UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SUBDIRECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADOAnteproyecto de tesis que presenta la Q.B.P. Martha Patricia Rodríguez Magaña como requisito para obtener el grado de Maestría en Ciencias con acentuación en Química de Productos Naturales TITULO PROVISIONAL Actividad antimicobacteriana de extractos de Juglans regia y Juglans mollis contra Mycobacterium tuberculosis intracelular DIRECTOR Dra. María Azucena Oranday Cárdenas DISCIPLINA Y CAMPO DE INVESTIGACIÓN Aislamiento y caracterización de compuestos derivados de plantas de la familia Juglandaceae con efecto antimicrobiano sobre Mycobacterium tuberculosis. LUGAR DE TRABAJO Laboratorio de Fitoquímica, Facultad de Ciencias Biológicas, UANL Laboratorio de Química Analítica, Facultad de Medicina, UANL Centro Regional de Control de Enfermedades Infecciosas, Facultad de Medicina, UANL FECHA DE INICIO. Febrero de 2009 DURACION PROBABLE. 3 años RESUMEN La tuberculosis, declarada una enfermedad de emergencia global desde 1993 por la Organización Mundial de la Salud (OMS), produce aproximadamente dos millones de defunciones al año. Mycobacterium tuberculosis, principal causante de la enfermedad, es un organismo intracelular facultativo, una vez dentro de las células, puede encontrar un medio adecuado para su crecimiento evadiendo los mecanismos inmunes antimicrobianos, por lo que es importante que en el desarrollo de nuevos agentes antituberculosos se analice la efectividad de estos contra M. tuberculosis intracelular. Esto induce a la búsqueda de nuevos compuestos con acciones antibacterianas. Dentro de la familia Juglandaceae se encuentran algunas especies como encuentran algunas especies como Juglans regia y Juglans mollis, las cuales constituyen una alternativa en el combate contra microorganismos de importancia médica, ya que estas plantas además de que poseen diversas características útiles para el hombre, son consideradas efectivas en medicina tradicional para tratar otros padecimientos infecciosos de origen bacteriano por poseer metabolitos que pueden actuar como agentes bactericidas. Por lo tanto, si se aísla, purifica y demuestra la actividad antimicrobiana de los compuestos presentes en las plantas de Nogal en estudio, sería de mucha utilidad para contribuir en la solución de infecciones y complicaciones por este patógeno. INTRODUCCIÓN La medicina tradicional es una importante fuente de información etnobotánica, en la búsqueda de compuestos con actividad biológica y farmacológica. De las 265 mil especies de plantas que se calcula habitan el planeta, únicamente se han estudiado científicamente entre 5 y 10 % en busca de actividad farmacológica. México es uno de los países que presenta una mayor diversidad biológica en el mundo, con aproximadamente 30,000 especies de plantas, lo cual representa un 10 % de la flora mundial. De las espcies de plantas presentes en México, menos de 5,000 especies han sido estudiadas fitoquímicamente, en 3,000 especies se han encontrado propiedades medicinales y a un número aún menor se le ha realizado estudios biológicos o farmacológicos (CONABIO, 2002). Recientemente, la medicina tradicional ha sido aceptada como forma alternativa en el cuidado de la salud así como para el descubrimiento y desarrollo de nuevos compuestos para el tratamiento de infecciones causadas por microorganismos con resistencia a los antibióticos. Lo anterior ha llevado a muchos investigadores a la búsqueda de actividad antimicrobiana en plantas medicinales (Nostro, et al., 2000). Las plantas medicinales y sus productos han sido utilizados a lo largo de la historia contra la tuberculosis, enfermedad infecciosa causada principalmente por Mycobacterium tuberculosis. La tuberculosis es considerada como una enfermedad infecciosa re-emergente y un problema de salud pública mundial, se estima que es la enfermedad que causa más muertes que cualquier otra enfermedad infecciosa curable y fue declarada una emergencia global desde 1993 por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (WHO, 2003). En la actualidad la OMS señala algunas prioridades para el control de la tuberculosis, en la que sobresale, la búsqueda y el desarrollo de nuevos por lo que es importante encontrar futuros agentes antituberculosos que sean efectivos contra M. tuberculosis intracelular.fármacos. Dentro de estas células. . los bacilos pueden encontrar un medio adecuado para su crecimiento evadiendo los mecanismos inmunes antimicrobianos. acortar la duración total de los mismos. mejorar los esquemas de tratamiento. así como ofrecer tratamiento contra cepas MDR-TB (WHO. Como M. y que presenten baja citotoxicidad. tuberculosis crece como un organismo intracelular que sobrevive y se multiplica dentro de macrófagos y otras células del sistema reticulo endotelial de pacientes infectados. 2003). tuberculosis intracelular. que es como se encuentra en el organismo en la fase de infección latente o en la fase activa. . tuberculosis en cultivos in vitro De acuerdo a éstos resultados se pretende probar la actividad de los extractos de Juglans regia y Juglans mollis contra M. que muestren actividad antituberculosa. Una de las opciones es la búsqueda de extractos o compuestos de origen vegetal. la micobacteria tiene la capacidad de multiplicarse dentro de los macrófagos. en ésta última fase. En estudios previos se probaron los extractos de Juglans regia y Juglans mollis mostrando una actividad inhibitoria del crecimiento sobre M. tuberculosis resistentes a los fármacos utilizados actualmente como tratamiento. por lo que se han buscado otras alternativas para el tratamiento de la enfermedad .DEFINICIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN En las últimas décadas se han incrementado los reportes de cepas de M. por lo que se pretende encontrar una inhibición del crecimiento o encontrar una actividad antituberculosa de los extractos en estas fases de infección. 3. mollis. Identificar parcialmente los grupos químicos presentes en cada extracto mediante pruebas coloridas. Obtener los extractos hexánicos de J. Determinar la citotoxicidad de los extractos de J. 5. regia contra M. Obtener los extractos metanólicos de J. tuberculosis intracelular mediante el conteo de UFC/ml. el extracto metanólico de J. mollis. regia 4. mollis 2. 6.OBJETIVO GENERAL Determinar in vitro la actividad antimicobacteriana de extractos de Juglans regia y Juglans mollis contra M. mollis. regia sobre la línea celular THP-1 monocitos/macrófagos. mollis y J. Identificar parcialmente los compuestos presentes en los extractos probados. Obtener el extracto etanólico de J. mollis y J. mollis y J. . tuberculosis intracelular. Determinar la actividad antimicobacteriana in vitro del extracto etanólico de J. OBJETIVOS PARTICULARES 1. y los extractos hexánicos de J. tuberculosis intracelular . mollis y J. regia y presentan actividad antimicobacteriana contra M.HIPÓTESIS Los extractos de J. 1 Mycobacterium tuberculosis Es un patógeno intracelular facultativo que tiene la habilidad de persistir dentro de los macrófagos y otras células del sistema retículo endotelial (SER). M. tuberculosis.ANTECEDENTES Roberto Koch en 1882 describió a M. . de tamaño y estructura única para las micobacterias. en cuyos extremos distales están esterificados los ácidos micólicos. tuberculosis como el agente causal de la tuberculosis. a la cual se le atribuye una estructura glucolípida sulfatada. son inmóviles. fig. es una bacteria resistente a ácidos y álcalis por la compleja estructura hidrofóbica presente en su pared. El complejo de la pared celular consta de tres capas: 1) capa interna. constituida por el peptidoglicano. no esporulados. Su morfología característica suele ser bacilar. con dos capas electrodensas separadas por una capa transparente. tuberculosis al igual que los miembros de éste género presentan una estructura de la pared poco común.6 μm de ancho (figura 1).2 a 0. y miden de 1 a 10 μm de longitud y 0. M. La membrana plasmática aparece en secciones ultra finas como una membrana trilaminar clásica. y 3) capa externa. compuesta por el arabinogalactano. ligeramente curvos. 2) capa media. . observándose desarrollo de colonias entre 3 y 5 semanas. La infectividad está relacionada a ciertas características de la persona. con una temperatura óptima de 37°C (Wayne. partículas de 1 a 5 µm en diámetro que contienen al bacilo. estornuda. 1986. así como también el número de microorganismos requeridos para infectar a una persona. el cual se ha estimado en menos de diez bacilos (Bloom. M. y a los factores ambientales específicos tales como una pobre circulación de aire. las cuales son diseminadas en el ambiente cuando una persona enferma tose. et al. M.. Bloom. 1994. Por esta razón sus células presentan una superficie cérea externa que le confiere propiedades importantes como resistencia a muchos antibióticos y protección contra ambientes adversos. 2002). 1994). et al. tuberculosis tiene crecimiento lento. tuberculosis es . El bacilo inhalado llega al árbol bronquial y se implantan en los bronquiolos respiratorios o en el alveolo. sin desarrollar la enfermedad y la única evidencia de un contacto previo con el bacilo o de infección.presentando algunos componentes distintivos como lipopolisacáridos. tuberculosis se transmite de persona a persona mediante la inhalación de microgotas.. et al. 1994). Una persona infectada puede permanecer así por muchos años. es la prueba positiva a la tuberculina. canta o incluso cuando respira (figura 2) (Edwards. y en una primera etapa. 1994) . Brennan. El bacilo de la tuberculosis es aerobio estricto y su crecimiento es favorecido con una atmósfera del 5-10 % de CO2. PATOGENIA fig 2 M. un macrófago alveolar (MA) ingiere el bacilo inhalado y a menudo lo destruye (Figura 3) (Kaufmann. lipoarabinomanano (LAM) lipomananos y fosfatidil inositol-monosidos. además de producir la activación de macrófagos.. además de inhibir directamente los genes que codifican para el IFN-γ. característicos de la respuesta granulomatosa. (Robbins. 2004). atrae a los monocitos de la circulación. secretando IFN-γ. 2004). 1999). ni los bacilos se causan daño (Fenton. Posteriormente. debido a que el bacilo inhibe la fusión de los lisosomas con las vacuolas fagocíticas. desarrollándose así la segunda etapa. Después de 6 a 8 semanas de la infección.capaz de sobrevivir dentro de los macrófagos.. Robbins. se afectan los ganglios regionales y se activan las células TCD 4+. ocasionando que los macrófagos no se activen. (Abbas. activándolos y diferenciándolos hacia los histiocitos epitelioides. El factor de necrosis totoral (TNF) producido por las células T y los macrófagos. los bacilos son ingeridos por otros MA y por macrófagos provenientes de la sangre. que activa a los macrófagos y aumenta su capacidad para matar a las bacterias fagocitadas. 1996). . logrando así su supervivencia y multiplicación dentro de los macrófagos (Ting LM et al. 1999. en la que ni los macrófagos del hospedero. et al. correspondiendo a una tercera etapa (Rossman. 1996). enzimas lisosomales y otros factores que matan y digieren a los bacilos tuberculosos. niveles altos de tuberculina reactiva y a la HTT licuando el tejido (Rook. el organismo desarrolla la inmunidad mediada por células (IMC). debido a las condiciones hostiles que prevalece en los focos caseosos (Smith. siendo tóxico a los tejidos por la presencia de la HTT. Esta sustancia licuada es evacuada por los bronquios y es eliminada como esputo. fig 4 La cuarta etapa se caracteriza. 2004). 1994).. 1996. produciéndose la caverna tuberculosa pulmonar (Figura 4). Los macrófagos activados liberan productos intermediarios de O2 y N2. diseminándose a otras zonas del pulmón y al ambiente (Bloom. los bacilos sobreviven sin poderse multiplicar. Robbins. y elimina un ambiente favorable para el crecimiento del bacilo. el cual es un mecanismo mediante el cual se destruyen los macrófagos no activados cargados de bacilos. 1994). la cual se caracteriza por la producción de citocinas que atraen a los monocitos/macrófagos hacia la lesión y activándolos. 3 Macrófago Alveolar La necrosis caseosa se inicia a través de una reacción de hipersensibilidad de tipo tardío (HTT). En esta caverna los macrófagos no sobreviven debido a ácidos grasos tóxicos de las células del hospedero. siendo los macrófagos ineficaces para controlar la multiplicación extracelular de los bacilos que se encuentran en la caverna (Dannenberg.et al. Mientras se lleva a cabo la HTT. . en personas no inmunocompetentes. o de algunos componentes de los bacilos. debido a la presencia de enzimas hidrolíticas.. por una lisis de la proteína semisólida coagulada. Durante la necrosis caseosa. 2003). et al. La quinta etapa puede presentarse. et al.fig. al vaciarse el absceso caseoso. pero ocurre a costo del tejido del hospedero. quinonas y a la presencia de triterpenos. 2003). Así mismo. mollis presentaron una CMI de 125 µ g/ml. se debe probablemente al contenido de compuestos no polares. et al. pinnifolia valores de CMI de 4 µ g/ml y triterpenos de C. illinoensis y J. Indicando que la actividad de los extractos hexánicos de la corteza de éstas plantas. (2003) reportó que el extracto obtenido con cloroformo de Limnophila geoffrayi mostró actividad contra M.. 50 y 100 µ g/ml respectivamente. Chamaedora tepejilote. Suksamrarn. Gu. et al. (Woldemichael. Juniperus communis y Malva parviflora. Lantana hispida. tuberculosis. encontrando para los esteroles de R.PLANTAS QUE HAN SIDO UTILIZADAS CONTRA M. tuberculosis Esteroles de Ruprechtia triflora y diterpenos de Calceolaria pinnifolia tuvieron un efecto inhibitorio en el crecimiento de M. tuberculosis. Salinas González (2004). reportó que extractos hexánicos de la corteza de Carya illinoensis.25. tuberculosis. tuberculosis. triflora valores de CMI en el rango de 2-128 µ g/ml y para los diterpenos de C. encontraron que los extractos obtenidos con diclorometano de Senecio chionophilus y extractos hexánicos de Valeriana laxiflora exhibían también actividad contra M. mollis con una CMI de 100 µ g/ml. Jiménez-Arellanes (2003) reportó que los extractos hexánicos de Artemisia ludoviciana. pinnifolia mostrando una CMI entre 8 y 16 µ g/ml. mostrando una CMI de 31. . et al.. así como el extracto etanólico de J. y extractos metanólicos de Artemisia ludoviciana y Juniperus communis inhibieron el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis. además el extracto metanólico de C. (2004) reportaron que los extractos obtenidos con diclorometano de Quinchamalium mayus presentaron actividad antituberculosa sobre M. Juglans mollis y Juglans regia presentaron actividad antimicobacteriana. . frutescens indujeron la expresión de IL-1β y la producción de la enzima óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS) en macrófagos medulares de ratones BALB/c. . 2005).. 2000). mediante una estimulación de iNOS y TNF-α en macrófagos de médula ósea de ratón.Fracciones de extractos de Chrysanthemum morifolium identificadas como triterpenoides revelaron actividad contra M. Por otra parte. y encontró actividad antimicobacterial y actividad inmunoestimuladora.. tuberculosis mostrando una concentración mínima inhibitoria (CMI) en el rango de 4-64 μg/ml (Akihisa. sino que se debe a una inmunoestimulación.. sugiriendo que tienen una actividad inmunoestimuladora. et al. y mediante ensayos de RTPCR encontró que los extractos hexánicos y metanólico de las hojas de B. (2003) analizaron la planta Pelargonium sidoides. A extractos metanólicos de Plantago major se le asoció con el aumento de la producción de óxido nítrico. favoreciendo con ello el control del crecimiento y desarrollo intracelular del agente. El extracto metanólico de Carpobrotus edulis inhibió el crecimiento de M. tuberculosis mostrando una CMI de 125 µ g/ml. 2005). pero no indujeron la expresión de IL-10. tuberculosis una vez que estaban fagocitadas por monocitos derivados a macrófagos humanos (Martins. en estudios recientes se han encontrado que algunas plantas no presentan una actividad directa sobre la bacteria. Kolodziej. Rosales Hernández (2004) reportó que los extractos hexánicos y metanólico de las hojas de Bocconia frutescens presentaron actividad directa contra M. et al. et al. así como la producción de TNF-α en macrófagos peritoneales de ratón (Gómez-Flores. et al. α frneseno y germacreno. nuez de castilla. y en el reverso con pelos suaves (Martínez. con hojas de tres a cuatro centímetros de largo de color verde claro y lisas por el anverso. oeste de Asia. y la juglona. Los frutos se encuentran en pares y la semilla en una bellota con forma ovoide. regia vive en clima templado entre los 1600 a los 2.MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL BIOLÓGICO Juglans regia L. α y β ocimeno. nogal de persa. α y β pireno y sabineno y los sesquiterpenos cariofileno.750 m sobre el nivel del mar. En los libros de herbolaria y comúnmente se le conoce como nogal de castilla. miraceno. Asociada a bosque mixto de pino-encino y de juníperos. En las . J. limoneno. linalol. 1979). betafarneseno. Clasificación botánica Reino: Plantae Subreino: Tracheobionta Superdivisión: Spermatophyta División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Subclase: Hamamelidae Orden: Juglandales Familia: Juglandaceae Género: Juglans L Especie: Juglans regia L. Descripción botánica Es un árbol que mide de ocho a quince metros de altura. De las hojas se han identificado los monoterpenos borneol. Es originaria del sureste de Europa. nuez criolla. 1987) (Figuras 7 y 8). nuez corriente. nogal encarcelado. Se localiza en Nuevo León y en el Norte de San Luis Potosí (Martínez. Tutiki (mixteco).4-naftaquinona. de la forma. β sitosterol. . 1989) (Figuras 5 y 6). el flavonoide catequina.. cumárico. color y tamaño de un limón. clorogénico. los triterpenosbetulina y ácido botulínico. Juglans mollis Clasificación botánica Reino: Plantae Subreino: Tracheobionta Superdivisión: Spermatophyta División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Subclase: Hamamelidae Orden: Juglandales Familia: Juglandaceae Género: Juglans L Especie: Juglans mollis Nombres comunes: Nogal de nuez meca. y β sitosterol. Cuartololote. Hojas compuestas de 5 a 9 hojuelas afelpadas. el alcaloide berberina. y el ácido caféico. Las nueces no comestibles. ferúlico y sinápico. El fruto contiene las quinonas juglona y 1.3´-bis-juglona y ciclo-trijuglona. Tih ti (mixteco). En la corteza la juglona y regiona. (INI. de altura. La raíz contiene las quinonas juglona. 3. de 3 a 4 cm. alcanza a medir hasta 18 m. Descripción Es un nogal silvestre que crece en áreas cercanas a ríos y arroyos.hojas y pericarpio del fruto se han encontrado los componentes ácidos caféico. . Se utilizarán frascos de cultivo con medio Middlebrook 7H9 con Tween 80 y suplementado con ácido oleico.PREPARACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD BACTERICIDA Microorganismos: Mycobacterium tuberculosis (cepa H37Rv) Activación de la cepa. albúmina dextrosa y catalasa (OADC). EXTRACCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL Se realizará una extracción con solvente polar por la técnica de maceración a temperatura ambiente con agitación. Se colectará y clasificará el material. se depositará en un matraz 30 g del material vegetal en 250 ml de metanol y se sellará bien para posteriormente colocarlos en un agitador Dual Action Shaker Lab Line. posteriormente se pesará cada planta por separado (ya seca) para realizar la extracción por maceración con un agitador a temperatura ambiente. transcurrido este tiempo se separará el solvente del extracto por filtración y utilizando el método de evaporación se eliminará el solvente. Se colocará la cepa en estudio aislada para después ser llevadas a la incubadora con agitación continua por 7 días a 37 ºC . por un periodo de 4 días. se cortará en trozos pequeños y se secará en una estufa o a temperatura ambiente a peso constante. A continuación el extracto obtenido se utilizará para la realización de la siguiente prueba microbiológica. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD TÓXICA Se preparará una solución con 40 g de sal de mar por litro de agua y se filtrará. estos se aforarán a 5ml de agua de mar. los componentes de la muestra se separaran en bandas discriminadas que pueden analizarse cualitativa o cuantitativamente. se mueven con rapidez. . En general la cromatografía es un proceso de migración diferencial en el cual los componentes de una mezcla son transportados por una fase móvil que puede ser un líquido o un gas y son retenidos selectivamente por la fase estacionaria que también puede ser un liquido o un sólido. se agregarán las larvas de Artemia salina en uno de los lados del recipiente y se cubrirán de la luz. Para cada extracto se prepararán soluciones de 1000. Aquellos componentes que son retenidos con fuerza por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil. haciéndola pasar a través de un sistema que consta de una fase móvil y una fase estacionaria. al igual que el control (agua de mar) se realizará por triplicado. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS. se succionarán larvas con una pipeta Pasteur y se depositarán 10 en cada uno de los vasos. 100 y 10 μg/ml de cada extracto. La idea básica es la separación de los componentes de una mezcla. Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. por medio de una comunicación en la parte inferior del recipiente. el agua se colocará en un recipiente pequeño. Como consecuencia de la distinta movilidad. Después de 24 horas cuando las larvas alcancen un tamaño de aproximadamente 3 mm. Se colocará una lámpara sobre el otro lado para atraer a las larvas más fuertes a la parte no expuesta a la luz. se introduce en un recipiente que contenga el solvente. La mezcla se aplica en forma continua a todo lo ancho de la placa y se eluye en la mezcla de solventes. Para calcular el Rf se mide la distancia del punto de aplicación de la muestra hasta la mitad de la mancha detectada y se divide este valor entre la distancia del punto de aplicación y el frente del eluente. se localizan la o las bandas deseadas por medio de luz . Después de eluída se deja secar perfectamente.Cromatografía en capa fina Este método es usado para la identificación y aislamiento de los compuestos. en las que el espesor de la capa absorbente es mayor. En la placa seca se colocará la muestra por medio de un capilar. Para ellos se emplean placas de cromatografía de capa delgada de mayores dimensiones. Las placas cromatográficas se prepararán. CROMATOGRAFÍA PREPARATIVA EN CAPA FINA Este método se utilizará para la separación y purificación de los componentes de mezclas difíciles de separar. Desarrollo cromatográfico: la placa en la cual se coloca la muestra a separar. Los compuestos se separan en base a las diferencias de absorción con la silica gel y en la diferente interacción que tiene cada uno con el solvente. se deja secar y se remarcan las gotas varias veces asegurándose de colocarlas exactamente en la misma posición. Se utilizan placas de 20cm x 5 mm de espesor. se dejarán secar por un periodo de una hora en la estufa a 100ºC. se aplicará sobre las placas. utilizando silica gel 60G y agua biodestilada en proporción de 1:3 respectivamente. la placa se introducirá a una cámara de vidrio de boca ancha con el eluente de diferente polaridad y mezclas de los mismos en diversas proporciones. Forma de aplicar la muestra: una gota de la muestra se coloca en la fase estacionaria (con tubos capilares). en donde el compuesto bactericida es transferido de la placa cromatografíca a una capa de agar inoculado con el microorganismo en estudio. se colocan en una caja petri estéril. se utiliza la lámpara de luz ultravioleta.ultravioleta. Posteriormente se sembrará con el microorganismo con una micropipeta distribuyéndolo uniformemente con un asa bacteriológica. Se incuba durante el tiempo necesario para el microorganismo y se observa el área sin crecimiento microbiano. LOCALIZACIÓN DE LOS COMPUESTOS ACTIVOS Bioautografía: La bioautografía se basa en la técnica de difusión en placa. con las manchas ya localizadas. Las zonas de inhibición se visualizan después de un periodo de incubación de 18-24 horas a 37 ºC En el presente trabajo se utilizará una técnica de bioautografía modificada. Se determinarán los valores promedio de los ensayos de MIC. Agentes cromogénicos: Para observar el cromatograma y localizar los componentes.5 cm. se separan las bandas del gel de silica que contienen los compuestos deseados y se extraen con metanol. que no son perceptibles en el espectro visible. Para esto se realizarán cromatógramas en capa fina utilizando placas de vidrio de 2. Para la determinación de la .0. la cual puede detectar concentraciones mínimas del compuesto responsable de la actividad biológica y se observará a simple vista la zona de inhibición. después de esto bajo el mechero se le coloca un trozo largo. angosto y de unos 3 mm de espesor de medio sólido (se coloca un algodón para recolectar la humedad del medio). se obtendrán las desviaciones estándar de la actividad biológica sobre bacterias y las diferencias se determinarán por ANOVA de un factor con nivel de significancia de 0.5 x 7.05 con el programa estadístico SPSS versión 11. Prueba de Salkowski: La muestra (1-2 mg) se colocará en 1. una pequeña cantidad de muestra se disolverá en ácido sulfúrico concentrado y se considera positiva si se observan coloraciones amarillo para flavonas y flavonoides. PRUEBAS QUÍMICAS Los extractos que presenten mayor actividad biológica se someterán a pruebas químicas con el fin de conocer sus grupos funcionales al igual que sus metabolitos secundarios que estos poseen. naranja-guinda para flavonas. desarrollando colores amarillo o rojo. Se considera positiva con la aparición de colores naranja-rojo. salina se utilizará el Análisis PROBIT para determinar la DL50. 1. rosa.letalidad en A. Pruebas para grupos Funcionales. . se le aplicará calor (60 ºC) y después unas gotas de HCl por las paredes. Prueba de Ácido Sulfúrico: Para flavonoides. rojoazulosos.0 mg de la muestra se disolverá en etanol y se le agregarán unas limaduras de magnesio. Prueba de Shinoda: Para compuestos de tipo flavonoides. Aislamiento de compuestos activos: A las fracciones que presenten actividad biológica. azul o violeta. para chalconas. se purificarán y determinará su naturaleza química. para esteroles y metilesteroles.0 ml de cloroformo en contacto con 1 ml de ácido sulfúrico. 4 ml de solución B y 100 ml de agua.Prueba de Baljet: Para sesquiterpenlactonas. persistentes por 24 horas. . Prueba de Dragendorff: Modificación de Munier y Machelobuf. se preparará una solución de permanganato de potasio al 2% en agua.5%). El reactivo se preparará mezclando 5 ml de solución A. azul. La prueba se considera positiva al producir la decoloración del reactivo. Solución B: Se disuelven 8 gramos de yoduro de potasio en 20 ml de agua. acetona o metanol y se le agregará la solución de permanganato de potasio. La prueba se considera positiva para alcaloides al dar la placa coloraciones rojas o naranjas. Solución A: Se disuelven 0. Para alcaloides. Prueba de Permanganato de potasio: Para dobles enlaces. Prueba de cloruro férrico. la aparición de una coloración o precipitado rojo. solución B) 10 gramos de hidróxido de sodio en 100 ml de agua.2 mg de muestra en agua. en una mezcla de 10 ml de ácido acético glacial y 40 ml de agua. Para oxhidrilos fenólicos una pequeña cantidad de muestra en etanol y se añade una gota de solución de cloruro férrico en agua (2. la solución A) un gramo de ácido pícrico en 100 ml de etanol. La prueba se considera positiva si se forma una coloración naranja o rojo oscuro. se disolverán 0. violeta o verde se considera positiva.85 g de nitrato de bismuto. se utilizan 2 soluciones que se mezclan en volúmenes iguales antes de usarse. Después se inclinará el tubo y se depositará por la pared 2 ml de ácido sulfúrico concentrado. La prueba se considera positiva si se forma un anillo coloreado en la interfase. Se agregarán 50 mg del compuesto carbonílico y se calienta a baño Maria por 10-15 minutos. . en un tubo de ensaye se colocará la muestra. la aparición de un precipitado naranja indica la presencia de un grupo carbonilo. El reactivo se prepara disolviendo 1 gramo de α-naftol en 100 ml de etanol al 95%. se le añadirá el reactivo de Molisch.4dinitrofenilhidracina en 1 ml de etanol caliente. se deja en reposo y luego se enfría a baño de hielo.4-Dinitrofenilhidracina: Para grupo carbonilo. (3 gotas) y se agitará. Prueba de Molisch: Para azucares.Prueba de 2. en un tubo de ensaye se disolverán 50 mg de 2. n=4 5 repeticiones. n=5 ANOVA Nivel de significancia 0.DISEÑO EXPERIMENTAL Extractos de diferente polaridad de 3 plantas y fracciones Actividad Antibacterial Ensayo de Letalidad 4 repeticiones. 5 concentraciones y control positivo y negativo. diluciones seriadas y control positivo y negativo.05 DL50 PROBIT . salina MARZO 2010 ABRIL 2010 MAYO 2010 Obtención de la CMI de los extractos activos MARZO 2009 ABRIL 2009 MAYO 2009 JUNIO 2009 JULIO 2009 AGOSTO 2009 SEPTIEMBRE 2009 OCTUBRE 2009 NOVIEMBRE 2009 DICIEMBRE 2009 ENERO 2010 FEBRERO 2010 Material vegetal seco y pulverizado Aprobar cursos Actualización en Técnicas Fotoquímicas Extracto hexánico y clorofórmico Extracto metanólico Por ciento de rendimiento de extractos Obtención de extractos activos Plantas recolectadas Identificación y depósito en Herbario UANL MES FEBRERO 2009 RESULTADOS ESPERADOS Anteproyecto de Maestría Aprobar cursos Obtención de la DL50 . salina Evaluar citotoxicidad en A.CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ACTIVIDAD Elaboración anteproyecto y búsqueda bibliográfica Cursar materias de especialidad Colecta de material vegetal Clasificación Taxonómica Preparación de material vegetal Preparación de material vegetal Cursar materias de especialidad Revisión bibliográfica Obtención de extractos con solventes no polares Obtención de extractos con solventes polares Concentración de extractos Evaluar actividad antimicrobiana Evaluar actividad antimicrobiana (CMI) Evaluar actividad antimicrobiana (CMI) Evaluar citotoxicidad en A. IR y EM Análisis de resultados de espectros Análisis estadístico de resultados Preparación de artículo en revista indexada Preparación de artículo en revista indexada Escritura de Tesis JUNIO 2010 JULIO 2010 Separación preliminar de fracciones de extractos activos Identificación de las fracciones activas AGOSTO 2010 SEPTIEMBRE 2010 OCTUBRE 2010 NOVIEMBRE 2010 DICIEMBRE 2010 ENERO 2011 FEBRERO 2011 MARZO 2011 ABRIL 2011 MAYO 2010 Fracciones activas Compuestos activos puros DL50 de compuestos puros Metabolitos presentes Obtención de espectros JUNIO 2011 JULIO 2011 AGOSTO 2011 SEPTIEMBRE 2011 OCTUBRE 2011 NOVIEMBRE 2011 DICIEMBRE 2011 Elucidación de estructuras Validación de resultados Artículo científico Tesis de Maestría Aprobada Obtención de Grado Presentación de examen .Separación por cromatografía de los extractos activos Separación por cromatografía de los extractos activos Bioautografía con bacteria CCF preparativa de extractos activos CCF preparativa de extractos activos Purificación de compuestos activos Purificación de compuestos activos Purificación de compuestos activos Citotoxicidad de compuestos activos Identificación parcial de compuestos activos Análisis espectroscópico por RMN. IR y EM Análisis espectroscópico por RMN. Yasukawa Ken. España. 2004. Antitubercular activity of triterpenoids from Asteraceae flowers. Ukiya Motohiko. Litchman A H. Inmunología Celular y Molecular. Screening of some New Caledonian and Vanuatu medicinal plants for antimycobacterial activity. Bouttier S. Quinta Edición. Pharm. Fournet A. Billo M. Waikedre J. Ethnopharmacol. Kimura Yumiko. .de grado BIBLIOGRAFIA Abbas A K. Bull. Franzblau Scott G. Microtubule-stabilizing agents: a growing class of important anticancer drugs. Cabalion P.. 28: 158160 (2005) Altmann KH 2001. Biol. Suzuki Takashi. Akihisa Toshihiro. Madrid. Zhang Fangqiu. 2005. Fourneau C. 2005. Hocquemiller R. Elsevier. Curr Opin Chem Biol 5: 424-431. 96:195-200. Okuda Hiroki. MJ Verde-Star. A. 14: 617-622. Immunoenhancing properties of Plantago major leaf extracts. Domínguez X. 1973. Immunoenhancing properties of Plantago major leaf extracts. 1996. protection. 2004. 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Elvira Garza González ______________________ Dra. Noemí Waksman de Torres ______________________ ALUMNA: QBP Martha Patricia Rodríguez Magaña ______________________ .