Aplikasi Bioinformatika Pada Produksi Alginat

APLIKASI BIOINFORMATIKA PADA PRODUKSI ALGINATPendahuluan (dari jurnal 2) Pada jurnal ”Insight into the Binding of The Wild Type and Mutated Alginate Lyase (AlyVI) with Its Substrate: A Computational and Experimental Study”, dibahas tentang aplikasi ilmu bioinformatika dalam mempelajari dan mendesain model baru untuk pembuatan alginate lyase. Alginate lyase adalah enzim yang berfungsi untuk memecah ikatan antar alginate. Bioinformatika sebagai disiplin ilmu yang berkaitan dengan studi secara komputasional akan memiliki peran sebagai modeler atau predictor untuk pembuatan sebuah protein baru. Alginate lyase digunakan dalam produksi protoplas alga, dan juga untuk mempelajai struktur alginate dengan tujuan memproduksi produk-produk alginate dengan fungsi tertentu. Sekuens dari alginate lyase telah memudahkan dalam menganalisis fungsi-fungsi struktur dari alginate lyase tersebut. Alginat lyase dapat memisahkan eksopolisakarida (EPS) dari permukaan Pseudomonas yang berlendir. Alginat sendiri memiliki peran cukup penting dalam menstabilisasi biofilm yang terbentuk oleh Pseudomonas aeruginosa dan beberapa spesies pseudomonas lainnya. Semakin tinggi massa molekul dan muatan negative dari bakteri alginate, maka semakin viskos pula mereka. Banyak bakteria-bakteria laut seperti Pseudoalteromonas elyakovii, sphingomonas sp., Klebsiella pneumonia, vibrio sp., dan pseudomonas sp. yang dilaporkan telah memproduksi alginate lyase dalam jumlah yang sangat besar. Dan juga sudah banyak gen-gen bakteri yang memproduksi alginate lyase tersebut yang diklon dan sekuensnya diketahui. Sehingga, perkembangan mutan-mutan alginate lyase ini akan menguntungkan industry makanan, farmasi, dan medis. Contoh yang akan dibahas kali ini adalah amplifikasi dari gen alyVI yang diperoleh dari bakteri Vibrio sp. menggunakan plasmid pGEX-4T-1 untuk mutagenesis. Ikatan alginate dengan mutan dari alyVI juga dipelajari secara komputasional dan menggunakan ilmu bioinformatika. Studi ini bertujuan untuk 3. Kemudian pfu DNA polymerase yang didapatkan dari stratagene. dan Tyr-312 ke Phe-312. Sel kemudian dipanen dengan sentrifugasi 5000 g selama 15 menit. Prosedur Percobaan 1. Tyr-312 ke Ala-312. alginate. Glutatione (GSH). Asn-217 ke Asp-217. Tyr-306 ke Phe-306. dan primer oligonukleotida. Asn18 ke Ser-138. sel tersebut dikembangbiakkan dalam medium 500 ml yang mengandung ampicillin pada suhu 37°C dengan pengadukan. Material Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan adalah. Kemudian isopropyl thiogalaktosida (IPTG) ditambahkan pada konsentrasi fina. His-200 ke Ala-200. Terdapat 9 (Sembilan pasang) primer yang dibutuhkan untuk melakukan Polymerase Chain Reaction (PCR).6. yaitu pertama. GSH-separose 4B. Membran polyvinylidene xuoride yang didapat dari Milipore.meningkatkan efisiensi katalitik dari alyVI terhadap alginate dengan meetode sitedirected mutagenesis berdasarkan model komputasional (bioinformatika). Proses Mutagenesis Semua proses mutagenesis dari alginate lyase dilakukan dengan metode QuikChange site-directed mutagenesis. dpnI endonuclease yang didapat dari New England Biolabs. . dan dithiothreitol (DTT) yang didapatkan dari Sigma. Pengekspresian dan purifikasi dari AlyVI dan mutan-mutannya Ada beberapa tahapan dalam melakukan pengekspresian dan purifikasi dari alginate. 1 mM. protein AHRP yang didapat dari Transduction Laboratories. Cell pellet kemudian diresuspensi dalam larutan buffer yang mengandung EDTA. Asn-217 ke Ala-217. hingga nilai OD 600 mencapai nilai 0. 2. Kesembilan primer tersebut digunakan untuk memutagenesis sekuens berikut: Thr-136 ke Ser-136. vector pGEX-2T yang didapat dari pharmacia. sodium dodecyl sulfat (SDS). Pro219 ke Gly-219. Larutan substrat tersebut mengandung sodium alginate yang sudah diinkubasi sebelumnya. Akan tetapi. Aktivitas enzim lyase diukur secara kuantitatif menggunakan metode asam thiobarbiturat. Satu unit aktivitas enzim ini didefinisikan sebagai peningkatan absorbance sebanyak 549 nm/menit.000 g selama 20 menit. QY101 didapatkan dari database pada GenBank. Setelah proses pencucian dilakukan di dalam kolom. jumlah sekuens yang mirip dari keduanya masih rendah.Setelah diresuspensi. Kemudian lisat dari sel akan dihilangkan dengan sentrifugasi 10. sehingga perlu dilakukan alignment berulang kali menggunakan homology module oleh software Accelrys. Ekstraknya lalu akan ditambahkan secara perlahan ke dalam kolom GSH-Separose-4B. Pengujian AlyVI Segala pengujian karakterisasi secara biokimia dilakukan dengan cara meresuspensi enzim yang sudah terpurifikasi di dalam larutan buffer. Konsentras dari enzim yang dipurifikasi dapat ditentukan dengan metode SDS/PAGE. sel akan hancur dikarenakan sonikasi. Tahapan-tahapan tersebut ialah:  Konstruksi model 3D dari protein AlyVI Sekuens asam amino dari bakteri Vibrio sp.2 ml kemudian ditambahkan ke dalam larutan substrat. 4. Modelling AlyVI Dalam memodelkan AlyVI. meskipun paling mendekati. Inc. alyVI lalu dipisahkan dari kolom GSHsepharose-4B tadi dengan cara diinkubasi dalam suhu ruang selama 5 menit di dalam larutan buffer khusus elusi. Kemudian sekuens ini kemudian dimasukkan ke dalam program BLAST untuk kemudian dicari manakah alginate lyase lainnya yang memiliki sekuens sama. . Setelah itu didapat bahwa Sphingomonas sp. sehingga struktur kristalnya dijadikan template untuk membuat model protein AlyVI. Reaksi enzimatik ini kemudian dihentikan dengan memanaskan campuran tersebut di dalam air mendidih selama 5 menit. 5. Aliquot dari larutan enzim sebanyak 0. yang paling mendekati. terdapat beberapa tahapan tersendiri. dan homology modelling dilakukan dengan  menggunakan SWISS-MODEL. Molecular Docking Penentuan keadaan terionisasi dari molekul-molekul kecil dibawah kondisi fisiologis dapat diprediksi menggunakan PKATYPER (Openeye Inc. Dalam kasus ini. model 3D AlyVI dibuat dengan menggunakan metode homology modelling. dan Verify3D (SWISS MODEL server). Geometri molekul dari ligan polisakarida linear terbentuk atas 3 (tiga) α-LGuluronat. residunya. Anolea. Sementara kualitas dari model final dapat ditentukan  dari nilai B-score yang bisa dilihat pada server SWISS MODEL. Kualitas stereokimia dan parameter energetic dievaluasi untuk menentukan apakah panjang ikatan dan sudutnya berada pada range yang normal. semua keadaan ionisasi dari molekul GGG sudah diketahui. α-L-Guluronat ini diotimisasi lewat perhitungan dengan program Gaussian03. Hal-hal yang dievaluasi antara lain kualitas  stereokimianya. Jumlah kesalahan dari metode yang diberikan bergantung pada tingkat kesamaan sekuens antara template dengan targetnya. Perbaikan Model Model alyVI inisial dilarutkan di dalam air dan ditujukan untuk meminimalisasi energy untuk memperkecil jumlah interaksi sterik dan untuk mengoptimisasi stereokimianya. dan kontak-kontak atomic yang terjadi di dalamnya. . Prosall. Setiap bagian yang terionisasi disimpan (dock) dan kompleks yang paling stabil dan energy ikatannya paling rendah disimpan. Geometri molekul yang telah dioptimisasi ini digunakan untuk menghitung potensial elektrostatik dari permukaan molekul. Bagian terpenting dari homology modeling adalah memverifikasi atau memvalidasi model yang ada.Setelah dilakukan alignment.) atau pKa predictor (Schrodinger). Beberapa tahapan diperlukan untuk memperkirakan kesalahan yang ada dalam model tiga dimensinya. Model tiga dimensi yang sudah diperbaiki dan diperbaharui dievaluasi lebih lanjut secara berkala. Validasi dari Model Model homologi umumnya mengandung kesalahan dalam struktur inisialnya. Hal tersebut dievaluasi menggunakan Whatcheck. berikutnya adalah pengujian untuk interaksi yag berbeda-beda yang mungkin terbentuk di antara protein. Analisis Gugus Setelah docking dilakukan. Polisakarida ini kemudian diekstraksi dan disalin ke dalam sisi aktif dari struktur model homology alyVI. Hal ini akan menghailkan struktur awal yang memungkinkan untuk studi modeling. Setiap docking memiliki gugus yang mengandung RMSD sebesar 8x10-11. tempat ikatan didefinisikan sebagai sebuah kubah yang terpusat pada posisi inisial ligan dengan jari-jari sekitar 1x10-9 m dan mengitari situs aktif dari protein alyVI. Setelah kriteria pertama didapat. Pergerakan ligan kemudian akan berubah secara translasi. .). Pergerakan acak ini merepresentasikan perubaan orientasi dan konformasi ligan terhadap alyVI. dan torsi dan dilakukan secara acak. The Affinity/InsightII digunakan untuk meminimalisasi energy dari struktur awal. tahapan berikutnya adalah mengidentifikasi gugusgugus pada pendistribusian ligan. dilakukan dengan menggunakan cara otomatis yaitu dengan software InsightII package (Accelrys. Prosedur ini memiliki keuntungan yaitu untuk  menanggulangi penahan-penahan energy pada permukaan yang mengandung energy potensial. Inc. Identifikasi ini dilakukan dengan metode Root Means Squared Deviation (RMSD). rotasi. Di akhir.Sementara untuk proses docking dari ligan alginate (α-L-Guluronat). Ligan diposisikan di dalam sisi aktif alyVI untuk menciptakan interaksi yang tepat antara ligan dengan rantai samping residu.