u ff UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSEINSTITUTO DE BIOLOGIA DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR GCM ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS quando este descobriu que a luz branca. No entanto. se é negro. que deverá ser constituído de: uma fonte luminosa. A tabela abaixo mostra as regiões do espectro em relação ao comprimento de onda: REGIÃO: Raios X Ultravioleta Visível Infravermelho Microonda (λ) EM nm: 0. formada por ondas que apresentam comprimentos diferentes. praticamente. Atualmente. que transmite uma determinada faixa de λ na região do ultravioleta.1-100 100-400 400-800 800-5000 5000-30000 INTERVALO (nm) COR ABSORVIDA COR COMPLEMENTAR 380-435 435-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-595 595-650 650-780 violeta azul azul esverdeada verde azulada verde Verde. Quando um objeto é da cor branca. uma vez que o espectro de absorção é característico para uma determinada substância e a quantidade de absorção A cor dos objetos é devida a duas causas: reflexão e absorção. Pode-se selecionar o comprimento de onda que incidirá sobre a solução usando-se um monocromador (prisma ou retículo de difração) ou um filtro óptico (vidro colorido ou quartzo. recebe todos os λ da luz branca. sendo o restante absorvido. UV). Princípios gerais O termo espectro foi utilizado inicialmente por Newton. ao atravessar um prisma. mas reflete e transmite somente o vermelho. é dependente da concentração do A intensidade da radiação transmitida por uma solução pode ser determinada em aparelho (fotômetro).amarelada amarelada alaranjada vermelha Verde-amarelada amarela alaranjada vermelha púrpura violeta azul Azul-esverdeada verde-azulada A capacidade que as diversas substâncias químicas têm de absorverem luz em determinados comprimentos de onda pode ser utilizada para a sua determinação quantitativa e qualitativa. a qual corresponde à chamada cor complementar. Este último é muito útil. A tabela abaixo mostra as cores de cada intervalo de radiação da faixa do visível e as suas respectivas cores complementares: (intensidade) composto. portanto. A luz é. O comprimento de onda (λ) é medido em nm onde 1.1 PRÁTICA No 1 . que corresponde à radiação azul. vermelho. um seletor de λ (filtro ou prisma). que não foram absorvidos. sabe-se que o espectro visível é apenas uma pequena parte do espectro eletromagnético. todos os λ são absorvidos. é dividida em várias cores.0 nm equivale a 10-9 m. Se uma solução absorve na faixa de 435-480 nm. a sua cor (cor complementar) será o amarelo. pois pode selecionar faixas de comprimentos de onda .FUNDAMENTOS DE FOTOMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO 1. existe uma cor (ou λ) que é mais absorvida. uma célula fotoelétrica (ou fototubo) e um sistema para amplificação e medida do sinal (corrente elétrica) proveniente da célula fotoelétrica (medidor de potencial elétrico = potenciômetro). Assim. é denominado fotômetro ou fotocolorímetro e se dispõe de prisma ou retículo é denominado de espectrofotômetro. Se o aparelho dispõe de filtro óptico. a sensação visual do amarelo será dada pelo conjunto de todos os outros componentes da luz branca. definida como uma forma de energia eletromagnética. um compartimento para a amostra. um papel transparente. todos os λ são refletidos. é porque. Observe que o termo transmissão tem aplicação limitada.. presta-se tanto para a medida da concentração de compostos naturalmente corados. desta forma. bloqueada a passagem de luz para o fototubo (fotocélula). Deste modo. pelo material da cubeta e por outras substâncias aí existentes. Leis da fotometria O princípio básico da fotometria é baseado no fato de que: partículas dispersas ou dissolvidas em uma solução interferem seletivamente com um raio de luz que passa através desta solução. A relação da A com a concentração pelas de uma da Leis substância de é pode ser a à compreendida absorvância Lambert-Beer: proporcional solução concentração da substância na solução e à distância percorrida pelo feixe luminoso que atravessa a solução (caminho óptico): A = ε. Para corrigir tal efeito. bem como de compostos incolores que absorvem UV ou IV. admite-se It =1 (100% de Transmitância) a luz transmitida após I0 atravessar a cubeta contendo uma solução denominada branco. Alguns poucos exemplos: na determinação de atividade enzimática ou nas dosagens de compostos orgânicos em fluidos biológicos. as partículas podem absorver e transmitir parte do espectro. Esta metodologia.) ou absorvância (A). da sua natureza química e/ou da sua cor. a It é I0 menos a luz que é absorvida não só pela substância que se deseja medir. por A seguinte formulação pode ser feita: Transmissão = It / Io (luz transmitida / luz incidente). uma vez que. exceto a substância a ser medida. mas passíveis de adquirirem cor mediante o emprego de certos reativos. não há luz transmitida a ser medida. Ensaios imunológicos quantitativos (como o ELISA: EnzymeLinke ImmunoadSorbent Assay) também usam a fotometria. mas também pelo solvente. como glicose. Este branco contém todos os componentes do meio. d) combinação dos fatores acima.O. medida em uma escala de 0 (log 1/1) a infinito (log 1/0). Na prática. visível e infravermelho (IV). b) tamanho da partícula. em que se dosa um produto colorido. It é a luz transmitida após as absorções pela substância de interesse mais os interferentes. Se pudermos medir o total de luz que incide (Io) sobre a solução de uma determinada substância e o total da luz transmitida (It). a transmitância (T). obtido por meio de uma reação química.2 extremamente estreitas. nas regiões do UV. podemos avaliar o quanto a substância absorveu (absorvância: A) O esquema abaixo mostra como funciona um fotômetro ou um espectrofotômetro: substituída pelo valor de densidade óptica (D. e definido como a absovância (A) de uma solução l molar da substância em um determinado comprimento de onda (λ). No escuro. A fotometria de absorção.c. como daqueles incolores. numa cubeta de caminho óptico l = l cm (largura da cubeta) e c = à concentração da solução. termo mais aceito atualmente. onde: ε = coeficiente extinção molar. que é constante para cada substância. que corresponde ao logaritmo do inverso da transmitância: A = log 1/T A absorvância é. é pouco utilizada. Assim. c) transparência da solução. Esta interferência depende dos seguintes fatores: a) cor do composto ou do tipo de ligação química presente.1. ou seja. pois é conseguinte. que é medida em uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o branco na passagem da luz). a Transmitância = 0. 1. etc. portanto. l. proteínas. . ou um produto incolor que absorva na região do UV ou do IV. tem largo emprego na química analítica quantitativa. uréia. dependendo da sua concentração. Reagentes • Solução de Azul de Bromofenol 1 mg /100 mL em meio levemente ácido (amarelo) e Solução de Azul de Bromofenol 1 mg /100 mL em meio alcalino (azul/violeta). 2. previamente. que a absorvância é uma função linear da concentração. Sendo os mesmos valores de λ. onde há linearidade. O comprimento de onda (λ) usado para a obtenção da curva padrão é obtido pela preparação do espectro de absorção da substância em estudo e é. o λ onde a absorvância para a substância apresenta o valor máximo. a considerando-se A é o caminho óptico à 3. • Caracterizar o comprimento de onda (λ) onde ocorre absorção máxima. bases e sais na solução podem contribuir para essas desobediências. Objetivos • Determinar o espectro de absorção de uma solução de Azul de Bromofenol em pH alcalino e em pH ácido. as Leis de Lambert–Beer nem sem pre são obedecidas. e verificar as absorvâncias no comprimento de onda indicado e na cubeta de caminho óptico adequado. • Repetir estas operações para os valores de λ mostrados na tabela. • O mesmo será feito para o Azul de Bromofenol em pH alcalino. novamente. por estarem mais completamente dissociados. repetir o ajuste do branco. . Procedimentos gerais de ajuste do fotômetro • Ligar o aparelho e aguardar por cerca de 10 minutos. Também as presenças de ácidos. Para se evitar discrepâncias das Leis de Lambert-Beer. etc. 4. de acordo com a tabela. • Selecionar o comprimento de onda adequado. Algumas desobediências são conhecidas e atribuídas a fatores como: mudança na natureza do soluto. No entanto. valores muitos altos ou muitos baixos das concentrações das soluções.1. deve-se trabalhar com soluções mais diluídas e construir. determinar a concentração de uma solução problema. • Construir uma curva padrão do Azul de Bromofenol. normalmente. Procedimentos 4. • Ajustar o λ a 430 nm. no botão correspondente. • Ajustar o 100% de transmitância com o branco. • Obtenção do espectro de absorção: • Ajustar o comprimento de onda inicialmente em 400 nm. a absorvância correspondente a este λ. • Colocar a cubeta com a solução de Azul de Bromofenol em meio ácido à concentração de 1 mg/100 mL. Assim. em que são usadas concentrações conhecidas (e crescentes) da substância em análise. recolocar a solução de Azul de Bromofenol e ler. também. uma curva padrão.3 Observe. • Introduzir a cubeta com o branco (água destilada) e ajustar a 100% de transmitância. à medida que aumenta a diluição. Com o emprego da curva padrão. constante. • Ajustar o zero de transmitância. Desta forma. teremos os limites de concentração nos quais a solução obedece às Leis de Lambert-Beer. • Repetir os ajustes acima. visto que absorção da luz pelos íons é diferente daquela apresentada pelas moléculas não ionizadas. podemos. portanto. diretamente proporcional concentração desta substância. Isto coincide com o 0 % de absorvância. • Ler a absorvância e registrá-la. para uma mesma substância. ou seja. relacionando absorvância (ordenada) contra λ (abscissa).2.Avalie. 2) Preparar soluções de Azul de bromofenol nas concentrações citadas na tabela abaixo: Concentração de Absorvânci Absorvância Azul de Bromofenol (mg/100ml) λ 410 430 450 470 490 510 530 550 570 590 610 630 660 700 a (pH<3) (pH>7. As absovâncias destas soluções.4. Colocar 4 mL de Azul de Bromofenol no tubo 1e agitar. . Questões complementares 6.3. em papel milimetrado. 5. Curva padrão – Obtenção 1) Fazer diluição seriada: • • • • • Utilizar 6 tubos de ensaio e numerá-los. se o Azul de Bromofenol segue.Você dispõe dos filtros azul. Material: 1) Espectofotômetro: TUNER. vermelho e amarelo de um fotômetro. estritamente. 3) λ: comprimento de onda. foram.50 (1/2) 0. 6. as Leis de Lambert- 2) Solução: Azul de bromofenol em meio ácido (1mg/100ml) e Azul de bromofenol em pH alcalino (1mg/100ml).1. Adicionar 4 mL de H2O em cada tubo. Azul de Bromofenol (pH<3) A Azul de Bromofenol (pH>7. 5.1 – Você pesou l. 4) A: absorvância. 4. Questões para discussão 5. Repetir em todos os tubos.Explique por que não se deve usar cubetas de vidro para leituras na região do ultravioleta.4 • Fazer o gráfico dos espectros de absorção do Azul de Bromofenol em papel milimetrado.Explique porque o Azul de Bromofenol apresenta colorações diferentes com a mudança no pH da solução.2.125 (1/8) 0. admitindo que nada interferiu em seu procedimento.03125 (1/32) 0.015625 (1/64) • • Ler no espectrofotômetro todos os tubos no comprimento de onda (λ) ideal para cada solução. diluído em 2x com relação ao anterior. Qual deles você usará.0625 (1/16) 0.2.6) A • Cada tubo estará desta forma. respectivamente. modelo 330 5. Beer. • Determinar o λ de absorvância máxima. para que uma solução de cor vermelha tenha uma absorção (contra o branco) o mais próximo de zero possível? 5. 0. em 430nm. nas condições experimentais acima.6) 0. No tubo 6 retirar 4 mL e descartar. a curva padrão (leituras obtidas na ordenada e concentrações na abscissa). verde. Construir.25 (1/4) 0. Retirar 4 mL da solução do tubo 1 e adicionar no tubo 2. 2 e 3 mg de Azul de Bromofenol e dissolveu cada uma quantidade em 50 mL. considerando os pontos zero de absorção e de concentração. ...0..0....0. numa cubeta de caminho óptico de 2 cm......5.. Calcule a sua concentração...O coeficiente de extinção molar (ε) de uma substância de peso molecular 200 é 14.400.. 20 e 30mg/100mL foram processados para a dosagem da glicose...... ...2 – Para a dosagem da glicose do sangue de um paciente. 1mL do desproteinizado e 2mL de cada um dos padrões de glicose (P) de 10. em mg/100mL..... em todos os tubos.150 P-20 mg/100mL. a amostra foi diluída em 10 vezes (no processo de desproteinização)... Qual a concentração (em mg/L) da substância nesta solução? • Papel milimetrado: ... sendo o volume final.......3.. 6..298 P-30 mg/100mL..180 P-10 mg/100mL. Uma solução desta substância apresentou .4 e 0..5 0....6. Após as leituras espectrofotométricas em comprimento de onda adequado..3 .. 0......800. A abosvância de uma solução desconhecida do sal foi 0. Qual a concentração da glicose no sangue do paciente? 6...... a absorvância de 0.. as absorvâncias obtidas foram: Amostra.... ajustados para 5mL.. Certos agentes podem alterar a conformação espacial original das proteínas. As proteínas possuem estruturas espaciais bem definidas que. possuem uma camada de solvatação ou hidratação. excluindo a água. ao estudo de proteínas. métodos cromatográficos podem ser baseados em diferenças no peso molecular e/ou carga elétrica. são os compostos químicos mais abundantes nos organismos. podem ser caracterizadas como estruturas secundária. No entanto. Dentre os métodos utilizados. podem-se ter diferenças fisico-químicas individuais entre proteínas numa mistura. torna-se importante a existência de métodos adequados de purificação e quantificação destes compostos. terciária e quaternária.6 PRÁTICA No 2 . pode ser produzido pelo aumento da URÉIA Quando a substância contém duas ou mais ligações peptídicas. Por serem Dependendo dos aminoácidos que fazem parte das proteínas (estrutura primária). Na2SO4 e outros) podem alterar a camada de solvatação de proteínas. sem que ocorra alteração da estrutura primária. podem ser detectadas através da absorção de luz a 280 nm. os quais originam substâncias coloridas que absorvem luz na região visível. que permitem a sua solubilidade. com extrema versatilidade de conformações e funções. modificando. invariavelmente. produz uma cor azul-violeta com o reativo de biureto. que. a detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reações específicas com determinados reativos. O estudo de aspectos importantes da bioquímica nos leva. que é baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo do biureto) com proteínas e peptídeos (no mínimo tripeptídeos). segundo o nível de complexidade. O nome do método provém do fato de que a uréia aquecida a 180oC dará reação positiva com desprendimento de amônia: 0 C NH2 H N H H N 0 C NH2 BIURETO H NH3 0 C NH2 0 C NH2 N H exemplo. Diversas substâncias. Este efeito. as proteínas. Ao seu redor interagem moléculas de água. depende da estrutura primária (a simples disposição dos aminoácidos na cadeia polipeptídica). permitindo a sua quantificação. Por R R O C C NH HN CH C CH O R 0 C NH H Cu+2 R NH C H C O formadas por aminoácidos e considerando-se que os aminoácidos aromáticos absorvem luz na região ultravioleta.ESTUDO FÍSICO-QUÍMICO DAS PROTEÍNAS 1. algumas de suas propriedades biológicas. Esta cor desenvolvida é devida a um complexo entre o íon cúprico e duas cadeias peptídicas adjacentes: . Portanto. As proteínas são macromoléculas coloidais. A purificação e caracterização de uma proteína baseiam-se em suas características físico-químicas. A função biológica está associada à estrutura espacial. Introdução As proteínas. aumentando (“salting-in”) ou diminuindo (“salting-out) a solubilidade. por sua vez. situa-se o método do biureto. desta forma. entre elas os sais inorgânicos ((NH4)2SO4. as quais podem ser utilizadas para a separação e purificação destes compostos. chamado de desnaturação. em geral. 5 mL da solução diluída de proteínas. • Tubo 5: colocar 2 mL da solução de ninhidrina + 0. • Verificar a alteração de solubilidade de proteínas em presença de soluções salinas e solventes orgânicos.0.5 mL de água destilada. Precipitação ácida: . contendo sacarose). efetuarmos a reação da ninhidrina. • Observar a separação cromatográfica (cromatografia de exclusão molecular) de substâncias de pesos moleculares diferentes. • Solução saturada de sulfato de amônio (NH4)2 SO4. • Tubo 6: colocar 2 mL da solução de ninhidrina + 0.5 mL de água destilada.000. Os aminoácidos componentes de uma proteína podem ser genericamente caracterizados se. como o sangue: ânions de ácidos complexos (tricloroacético. É uma reação inespecífica quanto à identidade do aminoácido. • Tubo 2: colocar: 1 mL do reativo do Biureto + 0. • Solução de aminoácidos. • Solução tampão de fosfato de sódio 0. • Tubo 3: colocar: 1 mL do reativo do Biureto + 0.1g% (P/V). após sua hidrólise.7 temperatura do meio. • Comparar o desenvolvimento de cor nos tubos. 5 e 6 por 5 minutos. alteração do pH ou pela adição de solventes orgânicos. 2. pH 7. fosfotúngstico) formam sais insolúveis onde a proteína funciona como cátion. • Etanol gelado. • Resina Sephadex G-25 (faixa de separação PM 1000-5000 D).2. • Solução de ninhidrina 0.000 D. metais pesados (cobre. na verdade um iminoácido. reação específica de detecção de 4. • Verificar a ação de agentes desnaturantes. o • Solução concentrada de proteínas. • Ferver os tubos de ensaio 4. vitamina B12: 1355 D em tampão pH 7.1.0. Objetivos • Realizar • Realizar reação específica para detecção de proteínas (reação do Biureto). sendo a reação dependente da presença de grupos amina livres. tânico. A alteração da estrutura primária das proteínas (quebra das ligações peptídicas) ocorre por tratamento à quente (100 C) em presença de ácido ou base forte ou através de adição de enzimas proteolíticas.5 mL da solução de aminoácidos.5 mL da solução de aminoácidos. • Comparar o desenvolvimento de cor nos tubos.4. aminoácidos (reação com a ninhidrina). • Ácido tricloroacético (TCA ) 10% (P/V). ao reagir com a ninhidrina produz coloração amarela. Reação da ninhidrina: • Aquecer água à 100oC • Tubo 4 (tubo branco): colocar 2 mL da solução de ninhidrina + 0. zinco. A ninhidrina (hidrato de tricetoidrindeno) reage com aminoácidos produzindo cor púrpura. • Solução diluída de proteínas. 3. 4.2 M. prata. 4. • Solução contendo compostos de diferentes pesos moleculares (azul de dextran: 2. Reagentes • Reagente do Biureto: CuSO4 em solução alcalina.5 mL da solução diluída de proteínas. Procedimentos • Enumerar 12 tubos de ensaio 4. o que é útil na desproteinização de materiais biológicos. Reação do Biureto: • Tubo 1 (tubo branco): colocar: 1 mL do reativo do Biureto + 0. O aminoácido prolina. mercúrio) em meio alcalino formam precipitados onde a proteína atua como ânion. Determinados agentes podem ser usados na precipitação de proteínas. contém uma solução de proteínas. redissolvido em tampão? Por quê? 5.5ml do sobrenadante no Tubo 8.8. c) as proteínas de no 1. • Adicionar 1mL do reativo do biureto ao Tubo 8. 5.Você dispõe num laboratório de dois frascos idênticos.Descrever um método que permita separar a 4. não rotulados.5. Cromatografia em peneira molecular: Montagem da coluna: numa coluna de vidro (aprox. até que o gel esteja equilibrado e acamado. o outro. 4 e 6 precipitam pelo etanol gelado. podemos afirmar que a solução de sulfato de amônio saturado 4. Aplicação da amostra: aplicar 1mL da amostra sobre a superfície da coluna. • Agitar e observar. o da proteína 2 é 7.5 cm). sabendo-se que: a) as proteínas de no 1. densa.2. tentar dissolvê-lo com 1 mL de tampão. Se aparecer algum precipitado. Centrifugar à 3000rpm por 10 minutos. o das proteínas 4 e 6 se igualam a 6. 30 x 1. 2. que deverá estar com cerca de 2 cm de tampão sobre o gel. devido à presença da sacarose. • Colocar 0. Verificar o que acontece.1. Adicionar igual volume de TCA 10% (P/V). 6. 3 e 5 precipitam pelo sulfato de amônio a 40% de saturação. 5 e 6 precipitam pelo sulfato de amônio a 75% de saturação. d) os pontos isoelétricos das proteínas 1 e 3 são iguais a 6. anotando os resultados. podemos afirmar que o etanol gelado precipita todas as proteínas? Por quê? Como poderíamos comprovar isto? O precipitado obtido (após centrifugação) seria precipitado. Qual seria o seu procedimento para identificar as duas soluções e rotular os frascos? aparecimento de uma ligeira turvação). colocar o gel suspenso em tampão pH 7. separando as frações sobrenadante e precipitado. Efeito da adição de sais: • Tubo 9: Colocar 2 mL da solução diluída de proteínas + 2 mL da solução saturada de sulfato de amônio. Um deles contém 4. + 1 mL da solução diluída de proteínas. Como a amostra está mais proteína no 6 de uma mistura que contenha seis proteínas.3. separar as frações sobrenadante e precipita todas as proteínas? Por quê? Como podemos saber se esta precipitação é reversível ou não? 5. • Adicionar tampão ao precipitado do Tubo 7.Explique o que ocorreu em cada etapa executada. Questões para discussão: 5.0.5 . porém..5. deixando a extremidade inferior da coluna aberta.6. Agitar. • Centrifugar (por 10 minutos).1. b) as proteínas de no 1. 3.Pelos resultados obtidos no item 4. Continuar adicionando o tampão e acompanhar o fracionamento dos componentes da amostra.2. Efeito da adição de solventes orgânicos: • Tubo 11: colocar 1mL da solução de proteínas + 2mL de etanol gelado (lentamente até o solução de aminoácidos e. • Colocar o sobrenadante no tubo 10.7)? Por quê? 6 .Exercícios complementares: 6. • Adicionar 1 mL de tampão ao precipitado do tubo 10 e agitar.3 e o da proteína 5 é 6. adicionando sempre tampão. agitar e centrifugar novamente. • Comparar os resultados.6.4 ..Qual foi a ordem de eluição das amostras na coluna (item 4. Agitar.8 • Tubo 7 (tubo de centrífuga): colocar 1 mL de TCA 10% (P/V). esta se depositará sobre o gel. 5. Cuidado para não deixar secar o gel. . até que o gel se acame.Pelos resultados obtidos no item 4.2.7. 3- Num extrato biológico existem hormônios 6. b) a adição de ácido forte gelado e posterior neutralização do pH.4. c) Com a adição de ácido forte à quente (100oC por 2 h) e posterior resfriamento e neutralização do pH . Interprete e explique estes resultados. protéicos e isoenzimas. Que métodos não poderiam ser utilizados? . resinas cromatográficas. etanol.9 6. que devem ser isolados da maneira mais pura possível para uso posterior. Que métodos você poderia utilizar? Explique o seu princípio e como executá-lo. equipamentos cromatográficos e de eletroforese. TCA.Uma solução a 1% de hormônio anti-diurético (nonapeptídio) foi submetida aos tratamentos abaixo com os seguintes resultados: a) reação fortemente positiva para o biureto e fracamente positiva para ninhidrina. Você dispõe de sulfato de amônio. não alteraram os resultados do item anterior. a reação da ninhidrina foi positiva (fortemente positiva). As enzimas são. a atividade enzimática será detectada pelo aparecimento da coloração amarela no meio reacional. formando um complexo com estes durante a catálise: E + S ↔ ES ↔ E + P Algumas teorias procuram explicar esta para medida. estado onde a barreira energética (energia de ativação) foi vencida. 2teoria de Koshland do encaixe induzido. acontecer com qualquer outra substância encontrada no meio reacional). a concentração de substrato e de enzima no meio reacional são determinantes para a velocidade reacional. Por terem estrutura protéica. Como desenvolvidos na aula prática serão realizados com a enzima FOSFATASE. a enzima catalisará a reação de desfosforilação do para-nitrofenil fosfato. O produto formado pode ser medido diretamente através de alguma propriedade físico-química característica. o tempo de reação. 2. 3. diminuindo a energia de ativação.CINÉTICA ENZIMÁTICA 1. onde enzima e substrato seriam complementares. sendo que foram descritas algumas moléculas de RNA com atividade catalítica. Os ensaios de atividade enzimática especificidade: 1. sob a forma original. No ensaio. resultando na formação de um composto de cor amarelada em meio alcalino. As moléculas reagentes são denominadas substratos (S) e produtos (P) são formados ao final. 3teoria que propõe o perfeito encaixe no estado de transição. presente no extrato aquoso da batata inglesa. na força iônica do meio reacional podem modificá-las (ás vezes. geralmente. ou seja. através da determinação do produto formado por unidade de tempo (caso mais comum) ou através da mensuração do substrato consumido por unidade de tempo. o substrato durante a catálise se encaixa na enzima. até a estrutura dos substratos é alterada). a velocidade das reações. Introdução Enzimas são catalisadores biológicos: aceleram a velocidade das reações químicas. tais como. assim. As enzimas não alteram a esperado. alterações no pH. em geral. a concentração de substrato e a concentração de enzima. bastante específicas com relação aos substratos. em instantes iniciais. ao final da catálise. na temperatura. estrutura protéica. Diversos são os fatores que influenciam a velocidade de uma reação enzimática.teoria de Fischer (“chave-fechadura”) . em princípio. aplicando-se os princípios da fotometria. ou então fazer uma reação química com este produto produzindo apropriadas um outro que possua Uma propriedades propriedade constante de equilíbrio nem a variação de energia livre das reações. sendo regeneradas. Portanto. o para-nitrofenol. .10 PRÁTICA No 3 . Possuem. modificando. A velocidade de uma reação catalisada pode ser determinada. freqüentemente usada para tal fim é a capacidade do produto a ser quantificado de absorver determinados comprimentos de onda de radiações luminosas (o que não deve. Objetivos Avaliar o efeito de alguns fatores que interferem na atividade enzimática. Reagentes • Uma batata inglesa média (cerca de 110g). 02N.1.2.0 0.5 0.0 3.02N em cada tubo.5 0. Procedimentos • • • Enumerar os tubos de ensaio que seu grupo vai usar.11 • Substrato: para-nitrofenilfosfato de sódio 1mM (solução fresca). Homogeneizar a batata descascada em 200mL de água. Preparo de fração com atividade de fosfatase alcalina • • • • Descascar a batata.5* 0.5 0.9 0.0 3. Anote os resultados.0 3. 4.0 2. usando um liquidificador.5 Tempo após a adição de 2mL de NaOH 0.5 0. Colocar sempre os reagentes na mesma ordem em todos os tubos. agite a mistura suavemente.0 2.0 3.0 0.0 3. . • NaOH 0.0 HOMOGENEIZADO (mL) 0.0 Após 5 minutos de reação.0 3.0 HOMOGENEIZADO (mL) 0. Após adicionar o homogeneizado. Filtrar o homogeneizado em algodão.1 0. INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA TUBO 7 8 9 10 • • SUBSTRATO (mL) 3. O HOMOGENEIZADO DEVERÁ SER ADICIONADA SEMPRE POR ÚLTIMO. adicione 2mL de NaOH 0.0 ÁGUA (mL) 1. Anote os resultados. IMPORTANTE: O homogeneizado deve ser usado no prazo máximo de 30 minutos. • Liquidificador. INFLUÊNCIA DO TEMPO DE REAÇÃO TUBO 1 2 3 4 5 6 SUBSTRATO (mL) 3.02N (min) 0 2 5 10 20 30 *Adicionar 2mL de NaOH 0. 5. 5.0 2.5 1.5 0.0 2. Observe a cor desenvolvida nos tubos (7-10).0 ÀGUA (mL) 2.0 3.0 2.02N antes da adição do homogeneizado (SOMENTE NO TUBO 1) • • Observe a cor desenvolvida em todos os tubos. A incubação será realizada à temperatura ambiente. • • 5.0 3. discuta: a) o fato de ter sido obtida a mesma quantidade de produto nos quatro primeiros tubos.3.Ao estudar-se “in vitro” a cinética da reação onde a formação do produto P (fumarato).5 0. adicione 2mL de NaOH 0.5 2.0 SUBSTRATO (mL) 0.12 5.3 0.Como são fixadas as condições de dosagem de uma determinada enzima em condições ótimas? 6. que poderiam acarretar a diminuição da velocidade a partir do 20o minuto de incubação. A enzima usada (E) estava contida num homogeneizado hepático a 10g% e na tabela abaixo estão indicados os volumes deste homogeneizado adicionado a cada tubo.5 Após 10 minutos de reação.1. c) o que teria acontecido no tubo 5? TUBO 1 2 3 4 5 ENZIMA (mL) 0.8 0.0 545. um mesmo volume do mesmo extrato celular.2.A variação da velocidade de reação de uma enzima em função de sua concentração foi analisada em 5 tubos conforme o indicado na tabela abaixo. dentre aqueles analisados. (curva [S] x velocidade da reação) TUBO 11 12 13 14 15 16 • • SUBSTRATO μM 0. Pede-se: discutir os fatores. O volume final em cada tubo foi o mesmo.3.5 0.0 0. Questões para discussão: 6.0 5.0 ÁGUA (mL) 5.02N em cada tubo. INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO.0 HOMOGENEIZADO (mL) 0. a partir do substrato S (succinato) é catalisada pela enzima E (succinato desidrogenase) verificou-se que: I) não sendo possível obter-se a enzima pura. a velocidade de reação medida pela quantidade de produto formado por minuto.0 54. Com estas informações.7 4.9 1.5 0.Explique os resultados de cada item. VI) todas as observações acima foram obtidas em temperatura ótima de reação. exceto no tubo 5 que foi mantido a 0oC durante toda a experiência. . Ao final de 30 minutos de reação a quantidade de produto formado foi igual em todos os tubos.2 .5 163. III) o pH tinha sido previamente estudado e escolheu-se aquele que proporcionava o máximo de atividade enzimática. V) a partir do 20o minuto de incubação. Anote os resultados.5 3. diminuiu. Exercícios complementares 7.1 3.1.8 mL de uma solução de substrato 0.6 0.01mM. Cada tubo recebeu 0. ajustado com tampão apropriado. 6. usou-se.2 0.8 7. como seria possível aumentar a quantidade de produto formado nesses quatro tubos? 7.0 909. II) a quantidade de substrato inicial estava em ligeiro excesso.4 0. b) sem alterar o tempo de reação.5 0.5 0. sempre.Por que a enzima (homogeneizado) só deve ser adicionada por último? 6.0 272. IV) a formação de produto cresceu entre o instante zero (início da reação) até 20 minutos da reação.0 0. Observe a cor desenvolvida nos tubos (11-16).0 4. tem coloração variável entre o incolor e o amarelo (dependente da dieta. utiliza-se para a pesquisa de indispensáveis ao metabolismo. quando presentes em níveis elevados na urina. Em condições normais. ao passar pelos rins. indicam um quadro de jejum severo e prolongado ou diabetes mellitus não tratado. do trato genital e até de doenças sistêmicas. o ácido acetoacético e o ácido β-hidroxibutírico que entram na corrente sangüínea são transportados. Todavia. e carreia substâncias de excreção. A presença de glicose na urina pode ser evidenciada através da redução alcalina pelo cobre. No diabetes mellitus não-controlado. a sua excreção urinária se dá em nível detectável. as células são limitadas. combinadas. resultantes do metabolismo do organismo. devido a várias razões.13 PRÁTICA No 4 – URINÁLISE 1. Os chamados corpos cetônicos (acetoacetato. não aparece glicose na urina em quantidade detectável pelos reagentes convencionais. ocasiona a excreção do excesso de glicose na urina. para os tecidos. glicose e altas quantidades de corpos cetônicos. raramente se elevam acima de 3 mg/dL. ácido β-hidroxibutírico e acetona). quanto à quantidade de corpos cetônicos que podem oxidar. toda a glicose . dependendo das necessidades do corpo. Todo sangue. o nível plasmático de glicose pode atingir valores elevados. Introdução Os rins desempenham suas funções mais importantes ao filtrarem o plasma sangüíneo e removerem as substâncias do filtrado em quantidades variáveis. tão rapidamente. visto que. que suas concentrações plasmáticas. que são veiculados pela água. Portanto. Os corpos cetônicos são liberados do fígado e transportados até as células. reabsorção de substâncias dos túbulos renais para o sangue e secreção de substâncias do sangue para os túbulos renais. dentre as quais pode-se destacar a quantidade de oxaloacetato que é necessário para iniciar a oxidação de Acetil-CoA no ciclo do ácido cítrico. A glicose plasmática no indivíduo sadio quase nunca fica elevada o suficiente para causar a sua excreção pela urina. como. A intensidade de excreção de diferentes substâncias na urina representa a soma de três processos renais: filtração glomerular. podem aparecer na urina elementos glicose na urina o reagente de Benedict. que consiste de uma solução de sulfato de cobre em um meio alcalino. do sangue). sais e pigmentos biliares (urobilinogênio e urobilina). é filtrado ou depurado. com conseqüente excreção urinária desta ose. A análise da urina fornece valiosas informações no diagnóstico de doenças renais. atividades físicas e principalmente da ingestão de água). capaz de elevar a carga de filtração renal acima de 320 mg/minuto. neurológicos e alimentares. por exemplo: fatores endócrinos. enquanto devolvem ao sangue as substâncias filtrada é reabsorvida pelos rins. praticamente. Esta prática refere-se a dois dos exames de rotina de urina. portanto. Entretanto. A glicosúria (presença de glicose na urina) pode estar relacionada a várias causas. eliminando seus catabólitos. das vias urinárias. quando a carga filtrada excede a capacidade de reabsorção da glicose. Além disso. Um grande aumento da concentração plasmática de glicose. ao excretá-las na urina. Entretanto. Os corpos cetônicos no sangue e na urina podem atingir níveis anormais. Em condições normais. eles “depuram” as substâncias indesejáveis do filtrado (e. hepáticos. como: albumina. através dos quais é possível observar o metabolismo anormal envolvendo algumas substâncias como a glicose e os corpos cetônicos. A urina normal é essencialmente composta de água. lentamente. 4. A pesquisa de corpos cetônicos na urina é realizada através do reagente de Imbert. • deixar esfriar espontaneamente (aproximadamente 15 minutos). • 3 mL de NH4OH 10% (p/v). escorrer pelas paredes do tubo aproximadamente 3 ml de NH4OH 10%. Pesquisa de Glicose • colocar 2.5 mL de urina.Comente (sucintamente) a participação dos hormônios: adrenalina.14 extraordinariamente altos. • observar a superfície de contato entre os dois líquidos.1. • misturar e levar ao banho-maria até entrar em ebulição. • 2. deixar 2. • observar a coloração do líquido. 3. cortisol.3RESULTADOS Conceitue e diferencie (metabolicamente): “diabetes insipidus” e “diabetes mellitus” e “diabetes negativo traços cor inalterada (azul) verde-azulado ou verde renallis”. 5. 5. PRÁTICA No 5 . Este reativo é de uma solução de nitroprussiato de sódio em ácido acético glacial.2. • 1 mL de Reativo de Imbert ( nitroprussiato de sódio e ácido acético glacial).1. provocando uma condição conhecida como: cetonemia e cetonúria. Procedimentos 4.2. envolvendo as vias metabólicas e os seus mecanismos de ação. glucagon e insulina no controle da glicemia. citrato de sódio e Na2CO3).ISOLAMENTO DE DNA DE CÉLULAS DE CEBOLA . • adicionar 12 gotas do Reativo de Imbert e misturar. quanto à presença ou ausência de glicose e de corpos cetônicos. verde (qualquer tom) com precipitado amarelo castanho ou marrom vermelho tijolo positivo + positivo ++ positivo +++ respectivamente.5 mL de Reativo de Benedict ( CuSO4.Questões para Discussão positivo 5. Reagentes • 8. Pesquisa de Corpos Cetônicos • colocar 8 ml de urina em um tubo de ensaio. de tal maneira que os dois líquidos não se misturem.5 ml do Reativo de Benedict em um tubo de ensaio. • inclinar o tubo e com o auxílio de uma pipeta. RESULTADOS Nenhuma alteração ocorrida negativo Presença de um anel violeta 4.Por que em condições de jejum severo e prolongado ou o diabete melito não compensado pode acarretar uma cetonemia e conseqüente cetonúria? 5. • depositar 4 gotas de urina límpida. Objetivo Analisar amostras de urina. • Solução salina-EDTA: NaCl 0. forma-se um material insolúvel filamentoso. • Macerar a cebola com ajuda de um bastão de vidro durante 5 minutos. Os métodos utilizados para a detecção e dosagem do DNA celular nuclear de eucariontes (pois o de cloroplastos e mitocôndrias não é em geral. promovendo uma menor solubilização das moléculas de DNA. com pipeta. são largamente utilizados na solubilização de proteínas e lipídeos de membrana. Neste experimento. necessários para a ação da DNase. o DNA. contendo os ácidos nucléicos dissolvidos. O tratamento das células com uma concentração 4.pH 7. Obs: *Esta solução mantém a força iônica. . esse procedimento é realizado utilizando-se uma solução de clorofórmio/álcool misturem.5. que desnatura as proteínas e. dissolvendo o DNA. • SDS 2% (P/V).0 mL de SDS 2%. • Adicionar 1. relativamente alta de SDS resulta no rompimento das membranas celulares com a conseqüente liberação das nucleoproteínas. A adição de etanol sobre a fase aquosa. Normalmente. associado com proteínas (principalmente histonas) e dentro de organelas como mitocôndrias e cloroplastos. Objetivo Isolar DNA de células de cebola. que consistem de proteínas. 3. o DNA deve estar livre de proteínas. além de quelar íons divalentes. uma vez que o etanol diminui a constante dielétrica da água. A atividade da enzima digestiva (DNAase) será inibida pela ação do EDTA em meio alcalino − que altera pH e quela os íons divalentes necessários à ação da DNAase. Material • Cebola. • Colocar a cebola picada em um tubo Falcon de 15 mL.5 mL de solução salina EDTA. estas são retiradas da solução de DNA. que são polímeros de nucleotídeos. são formadas micelas.0).15 1. estas devem ser extraídas. 1 mM EDTA . Introdução Nos organismos eucariontes e procariontes a informação genética está localizada nas moléculas de ácido desoxirribonucléico (DNA). após centrifugação. Notar que na interface. detectado pelas técnicas rotineiras) implicam no rompimento das membranas citoplasmática e nuclear. resultará na precipitação destes. 4 mL de álcool etílico 95% de modo que os dois líquidos não se Nas técnicas de biologia molecular. lipídios e detergentes. para isto. solubilização por detergentes. iônicos ou não. • Colocar o filtrado em um tubo de vidro. Os tratamentos com detergentes. o rompimento das membranas plasmática e nuclear será realizado com o tratamento do detergente aniônico duodecil sulfato de sódio (SDS). lentamente.15 M EDTA 0. • Filtrar a solução com gaze para retirar os fragmentos de cebola. Procedimentos • Cortar 5 g de cebola (fatia fina e bem picotada). 2. • Etanol absoluto 95%. nos quais o açúcar é a desoxirribose.1 M (pH=8.Cl. • Adicionar 2. Nestes processos de isoamílico. • Adicionar. O DNA está localizado principalmente no núcleo dos eucariontes. • Solução Tris-EDTA (TE)* 10 mM Tris. 5.1 .16 • Introduzir um bastão até a região de interface. • Retirar o bastão e dissolver o precipitado a ele aderido em 2 mL da solução de Tris-EDTA. • Centrifugue a emulsão resultante a 3000 rpm durante 10 minutos. Imprimir-lhe um movimento circular e verificar que o material filamentoso irá aderir ao mesmo. adicione igual volume (2 mL) da mistura de clorofórmio:álcool isoamílico 24:1 (V/V). • A emulsão será separada em 3 camadas. e agite vigorosamente por 30 minutos.2 .Qual a função da solução de SDS? . 5. Questões para discussão: Desproteinização – (Não realizada durante a aula prática): • Após a dissolução do DNA. também. SOLUÇÃO DE DNA • A camada superior (aquosa) contém os dois tipos de ácidos nucléicos (DNA e RNA) que devem coletados para posterior utilização. suas organelas. pela técnica descrita acima.Ao romper a célula e. o DNA não seria degradado por enzimas lisossomais? 5.