilidade metabólica para excreção de uréia ou ácido úrico voltam a excretar nitrogênio amoniacal quando em ambiente com grande disponibilidade de água? QUESTIONÁRIO 6 : INTEGRAÇÃO DO METABOLISMO. REGULAÇÃO METABÓLICA. Quais as formas nitrogenadas de excreção utilizadas pelos organismos animais? Que propriedades de solubilidade e toxidez apresentam? 13. atender a demanda energética de nosso organismo? 9. célula? ésteres.Quais são os 3 compostos chaves do metabolismo degradativo dos proteínas? Quais 4. e como. O que vem a ser reação de transaminação? Cite uma delas e comente a sua importância. FOTOSSINTESE E CICLO DO NITROGÊNIO 1.Podem os triglicerídios ser convertidos em açúcar no organismo animal? Por que? 9. 0 que vem a ser balanço nítrogenado? Por que ele é nulo em animais adultos e negativo quando de uma dieta deficiente em aminoácidos essenciais? 11.Esquematize a formação de triglicerídio a partir de carboidrato. aspártico e alanina a partir de uréia e açúcar de melaço no rumen bovino. Esquematize a formação dos ácidos glutâmico. Por que a uréia é a forma nitrogenada de excreção mais adequada para os mamíferos? Idem quanto ao ácido úrico para as aves. 10.Como o excesso de amônia pode comprometer o metabolismo das células nervosas (cérebro) levando ao coma cerebral? Como a intoxicação com etanol leva ao mesmo quadro clínico? . 5. Por que as proteínas devem estar presentes em nossa dieta? Podem elas. 12. Porque a uréia tem que ser fornecida juntamente com uma forma facilmente metabolizável de açúcar? 6. 14.O que vem a ser “Ciclo do Glioxilato”? Em que organismos ocorre e qual a sua função bioquímica? Porque tal ciclo é particularmente ativo durante a germinação de sementes oleaginosas? 10.O que vem a ser “aminoacido glicogênico”? Cite 3 deles. O que vem a ser “corpos cetônicos” e como são formados em nosso organismo? Em que condições fisiológicas tais compostos se mostram com conteúdos mais elevados na urina e no sangue? 8. O que vem a ser aminoácido essencial? Cite 3 deles para o homem. alimentos? destinos? triglicerídios e proteínas para atender à demanda de energia (ATP) por 3. Idem para reação de descarboxilação de aminoácido.Com que eficiência e é glicosídicas carboidratos. peptídicas lipídios e são as etapas (fases) pelas da aprisionada na a energia de das ligações dos seus fase hidrólise os quais passam polissacarídios. Qual a importância deste fato para o metabolismo animal? 7.Por que uma adubação nitrogenada excessiva por acarretar o “acamamento” em certas culturas? 12.0 que vem a ser “Efeito Pasteur” e como ele é explicado bioquímicamente? 11.47 8. Mn e Mg para o processo fotossintético? 1 8.0 que vem a ser “fixação do nitrogênio”? Quais as modalidades de fixação do N ? 34.Qual a função da água no processo fotossíntético? 20.Cite 4 diferenças entre plantas C-3 e C-4 (exceto foto-respiração). 0 que vem a ser “assimilação da amônia” e quais a vias metabólcas envolvidas? .6diclorofenolindofenol por cloroplastos iluminados (reação de Hill)? 21.Como são estruturados os sistemas de pigmentos para a captação da energia radiante para a condução da fotossíntese? 19.Como os herbicidas que bloqueiam o transporte de elétrons no processo fotossintético matam a planta? 32.Quais as funções dos carotenóides no processo fotossintético conduzido pelas plantas? 17.0 que vem a ser “redução do nitrato”? Quais as participações do ferro e molibdênio neste processo? 33. 0 que vem a ser “foto-redução do NADP + e “fotofosforilação do ADP”? 22.Por que as luzes de comprimentos de onde de 450 e 650 nm são mais eficientes para a realização de fotossíntese pelas plantas superiores? 16. 0 que fica demonstrado quando se observa a redução do 2.0 que vem a ser “ponto de compensação” e por que é menor para as plantas C-4? 30.Porque as plantas C-4 fazem fotossíntese com boa eficiência mesmo em temperaturas mais elevadas? 28.0 que vem a ser “fotorrespiração”? Qual o seu substrato e porque é pouco intensa nas plantas C-4? Qual a importância da luz e do 02 neste processo? 25.Porque o nitrato é a forma nitrogenada mais abundante no solo? Existiria alguma vantagem para as plantas? 31 . Porque a fotossíntese nas plantas C-4 não atinge a saturação mesmo com grande intensidade luminosa? 29. Quais as enzimas ‘envolvidas nesta etapa e suas afinidades para com o CO2? 23. 26.Quais os eventos que dependem e quais os que não dependem da luz quanto à formação de glicose por uma planta fotossintetizadora? 15.48 13.Que adaptações ocorreram nas crassuláceas que lhes permitem a Me sobrevivência em ambientes quentes e áridos? 24.Como se explicam a essencialidade do Cl.Por que as plantas C-4 são menos exigentes em nitrogênio quando comparadas com as C-3? 27. Qual o primeiro composto formado pela assimilação do CO2 mediante a via C-3 de fixação? Idem para a via C-4.Porque o diabético bebe mais água que o indivíduo saudável? 14. Como que os herbicidas ‘que bloqueiam o transporte de elétrons na fase luminosa da fotossíntese (2.49 35.0 que vem a ser “desnitrificação”? Que organismo está envolvido e com que objetivo tal processo é conduzido? 37.4-DNP e DCMU) matam a planta? . 0que vem a ser “nitrificação” e qual a importância agronômica para essa transformação? 36. 114 1.2521.0321.161 7 1.1251.9830.553 01 02 03 04 05 06 07 08 09 2.638 1.9211.051 1.2681.0921.237 1.1491.2921.328 1.8241.721 2 1.3981.2601.222 2.0361.387 1.167 1.971 0.1941.097 1.1871.0711.108 1.3982.3871.201 1.0971.0861.174 1.770 0.3571.745 3.1191.319 1.6021.004 1.9591.420 1.5232.50 Tabela de Conversão T% em A x 1.6581.1551.3771.4581.4321.9790.3011.8541.2151.6991.1801.963 11 959 955 951 947 943 939 938 932 928 924 12 921 917 914 910 907 903 900 896 893 889 13 886 883 879 876 873 870 866 863 860 857 14 854 851 848 845 842 839 836 833 830 827 804 801 799 15 824 821 818 815 812 810 807 17 770 767 764 762 759 757 1.3471.4441.00026992.2841.0661.022 1.569 1.409 1.1311.276 1.310 5 1.0131.9750.6781.967 16 796 793 790 788 785 783 780 777 775 772 764 752 750 747 18 745 745 742 738 735 733 730 728 726 724 19 721 719 717 714 712 710 708 706 703 701 20 699 697 695 693 690 688 686 684 682 680 21 678 676 674 672 670 688 666 664 22 658 656 654 652 650 648 646 644 662 642 660 640 604 23 638 636 635 633 631 629 627 625 623 622 24 620 618 616 614 613 611 609 607 606 25 602 600 599 597 595 503 592 590 588 587 26 585 583 582 580 578 577 575 573 572 570 27 569 567 565 28 553 551 550 29 538 564 562 561 559 558 556 548 547 545 544 542 554 541 539 536 535 533 532 530 529 527 528 524 30 523 521 520 519 517 516 514 513 511 510 .4691.009 1.987 1.9910.886 2.2081.1431.0001.1552.000 00 0 1 1.229 6 1.076 1.3371.481 1.0000.102 8 9 10 0.046 1.6201.538 3 4 1.0811.0181.048 1.0601.137 1.5851.4951.5091.7961.3012.244 1.2221.056 1.9960.5231.0411.0271. 51 31 509 507 506 504 503 502 500 499 498 495 484 483 32 495 493 492 491 489 488 487 485 33 481 480 479 478 476 475 474 472 471 470 34 469 467 468 465 463 462 461 460 458 457 35 456 36 444 37 432 38 420 39 409 40 398 41 387 42 377 43 367 44 357 45 347 46 337 47 328 48 319 49 310 50 301 51 292 52 284 53 278 54 268 55 250 56 252 57 244 58 237 59 229 60 222 61 215 62 208 63 201 64 194 65 187 66 180 67 174 68 167 69 161 70 155 71 149 72 143 455 453 452 451 450 442 441 449 447 446 445 440 439 438 437 435 334 433 431 429 428 427 426 425 424 423 421 419 418 417 416 415 413 412 411 410 408 407 406 405 403 402 401 400 399 397 396 395 386 385 366 365 356 355 346 345 394 393 391 390 389 388 384 383 382 381 380 379 378 364 363 362 361 360 359 358 354 353 352 351 350 344 343 342 341 349 348 340 339 338 322 321 320 304 303 302 294 293 376 375 374 373 372 371 370 369 368 336 335 334 333 333 332 331 330 329 327 328 326 325 324 323 309 308 307 306 305 305 318 317 316 315 314 313 312 312 311 300 299 298 298 297 296 295 292 291 290 289 288 287 287 286 285 283 282 281 281 280 279 278 277 277 275 274 273 272 272 271 270 289 268 267 266 265 264 264 263 262 261 260 259 258 257 257 256 255 254 253 253 251 250 249 249 248 247 246 246 245 243 243 242 241 240 240 239 238 237 236 235 234 234 233 232 231 231 230 228 228 227 226 225 225 224 223 223 221 220 220 219 218 218 217 216 215 214 213 213 212 211 210 210 209 208 207 206 206 205 204 203 203 202 202 200 199 199 198 197 197 196 195 194 193 192 192 191 190 190 189 188 188 186 186 185 184 184 183 182 182 181 180 179 178 178 177 177 176 175 175 173 173 172 171 171 170 169 169 168 167 166 166 165 154 164 164 163 162 162 161 160 159 159 158 157 157 156 156 154 153 152 152 151 151 150 149 144 144 143 148 148 147 146 146 145 142 141 141 140 140 139 138 138 137 . 52 73 137 74 131 75 125 76 119 77 114 78 108 79 102 80 097 81 092 82 086 83 081 84 076 85 071 86 066 87 060 88 056 89 051 90 046 91 041 92 036 93 032 94 027 95 022 96 018 97 013 98 009 99 004 136 135 135 134 134 133 133 132 132 130 130 129 128 128 127 127 126 126 124 124 123 123 122 121 121 120 120 119 118 117 117 116 116 115 115 114 113 112 112 111 111 110 110 109 109 107 107 096 106 106 105 105 094 104 103 103 102 101 101 100 100 099 099 098 097 096 095 095 084 094 093 093 092 091 090 090 089 089 088 088 087 087 086 085 085 084 083 083 082 081 080 080 079 079 078 078 077 077 076 075 075 074 074 073 073 072 072 071 070 070 069 069 068 068 067 065 064 064 055 055 050 050 045 040 045 040 054 049 044 063 067 066 061 063 062 062 061 060 059 059 058 058 057 057 057 056 054 053 053 052 052 051 049 044 034 048 043 048 043 047 047 046 042 042 041 040 039 039 038 038 037 037 034 033 033 032 032 030 030 029 029 028 028 027 036 035 035 031 031 026 026 025 025 025 024 024 023 023 022 021 021 020 020 020 019 019 018 017 017 016’ 016 015 015 015 014 014 013 012 012 011 011 011 010 010 009 008 007 007 007 007 006 006 005 005 004 003 003 003 002 002 001 001 000 .