ANALISIS PROXIMAL DE WEENDE Y VAN SOEST INTRODUCCION Las celulas vegetales se encuentran rodeadas de una pared de celulosa y hemicelulosa, ademas de una sustancia que no es un carbohidrato la lignina. De estos tres esta formada la fibra. La fibra tiene diferente valor nutritivo para los rumiantes, dado que la celulosa y hemicelulosa presentes en la fibra por lo general son bien digeridas y aprovechados gracias a las enzimas producidas por la flora ruminal, mientras que estas mismas sustancias son practicamente no digestibles para monogastricos. OBJETIVOS . Conocer la historia y la metodologia de los diferentes analisis y el porque de su aplicación en la determinacion de los diferentes componentes existentes en un determinado alimento (fibra) METODO DE VAN SOEST FIBRA CRUDA La determinacion de la fibra cruda por el metodo del analisis proximal en el esquema de Weende, no es un metodo muy confiable para predecir y estimar la digestibilidad de los alimentos con alto contenido de fibra. HISTORIA En loa años sesenta el Ph.D. Peter Van Soest desarrollo una metodologia de analisis para forrajes que al paso del tiempo demostro ser mas precisa que la determinacion de la fibra cruda bajo el esquema de Weende. METODO VAN SOEST Bajo el esquema de trabajo de Van Soest, se obtiene dos residuos principales cuando se somete un forraje a analisis. LA FIBRA DETERGENTE NEUTRO(FDN) : A tratamiento con sulfato laudil sodico a pH neutro. Es la porcion de la muestra de alimento que es insoluble en un detergente neutro. por medio de la tecnica desarrollada por Van Soest. OBJETIVO Se determinara la cantidad de fibra detergente neutro en una muestra de forraje. FUNDAMENTO La pared celular de las celulas vegetales puede ser rota usando detergentes. Precisamente para tratar de obviar el inconveniente que supone el saber que parte de la fracción de fibra es potencialmente aprovechable por los rumiantes y que los no rumiantes pueden . como uno de los metodos auxiliares usados para estimar la calidad nutritiva del forraje. o con bajo contenido de fibra. Las críticas más duras recaen sobre la fracción hidrocarbonada (Fibra bruta y Extractivos libres de Nitrógeno). Este metodo no puede aplicarse a alimentos con alto contenido de proteina.LA FIBRA DETERGENTE ACIDO(FDA) : Cuando la solucion empleada es el bromuro de cetil trimetil amonio en pH acido. Es la porcion de la muestra de alimento que es insoluble en un detergente acido. en este caso especifico se utiliza una solucion de sulfato lauril sodico en un pH neutro. EQUIPOS Y MATERIALES REQUERIDOS Aparato digestor de fibra Crisol gooch Bomba de vacio Vaso berzelius Alargadera o extension para crisol Balanza analitica Matraz kitazato Trampa de humedad Fibra o lana de vidrio Desecador REACTIVOS Solucion detergente neutra Solucion de amilasa Acetona Sulfito de sodio anhidrido (solo para muestras de subproductos animales) Los nutrólogos consideran el análisis inmediato de los alimentos arcaico y poco exacto. cutina. proteína y ácidos orgánicos así como pectina componente normal de la pared celular que tiene una alta utilización nutritiva. en algunos aspectos no ha podido ser mejorado.encontrarse con alimentos aparentemente poco fibrosos pero que resultan de muy difícil digestión Van Soest en 1967 propuso una analítica que dividía a los componentes del alimento en tres grupos o fracciones: · Fracción muy utilizable · Fracción parcialmente utilizable · Fracción no utilizable Hirviendo la muestra de alimento en una solución detergente neutra se divide en una fracción muy utilizable que incluye al contenido celular y la pectina que son Solubles en detergente neutro (SND). a partir de la MS de la muestra. una serie de fracciones que presentan unas ciertas características comunes de solubilidad o insolubilidad en diferentes reactivos. El método fue ideado por Henneberg y Stohmann (1867) en la estación experimental de Weende (Alemania) y consiste en separar. el más conocido y. Los SND contienen lípidos. La FDN se hierve en detergente ácido con lo que la hemicelulosa se hidroliza y se obtiene un residuo denominado Fibra ácido detergente (FAD) que contiene celulosa y la fracción menos digestible (lignina. Con este método se obtienen cinco principios nutritivos brutos que incluyen los siguientes compuestos. si bien posee una utilidad relativa. sin duda. . sílice y nitrógeno no proteico). y una fracción parcialmente utilizable constituida por componentes de la pared celular insolubles denominada Fibra neutro detergente (FDN). almidón. - METODO WEENDE El análisis de Weende es. azúcares. Sustancias Extractivas Libres de Nitrógeno (SELN. mientras que la quinta (ELN) se calcula restando al porcentaje de MS las cuatro fracciones (Cnz. FB. 1. pigmentos. glucógeno.. lignina insoluble. EE). pigmentos. . lípidos complejos.. Las cuatro primeras fracciones (Cnz. PB. cutina. bases nitrogenadas. 4. Proteína bruta (PB): Proteínas. ELN): Almidón. péptidos.... vitaminas hidrosolubles. Fibra bruta (FB): Celulosa.Fracciones del analisis inmediato de los alimentos. Determinación del contenido de materia seca (MS). MELN. Extracto etéreo (EE) o Grasa bruta (GB): Grasas. aminoácidos (Aas). hemicelulosa. pectinas. ácidos grasos de bajo peso molecular.. hemicelulosa. amidas. vitaminas liposolubles. EE) se obtienen a partir de análisis específicos. azúcares. PB.. nitrógeno vitamínico. resinas. celulosa. lignina. Cenizas: Materiales inorgánicos en general 2. 5. ceras. La cantidad de materia seca (MS) que contiene un pienso o forraje destinado a la alimentación animal es un criterio esencial de apreciación tanto de su valor nutritivo como de su aptitud para la conservación.. 3. FB. productos lácteos. que no siempre sería justificable realizar. cereales hidrolizados. no es apropiada para determinar correctamente el contenido en agua y materia seca de ciertos alimentos como ingredientes ricos en azúcar. garrofas.Se pesa de nuevo el crisol con la muestra seca (T + MS) d. La MS resulta de sustraer al total... Cálculo % MS = (((T + MS) – T)/ MF) x 100 % Humedad = 100 . ácidos esenciales. tratándose de análisis laboriosos. también se pierden otras sustancias volátiles (ácidos grasos y amoníaco libres. . T). en presencia de un deshidratante o con una corriente continua de aire seco. Técnica . habría que determinar por separado el contenido en sustancias volátiles. pueden emplearse factores de corrección sobre los valores de MS obtenidos a 80 o 100ºC. Se pesa el crisol vacío en una balanza de precisión (Tara. hasta peso constante o durante 24 horas. Material (MS de laboratorio) Pesasustancias (crisoles) Estufa de desecación Desecador Balanza de precisión c. No obstante. de validez general. leche en polvo. y se colocan entre 3 y 5 g de muestra fresca (MF). ensilados. . una vez tarada.Se toma un crisol vacío de la estufa (100-105ºC). alcoholes. . se pone la balanza de precisión a 0 g con el crisol encima. se lleva al desecador (15-25 minutos mínimo). Precauciones Esta técnica.% MS e. Esto se debe a que durante la desecación a 100105ºC. En el caso de los ensilados y productos fermentados en general.a.) se recomienda obtenerla a 70ºC y 20 mm Hg de presión.) o a que ciertas reacciones químicas que ocurren durante la desecación ocasionan variaciones de peso. b.Se coloca el crisol en la estufa a 100-105ºC y se mantiene hasta que alcance un peso constante (mínimo 4 horas) o durante 24 horas. etc. el contenido en humedad. además de agua.. De hecho.Se retira el crisol de la estufa y se coloca en el desecador hasta que éste se enfríe (15-25 minutos) . a una temperatura de 100-105ºC.. Fundamento La humedad es la pérdida de peso experimentada por un alimento o pienso cuando se le somete a desecación en estufa de aire. la humedad de productos que contienen más del 5% de azúcares (melazas. % Czs Proteína bruta (PB) La Proteína Bruta o Materias Nitrogenadas Totales (MNT) se determinan mediante el método Kjeldahl que data de 1883. se determina por lo general el contenido de nitrógeno tras eliminar la materia orgánica con ácido sulfúrico. b. También se determina el nitrógeno ligado de compuestos aromáticos. desecador. Para la determinación analítica del contenido en proteína total o “proteína bruta”. Técnica .En un crisol de porcelana previamente calcinado y tarado (Tara. Cenizas a. sino también ácidos nucleicos y sales de amonio. fosfatos y sustancias minerales.Se retiran los crisoles con las pinzas adecuadas y se llevan a la estufa de 100 ºC con objeto de regular la temperatura. pirrol y oxazol. la muestra es sospechosa de contener todavía materia orgánica. c. Están constituidas por óxidos. d. balanza. así como el nitrógeno orgánico ligado de las vitaminas. Como consecuencia de su estructura a base de aminoácidos individuales. Las cenizas han de presentar un color blanquecino. carbonatos. la B2 (riboflavina) y la nicotinamida. De lo contrario. como pirazina. . tales como la B1 (tiamina). como el residuo inorgánico de una muestra que se obtiene al incinerar la muestra seca a 550ºC.T/ MF) x 100 % Materia OrgánicaMF = % MS . se colocan entre 2 y 5 g de muestra fresca (MF).25) En el tratamiento Kjeldahl de alimentos no se determinan sólo proteínas o aminoácidos libres. Posteriormente se pasan al desecador y se pesa de nuevo (T + Czs). el contenido de nitrógeno de las proteínas varía sólo entre unos límites muy estrechos (15 a 18% y como promedio 16%). . . mufla de incineración.Determinación de las diferentes fracciones del alimento por el método Weende.Se lleva a la mufla entre 2 y 6 h a 550 ºC. de forma general. ciclopentapirazina. Material Crisoles de porcelana. Fundamento Las cenizas están consideradas. calculándose finalmente el contenido de proteína con ayuda de un factor (en general 6. T) en la balanza de precisión (la cual se vuelve a colocar a 0 con él encima). Cálculos %CzsMF = ((T + Czs) . el de la hidracina. en forma de sulfato amónico. Colocar los matraces en la batería de digestión bajo campana de extracción de humos. Técnica . Anotar el gasto de ácido clorhídrico empleado (ml). Material Batería digestora y matraces Kjeldahl Aparato Kjeldahl de destilación y valoración Ácido sulfúrico concentrado Catalizador Solución de hidróxido sódico (30%) Ácido bórico con indicador Ácido clorhídrico valorado (0. por este método no se determinan el nitrógeno nítrico. pero con el mismo 0. Fundamento Al hervir una muestra con ácido sulfúrico concentrado en presencia de un catalizador. . añadir el catalizador (0. b. d. Este amoníaco es retenido por el ácido bórico y el borato amónico formado se neutraliza directamente con una disolución de ácido clorhídrico valorada y con la ayuda de un indicador de pH. Además. como por lo general los alimentos sólo contienen cantidades traza de compuestos aromáticos nitrogenados y de vitaminas.25 x 100 = ml HCl x NHCl (mol/l) x 14.1 N) c.25 . Preparar simultáneamente un matraz con un blanco (sin muestra. Digerir durante un mínimo de hora y media. ni el del grupo azo. añadir unos 60 ml de agua destilada por tubo y proceder a la destilación y valoración automática.Destilación y valoración: Una vez enfriados los tubos. Introducir en el matraz Kjeldahl.01 (g/mol) /1000 % PBMF = (1. el nitrógeno se convierte en amoníaco.No obstante. por lo cual el método es particularmente interesante y relativamente específico para la determinación de las proteínas. mientras que la materia orgánica se oxida hasta agua y CO2. a. Cálculos g de Nitrógeno x 6.401 x N x f x g) / peso en MF de la muestra NHCl = Normalidad del ácido clorhídrico f = Factor de proteína General: 6. hasta que la muestra quede del todo transparente. El nitrógeno.5 g de catalizador y 10 ml de sulfúrico). se determina agregando un exceso de sosa (NaOH) y destilando el amoníaco producido.Digestión: Pesar alrededor de 1 g de muestra fresca (MF). el cianhídrico. el error así cometido se considera despreciable.5 g) y 10 ml de ácido sulfúrico concentrado. añadir 150 ml a cada crisol junto con dos gotas de antiespumante.28 Leche y Derivados: 6. identificado. y que contenga 0. Ajustar la temperatura del aparato y mantener la ebullición durante 30 minutos. Sacar los crisoles del FiberTech y ponerlos a secar en la estufa a 100 – 105ºC durante más de 8 horas. a. .31 N Acetona Zelite (tierra de diatomeas) Iso-octanol (antiespumante) c.Se pesa alrededor de 1 g de muestra (MF) en un crisol de vidrio filtrante precalcinado. b. apagar la fuente de calor y lavar tres veces con agua destilada y una última con acetona. Fundamento La técnica determina el residuo que persiste después de dos hidrólisis sucesivas. Si la muestra posee un alto contenido graso (EE o GB > 8%). .Tras media hora.Calentar el ácido sulfúrico.). una ácida y otra alcalina. Dejar enfriar.Poner los crisoles en el desecador. En cierto modo.Calentar la solución de hidróxido sódico y agua destilada. . Colocar los crisoles en el FiberTech y ponerlo en funcionamiento. añadir 150 ml de hidróxido sódico caliente y dos gotas de antiespumante. Pesarlos (Crisol + Residuo) y colocarlos en la mufla para obtener las cenizas. Material Crisoles de vidrio filtrantes (porosidad 2) Aparato FiberTec Ácido sulfúrico 0.5 g de Zelite. intenta simular el ataque gástrico e intestinal que se produce in vivo. Una vez neutralizada la muestra.38 g = Gasto (en ml) de ácido clorhídrico en la valoración Fibra bruta (FB). las de origen animal han de contener cantidades inferiores a un 2%.Carne y Derivados: 6. parar la ebullición y lavar tres veces el residuo con agua destilada (50 ml/ lavado) y con ayuda de vacío. .26 N Hidróxido Sódico 0. se desengrasará previamente con éter etílico.3 .Introducir los crisoles en la estufa para regular su temperatura.0. Es una fracción que se encuentra únicamente en las muestras de origen vegetal. llevarlos al desecador para enfriar y pesar de nuevo (Crisol + Czs. Transcurrida la media hora de digestión ácida. . . Proceder de igual forma que con el ataque ácido y dejar hervir durante 30 minutos. Método . Cuando la solución ácida comience a hervir. Con materias de origen vegetal se hace referencia siempre a EE y no a GB ya que. ceras.))/ g MF muestra Extracto etéreo (EE) o Grasa bruta (GB). el éter extrae importantes cantidades de pigmentos vegetales.d. Cálculos % FBMF = 100 x ((Crisol + Residuo) . el éter residual del matraz se evapora en estufa (entre 1-4 horas) a 75 ºC. Estufa de desecación. Con muestras de origen animal.Tarar el matraz Soxhlet (T). aproximadamente. Posteriormente se enfría el matraz en el desecador y se pesa (Matraz + Grasa). Tras dejar airear durante 30 – 60 minutos. . . c. etc. b. Técnica . Montar la columna y poner el aparato en marcha poniendo en funcionamiento el sistema de refrigeración y el Baño María a 60 ºC. Poner éter en el cuerpo central del aparato Soxhlet hasta que sifone una vez. Fundamento Extracción de los materiales liposolubles de la muestra con éter de petróleo con pesada posterior del extracto tras la evaporación del disolvente. Introducir en él. unos 2 .Se deja sifonar repetidas veces hasta que el éter circule totalmente transparente (6 h mínimo) Transcurrido este período.Material Aparato extractor Soxhlet. d. .T)/ g MF Muestra Resultados. Éter de petróleo 40-60 ºC. Método Soxhlet a. es conveniente preceder la extracción con una hidrólisis ácida.3 g de muestra (MF).Confeccionar un cartucho de papel de filtro. Cálculos % EEMF = 100 x ((Matraz + Grasa) . Matraces.(Crisol + Czs. se recupera todo el éter del cuerpo central. Baño María con regulación de Tª. Tapar el cartucho con algodón e introducirlo en el cuerpo central del aparato Soxhlet. además de grasa. Añadir más éter sin que llegue a sifonar. sacado previamente de la estufa y puesto en desecador. ya que facilita la comparación nutritiva. se deben de calcular sobre materia seca (MS).Generalmente. la composición de los alimentos se expresa en materia seca (MS). Una vez obtenidos los resultados de los diferentes análisis (expresados sobre materia fresca (MF). Resultados expresados MF Resultados en expresados MS Muestra: % Agua % MATERIA SECA (MS) % CENIZAS (Cnz) % MATERIA ORGÁNICA (MO) % PROTEÍNA BRUTA (PB) % FIBRA BRUTA (FB) % EXTRACTo ETEREO (EE) % ELN en .