ANALISIS INSTRUMENTAL ESPECTROSCOPÍA Estudio de la interacción entre la radiación electromagnética (luz) y la materia, con absorción o emisión de la energía radiante. Espectroscopía atómica Luz se comporta como onda y partícula. Espectro electromagnético: Distribución energética del conjunto de las ondas electromagnéticas. Técnica Espectroscopía de emisión atómica Espectroscopía de absorción atómica Excitación Calor UV-vis Relajación UV-vis Calor Referido a un objeto se denomina espectro Espectroscopía de UV-vis UV-vis electromagnético o fluorescencia atómica simplemente espectro a la radiación Espectroscopía de Rayos X Rayos X rayos X electromagnética que emite (espectro de Espectroscopía molecular emisión) o absorbe (espectro de absorción) Técnica Radiación electromagnética una sustancia. Dicha radiación sirve para Espectroscopía de identificar la sustancia de manera análoga resonancia magnética Radiofrecuencias a una huella dactilar. Los espectros se nuclear Espectroscopía de microondas Microondas pueden observar Espectroscopía infrarroja Infrarrojo mediante espectroscopios que, además de Espectroscopía permitir observar el espectro, permiten Ultravioleta-visible ultravioleta-visible realizar medidas sobre éste, como Espectroscopía de la longitud de onda, la frecuencia y la fluorescencia Ultravioleta-visible ultravioleta-visible intensidad de la radiación. El espectro electromagnético se extiende desde la radiación de menor longitud de onda, como los rayos gamma y los rayos X, pasando por la luz ultravioleta, la luz visible y los rayos infrarrojos, hasta las ondas electromagnéticas de mayor longitud de onda, como son las ondas de radio. ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION 1. Molecular 2. Atómica El analito absorbe la energía transportada por un fotón pasando a un estado de mayor energía. Intensidad de fotones que pasa a través de una muestra se atenúa debido a absorción, medida = absorbancia. Instrumentación Fuente de energía • de radiación electromagnética: fuente continua: radiación dentro de una amplia gama de λ fuente lineal: emiten radiación en algunas gamas estrechas de λ • • de energía térmica: llamas y plasmas de energía química: reacciones exotérmicas Selección de λ: se intenta seleccionar solo una, para que sólo el analito absorba. • • Filtros de absorción o interferencia (no permiten selección continua de λ) Selectores monocromáticos: utiliza red de difracción o prisma que permite la variación continua de la λ que se deja pasar Slit: rendija por la que pasa la luz Slit pequeño: baja sensibilidad y alta resolución (análisis cualitativo) Slit grande: alta sensibilidad y baja resolución (análisis cuantitativo) Detectores: utilizan un transductor que convierte la señal formada por fotones en señal eléctrica fácil de medir. Lo ideal es que la señal del detector sea una función lineal de la potencia de la radiación electromagnética. Detector Fototubo Fotomultiplicador Fotodiodo de Si Fotoconductor Célula fotovoltaica Termopar Termistor Neumático Piroeléctrico Transductores de fotones Rango λ 200-1000nm 110-1000nm 250-1100nm 750-6000nm 400-5000nm Transductores térmicos 0,8-40 mm 0,8-40 mm 0,8-1000 mm 0,3-1000 mm Señal emitida Corriente Corriente Corriente Cambio de resistencia Corriente o voltaje Voltaje Cambio de resistencia Desplazamiento membrana Corriente Procesadores de la señal: La señal eléctrica generada por el transductor se envía a un procesador que la presenta de forma más cómoda para el analista. El procesador puede usarse también para calibrar la respuesta del detector, amplificar la señal procedente del detector, eliminar ruido mediante filtración o transformar matemáticamente la señal. 1. ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION MOLECULAR • UV/VISIBLE Cuando una molécula o ión absorbe radiación UV o visble sufre un cambio de su configuración de electrones de valencia. Transiciones en que un electrón pasa de un orbital ocupado a otro no ocupado σ σ* n σ* π π* n π* Los enlaces y grupos funcionales que originan la absorción de radiación UV y visible = cromóforos. Transmitancia: cuociente entre la luz transmitida y la incidente. T= P/Po x 100 se obtiene transmitancia porcentual 100%T es una sustancia totalmente transparente 0% T una sustancia totalmente opaca Ley de Lambert Beer: relación lineal entre la absorbancia (o transmitancia) y la concentración de la muestra. A=εbc A = log 1/T ε coeficiente de extinción molar: probabilidad de que el analito absorba un fotón de una energía determinada, por lo tanto depende de λ y del disolvente. En muestras con múltiples componentes las absorbancias son aditivas. Limitaciones ley L-B: - fundamentales: válida solo para concentraciones bajas de analito (concentraciones altas se pierde la independencia de partículas del analito de las demás. Las interacciones pueden cambiar el valor del coeficiente de extinción molar) - químicas: cuando las especies absorbentes participan en una reacción de equilibrio - instrumentales: válida solo para radiación monocromática. Radiación policromática produce desviación negativa. Radiación difusa (alanza detector pero no sigue el camino óptico entre fuente y detector) por espejos que guían los haces. Fuentes: dependiendo de la zona de trabajo. Esto sirve como electrodo colector (Ag). Al) en el que se deposita un material semiconductor como selenio y después se recubre con fina película de Ag o Au. (es difícil amplificar la señal de salida. Slit pequeño: baja sensibilidad. Se pueden miniaturizar y utilizar en series lineales de fotodiodos Detector de arreglo de diodos: permite detectar simultáneamente la radiación de varias λ. Al incidir radiación el semiconductor se vuelve conductor. La mitad de la luz atraviesa la muestra y la otra un blanco. Espectrómetro: utiliza un monocromador. manifiestan fatiga) fototubo: fotón incide en cátodo recubierto con una superficie fotoemisora.Lámpara H2 y D2: continua 160-380 (UV) . - . Deben ser uniformes en intensidad . La energía radiante genera una corriente en la interfase entre el semiconductor y el metal. Puede ser mono haz o doble haz (con ayuda de un chopper). elemento dispersante (prisma o red de difracción). Tubos producen pequeñas corrientes oscuras debidas a efectos térmicos Tubo fotomultiplicador: la señal se amplifica mediante el uso de dinodos en serie. Se obtiene corriente proporcional a intensidad fotónica. se crea una corriente cuya magnitud es proporcional al número de fotones que inciden. se liberan electrones y huecos +. Electrones pasan a circuito externo para recombinarse con huecos que migran hacia el metal base. alta resolución Slit grande: alta sensibilidad y baja resolución (se puede perder linealidad pq deja entrar luz policromática) Detectores (de fotones): conversión de radiación en flujo de electrones y posteriormente en corriente o voltaje en el circuito de lectura: célula fotovoltaica: Consisten en un electrodo (ánodo) de un metal (Cu.Lámpara tungsteno: continua: 320-2400nm (VIS) Cubetas: vidrio o sílice (VIS) cuarzo (UV) Monocromador: debe tener: rendija de entrada. Cada dinodo se conecta a una fuente externa de 90V generando en el colector una avalancha de 106-107 electrones por fotón incidente Fotodiodos de silicio: la absorción de la radiación electromagnética aumenta la conductividad a través de una unión pn de polarización inversa. Doble haz: se puede desdoblar haz a intervalos regulares. La absorbancia medida tiene en cuanta la tasa de absorción muestra/banco y permite corregir desviaciones en el detector y en la fuente de salida. rendija de salida. Fe. Instrumentación: Fotómetro de filtro: utiliza un filtro de absorción o interferencia.imperfecciones del selector de λ que permiten que luces extrañas se cuelen también interfieren. Rápida adquisición de espectros. Espectro IR: % transmitancia v/s número de onda (cm-1).Estequiometría de un complejo ML . Intensidad se puede expresar como transmitância o absorbancia. Está limitada por la calidad del blanco .Determinación de 2 compuestos que absorben a 2 λ distintas Evaluación: . Así observando su IR podemos saber qué enlaces hay y por lo tanto los grupos funcionales que existen en un compuesto orgánico. interferir con absorción .Determinación constante de acidez .Titulaciones fotométricas . Es fácilmente demostrable que calibrado que suponga un 2080% de transmitancia.Precisión: limitada por errores indeterminados o ruido instrumental .pH . En esta zona se consigue excitar transiciones vibracionales de la molécula: estiramientos y flexiones de los enlaces. ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL IR Región que se utiliza en espectro infrarrojo: 2500-16000nm.Factores que influyen en absorción: .Exactitud: 1-5% errores relativos. interaccionar con analito y disminuir absorción.434 * ∆T ) / TlogT ∆T: característica del instrumento Es conveniente ajusta el intervalo óptimo de transmitancia en que el error de concentración es mínimo. Cuando una molécula absorbe radiación IR.solventes: pueden absorber luz. la vibraciones molecular con frecuencia igual a la luz aumenta en intensidad.ancho slit Aplicaciones espectrometría de absorción molecular . . es decir. La frecuencia exacta de una transición para un enlace determinado va a depender entre otras cosas de la fuerza de enlace y de la masa de los átomos en los extremos del enlace. Cuando una molécula se irradia con radiación electromagnética de la zona IR.Determinación constantes de equilibrio . Mejora cuando se selecciona la λ en el máx de absorbancia o cuando se aumenta longitud del paso de luz Error fotométrico: ∆c/c= (0.Sensibilidad: equivalente a la pendiente de la curva de calibrado de ley lambert-beer. Cada molécula dará lugar a un IR diferente. el error es mínimo. el enlace de vibración absorbe energía radiante si la frecuencia de vibración es igual a la de la radiación. el enlace que une 2 átomos se estira y comprime un poco más Cada frecuencia de luz absorbida por la molécula corresponde a la frecuencia de vibración de un enlace específico. Determinación de contaminantes en el aire. En IR se puede acoplar al detector un procesador de Transformada de Fourier (FTIR): se sustituye el monocromador por un interferómetro (hace que todas las λ lleguen al mismo tiempo al detector) Aplicaciones: útil para identificar compuestos orgánicos e inorgánicos puros.Globar nicrom (carburo de silício): continua. 600-20.termopar: la radiación incide sobre la unión de 2 metales (ej Bi y Sb) la cual genera una diferencia de potencial que varía en función de la temperatura. Detectores térmicos: . La absorción de fotones infrarrojos por detectores térmicos aumenta su temperatura cambiando sus propiedades. Analisis cuantitativo menos útil que rango uv-vis. Se pueden determinar hidrocarburos totales por enlace C-H. 1-40 mm . Así se mide la absorción UV-VIS.Filamento de wolframio .Bombilla nerst (oxidos de tierras raras): continua. Si está constituido por Si se llama termistor. Detecta variaciones del orden de 10-6K.bolómetro: tipo de termómetro de Pt o Ni en los cuales cambia la resistencia en función de un pequeño cambio de temperatura.000nm Detectores piroeléctricos: Cambia la polarización en función de la temperatura generando un potencial eléctrico producido por movimiento de cargas + y – a los extremos opuestos de la superficie a través de la migración.Instrumentación Fuentes: . Se usa un material piroeléctrico como el sulfato de glicina.Laser de CO2 Constan de um sólido interte que se calienta eléctricamente a 1500-2200K y se obtiene una radiación continua. 600-20. 04-20mm . la emisión o la fluorescencia de las especies. Detectores: energía de IR no es suficiente para producir una corriente medible cuando se utiliza un detector de fotones. ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA Moléculas se atomizan hasta átomos o iones elementales en estado gaseoso. Espectro: % T v/s n° de onda (cm-1) 2. Instrumentación: .Lámpara tungsteno em IR cercano . Hay más desviaciones a ley de beer.000nm . vapor en frío (Hg) Fuente: lámpara cátodo hueco Monocromador Detector: fototubos. etc Sistema de lectura y procesamiento de la señal • Absorción atómica con llama (FAAS): Atomización: llama (cámara de aerosol. polvo) . Ionización: si hay exceso de energía se produce ionización además de atomización. disolución) . la muestra debe estar líquida y disponer de al menos 2-4 mL. H2SO4.inserción directa (sólido. Para concentrar los analitos suele recurrirse a extracción líquido-líquido. Iones interfieren. Las muestras sólidas deben disolverse en solvente adecuado. Autoabsorción: desviaciones a concentraciones altas. análisis cuantitativo. pequeña dependencia de la temperatura. Átomos absorben la radiación de átomos vecinos y no de la fuente de excitación. Análisis cuantitativo: A = KbC K: involucra eficiencia de la atomización y el paso al estado excitado (sensibilidad) b: paso a través de la llama C: concentración de átomos en la llama Se pueden analizar 67 elementos. .chisporroteo de descarga luminiscente (sólido conductor) Atomización de llama y electrotérmica requieren muestra líquida o en disolución.generación de hidruros (disolución de ciertos elementos) . si no es solublel deben digerirse usando HNO3. metal) . tubos fotomultiplicadores. o HClO4.Métodos introducción de la muestra: sometida a un proceso de preparación en que pasa a disolución orgánica o acuosa: . gases de combustión: combustible y oxidante) Ventajas: mínimas interferencias espectrales. Agregar otro elemento con potencial de ionización mayor.nebulización neumática (disolución o suspensión) . generador hidruros. electrotérmico.vaporización electrotérmica (sólido. líquido. A concentraciones bajas.ablación por laser (sólido. buena sensibilidad y exactitud Desventajas: solo metales (otros elementos forman óxidos rápidamente). Atomizador: llama.nebulización ultrasónica (disolución) .ablación por arco o chispa (sólido conductor) . • Atomización electrotérmica Se utiliza calentamiento por resistencia en lugar de por llama. LD menor. Atomizador típico: Horno de grafito: por el tubo pasa una corriente eléctrica que produce un calentamiento por resistencia. 3 fases: 1. Secado 50-200 °C 2. Calcinación 200-800°C 3. Atomización 2000-3000°C Muestras entre 5-50uL. Señal de salida: abs v/s ug/ml. Se deben utilizar patrones. • Atomización por generador de hidruros Reacción química que produce un producto volátil. Elementos como As, Se, Sb, Bi, Ge, Sn, Te y Tb forman hidruros volátiles cuando reaccionan con NaBH4 en medio ácido. Un gas inerte transporta hidruros volátiles a una llama o tubo de observación de cuarzo calentado situado en la vía óptica. • Atomización en vapor frío Sólo para mercurio. Se trata muestra con ácido nítrico y sulfúrico (Hg2+) y luego reducción del mercurio con SnCl2. mercurio elemental conducido a tubote absorción en camino óptico largo. Elección método de atomización: depende principalmente de la concentración de analito. LD menor para atomización electrotérmica, gran sensibilidad. Atomización con llama mayor precisión, menos interferencias, mayor cantidad de muestra y menos experiencia por lo tanto se elige este cuando la concentración del analito es mayor al LD, sino se utiliza la atomización electrotérmica. Selección λ y amplitud de rendija: lámpara de cátodo hueco proporciona líneas de emisión que corresponden con el espectro de absorción del analito. La sensibilidad de una línea de absorción atómica se describe por su concentración carácterística (concentración del analito que proporciona un 99% de transmitancia) en general se elige la λ que proporciona mejor sensibilidad (y que absorba solo analito y no interferente) Interferencias de matriz: se produce por el cambio en la viscosidad y densidad de la muestra con respecto a las disoluciones estándares. Hay que igualar propiedades físicas de patrones y muestras: método de la adición de estándar. Si la composición de la matriz es conocida se pueden preparara patrones de matriz idéntica. Si el fondo se debe a un componente conocido de la matriz se puede agregar un exceso de él a todas las muestras. Interferencias espectrales: cuando la línea de absorción de un analito se superpone con la línea o banda de absorción de un interferente. Absorción y dispersión se corrigen analizando un blanco. Interferencias químicas: presencia de compuestos que forman productos estables con el analito. Se pueden añadir agentes protectores y liberadores. Ionización. Estandarización método: ley de beer también se aplica pero en general no hay buena linealidad. Curvas se pueden adaptar usando ecuaciones cuadráticas y cúbicas. Lo mejor es hacer análisis cuantitativo con patrones externos, aunque las interferencias de matriz son frecuentes. A menudo se recurre al método de adición del patrón aunque tiene la limitación de que debe haber relación lineal entre absorbancia y concentración. Sensibilidad: depende de la composición de la llama y la posición. Se puede mejorar aspirando un patrón y ajustando las condiciones de funcionamiento. En atomización electrotérmica depende de las fases de secado y formación de cenizas. Para cada tipo de muestra han de establecerse la temperatura y tiempo utilizados en cada fase. Excelente selectividad. ESPECTROSCOPIA DE EMISIÓN (molecular) Relajación: analito pasa de estado de alta energía a baja energía, la liberación puede ser en forma de calor o radiación electromagnética. Fluorescencia: emisión de un fotón cuando el analito regresa a un estado de menor energía con el mismo espin que el estado de mayor energía Fosforescencia: emisión de un fotón cuando el analito regresa al estado de baja energía con espin contrario al estado de alta energía. Espectro de excitación: controlando la emisión en una λ fija y variando la λ de excitación. Permite seleccionar la mejor λ para análisis cuantitativos o cualitativos. Una molécula solo tiene 1 espectro de excitación, pero 2 de emisión (fluorescencia y fosforescencia). Instrumentación: Para fluorescencia: 2 diseños para medirla 1. Fluorímetro: las λ de excitación y emisión se seleccionan mediante filtros de absorción o interferencia. Fuente de excitación: lámpara de vapor de mercurio de baja presión que proporciona intensas líneas distribuidas por toda la región UV/VIS. 2. Espectrofluorímetros: utilizan selectores monocromáticos para λ de emisión y excitación. Fuente de excitación: lámpara de arco de Xe de alta presión con espectro de emisión continuo. Cubetas: similares a absorción óptica molecular. Ambos útiles para análisis cuantitativos, para obtener espectro de emisión o excitación solo puede usarse espectrofluorímetro. Fosforescencia: se debe discriminar entre fosforescencia y fluorescencia. Esta última tiene menor tiempo de vida, se logra retrasando la medición entre la excitación y la medición de la emisión de fosforescencia. 2 hélices controlan esto. Aplicaciones cuantitativas de luminiscencia molecular: fluorescencia (en mayor medida que fosforescencia) utilizada para análisis cuantitativo directo o indirecto. Indirecto cuando analito no fluorescente y se hace reaccionar con reactivo para formar producto con propiedades fluorescentes. También se puede medir la disminución en la fluorescencia debida al analito. Analitos inorgánicos generalmente no tienen fluorescencia suficiente. Los orgánicos muchas veces contienen anillos aromáticos que suelen ser fluorescentes. Alta selectividad. Sensibilidad depende de: rendimiento cuántico, fuente de excitación, volumen muestra. ESPECTROSCOPÍA DE EMISIÓN ATÓMICA Emisión atómica: cuando un electrón de valencia pasa a un nivel de mayor energía a uno menor. Equipo similar al de absorción atómica. Atomización y excitación La misma fuente de energía térmica suele servir también como fuente de excitación Por llama o plasma Fuentes de llama: atomización y excitación con el mismo conjunto de nebulizador y cámara de aerosol utilizado en absorción atómica. Poca utilidad (mejor plasma) salvo para el análisis de metales alcalinos y ocasionalmente calcio. Estos elementos se excitan a temperaturas relativamente bajas y dan espectros sencillos y exentos de interferencias. Debido a la simplicidad fotómetros de filtros son suficientes para las determinaciones. Dependencia con temperatura de la llama. Fuentes de plasma: plasma: gas caliente y parcialmente ionizado con concentración abundante de cationes y electrones que lo convierten en conductor. Frecuentemente se emplea plasma de argón. Elevadas temperaturas se alcanzan por el calor de la resistencia desarrollado por el movimiento de electrones y iones de argón. 3 tipos: 1. Plasma de acoplamiento inductivo (ICP) 2. Plasma de corriente continua (DCP) 3. Plasma inducido por microondas (MIP) 1. Plasma de acoplamiento inductivo: antorcha: 3 tubos concéntricos de cuarzo a través de los cuales fluye corriente de argón. Ionización de argón se inicia por medio de una chispa proveniente de bobina tesla. Iones resultantes y sus electrones interaccionan con el campo magnético oscilante producido por bobina de inducción. Esto hace que iones y electrones se muevan en trayectorias circulares; calentamiento es consecuencia de la resistencia que presentan iones y electrones a este movimiento. - circular Ar por la antorcha - se aplica radiofrecuencia se hace insignificante a altura 10-30 mm por encima del centro. Puede medir relaciones isotópicas atómicas. 3 y 4 se hacen en espectrómetro de masas.una chispa produce electrones libres en argón . deriva del instrumento del 5-10% por hora. Separación de iones según masa/carga 4. . Etapas: 1. Atomización 2. forma más fácil es obtener espectro de emisión de la muestra y después buscar una línea de emisión del analito que proporcione señal intensa y que se encuentre separada de las demás líneas de emisión.se aceleran electrones en la antorcha causando más ionización . Puede programarse selector monocromático variable para que se mueva rápidamente entre λ. Interferencias químicas: se disminuyen añadiendo agentes protectores. Se utilizan nebulizadores (con corriente de argón) gotitas se introducen en plasma. Desventajas: caro.la muestra atraviesa la antorcha Se puede hacer análisis multielemental: porque todos los analitos se excitan al mismo tiempo. donde se hacen las mediciones. ESPECTROSCOPIA DE DISPERSIÓN ESPECTROMETRÍA DE MASAS ATÓMICA Muy utilizada para identificar elementos presentes en muestras de materia y determinar sus concentraciones. Ventajas: mejores LD. Selección fuente de atomización y excitación: mejor plasma Selección λ: (harta interferencia por superposición). Estandarización método: intensidad de emisión proporcional a la población del estado excitado de la que se origina la línea de emisión. Recuento del número de iones de cada tipo o medida de la corriente iónica producida cuando iones inciden en detector. O se puede usar un aparato de canales múltiples que permita controla de forma simultánea muchos analitos (red de difracción con 48-60 rendijas de salida separadas y detectores colocados en disposición semicircular alrededor de la red de difracción) Introducción de la muestra: mediante flujo de argón a través de tubo central de cuarzo. Interferencias espectrales: más importantes son una fuente continua de emisión de fondo a partir de llama o plasma. liberadores y supresores de ionización.. Conversión de una fracción significativa de átomos en iones (generalmente +) 3. espectros sencillos únicos y fácilmente interpretables. 1 y 2 igual que en espectroscopía atómica. de doble enfoque Componentes de espectrómetro de masas Fuente de iones gaseosos Entrada Analizador de masas Detector iones Procesador La función del analizador de masas es análoga a la de un monocromador. Bandas opuestas se conectan elléctricamente. plasma de corriente continua (DCPMS). El detector convierte el haz de iones en una señal eléctrica que pueda ser procesada. fuente de chispa (SSMS). Espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICPMS) Bajo limite de detección. Iones que alcanzan el detector tiene suficiente energía como para expulsar electrones desde la primera zona del dispositivo. Se aplican a cada par de barras potenciales variables de corriente alterna de radiofrecuencia. que están desfasados 180 grados. Analizador de masas cuadrupolar: más común. su relación masa/carga y la magnitud de la señal de corriente alterna y continua. Componentes requieren bajas presiones (salvo procesador). descarga luminiscente (GDMS).Canales multiplicadores de electrones: similar a fotomultiplicador. Espectrómetro de masas: separa los inoes que se desplazan rápidamente según su relación carga/masa.cuadrupolar . ionización térmica(TIMS). Detectores: .de tiempo de vuelo . Iones producidos en la antorcha se introducen a través de interfase de vació diferencial unido a un espectrómetro de masas cuadrupolar. 4 barras paralelas que actúan como electrodos. alto grado de selectividad y su razonable buena precisión y exactitud lo han hecho muy importante para el análisis elemental. Se obtienen espectros .Distintos tipos de espectrometría de masas: plasma de acoplamiento inductivo (ICPMS). plasma por inducción de microondas (MIPMS). ión secundario (SIMS). microonda láser (LMMS). La dispersión se realiza en función de la relación masa/carga de los iones del analito. Antorcha de ICP sirve como atomizador y ionizador. capaces de proporcionar ganancias de corriente elevadas y tiempos de respuesta de nanosegundos. . Cada dinodo se mantiene a un potencial más alto que el anterior.Copa de Faraday. El que un ión choque o no contra la barra depende de la velocidad del movimiento del ión a lo largo del eje z-y. Se introduce muestra por nebulizador. Son robustos y fiables. Elevada velocidad de barrido. Cátodo y los dinodos tienen superficies de Cu/Be de las que se emiten ráfagas de electrones cuando son alcanzados por los iones o electrones de alta energía. 3 tipos más corrientes . almacenada y registrada de alguna forma. Análisis cuantitativos: el más utilizado emplea un conjunto de patrones de calibración para preparar curva e calibrado. las inestabilidades y los efectos de matriz. . Para concentraciones elevadas de elementos de matriz se intenta igualar los elementos presentes en la matriz de las muestras con los patrones. Patrón interno (elemento ausente de las muestras y que tiene una masa atómica y un potencial de ionización próximo al de los analitos) para compensar la deriva del instrumento.sencillos que se utilizan para determinación cualitativa y cuantitativa (por curvas de calibrado en que se representa el cuociente entre el recuento de iones para el analito respecto del recuento para un patrón interno en función de la concentración). Un patrón único en disolución acuosa adecuado si muestra problema esta lo suficientemente diluida (<2000ug/ml) de sólidos disueltos totales. CROMATOGRAFÍA Eficiencia cromatografía: Resolución: separacion de 2 picos cromatográficos ∆ t = tR2 – tR1 Factor de capacidad (k´) : Medida de la fuerza con que la FE retiene el analito K´= t´R/tm Factor de selectividad (α ) : Selectividad relativa de la FE para un par de analitos α = k´1/k´2 Al comenzar una separación cromatográfica el soluto ocupa una estrecha banda de anchura finita. A medida que el soluto atraviesa la columna la anchura de su banda va . en las que tiene lugar el reparto entre las fases móvil y estacionaria. Difusión longitudinal: una contribución al ensanchamiento de la banda debida a la difusión del soluto desde las áreas de mayor concentración a las de menor concentración. Factores que contribuyen al ensanchamiento de banda: (altura del plato se establece a partir de 4 contribuciones: 1. Capacidad del pico: número máximo de solutos que pueden separarse en una columna dada. . Transferencia de masa: una contribución al ensanchamiento de la banda debida al tiempo necesario para que un soluto se desplace desde las fases móvil o estacionaria a la interfaz entre las dos fases.auementando. o platos. 2. Así moléculas inyectadas al mismo tiempo se mueven con tiempos distintos. 3 y 4. La eficacia de una columna mejora con el aumento del número de platos teóricos o con la disminución de la altura del plato. Ecuación de Van Deemter: ecuación que demuestra el efecto de la velocidad de flujo de la fase móvil sobre la altura de un plato teórico (cuenta los 4 factores antes mencionados). Plato teórico: medio cuantitativo para evaluar la eficacia de una columna y que consiste en tratar la columna como si estuviera compuesta de pequeñas zonas. Difusión en remolino: moléculas en disolución que atraviesan una columna cromatográfica siguen remolinos distintos de longitud variada. La eficacia de la columna proporciona una medida cuantitativa de la magnitud del ensanchamiento de banda. polidimetil siloxano ligeramente polar. Las fases de polaridad intermedia separan los compuestos de acuerdo a la temperatura de ebullición y a la interacción de los dipolos inducidos o a los puentes de hidrógeno. baja volatilidad. cobre o aluminio. polaridad adecuada. Ar. Da selectividad. Las fases . acero. térmicamente estable. Debe ser químicamente inerte. (ej escualeno no polar. Se llena co soporte sólido en forma de partículas (tierra datomeas) • capilar: FSOT: columna cubierta de sílice fundida recubierta con polímero protector WCOT: columna abierta de pared recubierta (fina capa de fase estacionaria que reviste pared interna de capilar) SCOT: columna abierta recubierta con soporte (sobre pared interna existe fina capa de sorte sólido revestido por fase estacionaria líquida) Fase estacionaria: depende de lo que se quiera separar.CROMATOGRAFIA DE GAS Cromatografía gas-líquido: Fase móvil: gas inerte (He. se puede aumentar polaridad cambiando sus grupos metilo) Problema común a fase estacionaria líquida: sangrado (tendencia de la fase estacionaria a eluir de la columna). polietilenglicol polar. polar apolar. límites de temperatura disminuyen esto Separación mejor cuanto más fina es la película de fase estacionaria (para solutos muy volátiles hay que usar películas más gruesas) ELECCIÓN DE LA COLUMNA: • Polaridad: Las fases móviles no polar separan los compuestos basados principalmente en sus temperaturas de ebullición. N2) Columna: empaquetada o capilar • Empaquetada: de vidrio. De esta forma.25 . Estabilidad térmica de columnas Polares y Apolares. Detectores: Detector Límite de Rango detección g lineal TCD 10-5-10-6 103-104 FID ECD NPD MSD 10-12 10-14 10-8-10-14 10-12 Comentarios Tratamiento analito No destructivo Destructivo No destructivo Destructivo Destructivo Detector universal 6 7 10 -10 Detector universal 2 3 10 -10 Detector selectivo 5 7 10 -10 Detector Selectivo N.P Según tipo Detector detector universal TCD: detector de conductividad térmica (helio como fase móvil). 0.1-1%) Sin divisor: permite paso de más muestra (columna empaquetada) En columna: para muestras termolábiles Control de temperatura: columna se encuentra en horno con termostato.• • • • • • • • móviles polares y altamente polares retienen los compuestos polares debido a la interacción dipolo-dipolo entre los grupos funcionales de la muestra y de la fase estacionaria. ceras). Generalmente. tiempos de retención muy largos para solutos con mayor punto de ebullición. Espesor del film. triglicéridos. se soluciona con hornos de temperatura regulable. 3 -5 µ m: gases. 0. Inyector: Con divisor: solo entra pequeña parte de la muestra a la columna capilar (0. los compuestos se produce interacción con la fase estacionaria y se retarda la elución. solventes y compuestos de temperatura de ebullición cercana a la ambiente. a medida que la polaridad de una columna aumenta.1. Ventajas: universal (señal para cualquier analito). su respuesta a las concentraciones de soluto es lineal en . se aumenta la temperatura). favoreciendo interacción de solutos con fase estacionaria (problema.0. ligeramente por debajo del punto de ebullición más bajo de los solutos. Por regla general debería usarse film delgados para compuestos con temperaturas de ebullición altas y film mas gruesos para compuestos que eluyen rápidamente. a medida que separación progresa.1 µ m: son ideales para compuestos de alto peso molecular y que eluyen sobre los 300 oC.5 µ m: muestras que eluyen sobre los 300 oC (esteroides. 1 . Separación isotérmica: T constate.5 µ m: muestras que eluyen entre 100 a 200 oC. la estabilidad térmica disminuye. que un sistema sensible a concentración. Solutos Que eluyen pasan directamente a la cámara de ionización del espectrómetro de masas. MSD: espectro de masas. Excelente LD pero respuesta lineal abarca solo 2 órdenes de magnitud. NPD: ionización de llama alcalina: responde a compuestos que contienen nitrógeno o fósforo. Igual el volumen puede diferir en 5% o más. alcoholes e hidrocarburos. El detector responde al número de átomos de carbono que entra en el detector por unidad de tiempo por ello es más un detector sensible a la masa. ECD: detector de captura de electrones: fase móvil N2. Desventajas: muestra se destruye.un amplio rango. halógeno y amina). respuesta lineal. Desventajas: peores LD (imposibilita la utilización en columnas capilares debido al pequeño tamaño de muestras) FID: detector de ionización de llama. Importante para detección de contaminantes clorados. Una mejor opción: área bajo el pico. bajo ruido. Mientras volumen inyectado sea igula en patrones y muestras la curva de calibración proporcionará resultados exactos y precisos. Selectivo para solutos con grupos halógenos o nitro. Insensible para aminas. Ventajas: LD. detector para muestras ambientales y acuosas. . El espectro de masas proporciona información cualitativa que permite identificar el analito. Número de iones que se produce es relativamente roporcional al número de átomos de carbono reducidos en la llama. No producen señal los grupos carbonilo ni carboxilo (ni alcohol. que es directamente proporcional a la cantidad de analito inyectado. Aplicaciones cuantitativas: la altura o área del pico cromatográfico permiten determinar su concentración. no destructivo. Altura fácil de medir pero utilidad limitada por la relación inversa ente altura y anchura del pico. Curvas de calibración suelen hacerse analizando una serie de patrones externos y representando la señal del detector en función de concentraciones conocidas. Para trabajos en los que se require de gran exactitud y precisión se efectúan usando un patrón interno (corrige variaciones entre una inyección y otra). 300. • Índice de retención de Kovats Es una relación lineal-logarítmica entre el volumen de elución y el número de carbonos. etc. También se pueden usar tablas con tiempos de retención de patrones pero está limitado porque las condiciones nunca son iguales. El índice de retención para otros tipos de compuestos se define por la ecuación: I = 100z + 100 log (t´Ri/t´Rz). flujos.Aplicaciones cualitativas: cuando se usa como detector un IR-TF o un espectrómetro de masas la información espectral disponible se emplea para identificar solutos individuales. la temperatura. 200. El índice de retención para los compuestos que no son alcanos normales varía según las condiciones cromatográficas./log(t´Rz+1/t´Rz) α zi = t´Ri/t´Rz . 500 etc. Por ejemplo hacer una adición de patrón a la muestra añadiendo una alícuota del presunto analito y buscando un aumento en la altura del pico. El índice de retención para un alcano normal es igual a 100 veces el número de átomos de carbono del compuesto independiente del relleno de la columna. Solución: Indice de retención de Kovat: método para normalizar los tiempos de retención de un soluto con los de alcanos normales. El índice de Kovats I definido para todos los n-alcanos en cualquier conjunto de condiciones y para cualquier columna es: • • • • I C2H2z+2 = 100 z Los valores del índice para los alcanos son 100. Con los detectores convencionales no espectroscópicos hay que recurrir a oros métodos. 400. controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia fuera de un cilindro.5% relativo 5.1-4.CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN De las técnicas más utilizadas (no tiene la limitación de que las muestras sean térmicamente estables y fáciles de volatilizar como en cromatografía de gases). . el reparto liquido-liquido. Bombas recíprocas: son las que se usan en un 90%. Intervalo de caudales de 0. Generaciones de presiones por encima de 6. La separación se efectúa gracias a las interacciones de las fases soluble y estacionaria. Se empaquetan con partículas de sílice poroso. 40. y las interacciones entre las fases soluto y móvil.1 a 10 ml/min 4. el intercambio de iones y la exclusión por tamaño.00060. Dos válvulas que se abren y cierran alternativamente.sólido. Flujo libre de pulsaciones 3. Como consecuencia de estas elevadas presiones se requiere un equipo más sofisticado.000 psi 2. Ventajas: pequeño volumen interno. fácil adaptación a la elución con gradiente y sus caudales constantes. componentes resistentes a la corrosión (acero inox o teflón). En HPLC: una muestra líquida o una muestra sólida disuelta en un disolvente adecuado se hacen pasar por una columna cromatográfica junto con una fase móvil líquida. Disolvente es impelido por el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor de arrastre. Columnas: más utilizadas de acero inoxidable con diametro interno de 2. Desventaja: producen flujo pulsado que debe amortiguarse. Control y reproducibilidad del caudal mejor del 0. Requisitos para un sistema de bombeo: 1. El disolvente está en contacto directo con el pistón. Controlador de gradiente • Bomba Inyector Fases móviles Columna Detector Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamaño de partícula entre 2 y 10 um se requieren presiones de algunos cientos de kg-fuerza por centímetro cuadrado. altas presiones de salida.6mm y longitudes entre 30-300mm.000 platos teóricos. tales como la adsorción liquido. 5. Introducción muestra: imposible inyectar la muestra como en GC por las altas presiones. . En posición de carga el bucle está separado de la fase móvil y abierto a la atmósfera. y las que no hayan reaccionado se cubren con Si(CH3)Cl. Detectores HPLC: .fase inversa: soluto más polar eluye primero. Se usa un bucle de inyección. Si se aumenta polaridad de fase móvil se prolonga el tiempo de retención. Partículas capaces de ocluir la columna deben ser filtradas. Mezclando 2 o varias fases móviles puede obtenerse una polaridad intermedia. Cromatografía de fase normal: fase estacionaria polar y fase móvil no polar Cromatografía de fase inversa: fase estacionaria no polar (C8. Una vez cargada se gira el inyector.en fase normal: soluto menos polar eluye primero. Se introduce muestra en interior con jeringa (lo que sobra a desagüe). Fases estacionarias: (liq-liq) película líquida que reviste material empaquetado. acetonitrilo. Se une mediante enlaces covalentes a las partículas de sílice (reacción con organoclorosilano. Fases móviles: el orden de elución de solutos depende de la polaridad. la fase móvil pasa a través del bucle y arrastra a la muestra a través de la columna. El uso de una fase móvil menos polar alargará los tiempos de retención (mejora separación si una separación es mala pq los solutos eluyen muy rápido) . Propiedades de fase estacionaria depende del grupo alquilo R del organosilano. THF se usan en disolventes para cambiar tiempo de elución) Elución isocrática: uso de fase móvil cuya composición permanece constante durante la separación Elución en grandiente: cambio de la composición de la fase móvil a lo largo del tiempo (para esto hay varios depósitos de fase móvil). C18) fase móvil polar (mas habitual) Sustrato de sílice se hidroliza en soluciones básicas por lo tanto pH de fase móvil debe ser menor a 7.Guarda columna: para proteger columna del matrial que la ocluya o solutos que se forman irreversiblemente a la fase estacionaria. Para mejorar la separación también se puede modificar pH. metanol. variar uno o más de los disolventes de la fase móvil también (ejemplo agua. Elección de la fase móvil: útil el índice de polaridad. Hay que desgasificar solventes de fase móvil con bomba de vacío o purga con gas inerte como el He. Si R es polar fase estacionaria será polar. Disolvente se mueve por las bombas mencionadas antes. Detector LD Ultravioleta 0. son fiables y no dependen del caudal. Responden a casi todos los solutos (universal). Los detectores más sencillos utilizan fuente de excitación de mercurio y 1 o más filtros para la radiación emitida. Los más sofisticados consisten en fuente de radiación de xenón y emplean monocromador en red para aislar la radiación fluorescente.1 . estructural que puede ayudar a identificar el analito. Aplicaciones cuantitativas: cálculos.01 . Cromatorama: absorbancia en función de tiempo de elución.0. Buena sensibilidad porque no todos los compuestos son fluorescentes. La fluorescencia se detecta por detector fotoeléctrico colocado perpendicular respecto al haz de excitación. Detector de arreglo de diodos: registran la totalidad del espectro proporcionando un cromatograma tridimensional que muestra absorbancia en función de λ y tiempo de elución.1 Infrarrojo de transformada de Fourier 1000 ¿útil con gradiente? si no no si no si si Detector UV/VIS: el más utilizado porque muchos solutos absorben dicha radiación.1 Indice de refracción 100 . LD: 100pg-1ng de analito inyectado (mejor fluorescencia) Limitación: fase móvil no debe absorber a λ elegida. no son tan sensibles.1000 Electroquímico (amperométrico) 0. Proporciona información cualitativa. Detectores de fluorescencia: semejantes a fluorómetros y espectrofluorímetros. El desplazamiento del haz con respecto a superficie fotosensible del detector provoca señal la cual una vez amplificada y registrada proporciona el cromatograma. Detector por espectrometría de masas: problema: enorme contraste entre los volúmenes relativamente grandes de disolvente de cromatografía y los requerimientos de vacío de la espectrometría de masas.01 Conductividad 0.5 . El sistema más simple emplea emisión a 254 nm de una lámpara de mercurio y detección de una sola λ.001 . pero son muy sensibles a cambios de temperatura. más fácil que GC ya que inyección se hace con bucle de inyección de volumen fijo así las variaciones en cantidad de muestra se reducen al mínimo y se pueden utilizar patrones externos y curva de calibración normal. También se utiliza lámpara de deuterio y un monocromador para mediciones a λ variable. Para resolver esto se han desarrollado varias interfases.1 .1 Espectrofotometría de masa 0. Detectores de índice de refracción: disolvente en su camino hacia columna pasa a través de una mitad de la cubeta y el eluyente de la columna pasa por la otra mitad. Los dos compartimientos separados por una placa de vidrio montada en ángulo tal que si las 2 disoluciones difieren en índice de refracción se produce una desviación del haz incidente.1 Fluorescencia 0. EVALUACION: . tiempo y costo. carboxílico –COOH . sensibilidad. sales insolubles de metales polivalentes. Ofrece ventaja (vs cromatografía liq-liq) solo para análisis de isómeros. sílice o aluminio. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IONICO: Fase estacionaria: resina polimerizada mediante enlaces cruzados.la precisión de HPLC es mejor gracias al bucle de inyección . zeolitas sintéticas Intercambiadores iónicos orgánicos: .Sintéticos: óxidos metales hidratados. exactitud. isooctano.resinas catiónicas (ác. NR2 (1. Fase móvil suele ser disolvente no polar o moderadamente polar (hexano. sales insolubles de heteropoliácidos.resinas aniónicas (base fuerte): grf sal de amonio cuaternaria R4N+ . Muestran selectividad por iones metálicos.Las columnas capilares de GC tienen más platos teóricos lo que proporciona mayor poder de resolución para matrices complejas. Los contraiones de estas cargas fijas son móviles y pueden ser reemplazados por iones que compiten por unión. 4 tipos de resinas: . -NHR. fuerte): grf ác. se pueden analizar más compuestos que en GC. débil): grf AC. Los átomos más frecuentes son S. arcillas minerales y feldespatos . Cromatografía de adsorción líquido-sólido: fase estacionaria es un adsorbente sólido (empaquetado de columna sirve de fase estacionaria.HPLC no se limita a analitos volátiles. cloruro de metileno). habitualmente poliestireno con enlaces cruzados de divinilbenceno unidos covalentemente a grupos funcionales iónicos. sales complejas basadas en hexanofierratos. . sulfúrico –SO3H .resinas aniónicas (base débil): grf -NH2. Regeneración columna: iones unidos a grupos funcionales de fase estacionaria se pueden eluir por compuestos que compitan (ác o bases que regeneren el H)l Intercambiadores iónicos inorgánicos: . 3 respectivamente) * resinas quelantes: el gruop funcional es el quelante o complejante.resinas catiónicas (ac. O. de fluorescencia y electroquímicos) no son tan universales como los detectores de ionización de llama utilizados en GC.Naturales: aluminosilicatos como zeolitas. La cromatografía líquida puede usarse para una gama mayor de compuestos sin embargo los detectores más utilizados (UV. selectividad. precisión. Son caras y reaccionan lentamente. N. 2.volúmenes de inyección suelen ser significativamente mayores en HPLC que en CG dada la mayor capacidad de las columnas de HPLC . polar). que forman en laces de coordinación con los metales. pero sólo para analitos volátiles o que puedan hacerse volátiles por derivación adecuada. La GC con columnas capilares proporciona rápidas separaciones con una resolución excelente.Las diferencias entre cromatografía gaseosa y HPLC son escasas en cuanto a escala de operación. P. . que es proporcional a su tamaño.Naturales: celulosa. muestras clínicas. Sin embargo la elevada concentración de iones de la fase móvil es un problema porque los iones de esta fase son los dominantes en la conductividad. Límite de inclusión: soluto más pequeño que puede separarse de otros solutos. entre la columna analítica y el detector se coloca una columna supresora de iones que elimina selectivamente los iones electrolitos de la fase móvil sin eliminar los iones del soluto. azúcares. agarosa . El detector más utilizado mide la conductividad de la fase móvil a medida que eluye de la columna. productos farmacéuticos. En instrumentos de HPLC se puede sustituir columna por una de intercambio iónico. aminoácidos. Por ejemplo si la fase móvil es HCl acuoso la columna supresora tiene resina de intercambio aniónico. quitina. estabilidad en todo el rango de pH y temperatura. La selectividad depende en cierta medida de si la resina tiene un lugar de intercambio fuerte o débil y de la magnitud de los enlaces cruzados Fase móvil: suele ser un tampón acuoso cuyo pH y composición iónica determinan el tiempo de retención del soluto. Para disminuir al mínimo la contribución de la fase móvil a la conductividad. física. Si los iones del soluto absorben radiación UV/VIS podrá utilizarse un detector uv-vis. etc. Las que no absorben pueden detectarse indirectamente cuando la fase móvil tiene especies que absorben: se mide la reducción de la absorbancia cuando el soluto pasa por el detector. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSION POR TAMAÑO Base de la separación es la capacidad del soluto de penetrar en los poros del empaquetamiento de la columna. Es posible realizar elusiones en gradiente en que la fuerza iónica o el pH de la fase móvil cambian con el tiempo. Se exige que la exclusión por tamaño sea la única interacción entre soluto y fase estacionaria.Sintéticas: matriz polimérica reticulada por la acción de un agente entrecruzante y derivatizada con grupos inorgánicos que actúan como grupos funcionales. Para esto se desactivan las partículas de sílice y las resinas de polímeros se sintetizan de forma que no posean lugares de intercambio. dextran. todos los solutos de mayor tamaño eluyen juntos Entre el límite de inclusión y el de exclusión. Son los más habituales en aplicaciones de intercambio iónico en la industrial. . todos los solutos de menor tamaño eluyen juntos. nucleótidos.. Límite de exclusión: soluto más grande que puede separarse de otros solutos. La mayoría basada en la estructura estierno-divinilbenceno por su buena resistencia química. Las resinas de intercambio iónico se introducen en columnas de HPLC como perlas de polímero poroso o recubriendo con ellas las partículas de sílice porosa. cada soluto pasa en el espacio poroso en un cierto tiempo. Util para análisis de: proteínas. quitosano. aunque no tan buenos como GC. Instrumentos: similar a HPLC o CG. fácil eliminación desde solutos. En HPLC se puede sustituir la columna por una de exclusión por tamaño. En estas condiciones la fase móvil no es ni gaseosa ni líquida sino que está constituida por un fluido supercrítico de propiedades intermedias entre la de los gases y líquidos. Presión: tiene un marcado efecto en el factor de capacidad k’. baja reactividad. este efecto es una consecuencia del aumento de la densidad de la fase móvil . Fase móvil más utilizada: CO2 por: Tc= 31°C Pc= 72. Fase móvil: es un gas que está a una presión y temperatura que superan su punto crítico. La única adición importante ES um limitador de presión para mantener la presión crítica. no tiene olor. no corrosivo. El tiempo de análisis y la resolución. bajo costo.9 atm (1071 psi) Baja toxicidad. suelen ser mejores que los obtenidos con HPLC convencional. CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS Útil para algunas muestras que no se pueden separar por GC ni HPLC. Las elusiones en gradiente se logran cambiando la presión a lo largo del tiempo. • • • • Viscosidad: similar a la de los gases: mejor difusión (se mueven por columnas sin necesidad de aplicar presión como en HPLC) Baja tensión superficial: penetrabilidad Densidad: similar a líquido: buenas propiedades disolventes Alta difusividad: mayor transporte de masa Por lo tanto fase móvil se comporta más como fase líquida de HPLC que como la gaseosa de CG. no contamina. Es un buen disolvente para compuestos orgánicos no polares y menos útil para polares.Las mezclas que contienen una amplia gama de PM pueden separarse reuniendo varias columnas en serie. no absorbe UV. alta pureza. El detector más utilizado para obtener cromatograma es el de radiación UV/VIS. Aplicación en determinación de PM: las curvas de calibración (usando proteínas de PM conocido) del logPM vs volumen de retención se establecen entre el límite de inclusión y el de exclusión. baja inflamabilidad. La adición de un modificador orgánico (ej metanol) mejora la fuerza de elución de la fase móvil. 0. donde a la salida el fluido supercrítico se expande y pasa a estado gaseoso y se puede mantener simultáneamente la presión al interior de la columna Aumento de la presión aumenta la velocidad de elución ya que aumenta la densidad del disolvente lo que permite mayor interacción analito-fase móvil y disminuye los tiempos de elución. diclorofluorometano y óxido nitroso. combustibles fósiles.Fase estacionaria: columnas capilares de sílice fundida y empacadas. etano. amoníaco. Detectores: además de todos los detectores para HPLC se puede usar también el FID. Análisis de polímeros. inestabilidad con la temperatura (GC). Longitud 10-20m. fármacos.05-0. Restrictor: para poder mantener por una parte la presión en el interior de la columna y por otra parte permitir la bajada de la resión a la salida para que el fluído supercrítico pase al estado gaseoso y pueda ser detectado correctamente el analito. DERIVATIZACIÓN EN CROMATOGRAFÍA (GC. dietiléter. HPLC) se convierte el analito en otro compuesto por reacciones con la fase estacionaria. pentano. ceras. Es un tubo capilar de 2-10 cm de longitud y díametro interno 1/10 del de la columna. productos alimenticios. Técnicas precolumna y post columna.1 mm. diámetro interno. para que sea más sensible con un determinado detector. THF. Reacciones para mejorar detección (p ej para usar detector de fluorescencia) Derivatización cromatografía de gases . Se puede emplear en las diluciones una primera etapa isobárica para luego aumentar la presión lineal o asintóticamente hasta el final de la elución. Fase móvil: CO2. Horno termostático: para controlar con precisión la temperatura de la fase móvil. responsables de uniones intermoleculares. En el solvente acuoso se disuelve solutos polares e ionicos. Reacción de alquilación para formar éteres: ROH + Ag2O + MeI DMF> ROMe + 2AgI + H2O Acilación ROH + (CF3CO)2O Sililación ROH SiMe3 > piridina > ROCOCF3 ROSiMe3 MÉTODOS EXTRACCIÓN Y TRATAMIENTO DE MUESTRAS: • • • • • • • • Líquido-líquido Soxhlet Extracción en fase sólida Extracción con fluido supercrítico Extracción con solvente acelerada Microondas Baño ultrasónico Mezclador EXTRACCIÓN LIQ-LIQ Embudo de decantación Se usan 2 solventes inmiscibles para separar un analito desde una fase a otra.Los compuestos a analizar deben transformarse en otros que tengan un menor punto de ebullición y puedan transformarse en gases sin someterlos a una temperatura muy alta y causar su descomposición. . La distribución de un analito entre dos fases es una condición de equilibrio descrita por la teoría de partición. La reacción de derivatización tiene como objetivo principal modificar la molécula tratada para evitar la formación de puentes de hidrógeno. HPA en sedimentos. Arriba se pone un refrigerante para evitar la evaporación del solvente (4) Se calienta el balón y el solvente llega a la base del refrigerante el cual lo condensa y cae al reservorio que contiene la muestra (2) El solvente se empieza a acumular en el reservorio para la muestra y luego que llega al nivel superior cae al balón (1) que contiene el solvente. Gasto de energía. Este proceso se repite en el tiempo que dura la extracción que normalmente son horas. Es muy adecuado para extraer compuestos orgánicos desde matrices sólidas: extracción de pesticidas en suelo. . etc. Ventajas: Técnica muy efectiva. normalmente se logra extracciones con 100 % de eficiencia. Desventajas: Solventes caros y tóxicos.SOXHLET • • • • • • La muestra se coloca envuelta en un papel de filtro y se introduce en la columna de extracción (2) mientras que el solvente a extraer en el balón 1. Extracción en fase sólida (SPE) Se utilizan jeringas que contienen una fase estacionaria y se hace pasar una fase móvil líquida. que permite mayores flujos. El liquido es pasado a través de una fase sólida la cual selectivamente remueve el analito (o la matriz). con solvente o con baño frío. EXTRACCIÓN CON FLUIDO SUPERCRÍTICO El analito se pone en una celda. Además no se utiliza solventes orgánicos los cuales son de alto costo y toxicidad. comercializada desde 1978. Se puede fijar el analito en la muestra o fijar las impurezas y eluir el analito. de acuerdo a la volatitilidad • Ventajas: Las extracciones son mas rápidas que con Soxhlet. para concentrar. Para esta técnica existe. automatizable y que facilita aún más la extracción. etc. Metanol. Introducida en los 70s. además de la variante en cartuchos. El mecanismo es el mismo que para LC / HPLC. la cual se introduce en el horno. el analito es eluído con un solvente más fuerte. Esto depende de la polaridad del solvente que se utilice para eluir. Al salir del horno en el restrictor ocurre la despresurización y se recibe en un frasco colector (vacío. • Desventajas: Muchas veces las extracciones no son del 100 % • Se considera dentro de los métodos de “screening” . la opción de discos. Se aplica una presión alta (sobre la presión crítica de la muestra y una temperatura alta (sobre la presión crítica) y este fluido pasa por la muestra disolviendo los analitos de acuerdo a las polaridades. Se utilizan para limpiar muestras con matrices complejas (clean up). El solvente es normalmente CO2 y como este es muy apolar se agrega un co-solvente como por ej. A mayor presi la temperatura de ebullici de los solventes aumenta y con ello la efectividad de la extracci. Ventajas: Rapidez y menor gasto de solventes. . (m騁odo de screening) Reacci con microondas Se usa peque s cantidades de muestra y de solvente. (no hay evaporaci de 駸tos) Desventajas: Aveces la efectividad est�bajo el 100 %. La temperatura no es muy alta por lo que no hay descomposici de muestra ni del 當 ido necesario para el ataque. Se aplica la radiaci de microondas y los 當idos minerales se calientan r疳idamente disminuyendo el tiempo de reacci. Desventajas: Al disminuir la cantidad de muestra disminuye la concentraci del analito y se necesita un m騁odo de cuantificaci m疽 sensible. Ventajas: R疳idez y menor cantidad de muestra y de 當idos para el ataque.ANALISIS CON SOLVENTE DE ACELERADA Se realiza una extracci poniendo en la matriz con un solvente a una temperatura y presi alta. Extractantes: • Es un proceso por el cual se transfiere uno o más solutos de una fase a otra. • Se emplea una fase acuosa y una fase orgánica no miscible. generalmente entre dos líquidos inmiscibles entre si. sedimentos. . lodos etc. La vibraci a alta intensidad (20 kHz rang) permite la penetraci del solvente en la matriz solubilizando los analitos.BAÑO ULTRASÓNICO Normalmente el ba ultrasico se emplea para extraer analitos desde muestras de suelos. mientras que el ba ultrasico requiere solo de 8 a 10 minutos. El generador ultrasico produce una sel el馗 trica a una frecuencia determinada. Se emplea una fase acuosa y una fase orgánica no miscible. EXTRACCIÓN CON SOLVENTES: Convencional: • • • Es un proceso por el cual se transfiere uno o más solutos de una fase a otra. generalmente entre dos líquidos inmiscibles entre si. Por ej. La fase orgánica puede ser más densa o menos densa que la fase acuosa. Algunos pesticidas requieren extracciSoxhlet de 4-18 horas. Es mucho m疽 r疳ido que la extracci Soxhlet. Ejemplo. H3PO4x12MoO3 3. Al(Quinolina)3. Por ejemplo. Sistemas de extracción. Sustancias orgánicas: Se extraen sin mayor transformación química. carbonilos. etc. • II. Formación de pares iónicos. Coordinación simple. Cu(DDC)2. Por ejemplo GeCl4 2. Quelación: Ejemplo. compatible con el solvente orgánico extractante. Heteropoliácidos: El ión central es un complejo monoatómico. •I. alcoholes. Cd(morin)2 4. Ej.• La fase orgánica puede ser más densa o menos densa que la fase acuosa. Métodos para formar especies extractables: 1. Aminas. Cs+ (C6H5)4B- Relación de distribución: A partir de las expresiones de K y KA K= [HA] [HA] 2 1 . Sustancias inorgánicas: Se debe reemplazar el agua de coordinación por otro ligante que forme una especie neutra. KA = [H +]2 [A-]2 [HA]2 Sustituyendo en la expresión de DC DC = [HA] 1 [HA] 2 + [A-]2 DC = = <[HA] K [HA] 1 1 1 + KA [HA] K [H +]2 K [H +]2 [H +]2 + KA demuestra la influencia del pH en el valor de Dc . * El disolvente debe de poseer propiedades fuertemente solvatantes. . Extracción de quelatos cupferrón oxina Extracción de pares iónicos *Se necesita formar iones muy voluminosos (complejos) a los que se debe de asociar un contra-ion.Procesos frecuentes de la extracción Liq-Liq Especie a extraer Compuestos orgánicos poco polares Compuestos orgánicos ionizables Metales (quelatos) Complejos de asociación iónica Fundamento “Lo similar disuelve a lo similar” Debe de controlarse el pH Se requiere formar complejos neutros. Se requiere formar pares iónicos neutros. poco solubles en agua. Ejemplos: Fe 3+ HCl (6M) Fe Cl4 .(formación del ión) Especie extraída: HFeCl4 (extracción en metil-isobutil-cetona o éter dietílico) Determinados tipos de nitratos metálicos. pueden ser extraidos de forma parecida ( U(VI). Bi(III) y Fe(III)) Efecto del pH Sea el ácido débil HA cuyo equilibrio de disociación es: HA A.+ H+ Ka = (H+)(A-) / (HA) El coeficiente de distribución D se define: D = (HA) total en fase 2 / (HA) total en fase 1 El coeficiente de reparto para las formas moleculares es: K = (HA)2 / (HA)1 Se supone que la forma iónica sólo está presente en la fase acuosa y que se reparte la forma molecular. A partir de K: D = (HA)2 / ( (HA)1 + (A-)1 ) K(HA)1 = (HA)2 D = K(HA)1 / ( (HA)1 + (A-)1 ) A partir de Ka: (A-)1 = Ka(HA)1 / (H+) y sustituyendo: D = K(H+) / Ka + (H+) Agentes quelantes: Sea un agente quelante HL que se disocia de acuerdo a: HL H+ + LKa = (H+)(L-) / (HL) La complejación viene dada por: . Mn+ + nL- MLn β = (MLn) / (Mn+)(L-)n El coeficiente de distribución: D = (metal total)2 / (metal total)1 = (MLn)2 / (Mn+)1+)1 MÉTODOS ELECTROQUÍMICOS DE ANÁLISIS Electrodo de trabajo o indicador: electrodo cuyo potencial es sensible a la concentración del analito Contraelectrodo: segundo electrodo que completa el circuito en una célula de dos electrodos . 4. Coulombimetría: Se mide los coulombs necesarios para electrolizar el analito Q=it=nmF). Amperometría: Se mide la corriente en función de la concentración (i = KC). La respuesta del electrodo indicador es Nerstsiana. Se necesita: a) Un electrodo de Referencia: Potencial conocido y cte → Insensible a la composición de las disoluciones.Electrodo de referencia: electrodo cuyo potencial permaece constante y frente al que pueden medirse otros electrodos Electrodo auxiliar: tercer electrodo que completa el circuito en una célula de tres electrodos Ley Ohm: declaración según la cual la corriente que pasa a través de un circuito es directamente proporcional al potencial aplicado e inversamente proporcional a la resistencia de ese circuito (E=IR) Potenciómetro: dispositivo para medir el potencial de una célula electroquímica sin producir una corriente ni alterar la composición de dicha célula Galvanostato: dispositivo que se emplea para controlar la corriente de una célula electroquímica. Nerst) 2. Electrogravimetría: Se pesa un electrodo sobre el cual se ha depositado electroquímicamente el analito. Fundamento: Se mide el ∆ E que se establece entre dos electrodos (en ausencia de corriente). 1. POTENCIOMETRÍA Se mide la diferencia de potencial en función de la concentración del analito. Existen electrodos de trabajo de distinto tipo útiles para distintos cationes o aniones. 3. . Potenciometría: Se mide la diferencia de potencial en función de la concentración del analito (Ec. 6. Conductimetría: Se mide la resistencia de la disolución. 5. Es una técnica electroanalítica con la que se puede determinar la concentración de una especie electroactiva en una disolución empleando un electrodo de referencia (un electrodo con un potencial constante con el tiempo y conocido) y un electrodo de trabajo (un electrodo sensible a la especie electroactiva). Voltamperometría: Se mide la corriente en función del potencial aplicado. Potenciostato: dispositivo utilizado para controlar el potencial de una celda electroquímica. Potencial de electrodo 1) Definición: Potencial de una celda formada por el electrodo de trabajo.b) Un electrodo Indicador: Potencial dependiente de la composición de analito en la disolución.059 [H + ]2 log K = E 0 − log n 2 [Zn 2+ ] ⋅ PH 2 Electrodos de referencia: • Potencial constante y reproducible • Potencial conocido • Insensible a la composición de la solución • Resistente • Fácil de usar Ejemplos: • Electrodo normal de hidrógeno • Electrodo de calomelanos • Electrodo de Ag/AgCl Consiste en un electrodo de Pt sumergido en una disolución en la que la actividad del ión hidrógeno es 1 y en la que se burbujea gas H2 a una presión de 1 atm.000 V 2) El valor numérico del potencial de electrodo viene definido teóricamente por la ecuación de Nernst. por convención.Bajo esas condiciones el electrodo de hidrógeno recibe el nombre de electrodo estándar de hidrógeno y se le asigna.059 0. actuando como cátodo y un electrodo de hidrógeno (de referencia) que actúa como ánodo . Para la reacción: Zn2+ + H2 ↔ Zn + 2H+ E = E0 − 0.Potencial normal de electrodo (E0): Potencial de electrodo cuando las actividades de todos sus reactivos y productos son la unidad . Pese a su importancia como electrodo de referencia fundamental con el que se miden y . un valor de potencial de 0. Un puente salino convencional conecta el electrodo de hidrógeno con la semicelda indicadora. El potencial estándar para la reacción es por definición 0V a todas las temperaturas. utilizada en su preparación. Por otro lado tiene mayor tendencia a reacciones con disoluciones para formar complejos insolubles de plata que pueden bloquear el puente salino entre el electrodo y la disolución. apenas se utiliza pues es difícil de preparar e incómodo de manejar. Celdas electroquímicas: Se divide en 2 mitades. Un puente salino que contiene un electrodo inerte (ej KCl) conecta las dos semiceldas. al tiempo que impiden el paso del contenido del puente salino a las semiceldas. Los extremos del puente salino se fijan con vidrios porosos que permiten el desplazamiento libre de los iones entre las semiceldas y el puente salino. El potencial de un electrodo de calomelanos depende de la concentración de Cl-. Punte salino: comunicación entre 2 disoluciones que permite el movimiento de la corriente en forma de carga iónica. (Se reduce el H+) Calomelanos: Hg2Cl2 (s) + 2 e 2 Hg (l) + 2 Cl- Par redox formada por Hg2Cl2 y Hg. Esta separación es necesaria para evitar que se produzca una reacción redox espontánea sobre la superficie de uno de los electrodos. Este movimiento de iones en el puente salino es el que completa el circuito eléctrico. cada una de ellas con un electrodo sumergido en una disolución que contiene iones. evitando el paso de la corriente por la celda e impidiendo la medición del potencial. Ventaja es que puede usarse a temperaturas más altas. . El potencial también depende de la concentración de Cl. Se basa en par redox AgCl y Ag. Ánodo: electrodo donde tiene lugar la oxidación (referencia) Cátodo: electrodo donde tiene lugar la reducción (indicador) La celda electroquímica potenciométrica se construye de tal forma que una de las semiceldas proporciona un potencial de referencia conocido y el potencial de la otra semicelda indica la concentración del analito. de cuyas concentraciones depende el potencial del electrodo. Se acepta por conveniencia que el electrodo de referencia es el ánodo.comparan todos los demás potenciales. Electrodo de vidrio • Se mide la diferencia de potencial a través de una membrana de vidrio que separa una disolución de concentración desconocida de una disolución de referencia cuya [H+] es conocida .0592xLog areducida /aoxidada Electrodos indicadores: Respuesta rápida y reproducible a los cambios de concentración de un analito.Primera especie (electrodos metálicos en los que el metal está en contacto con una disolución que contiene su ión) .membrana cristalina . Ecuación de Nernst: El potencial de una celda electroquímica potenciométrica viene dado por: Ecel= Ecat – Ean (E potenciales de reducción) Estos potenciales dependen de las concentraciones de las especies responsables de los potenciales del electrodo.Metales inertes . Ered = E0red – 0. según la ecuación de Nernst n Actividades se pueden reemplazar por concentraciones molares solo en el caso de soluciones diluidas. El potencial del electrodo indicador es proporcional a la concentración del analito. Electrodos de membrana: -vidrio .membrana líquida .gases Electrodos indicadores metálicos: .Segunda especie electrodo de Ag (indicador de Cl-) (cuando un electrodo responde AL potencial de otro ión que está en equilibrio.El electrodo de referencia ideal sería el que proporcionara un potencial estable de forma que cualquier cambio de Ecel pudiera atribuirse al electrodo indicador y por tanto a un cambio en la concentración del analito. 1 M saturado c/ AgCl agitador magnético Fina membrana de vidro (responsable dela respuesta del pH) Electrodos de membrana La generación de potencial es muy diferente al de los electrodos metálicos: los metálicos transfieren electrones y las membranas iones.pH-metro ESC electrodo de vidro alambre de plata HCl O. Potencial de membrana: potencial que se desarrolla a través de una membrana conductora cuyas caras opuestas están en contacto con disoluciones de composición diferente. El término Easim se denomina potencial de asimetría representa el hecho de que el potencial de la membrana no suele ser igual a 0 en estas condiciones (soluciones idénticas a ambos lados y se observa potencial no igual a 0). Los potenciales de membrana se deben a una interacción química entre el analito y los lugares activos de la superficie de la membrana. Su respuesta se relaciona como función px (pH. El diseño es también muy distinto. PCa. Uno de los lados de la membrana está en contacto con una disolución interna que contiene una concentración fija del analito. La corriente pasa a través de la membrana gracias al movimiento del analito o de un ión que ya se encuentre presente en la matriz de la membrana. mientras que el otro lado está en contacto con la muestra. El potencial de membrana viene dado por una ecuación tipo nernst: Emem = Easim – RT/zF ln [A]int/[A]mues Z: carga del analito. Si existe diferencia entre las concentraciones de analito a ambos lados de la membrana. . Emem debe ser 0 cuando la concentración del analito sea igual en ambos lados de la membrana. Se denominan electrodos selectivos de iones (su potencial de membrana es función de la concentración de un ión dado en la solución). Por lo que el potencial de membrana será proporcional a la concentración de todos los iones existentes en la disolución de muestra que sean capaces de establecer interacciones con los lugares activos de la membrana. la interacción del analito con ésta producirá un potencial de membrana. Históricamente el electrodo de pH fue el primero.etc).. Típicamente en el caso del electrodo de pH:22% Na2O. genera un potencial eléctrico (de membrana EM). Electrodo simple de pH. 6% CaO. El electrodo de referencia externo se incorpora dentro del dispositivo. Las no cristalinas pueden ser de vidrio (electrodo de pH). o líquidas (electrodo de calcio). Fundamento: Los iones H3O+ se fijan parcialmente sobre la pared externa e interna de la membrana de SiO2 y la diferencia de concentraciones. 72 % SiO2.Clasificación: Las membranas pueden ser cristalinas y no cristalinas. La composición del vidrio fija selectivamente el tipo de ión a retener. Electrodo combinado de pH. . Cs. La hidratación da lugar a la formación de lugares de carga negativa.el potencial de los electrodos de vidrio tipo corning obedecen a la ecuación Ecel= K + 0. A valores superiores a 9 la membrana responde mejor a otros cationes como Na+ y K+.Se hidratan aproximadamente los 10nm más externos de la membrana. el transporte de carga a través de la membrana depende de los iones Na+. Rb.5 a 9. desplazan a éstos produciendo la selectividad de la membrana para el H+.059 log [H+] a lo largo de una gama de pH que varía desde alrededor de 0. NH4. Ag y Ti (diferente composición de la membrana). También se fabrican electrodos de vidrio para el análisis de Li. La mayoría de los electrodos de pH de membrana de vidrio suelen presentarse en forma combinada que incluye un electrodo indicador y otro de referencia. . como se unen con mayor fuerza al vidrio que los iones de Na. Los iones de hidrógeno de la disolución difunden hacia la membrana y. que forman parte de la estructura de silicio de la membrana de vidrio. Sustituyendo el Na2O y CaO por Li2O y Bao se amplían los límites útiles de pH de los electrodos de membrana de vidrio hasta valores de pH superiores a 12. lo que simplifica mucho la medida de pH. K. Los iones sodio capaces de moverse a través de la capa hidratada actúan como contraiones. Los electrodos de vidrio no deben dejarse secar para que no se destruya la capa hidratada de la membrana. El reservorio externo contiene di-(n-decil)fosfato en forma de di-n-octilfenil-fosfonato. Consiste en una membrana de plástico poroso saturada con di-(ndecil)-fosfato. El reservorio interno contiene una disolución acuosa patrón de Ca2+ y el electrodo de referencia Ag/AgCl.Base: El E de la capa hidratada tb se debe a la [Na+]vidrio (en menor medida) no sólo a [H+] vidrio .Errores en electrodo de vidrio 1) Tampones de calibración estropeados → pH ≠ al indicado → Recta de calibrado errónea 2) Matriz de tampones de calibración ≠ de la muestra → Ej (potencial de unión líquida) ≠ → Recta de calibrado errónea 3) Error alcalino . . que empapa la membrana porosa. La membrana se coloca en el extremo de un tubo cilíndrico no conductor y en contacto con dos reservorios.A pH<1 → pHmedido> pHreal → Errores por exceso 5) Deshidratación del electrodo → Medidas no reproducibles Electrodo de membrana líquido: (se incorporan um agente quelante a uma membrana hidrófoba) Ejemplo el de calcio.A pH<12 (depende del tipo de vidrio) → E(H+)>>E(Na+) pero a pH>12 → E(Na+) no es despreciable → Eind es > de lo que corresponde a la [H+]vidrio → pHmedido< pHreal → Errores por defecto 4) Error ácido . Determinación del PE . de complejación. (b) ácido-base. El potencial de membrana de la perla de Ag2S se desarrolla a causa de la diferencia de la posición de equilibrio de la reacción de solubilidad a ambos lados de la membrana. Titulaciones potenciométricas . Los electrodos se fabrican construyendo una fina perla de Ag2S o una mezcla de ésta y una segunda sal de plata u otro sulfuro metálico.Definición: Valoraciones en las que el seguimiento de la reacción se hace por medidas potenciométricas. en el que se introduce una disolución interna que contiene el analito y el electrodo de referencia. se sella en extremo de un cilindro de plástico no conductor. Electrodo enzimático: corresponde a la concentración de un sustrato al que se hace reaccionar con una enzima inmovilizada para producir un ión que pueda determinarse con un electrodo selectivo de iones. La perla de 1-2 mm de espesor.Medidas de potencial: Tras cada adición hay que esperar a que se alcance el Eeq .Curva de valoración → Logarítmica . Para las redox se usan electrodos redox del tipo alambre de pt y un electrodo de referencia.Electrodo de membrana cristalino: Tienen una membrana formada por Sales inorgánicas policristalinas o de un solo cristal. Los iones Ag+ transportan la carga a través de la membrana. . aunque también pueden usarse electrodos selectivos para el agente valorante o para el producto de la reacción. Titulación potenciométrica Utilización de la medida de potencial de un electrodo indicador para determinar el punto de equivalencia de una titulación. Aplicaciones cuantitativas . Las valoraciones potenciométrica ácido-base. Es un método más exacto y preciso que la utilización de indicadores visuales. de complejación y de precipitación suelen controlarse con electrodos de membrana selectivos para el analito.Tipos de valoraciones: (a) Precipitación. (c) complejación. redox y de precipitación y en las valoraciones realizadas con disolventes acusoso y no acusoso. (d) redox La determinación potenciométrica de los puntos de equivalencia es factible en las valoraciones ácido base. Siempre que Vp sea significativamente menor que Vx. 1. Significado de pH = -log [H+] Sin embargo el pH de una disolución se define por la respuesta de un electrodo al ión H+ y por tanto es una medida de su actividad: * pH=-log(aH+) Como es lógico la composición de la matriz influye sobre el pH verdadero de una disolución. debido a los cambios de su coeficiente de actividad.La medición más habitual quizás sea la medición de pH de una disolución. Como es frecuente observar pequeñas desviaciones de la pendiente “nernstiana” ideal la estandarización suele hacerse utilizando 2 o más patrones externos. En la mayoría de los análisis cuantitativos. por lo que podrá lograrse la estandarización con un solo patrón externo. Para determinar la concentración del analito de una muestra es necesario estandarizar el electrodo. las diferencias entre la matriz de la muestra y la de los patrones perderá importancia y el coeficiente de actividad permanecerá esencialmente constante. K’ comprende el coeficiente de actividad. la curva de calibración del potencial en relación con la actividad es una línea recta. dependiendo del pH previsto . la gráfica del potencial en relación con la concentración puede ser curva para las concentraciones más altas de analito. Sin embrago. 2.059/n log 1/[Mn+] M ión metálico. Incertidumbre de la relación entre potencial y actividad 3. no dependiente del conocimiento de la composición exacta de la matriz de la muestra consiste en añadir una concentración elevada de un electrolito inerte a todas las muestras y patrones. de un patrón que contiene una concentración conocida de analito Cp. podrá ignorarse el cambio de la matriz de la muestra y el coeficiente de actividad del analito permanecerá constante. Pero en realidad esta ecuación involucra actividades. Si la respuesta del electrodo sigue la ecuación de Nernst sólo será necesario determinar la constante K. no concentraciones. En la celda de la muestra se pone una muestra de volumen Vx y concentración del analito Cx y se mide el potencial Ecelx. Vp. Se hace una adición de patrón añadiendo un pequeño volumen. uno de pH cercano a 7 y otro mucho más ácido o básico. La ecuación de Nernst relaciona el potencial medido de la celda con la concentración del analito. Si la concentración de electrolito que se añade es suficiente. Calibración: se calibran usando un tampón cuya composición se elige de forma que el pH establecido se encuentre lo más cerca posible del obtenido mediante la ecuación de actividad *. no su actividad. Medida del pH: Complicaciones. En ausencia de interferentes. Sin embrago la respuesta del electrodo está en función de la actividad. Una curva de calibración con curvatura permitirá determinar la concentración del analito siempre que la matriz del patrón se similar a la de la muestra. La disolución de un electrolito inerte añadida a la muestra y a los patrones recibe el nombre de tampón de ajuste de fuerza iónica total. Habitualmente los electrodos de pH se estandarizan usando dos tampones. resulta imposible acoplarla a la del patrón. muhos métodos potenciométricos cuantitativos recurren a la adición de patrón. lo que interesa es determinar la concentración del analito. Por lo tanto una manera correcta de escribir la ecuación es: Ecel= K’ – 0. a la muestra y se vuelve a medir el potencial Ecels . Cuando no se conoce la composición exacta de la matriz de la muestra como a menudo sucede. Analisis cuantitativo usando el método de adición de patron: debido a la dificultad para mantener una matriz constante en las muestras y patrone. Otra posibilidad. Se puede medir la concentración de Ag+ con un segundo electrodo. Es un método electroquímico basado en la oxidación o reducción cuantitativa de un analito.de la muestra. -Se puede usar un indicador . COULOMBIMETRÍA Los métodos de análisis columbimétricos se basan en la electrolisis (separación de los elementos de un compuesto mediante electricidad) exhaustiva del analito. Se determina la cantidad de analito midiendo la corriente durante el tiempo necesario para que la reacción se complete. se introduce el electrodo en el segundo tampón y se ajusta el control pendiente o temperatura al pH del tampón. Q = it Ejemplo: Titulación coulombimétrica de cloruros usando un electrodo de plata Reacción electroquímica: Ag (s) => Ag+ + eReacción química: Ag+ + Cl.=>AgCl (s) ¿Cómo sabemos cuando la reacción química se ha completado? . A continuación. El electrodo de pH se sumerge en el primer tampón y se ajusta el control de estadarización o calibración hasta que el equipo de medida lee el pH correcto. 485 Coulombs (C)/mole eO de otra forma Q = it = nmF n: número electrones transferidos por mol de analito M: moles de analito (1:1 Ag+/e-) Ag (s) => Ag+ + e- Con lo cual se obtiene el número de moles de analito generado.8 A para depositar cobre en el cátodo y O 2 en el ánodo.5g Cu/mol Cu) = 0.485 C)(1 mol Cu/2 mol e-)(63.6 C (amp.sec) Cantidad de cobre: =(729.0g O2/mol O2) = 0.) t = tiempo (sec La relación entre carga y moles está dado por la constante de Faraday Faraday (F) = 96.2 minutos.6 C)(1 mol e-/96. ¿Qué cantidad de gramos se forma de cada producto? reacciones: Cu2+ + 2e.0605 g O2 .t Q = (0.=> Cu (s) 2H2O =>4e. consumido.240 g Cu Cantidad de O2 : =(729. Ejemplo: Se aplica una corriente constante de 0.+ O2 + 4H+ Resolución.6 C)(1 mol e-/96.Q = It Q = carga requerida (coulombs = amp . Si la reacción duró 15. Ley de Faraday: corriente o carga que pasa en una reacción redox es proporcional a los moles de los reactivos y productos de esa reacción.800 A)(15.2min) (60 sec/min) Q = 729. sec) I = corriente (amp. etc. Q = i.485 C)(1 mol O2/4 mol e-)(32. precipitación.+ H2 El OH.Titulación de un ácido .=>2OH.Fácil de dosificar pequeñas cantidades de reactivo y mayor exactitud y precisión. HgNH3Y2. Comparación con la volumetría tradicional.se puede automatizar completamente.error de titulación. .Tiempo y corriente son fácil de medir con exactitud. .Se debe conocer estquiometría de la reacción.error en la medida de la corriente .variación de la corriente durante la electrólisis . que al medir 3pequeños volúmenes.+ NH4+ + 2e.Se utiliza para titulantes inestables. (diferencia entre punto de equivalencia y punto final de titulación .) Titulaciones redox c) Fuentes de error 4+ Ce3+ => Ce + e. Titulación de una base . b) Ventajas de la coulombimetría b.Time Similitud con el volumne agregado 2H2O + 2e.reacciones4+ secundarias (100 % eficiencia de corriente) Ce + Fe2+ => Ce3+ + Fe3+ . .La reacción debe ser rápida.error en la medida del tiempo .) Titulaciones de complejación .Tipos de métodos a) Amperostático (titulación coulombimétrica) b) Potenciostática Requisito fundamental 100% de eficiencia en corriente Titulaciones coulombimétricas Se titula el analito aplicando una corriente constante para generar el titulante electroquímicamente.=> Hg + 2NH3 + HY3. redox y complejacíón.es el titulante generado electroq. c. Aplicaciones a) Tienen un pto de equivalencia observable a) Titulaciones ácido base . HY => H+ + Y4. cuantitativa y sin reacciones laterales. H2O => 2H+ + ½ O2 + 2eEl H+ es el titulante generado electroq.utilización en reacciones ácido-base.Corriente Similitud con el estándar . 2) Ventajas: . a) En los sistemas de corriente constante.) Se aplica un potencial constante para convertir por completo el analito en algún producto.Puede ser utilizada para mas de 55 elementos 3) Desventajas . La corriente decrece con el tiempo . el potencial de la celda cambia cuando el analito es consumido.=> H2 (g) Coulombimétria potenciostática 1. Por ejemplo generación de H2 2H+ + 2e.Es mas larga que la amperostática.=> Cu (s) reacción inicial Cuando todo el Cu2+ es consumido ocurre otra reacción electroquímica.Es más específica que la amperostática (evita reacciones redox que pueden interferir) .d) Cambio en el potencial durante la medición. Cu2+ + 2e. • La voltamperometría difiere de otras técnicas. Este último suele ser un alambre de platino. En el electrodo de trabajo se aplica una señal de excitación que es un potencial dependiente del tiempo. mientras que los de referencia habituales son ECS o uno de Ag/AgCl. Rh. como la coulombimetría. • Se aplica una diferencia de potencial entre un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia y se mide la corriente que circula. Au. C vítreo. La voltamperometría moderna utiliza un potenciostato de 3 electrodos.It = Ioe-kt k = 25. otencial que cambia en relación con el potencial fijo aplicado al electrodo de referencia. Voltamperograma: equivalente del espectro en espectroscopía y proporciona información cuantitativa y cualitativa sobre las especies que intervienen en la reacción de oxidación o reducción.8 DA/Vδ D = Coeficiente de difusión A = Area del electrodo V = volumen δ = espesor del film de la capa de difusion donde hay un gradiente de difusion VOLTAMPEROMETRÍA Y POLAROGRAFÍA Se aplica un potencial dependiente del tiempo a una celda electroquímica y se mide la corriente que pasa a través de ella como función de dicho potencial. en que se caracteriza por tener un consumo mínimo del analito mientras que la coulombimetría prácticamente todo el analito pasa a otro estado (el área de la superficie del electrodo de trabajo es significativamente menor que el de los utilizados en coulombimetría. • Ventana electroquímica . • Electrodos sólidos: Pt. Ru. Electrodos de trabajo • Mercurio: Goteante-Colgante-Film. por lo tanto la cantidad de analito que sufre electrolisis es muy pequeña y laconcentración del analito en el seno de la disolución prácticamente no se modifica). La corriente medida es la que se establece entre los electrodos de trabajo y auxiliar. Cu etc. Aunque el flujo de la corriente faradaica depende del potencial aplicado en el electrodo de trabajo. como la agitación de una disolución . se produce una corriente de electrones que atraviesa el circuito eléctrico externo hasta el electrodo auxiliar. En cualquier caso. La reducción de un analito en el electrodo de trabajo requiere una fuente de electrones capaz de generar una corriente que fluya desde el electrodo auxiliar hasta el cátodo. migración y convección Difusión: movimiento de un material como respuesta a un gradiente de concentración Convección: movimiento del material en respuesta a una fuerza mecánica. La corriente producida por la reducción del analito se llama corriente catódia y por convención se considera positiva. las reacciones redox producen una corriente entre los electrodos de trabajo y auxiliar a la que se denomina corriente faradaica. Las corrientes anódicas se deben a reacciones de oxidación y tienen carga negativa. donde tiene lugar la reducción del disolvente o de otros componentes de la matriz de la disolución. su magnitud depende de la velocidad de la reacción de oxidación o reducción que tiene lugar en la superficie del electrodo. Existen3 métodos de transporten que influyen en la velocidad con que los reactantes y productos son transportados desde y hacia la superficie del electrodo: difusión.Tipico polarograma Cuando un analito se oxida en el electrodo de trabajo. Existen 2 factores que determinan la velocidad de la reacción electroquímica: la velocidad a la que los reactantes y productos son transportados desde y hasta la superficie del electrodo y la velocidad a la que los electrones se desplazan entre el electrodo y los reactantes y productos existentes en la disolución. potencial en un experimento de polarografía muestra las oscilaciones de corriente correspondientes a las gotas de mercurio que caen desde el capilar. cada nueva gota de Hg que cae crece en una Se desgaza con N2 u Ar de alta pureza disolución composición es idéntica a la de la disolución total inicial. que causa un cambio proporcional al tiempo del área del electrodo de trabajo.70 V E° de mercurio: se efectúa en una disolución no agitada. yCes la concentración del analito en mol/cm3.Nes el número de electrones transferidos por mol de analito. Relación ente i y C Id(promedio) = 607 n D1/2 m2/3 t1/6 C Id(máxima) = 706 n D1/2 m2/3 t1/6 C t es el tiempo de goteo (segundos). potencial de un experimento polarográfico tiene la típica forma sigmoidal. ytes el tiempo de vida de la gota en segundos. la caída de las gotas de Hg que se mezclan con la disolución hace que la corriente obtenida sea limitante. Una gráfica de la corriente vs. La polarografía es una medida voltamperométrica cuya respuesta está determinada por el transporte combinado de masa difusión/convección. • D es el coeficiente de difusión (cm2/s). Lo que hace a la polarografía diferente de otras medidas de voltamperometría lineal de barrido es que polarografía hace uso delelectrodo de gota de mercurio (DME). donde el potencial de electrodo se encuentra alterado en forma lineal desde el potencial inicial hasta el potencial final. Como método de barrido lineal controlado por el transporte de masa por difusión/convección. se relaciona con la concentración del analito mediante la ecuación de Ilkovic: Donde D es el coeficiente de difusión del analito en el medio (cm2/s). La polarografía es un tipo específico de medida que cae en la categoría general de voltamperometría de barrido lineal. • C es la concentración del analito (Moles/mL) • I es la intensidad en Amperes. la respuesta corriente vs. Por tanto. Las oscilaciones de la corriente se deben al crecimiento de la gota de Hg. Ecuación de Ilkovic. • Id = K x C El oxígeno interfiere porque es electroactivo Solución saturada en aire es ≈ 4 mM y se obtiene una corriente de difusión de ≈ 5 A + – O2 + 4 H + 4 e ¾ 2 H2O E° = +1.23 V Polarografía+ 2 e– ¾ en2O2 O2 + 2 H+ clásica H electrodo de goteo= +0.Migración: movimiento de un catión o anión en respuesta al potencial aplicado. m es la velocidad del flujo de mercurio a través del capilar (miligramos/segundos).mes el flujo másico de Hg a través del capilar (mg/s). La corriente limitante (la meseta en el sigmoide). Si se conecta el máximo de corriente de cada gota resultaría una forma sigmoidea. Máximos polarográficos • Fenómeno de adsorción entre el electrodo cargado y el analito • • • • • • . llamada corriente de difusión porque la difusión es la principal contribución al flujo de material electroactivo en este momento de la vida gota de Hg. • Compuestos orgánicos con grupos nitro-. • Complejos • Oxyaniones. etc. etc. Polarografía de Tast . e. Desventajas polarografía clásica • Límite de detección 10-4 a 10-5 M aprox. SOx. Pb. • Límite de detección 10-4-10-5 M • Precisión 2-5% aprox Especies electroactivas: • Iones metálicos de transición: Cu. • Moléculas inorgánicas e. Fe. Tl. Cd.g. BrO3–. NOx etc. O2. IO4–.• Se elimina agregando un agente surfactante como Tritón X-100 Celda con electrodos Analisis cuantitativo • iD ∝ c • Curva de calibrado.g. H2O2. • Adición de estándar • Estándar interno o ión piloto. Carbonilos. Zn. SO32–. etc. C=N. Ni. • Corriente de difusión medida durante los últimos 20 ms. • Pulsos sucesivos con incremento de E en función del tiempo. • La corriente se muestrea antes y cerca del final del pulso. Voltamperometría cíclica (CV). La corriente de carga decae durante los ultimos 20 ms. Técnicas de onda cuadrada: Voltamperometría de onda cuadrada (SWV). Voltamperometría y polarografía de pulso normal (NPV-NPP). Polarografía diferencial de pulso • Pulsos de 5-100 mV se superponen con la aplicación linear de potencial. • Mayor sensibilidad • Mayor resolución Polarografía clásica vs de pulso De acuerdo al programa de potencial aplicado se ha dado origen a las siguientes técnicas: Técnicas de barrido: Polarografía clásica Voltamperometría de barrido lineal (LSV). Para ello se utiliza un martillo mecánico que despega la gota después de un intervalo de tiempo. Técnicas de pulso: Voltamperometría y polarografía de pulso diferencial (DPV–DPP).• La medición de la intensidad se realiza durante un período cercano al final de la vida de cada gota. Técnicas de redisolución: Voltamperometría de redisolución de pulso diferencial (DPSV). . Se mejora sensibilidad y resolución Polarografía de pulso • Durante un tiempo muy corto se aplica un pulso de potencial durante el ultimo 1/4 de tiempo de vida de la gota. • Mas sensible que la polarografía convencional DC y la de Tast. Forma de la señal Pulso diferencial La i se muestrea 2 veces. LD aprox. Polarografía o voltamperometría diferencial de pulso. 1x10-7M Onda cuadrada Voltamperometría o Polarografía de onda cuadrada LD aprox. 1x10-8M Onda triangular Voltamperometría cíclica E Curva i-E E T ie m p o T ie m p o . Voltamperometría de onda cuadrada de redisolución anódica (SWASV) y catódica (SWCSV).Voltamperometría de redisolución de barrido lineal (LSSV). Depósito. SWAdV. Sensibilidad: bajo ppb Redisolución anódica . SWSV.Resumen técnicas polarográficas Técnicas de stripping • • • • Técnicas en 2 etapas: a) acumulación. adsorción b) barrido. CV. etc. PDV. • Determinación de constantes de equilibrio. La separación es posible debido a que iones con diferente relación q/R migran a diferentes velocidades. Voltaje aplicado por unidad de longitud del medio de separación Medio de separación E ↑ v↑ conductor de la corriente eléctrica controla la carga eléctrica medio tamponado . Mo(VI). ambientales y alimentos: Principalmente: Cu. Zn. etc. Cd. • Capacidad complejante.Aplicaciones • Metales traza en matrices biológicas. Voltamperometría cíclica ELECTROFORESIS Técnica de separación que se basa en la capacidad de un soluto para desplazarse en un medio conductor por influencia de un campo eléctrico. Ni(II). Pb. Cr(III) y Cr(VI). La movilidad electroforética es la respuesta del analito al campo eléctrico aplicado (cationes al cátodo. η es la viscosidad del solvente tampón y r es el radio del analito). Los cationes de la doble capa migran hacia el cátodo y como están solvatados arrastran disolución. Al aplicar campo eléctrico El resto de las cargas (+) se mueven hacia el polo (-) Se genera un flujo de tampón que arrastra todo lo que hay en el interior del capilar . Flujo electroosmótico se produce cuando la disolución tampón se mueve por el capilar en respuesta al campo eléctrico. Movilidad electroforética y Movilidad electroosmótica. formando una doble capa. aniones al ánodo y las neutras permanecen estacionarias). produciendo flujo electroosmótico. los componentes de la muestra migran debido a 2 tipos de movilidades. A pH superior a 2 o 3 los grupos silanol (Si-OH) se ionizan formando silanatos atrayendo a los cationes del tampón en forma mas fuerte y más débil. Vef : µ efdelsoluto x E µ ef = q/6Π η r (q es la carga del analito. Cuando se aplica un campo eléctrico a este tubo. la muestra se inyecta en una disolución tamponada retenida en el interior de un tubo capilar. En general el tampón se mueve hacia el cátodo arrastrando a los analitos • La electroosmosis se produce porque las paredes del tubo capilar poseen carga eléctrica.En la electroforésis capilar. rapidez) Características electroforesis capilar RAPIDEZ ALTAS EFICACIAS PEQUEÑOS VOLÚMENES DE MUESTRA (nanolitros) AMPLIO RANGO DE APLICACIONES (Modos de EC) AUTOMATIZACIÓN DETECCIÓN EN LÍNEA (“on column”= en el propio capilar) .VENTAJAS electroforesis capilar electroforesis convencional MEJOR DISIPACIÓN DE CALOR ( ↑S /V ) et x in t POTENCIALES DE VARIAS DECENAS DE kV (E↑) TIEMPOS DE ANÁLISIS CORTOS DETECCIÓN EN CONTINUO AUTOMATIZACIÓN (sencillez. DETECCIÓN EN LÍNEA (“on column”) Monocromador Rendija Haz de luz UV Fotodiodo Fuente de luz Capilar Lente Absorción UV-Vis Fluorescencia (no todos los compuestos fluorescen) Amperométrica (no se disipa la corriente residual) MS (problemas de interfase) ELECTROFORESIS CAPILAR ⇔ HPLC PROPIEDADES ELECTRICAS DEL ANALITO DIFERENTE DISTRIBUCION ENTRE FASES t Flujo Flujo t - Perfil de flujo plano (mayor eficacia) Diferentes mecanismos de separación Mayor rapidez Menor requerimiento de muestra Peor reproducibilidad en analisis cuantitativo Problemas a escala micropreparativa . carbohidratos. Estudios de especiación. . DNA. aminoácidos. etc. Biociencia: Péptidos. proteínas. Reacciones quirales. iones inorgánicos. Alimentos: Cationes y aniones inorgánicos.- • • • • • Análisis Farmacéutico: Moléculas de baja masa molar. carbohidratos. ácidos orgánicos. metales de transición. compuestos cargados y neutros. Determinación de pureza. surfactantes. chequeo de productos finales. colorantes. estabilidad. Química Ambiental: pesticidas. Tiras colorimétricas 2. Sacarosa.Repetitividad Tipos y usos mas comercializados: 1.Ópticos: BIAcore: Ag proteicos.Reutilización . Alcohol.Anticuerpos x Antígenos .Lectinas x Carbohidratos .Enzimas x Sustratos . Lactato. Colesterol . Electroquímicos: . Laminoácidos. Alcohol 3. Ventajas: . Glicerol.Menor manipulación .BIOSENSORES “Instrumentos analíticos que transforman procesos biológicos en señales eléctricas u ópticas y permiten su cuantificación” Utilizan la especificidad de los procesos biológicos: .Potenciométricos: Glucosa. .Amperométricos: Glucosa.Complementariedad de ácidos nucleicos. Lactosa.Menor tiempo de ensayo . Biosensores electroquímicos – Amperométricos: Determinan corrientes eléctricas asociadas con los electrones involucrados en procesos redox . 2. militares y medio ambientales: – Alimentación – Cosmética – Control de Fermentaciones – Controles de Calidad – Detección de Explosivos – Detección de gases nerviosos y/o toxinas biológicas – Control de polución. Tipos de biosensores 1. Consultas y Urgencias Hospitalarias: – Obvia análisis caros y lentos en laboratorios centrales – Acelera la diagnosis y el comienzo del tratamiento – Menor riesgo de deterioro de la muestra 3.1. Aplicaciones in vivo: – Páncreas artificial – Corrección de niveles de metabolitos – Problemas : Miniaturización y Biocompatibilidad 5. Diagnóstico Doméstico: – Ensayos de Embarazos – Control de Glucosa en diabéticos 4. Control de metabolitos críticos durante las operaciones quirúrgicas. Aplicaciones Industriales. Biosensores piezoeléctricos 4.Potenciométricos: Usan electrodos selectivos para ciertos iones Conductimétricos: Determinan cambios en la conductancia asociados con cambios en el ambiente iónico de las soluciones 2. Biosensores celulares 6. Biosensores ópticos – De onda envanescente – Resonancia de plasma superficial 5. Inmunosensores Material biolico + Analito Analito Respuesta unido biolica Respuesta Electr ica Respuest a electric a (M痊ima respuesta electrica posible) x (Concentraci del analito) (Constante de semisaturaci) + (Concentraci del analito) – – = . Biosensores termométricos 3.