analisis (1)

1.8. Calibración.Según ISO (International Estándar Office), se entiende por calibración al conjunto de operaciones que permiten establece, bajo condiciones específicas, la relación entre las señales producidas por un instrumento analítico y los correspondientes valores de concentración [ ] o masa del juego de patrones de calibrado. El procedimiento consiste en que el operario prepara una serie de muestras (5-6) con [ ] conocida de analito, las mide en el instrumento en iguales condiciones y seguidamente medirá las muestras problema. De esta manera, a partir de la señal obtenida para cada patrón de [ ] conocida se construye la gráfica de calibración, y a partir de esta se interpola la [ ] del analito en las muestras problema. Figura. Nro. 27. Conjunto de operaciones en el proceso de calibración en química analítica. LS=Recta global por mínimos cuadrados de regresión, es muy sensible a los valores atípicos. Fuente: www.uclm.es/profesorado/.../4-ESPECTROSCOPIA%20ATOMICA.pdf.(Abril 2012) El procedimiento anterior presenta varias preguntas estadísticas: 1. ¿Es lineal la gráfica de calibración?, y si es curva ¿Qué grafica tiene? 2. Teniendo en cuenta que cada uno de los puntos de la gráfica está sujeto a errores, ¿Cuál es la mejor recta que pasa por esos puntos? 3. Suponiendo que la calibración es lineal, ¿Cuáles son los errores estimados y los límites de confianza para la pendiente y la ordenada en el origen? 4. Cuando la gráfica se usa para el análisis de una muestra problema, ¿cuáles son los errores y los límites de confianza para una [ ] determinada? 5. ¿Cuál es el límite de detección del método, es decir, la menor [ ] de analito que se puede detectar con un nivel de confianza predeterminado? Tabla Nro. 20 Relación entre los tipos de ensayo los parámetros de desempeño Fuente: http://www.lysconsultores.com/Descargar/NT004.pdf Figura. Nro. 28. Criterios de la calidad de una calibración analitica. Fuente: www.uclm.es/profesorado/.../4-ESPECTROSCOPIA%20ATOMICA.pdf.(Abril 2012) 1.8.1. Calidad de una calibración. La calidad de la determinación de una concentración no puede ser mejor que la calidad intrínseca de la calibración. Los factores que determinan la calidad de una calibración son: a. La precisión de las medidas: estimada a través de la repetitividad y la reproducibilidad de las medidas. La repetitividad se evalúa a través del cálculo de la desviación estándar relativa (RSD%) de la medida de los patrones de calibrado. En la práctica puede ocurrir que la repetitividad para los patrones sea más pequeña que para las muestras, por lo que será necesario fabricar patrones similares a las muestras o agregar el analito a las mismas. b. Exactitud de los patrones. Es esencial que los patrones de calibración cubran el intervalo completo de [ ] requerido en los análisis en los que se encuentran las muestras problemas. Valor de concentración o masa asignado a cada patrón trae aparejado un error pequeño si es preparado a partir de reactivos puros (grado analítico) con estequiometria bien definida. Este error en general se desprecia, frente al error en las medidas de las señales producidas por el instrumento. c. La [ ] de las muestras problema se calcula por interpolación, a excepción del método de la adición de estándar, que se hace por extrapolación. d. Es importante incluir una muestra en blanco en la curva de calibración. Esta muestra no contiene ningún analito, pero si contiene la misma composición que las otras muestras estándar de referencia, y está sujeta a la misma secuencia del proceso analítico. La respuesta podría ser cero, pero por impurezas de reactivos u otras causas pueda no ser así. e. La curva de calibración se presenta siempre con la respuesta del instrumento en el eje de las ordenadas y la [ ] de los patrones en el eje de abscisas. f. Validez de la calibración. Generalmente es el factor más importante. Cuando se calibra un instrumento se debe tener una razonable certeza de que éste responderá de igual manera a los patrones así como a las muestras, aunque estas tengan una matriz relativamente diferente*. Si estas diferencias son muy grandes, pueden llegar a invalidar el proceso de calibración. Es necesario estar completamente seguro de que el calibrado del instrumento es válido antes de utilizarlo para obtener el valor de la concentración de la muestras incógnita. En caso contrario, pueden cometerse serios errores en la determinación. Muchas veces, el uso de instrumentos verificados legalmente dentro de un sistema de calidad puede presentar problemas, ya que sólo se indican los EMP (errores máximos permitidos), sin la determinación de la incertidumbre. http://www.labci.com.ar/nota04.html Cuadro Nro. 17 Calibración y regresión Patrones de calibración 1. Concentración conocida 2. Cubrir el rango de concentración de las muestras a analizar en los ensayos 3. Mismoas disolventes y reactivos qque en el ensayo 4. Matriz lo más parecida posible que la muestra real 5. Incluir el blkanco en la curva (no restar) Gráfica de calibración 1. Señal instrumental en ordenadas 2. Concentración, cantidad en abcisa 3. Habitualmente lineal y= a + bx Errores 1. Coeficiente de variación de señal instrumental de 2-3% 2. Preparación del patrón < 0.1% (despreciable) 3. Si se realiza varias medidas punto calibración: Distribución gaussiana normal. Fuente: www.slideshare.net/todocello/tema-4-calibraciones-y-regresin-3946691 1.8.2. Grafica de calibración. En esta técnica se preparan una serie de soluciones estándar que contienen [ ] conocidas del analito teniendo en cuenta los puntos antes señalados. Dichas soluciones deben cubrir el intervalo de [ ] de interés, asi como tener una composición matricial tan parecida como se pueda a la de las soluciones de las muestras problema. También se analiza una solución en blanco de fondo. Generalmente hay una relación lineal entre la señal analítica y, y la [ ] x. Por ello los datos se ajustan a una recta por el método de mínimos cuadrados, es decir, minimizando la suma de los cuadrados de los residuos y. Una vez establecida la gráfica de calibración se puede obtener la [ ] de analito en cualquier muestra problema por interpolación del valor en dicha recta: Señal = constante x concentración y = m x (18) La constante m es llamada sensibilidad y corresponde a la constante de proporcionalidad entre la señal y la concentración. Esta proporcionalidad es útil sobre un restringido intervalo de valores. A valores muy bajos de concentración la señal es demasiado pequeña y está sujeta a una gran incertidumbre. A valores muy altos la proporcionalidad dada en ecuación (18) puede dejar de ser válida. Este modelo es utilizado en muy pocos casos. Si la respuesta a concentración cero de analito no es conocida de antemano, es necesaria una calibración con un mínimo de dos puntos. Para esta calibración se utiliza un modelo lineal con un término constante: Señal = señal del blanco + constante x concentración y = m x + b (19) El término b indica la magnitud de la señal estimada del blanco, mientras que m es la pendiente de la recta de calibrado e indica nuevamente la sensibilidad. Estadísticamente, una calibración realizada a partir de dos puntos es muy pobre y su construcción a partir de un número mayor de patrones es obligatoria. El procedimiento estadístico para determinar los coeficientes b y m de la ecuación (19) se denomina regresión por cuadrados mínimos. Figura. Nro. 29. Métodos instrumentales de establecer la relación señal/concentración. Fuente: www.slideshare.net/todocello/tema-4-calibraciones-y-regresin-3946691 La regresión por cuadrados mínimos es una herramienta muy útil, sin embargo, deben conocerse sus limitaciones. Además de la regresión por cuadrados mínimos siempre debe hacerse una inspección gráfica de los datos obtenidos, para detectar puntos anómalos test Q de Dixon valores dudosos o fallas en la linealidad. Las ecuaciones mediante las que se obtienen los coeficientes de la ecuación (19) se detallan en la próxima sección. a. ¿Por qué se prefiere la calibración lineal? Esta apoyado por un soporte teórico (Ley de Lambert-Beer, ecuación de Ilkovic y otros), el tratamiento matematico es mas sensillo y más intuitivo, la sensibilidad es constante en la región de calibrado y a cada valor de la señal analítica le corresponde un único valorde concentración. Figura. Nro. 30. Utilizar los datos para adaptar a una línea de predicción que relacione una variable dependiente y una sola variable independiente x. Es decir, queremos escribir y como una funciónlineal de x: y = α + ßx +ε. Linea verdadera (true line). Fuente: www.uclm.es/profesorado/.../4-ESPECTROSCOPIA%20ATOMICA.pdf.(Abril 2012) a. ¿Por qué se prefiere la calibración lineal? Esta apoyado por un soporte teórico (Ley de Lambert-Beer, ecuación de Ilkovic y otros), el tratamiento matemático es mas sensillo y más intuitivo, la sensibilidad es constante en la región de calibrado y a cada valor de la señal analítica le corresponde un único valor de concentración. 1.8.3. Cálculo de la recta de regresión por mínimos cuadrados. Es la recta que minimiza la suma de los cuadrados de los residuos, se establece una recta lineal que relaciona x e y. Para el modelo de la ecuación (19) los puntos individuales sobre la recta los denotaremos como:{(x 1 , y 1 ) = blanco, (x 2 ,y 2 ), (x 3 ,y 3 )} siendo el primer punto el corresponde a la lectura del blanco. Como los residuos de y, algunas veces serán negativos y otros positivos, se intenta minimizar la suma de los cuadrados de los residuos. Esto explica el uso del término de minimos cuadrados, por lo que la recta buscada pasa por el centro de gravedad, y su pendiente y su ordenada en el origen serán: b ∑ ( ̅)( ̅) ∑ ( ̅) (20) a =̅ ̅ (21) Donde: ̅, ̅ son promedio aritméticos de los valores de x (patrones de concentración = [ ]) y valores de y (señales). En la ecuación (20), el numerador es simbolizado S xy y el denominador S xx la expresión: S yy ∑ ( ̅) Se denota con el símbolo S yy Ejemplo Con la pendiente y la ordenada en el origen se construye la recta de regresión de y sobre x: y = 1.93x +1.52 (22) Figura Nro. 31. Grafica de una recta de regresión. Fuente:www.slideshare.net/todocello/tema-4- calibraciones-y-regresion-3946691. Este método es ampliamente utilizado en todas las ramas de las ciencias, encontrándose incorporado en muchas calculadoras y planillas de cálculo. La calidad de la calibración se evalúa prediciendo el valor de la señal ̂, para los distintos patrones a través del modelo utilizado (ecuación 22). Las diferencias entre la señal observada y las predichas se denominan residuos. A partir de estos valores se calcula: http://www.slideshare.net/todocello/tema-4-calibraciones-y-regresin-3946691 √ ∑( ̅ ) √ [S y/x para (N-2)] (23) S y/x es llamada desviación estándar residual y tiene unidades correspondientes a la señal observada. También se la conoce como s y/x en el texto de Miller o como s e en otros textos.Es una estimación de los parámetros de regresión.Se emplea N-2 grados de libertad para una regresión lineal simple, ya que hay N datos disponibles. Es importante conocer las limitaciones del método de cuadrados mínimos. Al deducir las ecuaciones anteriores fueron realizadas algunas suposiciones. Estas no siempre se cumplen en un problema de química analítica, por lo que debemos estar atentos. Las suposiciones que se realizan son: Figura Nro. 32. Los errores de la pendiente y ordenada en el origen parecida a la desviación estándar de medidas repetidas de una distribución gaussiana excepto que ahora trabajamos con una recta (n-2). Fuente: http://www.slideshare.net/todocello/tema-4-calibraciones-y-regresin- 3946691 a. La incertidumbre en la concentración de los patrones es despreciable frente a la desviación estándar de la señal medida. Para ello los patrones de calibrado deben ser preparados con una precisión superior a la de la medición de la señal. b. Todas las medidas son estadísticamente independientes unas de otras. Cualquier tendencia de las señales a través del tiempo (deriva de la línea de base o contaminaciones secuenciales) invalida el calibrado. c. Todas las medidas tienen igual desviación estándar, la cual no depende del valor de la señal observada, por lo tanto las señales altas tendrán igual desviación estándar que las pequeñas. Esta suposición es particularmente discutible si se trabaja en un amplio intervalo de concentraciones. Si no se cumple, es necesario utilizar un método de calibración ponderado por las desviaciones estándar de las medidas. d. Las medidas están normalmente distribuidas. En general, el error en una medida analítica es una suma de errores independientes provenientes de distintas partes del instrumento. Aunque el error de cada fuente individual no sea normalmente distribuido, la suma de esas contribuciones, producirá una distribución normal. De todas las suposiciones anteriores, la más débil es la tercera, porque en general a bajas concentraciones, la precisión de las medidas empeora. Una buena aproximación puede realizarse restringiendo el intervalo en el cual se realiza la curva de calibración, de manera que la precisión sea constante. Si no se desea disminuir el rango lineal, se debe hacer una regresión ponderada. La ecuación (24) se usa para calcular la concentración de una muestra incógnita: (24) Figgura Nro. 33. Los errores de estos parámetros se calculan a partir de la varianza de regresión, que estiman los errores aleatorios en la dirección y. Nro.xxx Fuente: http://www.slideshare.net/todocello/tema-4-calibraciones-y-regresin-3946691 Para controlarla calidad de la información obtenida se puede establecer el intervalo de confianza del modelo. La desviación estándar (mas correctamente llamada error estándar) de la pendiente, s m . Desviación estándar de la pendiente. S b √ √∑( ̅) Intervalo de confianza de la pendiente: b t (n-2) S b (25) La desviación estándar de la pendiente S b (error estándar) y de la ordenada S a al origen es: √ √ S b √∑ ( ̅ ) S a = S R √ ̅ ̅ √ ∑( ̅) (26) ̅ = puntos sobre la recta de regresión calculada, correspondientes a los valores de x, es decir; los valores de y ajustados. El valor de ̅ para un valor de x dado, se calcula a partir de la ecuación de regression. Los valores de S m y S b se pueden utilizar para estimar los límites de confianza para la pendiente y la ordenada en el Origen. Así, los límites de confianza para la pendiente viene dados por: b= t (n-2) S b con t que se obtiene para un nivel de confianza deseado y n-2 grados de libertad. De manera similar, los límites de confianza para la ordenada en el origen son: a= t (n-2) S a Intervalo de confianza de la ordenada en el origen: a t (n-2) S a Predicción en muestras incognitas. Los valores de b y a se requieren para realizar predicciones en muestras incognitas, a través de la ecuación: y = bx +a, donde puede obtenerse la concentración estimada del analito en la muestra: x inicial = (y inicial - a)/b Figura. Nro.34. Fuente: http://www.slideshare.net/todocello/tema-4-calibraciones-y-regresin-394669 Si tenemos una muestra de señal y o se puede calcular la concentración correspondiente a la misma como: Un resultado no es tal, sin embargo, si no está acompañado por su correspondiente nivel de incetidumbre. Para informar x inic con su incertidumbre asociada, y establecer su número correcto de cifras, es necesario calcular el error estándar en la concentración predicha Sx inic, lo cual se lleva a cabo mediante la siguiente expresión S xinic √ ( ̅) Siendo: (27) y inic = Valor de la señal experimental de la muestra N = Número de patrones utilizados en calibración x inic = Concentración de patrones de calibración. L = Repeticiones de la medida de la muestra. Sy/x = es el desvio estándar de los residuos de la regresión dado por la ecuación (26) Intervalo de confianza de la concentración interpolada La ecuación (27) permite calcular la desviación estándar para la concentración obtenida a partir de la media ̅ de un conjunto de L análisis repetidos cuando se usa una curva de calibración de N puntos. Recuérdese que ̅ es el promedio de la señal obtenida para los N datos de la calibración. A medida que el valor de la señal ̅ x se acerca al valor promedio ̅ el error de la determinación disminuye, por lo que es mejor determinar muestras cuyo valor de señal se encuentre en el centro de la curva de calibrado. Cuantas más veces se repite el análisis de la muestra incógnita, mayor será L y por lo tanto menor será la desviación estándar. El diseño de la curva de calibrado también es importante, puesto que S xx debe ser pequeño. Esto se logra aumentando la cantidad de patrones en los extremos de la curva de calibrado. La raíz cuadrada de la ecuación (27), y la segunda con los términos: que colectivamente recibe el nombre de de leva (del inglés). La leva mide, de algún modo, la distancia de la muestra incognita al centro de la calibración. ¿Cómo expresamos la incertidumbre del resultado de una muestra incógnita? Esto se hace en base a un intervalo de confianza para el promedio de concentraciones obtenidos mediante L análisis repetidos de la muestra. Puesto que en general el número de muestras utilizado en la calibración es pequeño se debe utilizar el parámetro t para generar un intervalo de confianza. Este intervalo de confianza de la concentración interpolado se calcula mediante la ecuación (28). Los resultados para una muestra incógnita se expresan como: ̅ ̅ (28) Donde t depende del número de muestras realizadas en la calibración y del intervalo de confianza deseado (ver tabla 14,15,16 y 17 Pag. Nro. 42). No debemos olvidar el correcto redondeo de las cifras decimales, que deberá hacerse cuando se hayan finalizado los cálculos. e. Ámbito Lineal del calibrado. Una parte importante de la tarea de calibración de un instrumento analítico es determinar el intervalo de concentraciones para el cual el modelo lineal es válido. Hay tres maneras de verificar esto, ninguna de ellas excluye a las otras. Diagrama. Nro. 04. Representación de la correlación de Pearson.Fuente: aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/mod/.../view.php? La primera, es la investigación del gráfico de residuos en función de la concentración. Los residuos deben ser todos de la misma magnitud y deben estar distribuidos aleatoriamente en su signo (en una secuencia del tipo ± ± ± etc.). Si esto no fuese así, debe sospecharse una relación no lineal entre x e y por lo que debe disminuirse el rango de trabajo, o bien aplicar otro modelo, si la teoría así lo permite. Otra manera de verificar la validez del modelo lineal es mediante el cálculo del coeficiente de correlación (r) de Pearson: resumen: r ∑,( ̅ )( ̅)- √,∑( ̅ ) -,( ̅) - -1 (29) b , ∑ ∑ ∑ , ∑( ̅ ) ∑( ) (∑ ) b Pendiente Sensibilidadinstrumental: a ̅ ̅ , Ordenada en el origen. ∑( ̅) ∑( ) (∑ ) El coeficiente de correlación vale 1 o –1 en el caso de que las variables estén perfectamente correlacionadas, pero no debe mal interpretarse puesto que un coeficiente de correlación de 1, no +1 -1 0.90 0.70 0.50 0 Buena Débil Poca Pésimo necesariamente significa que la linealidad sea buena, sino que el numerador y el denominador de la expresión anterior se cancelan mutuamente. Es común obtener buenos coeficientes de correlación con rectas de regresión que no responden a un modelo lineal. El coeficiente de correlación sólo es otro indicio adicional que debe sumarse al análisis de los residuos. En ocasiones se obtienen valores de r más bajos, siendo necesario utilizar una prueba estadística para establecer si r es realmente significativo. El método más simple es calcular un valor de t usando la ecuación: (√) √( ) (30) Este valor está tabulado y se compara usando una prueba t de dos colas y (n-2) grados de libertad. Si t calculada es mayor que t teórico, se puede asegurar que existe una correlación significativa. También se pueden calcular los límites de confianza de la pendiente y de la ordenada en el origen, y comparar que estos parámetros están incluidos dentro de estos límites. 1.8.4. El tercer método es el análisis de la varianza de la regresión. El análisis de la varianza (ANOVA) puede utilizarse para detectar una falla de ajuste en la regresión. Muchas planillas de cálculo realizan este cálculo automáticamente. Para realizar este análisis de forma completa, se necesitan datos replicados para cada patrón. Test F de Linealidad. Este Test se basa en descomponer la varianza existente entre las señales experimentales y los valores predichos en dos aportes. Uno de ellos es el error experimental. Para tener una estimación del error experimental en la medición de las señales, debemos medir “i” replicados de cada patrón, por lo que para cada punto x habrá varios valores de señal (y i ). Para estimar la varianza debida al error puramente Experimental, calculamos la media de los cuadrados debida a esta contribución (MS PE , Mean Squares Pure Error): (La media de cuadrados de error puro) MS PE ∑ ∑ ( ̂ ) (31) Donde n es el número total de mediciones, k es el número total de patrones, i son las repeticiones de cada patrón y los y ij son las señales de todos los experimentos. Para estimar el posible error debido a una falla de ajuste debida a la elección de un modelo incorrecto, calculamos la media de los cuadrados debida a la “falta de ajuste” (MS LOF , Mean Squares Lack of Fit): (Media de los Cuadrados falta de ajuste) MS LOF ∑ (̅ ̂ ) (32) F cal (33) Esto mide la diferencia media entre la media de las réplicas de cada patrón y su correspondiente valor estimado por la regresión. Cabe esperar que si el modelo lineal es correcto, las varianzas MS LOF y MS PE serán comparables. Si MS LOF es mayor que MS PE el ajuste no es correcto y hay que utilizar otro modelo o reducir el ámbito de concentraciones en el cuál se hace el calibrado. Para comparar M LOF y MS PE hacemos un test F de varianzas calculando (33) Si Fcal < Fk-2, n-k,o (obtenido de tablas) se acepta que existe buen ajuste al modelo lineal. Los cálculos de ANOVA pueden ser un poco engorrosos y se recomienda el uso de planillas de cálculo que facilitan mucho la tarea. 1.9. Adición de estándar y estándar interno. En el método del adición de estandar se le agrega a la muestra, concentraciones crecientes del analito de interés. La señal obtenida se deberá a la cantidad de analito originalmente presente en la muestra sumada a la cantidad agregada. El propósito de estos métodos es generalmente corregir efectos de interferencias multiplicativas (las interferencias multiplicativas son aquellas que producen un cambio en la concentración) debidas a la matriz de la muestra. Una vez obtenidas, la señales instrumentales se grafican versus las cantidades de analito añadidas. Figura. Nro. 35. Métodos de calibración en instrumentación. Fuente: www.uclm.es/profesorado/.../4-ESPECTROSCOPIA%20ATOMICA.pdf.(Abril 2012) 1.9.1. Método de adición de estándar. Otra solución consiste en realizar todas las medidas sobre la muestra problema, esto se consigue usando el método de la adición estándar. Este método consiste en tomar volúmenes iguales de problema, añadir a cada uno por separado cantidades distintas de analito, excepto a una de las muestras, y finalmente diluir todas las muestras al mismo volumen final. Seguidamente se determinan las señales instrumentales para cada disolución y se representan los resultados. La escala de concentración (x) se define con las [ ] concentraciones de analito agregadas a las soluciones muestra. Por tanto, la [ ] desconocida está dada por el punto en el cual la línea extrapolada corta al eje x, es decir, el valor de x para y = 0. Este valor es igual a la razón de la ordenada en el origen y la pendiente de la recta de regresión establecida por mínimos cuadrados. b y a están sujetos a error, así el valor calculado para la [ ], también lo estará. Pero en este caso el resultado no se obtiene a partir de medidas de una sola muestra, por lo que, la desviación estándar del valor extrapolado se calcula de la siguiente forma: (35). La recta de regresión se calcula de manera usual. Para conocer la concentración de la muestra incógnita se extrapola la recta al punto sobre el eje x donde y=0. La intersección negativa sobre el eje x corresponde a la cantidad de analito en la muestra problema. Este valor viene dado por a/b. En este caso los resultados se expresan como: √ ̅ (34) √ (̅) ∑( ̅) (35) En esta expresión no aparece L como en la expresión (27), puesto que no se hacen réplicas de cada muestra, sino que se hace un agregado patrón por cada una de ellas. Esto demanda mucho tiempo y esfuerzo. No debemos olvidar que para obtener el valor de concentración en la muestra original, debemos corregir al valor de x y a su incertidumbre, por las diluciones hechas.Fuente: http://es.scribd.com/doc/42087016/Calibracion-y-Limite-de-Deteccion-en-Tecnicas-Instrumentales. Figura. Nro.36. La adición de patrón es apropiada cuando la composición de la muestra es desconocida o compleja y afecta a la señal analítica. Fuente: http://www.slideshare.net/todocello/tema-4-calibraciones-y-regresin-394669 Puede observarse que al aumentar N mejora la precisión de la cantidad estimada, siendo necesarios al menos 6 puntos en un experimento de este tipo. Además se mejora la precisión maximizando esta cantidad, por lo que, el intervalo de [ ] a cubrir por las disoluciones de calibración debe ser lo más amplio posible. Los límites de confianza para la [ ] del analito en la muestra problema vendrán dados por: [C Analito ] = x E ± t Sx E Diagrama Nro. 05: Lectura del analito con agregado patrón Esta es una representación para orientar al alumno cuando tiene que desarrollar sus prácticas de laboratorio. Figura. Nro. 37. Representación gráfica del método de adición de un patrón en la solución problema. Fuente: www.slideshare.net/todocello/tema-4-calibraciones-y-regresin-3946691 Figura. Nro.38. La incertidumbre de la concentración por adición de patrón, método de extrapolación. Fuente: http://www.slideshare.net/todocello/tema-4-calibraciones-y-regresin-394669 1.9.2. Método de estándar interno. Una cantidad fija de una sustancia pura (estándar interno), se añade tanto a las soluciones muestra como a las soluciones estándar. Figura. Nro. 39. Adición de un patrón interno en la solución problema. Fuente: www.slideshare.net/todocello/tema-4-calibraciones-y-regresin-3946691 El estándar interno debe ser una sustancia similar al analito con una señal fácilmente medible y que no interfiere con la respuesta del analito. Después se determinan las respuestas del analito y del estándar interno, y se calcula el cociente de las dos respuestas. De esta manera, si sé varia algún parámetro que afecte a las respuestas medidas, dichas respuestas del analito y del estándar interno, deben ser afectadas por igual. Por tanto, el cociente de respuestas depende solamente de la concentración de analito. Figura. Nro.40. La incertidumbre de la concentración por adición de patrón, método de extrapolación. Fuente: http://www.slideshare.net/todocello/tema-4-calibraciones-y-regresin-394669 Una representación de la relación o cociente de respuestas analito a estándar interno como función de la [ ] del analito, da una gráfica de calibración cuyo ajuste se hace por mínimos cuadrados. 1.9.3. Parámetros característicos. “El primer objetivo de un proceso de medición en el laboratorio debe ser alcanzar su control estadístico” a. Límite de Detección. En Análisis Instrumental, debemos aprender a elegir la técnica correcta para cumplir con nuestro análisis. Para ello, debemos comparar muchas “figuras de mérito” de cada método. Las figuras de mérito forman una base común sobre las que se pueden comparar los métodos analíticos. Ya hemos visto algunas figuras de mérito, como ser la sensibilidad, la exactitud y la precisión. Otra figura de mérito importantísima es el Límite de Detección. Puede definirse como aquella que proporciona una señal instrumental significativamente diferente de la señal del blanco o señal de fondo. El cálculo del límite de detección responde la pregunta: ¿Cuál es la menor concentración que podemos detectar con este método de análisis? Para responder a esta pregunta, debemos analizar cuál es la menor señal detectable. Figura Nro. 41. Validación límite de Cuantificación, detección y de ruido. Fuente: www.ops- oms.org/Spanish/AD/THS/EV/bpm-Validacion04.pp La probabilidad que la más pequeña señal analítica discernible, y L , puede ser medida y no corresponde a una fluctuación aleatoria de la medida del blanco, y B , depende de a cuantas unidades de desviación estándar del blanco (s B ) está y L de ̅ (promedio de las medidas del blanco). Si la diferencia entre y B e y L es 3s B la probabilidad que la medida de y L sea una fluctuación del blanco es menor que el 0,13% (si el número de medidas del blanco es superior a 25). Para determinar la concentración límite, x L ,, IUPAC define que : (36) Ideal Ideal 0.70 0.50 0.90 Muy buena Débil Donde k es un valor que se elige de acuerdo al nivel de confianza que se desee, generalmente 3. La concentración límite es una función de y L y por lo tanto: (37) En donde x L es la señal límite, obtenida para la concentración mínima detectable de analito. Sustituyendo la ecuación (36) en la (37) se obtiene que: S B = desviación estandar del blanco (38) Por lo tanto el límite de detección puede encontrarse dividiendo ks B por la pendiente obtenida por regresión de la curva de calibración. Sin embargo, la concentración límite así obtenida será un reflejo del verdadero límite de detección sólo si la pendiente, m, y la ordenada al origen, b, están bien calculadas. El método IUPAC utiliza como fuente de variabilidad de las señales, la desviación estándar del blanco. Un método alternativo, aunque menos usado, utiliza la desviación estándar de los residuales del calibrado s x (ecuación 27) como estimador de la desviación estándar del blanco. Esto es útil si no se ha repetido el blanco y s B no puede calcularse. El método definido por la ecuación (37) es válido solo si la principal fuente de error está en el blanco. Por lo tanto, en la mayoría de los casos este método dará límites de detección más bajos que si se tiene en cuenta todo el error del calibrado. Un detallado artículo sobre límite de detección puede leerse en Analytical Chemistry; 55 (1983) 712A. Experimentalmente, el límite de detección se determina involucrando todos los factores que afectan la medida y se define, en general, para obtenerlo en unidades de concentración como: LD = 3s B / m cal bajas concentraciones (39) Donde, s B = desviación estándar de los blancos, (b) m cal es la pendiente de una curva de calibración del sistema, preparada a muy bajas concentraciones. Este criterio es recomendado por IUPAC. Aplicado a los métodos espectrofotométricos, entonces, s B = desviación estándar de los blancos en absorbancia y (b) m cal pendiente de la curva de calibración (A vs [C]) en unidades de Absorbancia/Concentración, por lo tanto, al calcular la relación el límite de detección se obtiene en unidades de concentración. Otros autores, utilizan para calcular el límite de detección, la siguiente expresión: (40) En donde C nominal es la concentración del patrón de baja concentración y C promedio corresponde al promedio aritmético, de las concentraciones halladas experimentalmente por interpolación (después de interpolar la absorbancia en una curva de calibración), de por lo menos diez replicas de la solución de baja concentración. Este criterio aunque no lo recomienda IUPAC es muy utilizado en diferentes laboratorios. b. Límite de cuantificación: Corresponde a la cantidad o concentración del analito a partir de la cual es confiable realizar determinaciones cuantitativas y se define como: Límite de cuantificación = LOQ = 10s B / m cal bajas concentraciones (41) Definición sugerida recientemente por organismos oficiales de EEUU. En términos generales se puede definir él limite de detección de un analito, como aquella [ ] que proporciona una señal instrumental significativamente diferente de la señal de una muestra en blanco, o la señal de fondo. “Significativamente diferente”, da al analista un buen margen de libertad para establecer la definición exacta del límite de detección. De hecho, en la práctica existe poco acuerdo entre los Organismos Oficiales sobre este acuerdo. Una definición aceptable de límite de detección, que ha sido sugerida recientemente por organismos de EEUU, es que el límite de detección es la cantidad de analito que proporciona una señal y e igual a la del blanco más tres veces la desviación estándar del blanco: y LD = y B + 3 S B (42) El límite de cuantificación o determinación considerado como el límite de [ ] más bajo para mediciones cuantitativamente precisas, se define como la cantidad de analito que proporciona una señal y e igual a la del blanco más diez veces la desviación estándar del blanco: y LQ = y B + 10 S B (43) En la práctica, cuando se trabaja con una recta de regresión convencional, se puede usar la desviación estándar de residuos S y/x en lugar de S B , y se puede emplear el valor de A = (0,0) como una estimación de la señal correspondiente al blanco. Una vez obtenido el valor de y obtendremos la [ ] correspondiente al límite de detección o cuantificación, a partir de la recta de calibrado. Para resolver problemas son definiciones ampliatorias a lo desarrollado anteriormente, pero que tienen el mismo concepto. Figura. Nro. 42. Representación gráfica de sensibilidad, LOD, LOQ (S b =S B ) y rango dinámico. Fuente: www.slideshare.net/todocello/tema-4-calibraciones-y-regresin-3946691 y LD = y B + 3 S B Luego: b + 3 S y/x = m x + b y LD = b + 3 S y/x x = (44) y = m x + b c. Rango de trabajo. Es el rango de concentraciones de analito el cual puede producir valores de absorbancia adecuados para análisis prácticos. Es imposible ser específico en definir este rango debido a que las necesidades analíticas pueden ser muy variables. No obstante como una regla general para un rango de trabajo debiera caer entre 0.1 y 0.8 U. ABS, pues esta es la región de mayor precisión óptica. Sin embargo, mediciones útiles pueden ser realizadas a absorbancias menores, y el rango completo de trabajo puede extenderse hasta el límite más bajo que es alrededor de 10 veces el límite de detección. Para análisis con llama, el cálculo del rango de trabajo es simple: El fabricante del instrumento usualmente proporciona la concentración característica que puede ser esperada para cada elemento en solución acuosa. Este valor puede entonces emplearse para establecer un rango nominal de trabajo. Figura. Nro. 43. [C m ] = Concentración mínima de sustancia apreciable, LC = Límite De cuantificación, LL = Límite de linealidad. Fuente: www.uam.es/personal_pdi/ciencias/.../InstrumentalLecc1.pdf Como la concentración característica corresponde a 0.0044 U. ABS, un factor 100 proporcionaría 0.44 U. ABS (alrededor de la mitad del rango óptimo). Una vez establecido lo anterior resulta fácil determinar el rango óptimo de trabajo. d. Rango lineal. El intervalo de [ ] en que es aplicable un método analítico va desde el limite de cuantificación hasta la [ ], a la cual, la curva de calibrado se desvía de la linealidad (LL). En el límite de cuantificación (LC), figura Nro. 42, la desviación estándar relativa de las medidas es de aproximadamente un 10 %, y disminuye con rapidez cuando aumentan las concentraciones [ ]. e. Sensibilidad. La sensibilidad de un instrumento o método se define como, su capacidad para discriminar entre pequeñas diferencias en la [ ] de un analito. La sensibilidad viene limitada por la pendiente de la curva de calibración y la reproducibilidad o precisión del sistema de medida, también se define como la pendiente del calibrado, de manera que para dos métodos que tengan igual precisión, el que presente mayor pendiente en la curva de calibración será el más sensible, y viceversa. La IUPAC, define la sensibilidad como la pendiente de la curva de calibración a la [ ] de interés. Como la mayoría de las curvas de calibración son lineales, en ellas la sensibilidad de calibración es independiente de la [ ], e igual a la pendiente de la recta de calibrado. Mandel y Stichler, definen la sensibilidad analítica a una determinada [ ], teniendo en cuenta la precisión, como: Donde m= pendiente S S = desviación estándar de las señales. = sensibilidad analítica. f. Selectividad. La selectividad de un método analítico durante el grado de ausencia de interferencias, debidas a otras especies contenidas en la matriz de la muestra. Desafortunadamente, ningún método analítico está totalmente libre de interferencias, y con frecuencia deben realizarse distintas operaciones para eliminarlas. Consideremos una muestra que contiene un analito A, así como dos especies potencialmente interferentes (B y C), encontrándose en [ ] C A , C B , C C , con sensibilidad de calibración: ma, mb, mc. La señal medida en el instrumento vendrá dada por: S blanco = ma C A + mb C B + mc C C + S bl (45) Se define el coeficiente de selectividad de B con respecto de A, como: El coeficiente de selectividad nos da la respuesta relativa del método para la especie B cuando se compara con A. Análogamente, el coeficiente de selectividad de C con respecto de A, será: Si sustituimos en la ecuación anterior estos coeficientes, obtenemos que: S = m A (C A + K B , A · C B + K C , A · C C ) + S bl (46) Los coeficientes de selectividad pueden variar desde 0 en ausencia de interferencias hasta 1 ó más. Un coeficiente será negativo si la interferencia causa una reducción en la intensidad de la señal del analito y a la inversa. Los coeficientes de selectividad son parámetros de calidad útiles para describir la selectividad de los métodos analíticos, pero son poco usados. g. Relación ruido-señal. La señal analítica puede dividirse en dos partes; una causada por los analitos componentes de la matriz de la muestra y la otra originada por la instrumentación usada en la medición, parte de la señal se conoce como ruido y constituye información no deseada, ya que degrada la exactitud y precisión del análisis, a la vez que aumenta el límite de detección. Para una señal cualquiera, la magnitud del ruido se define como la desviación estándar del valor de la señal medida, mientras que la señal viene dada por la media de la medida: S/N = ̅ (47) Conforme la [ ] disminuye hacia el nivel de trazas, el problema de distinguir las señales respecto al ruido, se hace cada vez más difícil, lo que ocasiona una disminución en la exactitud y presión de las mediciones a la vez que se aumenta el límite inferior de la cantidad de analito que se pueda detectar. h. Homocedasticidad: Varianza constante del término de error. Se refiere al supuesto de que las variables dependientes exhiban iguales niveles de varianza a lo largo del rango de los valores de las variables independientes. ¿Cómo evaluarla? 1. Examen visual de los residuos 2. Test de Levene: Igualdad de varianzas, este test es una alternativa al test de Bartlett. El test de Levene es menos sensible a la falta de normalidad que el de Bartlett. Sin embargo, si estamos seguros de que los datos provienen de una distribución normal, entonces el test de Bartlett es el mejor. El test de Levene se resuelve con un ANOVA de los valores absolutos de las desviaciones de los valores muestrales respecto a un estadístico de centralidad (media, mediana o media truncada) para cada grupo. La elección del estadístico de centralidad de los grupos detemina la robustez y la potencia del test. Por robustez se entiende la habilidad del test para no detectar erróneamente varianzas distintas, cuando la distribución no es normal y las varianzas son realmente iguales. La potencia significa la habilidad del test para señalar varianzas distintas, cuando efectivamente lo son. Fuente: http://erre-que-erre-paco.blogspot.com/2009/11/test-de- levene-para-la-igualdad-de.html Figura. Nro. 44. ¿Pero qué sucede si los datos tienen valores atípicos y/o no cumple con los supuestos de análisis de regresión? Fuente: www.uclm.es/profesorado/.../4-ESPECTROSCOPIA%20ATOMICA.pdf.(Abril 2012) 1.9.4. ¿Qué esperamos en el desarrollo del análisis instrumental? El análaisis instrumental que podemos conceptuar de otra manera, es la ciencia y la tecnología de los sistemas complejos que permiten medir magnitudes físicas cuyo objetivo es la obtención de datos que se transmiten a dispositivos de representación, registro o elementos de control aprovechando las propiedades físicas, químicas y electromagnéticas de la materia entendiéndolo en su manifestación infinitisimal. a.La instrumentación analítica. Se puede definir como la ciencia que desarrolla y mejora métodos e instrumentos para obtener información sobre la composición y naturaleza química de la materia. Dentro de la Química Analítica Instrumental se incluye el Análisis Instrumentación, que se basa en las propiedades químico, físicas y del espectro electromagnético. La clasificación del análisis instrumental como hemos visto en la sección preliminar. b. En el mercado ambiental. Nos permiten probar los contaminantes biológicos y químicos en el aire, agua, alimentos y tierra. Alrededor del mundo, estas herramientas han contribuido decisivamente en los esfuerzos para proteger el medio ambiente y la salud humana. c. Alteraciones endocrinas por pesticidas y metales pesados en la tierra, de los alimentos y el agua: Se cree que ciertos pesticidas alteran el sistema endocrinológico y causan trastornos tales como defectos de nacimiento, cáncer de seno y cancers de diverso orden. Existen metodologías de Cromatografía de gases/ espectrometría de masas (GC/MS) capaz de analizar rápidamente muestras de los 567 pesticidas y otros probables alteradores del sistema endocrino que causan preocupación mundial, ofreciendo un método más sencillo para supervisar estos químicos en el abasto de alimentos. Los hidrocarburos volátiles contribuyen a la degradación del ozono a nivel de la tierra, uno de los principales componentes del smog urbano. La Agencia Mundial Antidopaje (AMA) ha estipulado seis clases de substancias prohibidas: estimulantes, narcóticos, agentes anabólicos/esteroides, diuréticos, hormonas pépticas y compuestos afines, así como otras drogas restringidas. Estas clases incluyen más de 400 substancias y miles de compuestos relacionados. Problema Nro. 16. A partir de las siguientes observaciones para 5 años de las variables (x, y), ajústese el modelo de regresión de y en función de x más idóneo. Donde: y: producción nacional de un subsector industrial, en millones de toneladas. x: tiempo. Año x y 1995 1 1,25 1996 2 5 1997 3 11,25 1998 4 20 1999 5 30,5 ∑*( ̅)( ̅)+ ∑( ̅) Pendiente/sensibilidad instrumental, ̅ ̅ Ordenada en el origen ̅ ∑ ̅ ∑ , rxy = ∑ √∑ ∑ √ ∑ (̅) , √ ∑ (̅) 1. Ajuste de una función lineal: y = bx + a xi yi x 2 y 2 xi yi ( ̅ ) ( ̅) ( ̅ )( ̅) ( ̅ ) 1 1,25 1 1,56 1,25 -2 -12.35 24.7 4 2 5 4 25 10 -1 -8.6 8.6 1 3 11,25 9 126,56 33,75 0 -2.35 0 0 4 20 16 400 80 1 6.4 6.4 1 5 30,5 25 930,25 152,5 2 16.9 33.8 4 15 68 55 1483,3 277,5 73.5 10 3 13,6 11 Reemplazandolos datos del problema Nro. 16 en el cuadro de regresión lineal por mínimos cuadrados. Figura. Nro.44. Fuente: www.uclm.es/profesorado/.../4-ESPECTROSCOPIA%20ATOMICA.pdf - En caché - Similares 1.9.4. Covarianza. El análisis de la covarianza es una técnica estadística que, utilizando un modelo de regresión lineal múltiple, busca comparar los resultados obtenidos en diferentes grupos de una variable cuantitativa pero corrigiendo las posibles diferencias existentes entre los grupos en otras variables que pudieran afectar también al resultado (covariantes). En el estudio conjunto de dos variables, lo que interesa principalmente es saber si existe algún tipo de relación entre ellas. Esto se ve gráficamente con el diagrama de dispersión. La covarianza S(x,y) de dos variables aleatorias x e y se define como: (48) Donde x i y i representan los pares de valores de la variable y el producto ̅ ̅ que corresponde al producto de las medias aritmeticas de las variables x e y respectivamente. - Si S xy > 0 hay dependencia directa (positiva), es decir, a grandes valores de x corresponden grandes valores de y. - Si S xy = 0 Una covarianza 0 se interpreta como la no existencia de una relación lineal entre las dos variables estudiadas. - Si S xy < 0 hay dependencia inversa o negativa, es decir, a grandes valores de x corresponden pequeños valores de y. La matriz de covarianza S XY de dos variables aleatorias n-dimensionales expresadas como vectores columna ( ) e Y ( ) se define como: ,( ,- )( ,-)- Donde: E[ ] es el operador esperanza. ∑ - ̅ ̅ = = 55,32 Hemos obtenido un valor práctico para la covarianza que corresponde a una dependencia directa. CONCLUSIONES 1 Recordar: Un supuesto básico del modelo de regresión, es que para cada valor posible de x,y es una variable aleatoria con distribución normal cuya media es µ y/x 2 Lo correcto es decir que las medias poblacionales de y se incrementan ( o disminuyen) al aumentar x 3 Recordar que en realizad trabajamos con estimadores de parámetros desconocidos, y son por tanto, variables aleatorias sobre las que se deben hacerse afirmaciones probabilísticas. http://www.slideshare.net/smedinat/regresin-por-mnimos-cuadrados Problema Nro. 17. Calcular covarianza talla – peso Talla cm x 160 165 168 170 171 175 175 180 180 182 Peso Kg y 55 58 58 61 67 62 66 74 79 83 1. Sumamos los productos de los valores x (talla) por los de y (pesos) ∑ x i y i = 160*55+165*58+168*58+170*61+171*67+175*62+175*66+180*74+180*79+180*83 ∑ x i y i = 114987 Definimos n como numero de eventos que en este caso es igual a 10 Hasta esta parte hemos descrito como debemos manejar la muestra, en cuanto a la toma y preparación, así como debemos de manejar la teoría estadística que requerimos para evaluar los datos. 1.10. Puesta a punto del mètodo analitico. 1.10.1. Validación de un Método Analítico. Es el proceso que permite demostrar que los resultados producidos por el mismo son fiables y reproducibles y que el método es adecuado para la aplicación sobre la que se emplea. La confirmación mediante un examen y la provisión de una evidencia objetiva de que se han satisfecho unos requisitos particulares para un uso pretendido y específico. La puesta en operación de un método analítico se completa con la validación del mismo. Validar implica demostrar experimentalmente y formalmente que un proceso de medición química o una parte del proceso (por ej. Muestreo) funciona como se espera de él y lo hace a lo largo del tiempo. Se trata de documentar la calidad del procedimiento analítico determinando sus características (performance) sobre la base de criterios tales como la exactitud, precisión, límite de detección, etc. Este proceso obliga a que el analista investigue todas las posibles fuentes de error y las elimine. De esta forma demostrará que el método origina resultados que pueden ser manejados hasta las referencias elegidas, esto se consigue solo con estructuras adaptadas, personal entrenado, motivado y con instrumentos adaptados y convenientemente sustentados. 1.10.2. Los pasos de interés. a. Validación de la instrumentación. Debe ser siempre anterior a la validación del método. b. Revisión bibliográfica. Hay muy pocos métodos analíticos que estén suficientemente detallados y validados como para poder ser aplicados directamente sin riesgos. c. Validadción del método analítico. La estrategia consiste en estudiar el procedimiento analítico hacia atrás, estudiando primero el sistema más sensillo (p.e. las disoluciones empleadas en el calibrado) y después paso a paso hasta la muestra real. Tambien debe evaluarse la robustez del procedimiento, los métodos patrón o estandarizados son de validación sensilla. En este caso basta con evaluar la precisión, verificar la veracidad, investigar la sensibilidad y la robustez. d. Validación de la etapa de detección final. Los errores en la etapa de calibración son muy frecuentes, incluyen: Errores en cálculos sensillos (p.e. concentraciones) Errores de dilución Confusiones originadas al utilizar disolventes Utilización de compuestos impurificados Contaminaciones, interferencias, patrones inadecuados Corrección de fondo mal hecha o confianza ciega en sistemas de integración Mal uso de las unidades como ppm, ppb. Debe de prepararse disoluciones con concentraciones exactamente conocidas en el analito, almacenarse en adecuadas condiciones y ser manejadas con cuidado para no ser contaminados. e. Muestras sólidas. Estar familiarizado con el manejo de las muestras solidas mineralizadas f. Robustez del método. Evitar cambio del equipo (Soxhlet, reactores, …), de temperatura o humedad. g. Puntos y gráficos de control. Los gráficos de control permiten la detección de nuevos erroeres sistemáticos y elk seguimiento de la precisión si se hacen medidas replicadas. h. Materiales de referencia certificados.(MRC). Cada valor certificado se acompaña de su incertidumbre a un nivel de confianza dado: Sustancias o disoluciones puras para calibración e identificación Materiales de matriz conocida para calibración de métodos comprativos Materiales de matriz lo más parecida posible a la analizada por el usuario Materiales de referencia definidos metodológicamente p.e. biodisponibilidad, lixiviables, Implican un protocolo muy estricto. i. Buenas prácticas de laboratorio. (GLP). Estan relacionadas con los procesos organizativos y la planificación en los laboratorios j. Normalización. Depende del campo de actividad (alimentos, medio ambiente, biomédico), son sistemas de acreditación que cada países ha adoptado, hay normas escritas, organismos normalizadores, Anivel mundial el organismo central es el ISO, con cientos de comités técnicos. La validación tiene dos objetivos fundamentales. Linealidad de un analito en un material 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 Material de referencia mg/mL A n a l i t o c a l c u l a d o e n m g / m L Buena 0 . 0.33 Ade L ruido P Pico B Línea Valid Tabla de x y # Material de referencia Calculado mg/mL 1 Figura Nro. 45. El estudiante como parte de su entrenamiento, resolver manualmente y/o reemplazar. Determinar los parámetros validados de la estadística de linealidad que se han obtenido. Fuente: www.ops-oms.org/Spanish/AD/THS/EV/bpm-Validacion04.pp 0.0100 0.0101 Figura Nro.46 .Reemplazando los datos de la tabla anterior en: Fuente: www.uclm.es/profesorado/.../4-ESPECTROSCOPIA%20ATOMICA.pdf - En caché - Similares Se puede comparar los resultados con lo mostrado en la figura Nro. 39 Objetivo 1. Definir y asegurar la calidad de la información analítica generada. Una validación intrínseca que consiste en caracterizar un proceso de medición química a través de las propiedades o características de desempeño del mismo. Objetivo 2. Garantizar la coherencia entre la información analítica generada y las necesidades informativas planteadas por la sociedad, industria, comercio, ciencia y tecnología, en un proceso denominado validación extrínseca del proceso analítico. La validación intrínseca puede hacerse de dos maneras generales, una es la validación por etapas, se valida instrumentos, muestreo, datos etc, y la otra es la validación global del proceso de medición química. Durante el proceso de validación, los estudios para determinar los parámetros de desempeño de un método deben realizarse con equipamiento debidamente calificados, es decir que cumplan con las especificaciones necesarias, que funcionen correctamente y estén correctamente calibrados. Los analistas deben de estar entrenados y conocer adecuadamente la metodología en estudio. Deben utilizar equipos, reactivos y materiales de laboratorio apropiado y en perfectas condiciones para su uso; patrones de referencia bien caracterizados de pureza adecuada y debidamente documentada. Se recomienda la utilización de MRC de naturaleza similar a las muestras sobre que se aplicara el ensayo. Todo el proceso de validación se debe confirmar y encontrarse documentado en protocolos e informes de validación. Tenemos tres tipos de validación: Validación Prospectiva: es aquella validación realizada a métodos analíticos nuevos. Validación Retrospectiva: Para métodos analíticos antiguos, pero que se usan en forma rutinaria, y que no han sido validados. Revalidación: repetición parcial o total de una validación debido a cambios efectuados, que puedan afectar a la capacidad del método validado. 1.10.3. Parámetros fundamentales de validación. Una vez que se ha realizado el ajuste de los parámetros y se ha probado con éxito el método en muestras, se está en condiciones de realizar la validación del método, para poder confirmar y documentar que los resultados obtenidos por el método son seguros y confiables. En el proceso de validación, los parámetros que son evaluados generalmente son: Selectividad, Linealidad, Precisión, Sesgo, Exactitud, Sensibilidad. Parámetros de calidad. En la Tabla 18 se enumeran los criterios cuantitativos de funcionamiento de los instrumentos, criterios que se pueden utilizar para decidir si un determinado método instrumental es o no adecuado para resolver un problema analítico. Estas características se expresan en términos numéricos y se denominan parámetros de calidad. Tabla. Nro. 20: Criterios numéricos para seleccionar métodos analíticos Criterios Parámetros de calidad Precisión e incertidumbre: Grado de concordancia mutua entre los datos que se han obtenido de una misma forma. Estima la repetitividad. Desviación estándar absoluta, y relativa, coeficiente de variación, varianza, covarianza. Veracidad: Se refiere a la diferencia entre el valor obtenido y el verdadero. Exactitud Combinación de la veracidad y precisión Trazabilidad: Propiedad del resultado de una medición o de un patrón, Sesgo: Error absoluto sistemático, error relativo sistemático. Error absoluto sistemático, error relativo sistemático. sesgo ═ µ - xt Donde µ es la media de la población de la concentración de un analito en una muestra cuya concentración verdadera es xt Sensibilidad: Es una medida de la capacidad de un método, depende de la pendiente de la curva de calibrado y de la reproducibilidad de las medidas Sensibilidad de calibración, sensibilidad analítica Limite de detección: Mínima concentración o mínima masa de analito que se puede detectar para un nivel de Blanco mas tres veces la desviación estándar del blanco confianza dado. Intervalo de concentración Concentración entre el limite de cuantificación (LOQ),límite de detección (LOD) y el limite de linealidad ( LOL) Selectividad y especificidad: Grado de ausencia de interferencias con otras especies que contienen la matriz de la muestra. La capacidad de un método para determinar exactamente y específicamente el analito de interés en la presencia de otros componentes en la matriz, bajo condiciones de prueba estadística. Coeficiente de selectividad Robustez Es una medida de su capacidad de permanecer inalterado por pequeñas, pero deliberadas, variaciones en los parámetros del método y proporciona una indicación de su confiabilidad durante su uso normal. Otras características Velocidad, Facilidad y Comodidad, Habilidad del operador, Coste y disponibilidad de tiempo, Coste por muestra Fuente: Ampliada - SKOOG-HOLLER-NIEMAN Principios de ANALISIS INSTRUMENTAL 5ta Edic. Mc Graw Hill Pag. 12 Precisión. De los datos analíticos se define como el grado de concordancia mutua entre los datos que se han obtenido de una misma forma. La precisión indica la medida del error aleatorio, o indeterminado de un análisis. Los parámetros de la calidad de la precisión son la desviación estándar absoluta y relativa, el coeficiente de variación y la varianza. (SKOOG-HOLLER-NIEMAN Pag. 12) Exactitud. Mide el error sistemático o determinado de un método analítico. Se puede determinar por comparación con muestras patrón y por comparación con un método patrón. Exactitud = ̅ Donde ̅ valor medio Sesgo. El sesgo se define mediante la ecuación: sesgo ═ µ - x t Donde µ es la media de la población de la concentración de un analito en una muestra cuya concentración verdadera es x t Sensibilidad. En general se acepta que la sensibilidad de un instrumento o de un método es una medida de su capacidad de diferenciar pequeñas variaciones en la concentración del analito. La definición aceptada por (IUPAC), es la de sensibilidad de calibrado, que se define como la pendiente de la curva de calibrado a la concentración objeto de estudio. En un método (técnica) Instrumental se mide una señal (S), en función de la sensibilidad requeridas en la solución del problema de análisis. S ∞ [C X ] analit Figura Nro. 47. LD = Limite De dilución, LOQ = Límite de cuantificación, LOL = Límite de linealidad. Fuente: SKOOG-HOLLER-NIEMAN Principios de ANALISIS INSTRUMENTAL 5ta Edic. Mc Graw Hill Pag. 12 Donde: S (sensibilidad analítica) es proporcional a La concentración [C] del analito. Todos los métodos ofrecen características diferenciadas por lo que es necesaria su selección en función de la sensibilidad y selectividad requerida en el problema de análisis. S ═ m [C] + S bl (49) Donde S es la señal de medida, [C] es la concentración del analito, S bl es la señal instrumental de un blanco y m (b) es la pendiente de la línea recta. Mandel y Stiehler (1964) consideraron la necesidad de incluir la precisión en un tratamiento matemático y proponen: (m) γ ═ m ∕ S S (50) Donde m es la pendiente de la curva, S S es la desviacio0n estándar de las medidas. Selectividad. Depende de la interrelación de todos los componentes, longitud de onda, interferentes, y la muestra. 1.10.3. Limite de detección y cuantificación. Son varios los métodos empleados para la determinar el límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ), dependiendo si el procedimiento es instrumental o no instrumental. (LOD) Es la mínima concentración de analito que se puede detectar para un nivel de confianza dado. Este límite depende de la relación entre la magnitud de la señal analítica y el valor de las fluctuaciones estadísticas de la señal del blanco. (LOQ) Es la menor concentración de analito en una muestra determinada que puede proporcionar una medida cuantitativa positiva, utilizando un método analítico determinado. En análisis instrumental debemos aprender a elegir la técnica correcta para cumplir con nuestro análisis, ya hemos visto algunas figuras de mérito importantísimas en el límite de detección como la sensibilidad, la exactitud y la precisión, otra figura de mérito importantísima es el límite de detección. El cálculo del límite de detección (LD) responde a la pregunta. ¿Cuál es la menor concentración que podemos detectar con este método de análisis? Para responder a esta pregunta, debemos analizar cuál es la menor señal detectable. DEFINICION DE IUPAC: La concentración del analito que produce una señal igual a la del blanco mas “k” veces la desviación estándar del blanco. Ahora veamos si la concentración C L para lo cual: y L = ̅ Cada punto de la curva de calibración (incluyendo el blanco) tiene una variación (normalmente distributiva) sobre el eje “y” que puede estimarse con la desviación estándar de los residuos S R 0 -----------------------------------C LD ------------------------------------------C LC ---------- Concentración y B ------------------------------- y L + 3S B -----------------------------------y + 10S B --- Señal Analito sin detectar Región de Detección Región de cuantificación Recuewrde siempre: Las definiciones son bastante arbitrarias, es el usuario quien escoje “k” cuando se reporta un límite de detección debe incluirse información de “k”. Figura. Nro. 48. Patrones analíticos para la construcción de una curva de calibrado apartir de soluciones patrón. Fuente: http://isearch.babylon.com/?q=limite+de+detecci%C3%B3n+powerpoint&s=web&as=3&babsrc=HP_ss 1.10.4. Calibración de los instrumentos. Se entiende por el proceso por el cual se asegura que un sistema (instrumental) es apropiado para el uso que se desee emplear y que se desempeña de acuerdo con las especificaciones dadas por el fabricante. Es decir, asegurarse de que el instrumento funciona correctamente. Los distintos sistemas de calidad y/o requerimientos regulatorios requieren variados niveles y combinaciones de calificación, calibración, verificación y ensayos de adecuación del sistema. Son ejemplos la comprensión, el conocimiento y manejo del espectro electromagnético la determinación de la exactitud de la longitud de onda con filtros de oxido de holmio, o la calibración de una balanza analítica mediante el uso de pesas calibradas. Luego se continúa con la calibración metodológica analítica, que consiste en comparar la señal (S) generada por el analito presente en la muestra con aquella proporcionada por el analito de una muestra patrón o estándar. Por ejemplo en el cuadro 1-3, se aprecia la utilización del estándar externo, existe otros métodos como el de agregar un estándar a la muestra a analizar, y un estándar interno. a.Curva o gráfica analítica. Se preparan una serie de disoluciones patrón de forma que cubran un intervalo de concentraciones adecuado y que tengan una composición en matriz parecida a la de la muestra. También se prepara un blanco, este tiene igual composición que los demás estándares pero sin el analito. Su señal debería ser cero pero a veces por efecto del ruido de fondo no es así. Se representan las respuestas en una gráfica frente a las concentraciones de los estándares que las han proporcionado. Generalmente hay una relación lineal entre la señal analítica (y) y la concentración [x] y por ello los datos se ajustan a una recta por el método de mínimos cuadrados según y=ax+b, siendo y la señal instrumental, a la pendiente, b la ordenada en el origen y x las concentraciones de los estándares. En general, la etapa de calibración y la obtención de la concentración de analito en una muestra constan de los siguientes pasos: Paso 1: Preparación de los patrones. Se preparan patrones del analito que cubran un intervalo adecuado de concentraciones, y se mide la señal analítica proporcionada por los mismos. Disoluciones del analito de concentración conocida y creciente Paso 2: Obtención de la relación señal-concentración. Se traza un gráfico con las señales frente a la concentración de analito y se calcula la recta que "mejor" se ajusta a los datos mediante un ajuste por mínimos cuadrados. De esta forma se obtiene la pendiente (b) y la ordenada (a) en el origen que definen la recta. Gráfico señal-concentración y recta ajustada por mínimos cuadrados Paso 3: Uso de la recta de calibrado. Una vez obtenida la gráfica, se interpola la señal de la muestra y se obtiene la concentración de analito en la muestra. Figura Nro. 49 . Obtención de la concentración de analito en las muestras a partir de la gráfica y la recta Fuente: http://www.uv.es/gammmm/Subsitio%20Operaciones/6%20Calibracion.htm En el desarrollo del cursoel tutor del curso les alcanza una plantilla para el ajuste por mínimos cuadrados mediante la hoja de cálculo EXCEL y la herramienta de gráficos de dicho programa para que el estudiante pueda consolidar sus tareas. Finalmente, para obtener la concentración de analito en la muestra hay que tener en cuenta en los cálculos las posibles diluciones a las que se ha sometido la muestra para obtener las disoluciones M1, M2 y M3 de medida. Problema Nro. 18. Estimación de LD(Límite de detección) Y LC(Límite de cuantificación) a partir de la repetitibilidad de la señal del blanco (o matriz de la muestra) comparado con una señal producida por un estándar de concentración muy diluida, donde señal sea más de 3 veces la del ruido. Datos en mV obtenidos CG-FID para un pesticida en un efluente de aguas residuales. Cstd= 4 pp. A partir de lecturas de blanco y un estándar diluido 2 0.0150 0.0145 Estd Estd Yblanco blanco C Y S Y LD 29 . 3 + = 3 Estd Estd Yblanco blanco C Y S Y LC 10 + = 0.0200 Estd Estd Yblanco blanco C Y S Y LC 10 + = 0.0210 1 0 29 . 3 b S Y LD b blanco + = 0.0250 1 0 10 b S Y LC b blanco + = 0.0260 5 0. 03 00 0.0294 6 V a l i d a c i ó n Esti ma ció n de LD Y LC a part ir de la rep etib ilid ad de la señ ( ) 2 ˆ 2 / ÷ ÷ = ¿ n y y S i y x A partir de lecturas de blanco y un estándar diluido x b b y 1 0 ˆ + = 1 / 29 . 3 b S Y LD y x Std + = Figura Nro. 50. El estudiante desarrolle manualmente los parámetros encontrados, como parte de su preparación para el examen, determine la curva de calibrado a partir de soluciones patrón. Fuente: www.unlu.edu.ar/.../Tp/Introduccionalanalisisquimicocuantitativo2011.ppt Respuesta al ejercico de aplicaciones numéricas. Datos en µV obtenidos CG-FID para un pesticida en un efluente de aguas residuales. Cstd= 4 ppm. LIMITE DE DETECCION A PARTIR DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN POR ADICIÓN DE ESTÁNDAR Figura Nro.51 .Reemplazando los datos de la tabla anterior en: Fuente: www.uclm.es/profesorado/.../4-ESPECTROSCOPIA%20ATOMICA.pdf - En caché - Similares Problema Nro. 19: Se han analizado una serie de soluciones estándar de fluoresceína con un espectrofluorómetro, obteniéndose las siguientes intensidades de fluoresceína (en unidades arbitrarias) Intensidad fluorescencia (u.a) 2,1 5,0 9,0 12,6 17,3 21,0 24,7 Concentración de floresceina pg/mL 0 2 4 6 8 10 12 a. Calcule la pendiente y la ordenada al origen de la recta de regresión para los datos mostrados. b. Calcule la desviación estándar residual y los límites de confianza al (95 %) para la pendiente y la ordenada al origen. c. Determine las concentraciones, las desviaciones estándar y sus límites de confianza (95%) para soluciones con intensidades de fluorescencia de 2,9 13,5 y 23 unidades (L=1). Analice cual presenta el mejor limite de confianza en valores absolutos. Analice donde es conveniente que caiga el valor de la señal de la muestra dentro de la curva de calibración. d. Si se considera como el promedio de cuatro medidas el valor de intensidad de fluorescencia de 13,5 cuáles serán los valores de la desviación estándar de la concentración calculada y el límite de confianza? Y si fuera el promedio de ocho? Analice cual es la mejora obtenida al aumentar el número de medidas. e. ¿El análisis del grafico de residuos indica una buena linealidad? Solución: En el procedimiento de calibración en análisis instrumental se consideran los siguientes asunciones básicas. i. Los errores aleatorios en el experimento de calibración ocurren solamente en los valores de y, las “y” y las concentraciones estándares sobre la “x” ii. L magnitud del error aleatorio en y es independiente de la concentración del analito (HOMOCEDASTICIDAD) iii. El error aleatorio en y sigue una distribución normal iv. La muestra en blanco contiene todo los reactivos menos el analito. v. El coeficiente de correlación Momento-Producto: (x 1 , y 1 ) (x 2 , y 2 )..(x i , y i )..(x n , y n ) . Intensidad fluorescencia (u.a) 2,1 5,0 9,0 12,6 17,3 21,0 24,7 Concentración de floresceina pg/mL 0 2 4 6 8 10 12 El coeficiente de correlación “r” esta dado por: r = ∑(̅)(̅) √∑(̅) ∑(̅) ∑( ̅ )( ̅) ∑ ( ̅ ) ∑ ( ̅) , √ S b = √ , S a = √ ̅ ̅ S y/x = √ ∑( ̅) , r = ∑(̅)(̅) √∑(̅) ∑(̅) a. Calcule la pendiente y la ordenada al origen de la recta de regresión para los datos dados en el problema: Con los datos tabulados y las fórmulas de regresión. ∑ ( ̅ )( ̅) (10.5830)(20.4524) 216.45 Pendiente: Intercepto: ̅ ̅ Línea de regresión: y = 1,93x + 1,52 Desviación estándar de la pendiente: √ S b = √ , √ = √ () = 0.471423 S b = √ = √ = = 0.0445453 Desviación estándar de la ordenada en el origen: S a = √ ̅ ̅ = 0.47142√ () = 0.47142√ = 0.321221 El calculo del coeficiente de correlación “r” esta dado por: r = ∑(̅)(̅) √∑(̅) ∑(̅) = √ = 0.998545 b. Calcule la desviación estándar residual y los límites de confianza (al 95%) para la pendiente y la ordenada al origen. Datos: n = 7 a = 1,52 b = 1,93 S XX = 112 ̅ S YY = 418,56 t = 2,57 (95% f=5) √ √ 0,471423 √ √ Límites de confianza: Para la pendiente y la ordenada. b ± tS b = 1,93 ± 2,57*0,0445453 = 1,93 ± 0,11 S a = S R √ ̅ ̅ = 0, 471423 √ 0,321221 a ± tS a = 1,52 ± 2,57*0,321221 = 1,52 ± 0,83 Figura Nro. 52. Gráfica de la recta de regresión: y= (1.93±0.11) x – (1.52 ± 0.83) c. Determine las concentraciones, las desviaciones estándar y sus límites de confianza (95%) para soluciones con intensidades de fluorescencias de 2,9; 13,5 y 23 unidades para L= 1. Analice donde es conveniente que caiga el valor de la señal de la muestra dentro de la curva de calibración. Solución. 1. Calculo de la concentración de una muestra desconocida : x o = 2. y 0 = Es el valor experimental de y a partir del cual se determina x 0 3. √ | ̅ | Donde de L= es el número de lecturas para obtener y 0 4. Intervalo de confianza: x 0 ± t S xo t con (n-2) grados de libertad. 5. Datos: n=7 a = 1,52 ̅ S R = 0,471423 L = 1 b = 1,93 6. Intervalo de confianza: √ | ̅ ̃ | Para y o = 2,9 √ | ̅̅̅̅̅̅ | = 0,72 ± 0,74 Para y o = 13,5 = 6,21 ± 0,67 Para y o = 23,0 = 11,13 ± 0,73 Nótese que estos intervalos se hacen más anchos a medida que y o se aleja de y d. Si se considera como el promedio de cuatro medidas el valor de intensidad de fluorescencia de 13,5 cuáles serán los valores de la desviación estándar de la concentración calculada y el límite de confianza? Y si fuera el promedio ocho? Analice cual es la mejora obtenida al aumentar el número de medidas. n = 4 ̅ S R = 0,4672 b = 1,93 y o = 13,5 S xx = 112 √ | ̅ | √ | ̅̅̅̅̅̅ | = 0,3054 Limite de confianza para el 95%. b ± tS b = 1, 93 ± 2, 57*0, 3054 = 1, 93 ± 0, 8877 S a = S R √ ̅ ̅ = 0, 471423 √ 0, 3564 a ± tS a = 1,52 ± 2,57*0,3564 = 1,52 ± 0,9159; Para un valor de 8. √ | ̅̅̅̅̅̅ | = 0,2798 Problema Nro. 20. L a concentración de plata en una muestra de desechos fotográficos se determino por AA. 0 5 10 15 20 25 30 0.32 0.41 0.52 0.60 0.70 0.77 0.89 Determine la concentración de plata en la muestra y los límites de confianza al 95 % para esta concentración. y= 0.01864x + 0.3218 ̅ a = - 0.3216 S xx = 700 ̅ 0.6014 b = 0.01864 SR = 0.01092 y= 0.01864x + 0.3218 Cuando y= 0 X Ag =|[ - t = 2.57 (95% f=5) Sb Ag = √ ̅ = √ ̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅ = 0.2221 X Ag = 17.3 ± 0.2 ug/mL 1.10.5. Materiales de Referencia Certificada (CRM). 1. Son muestras en las que los valores de una o más de sus propiedades están certificadas, con sus incertidumbres especificas, obtenidos por procedimientos técnicamente validos bajo la responsabilidad de un organismo competente e independiente; la certificación también implica una documentación detallada de su trazabilidad. 2. En el mundo existen varios organismos reconocidos como certificadores de materiales de referencia dentro de ellos se encuentran: NIST (NationalInstitute of Standars and Technology) de US, NRC (nacional Research Council de Canada, BRC (EU Standars, measurement & testing programe, Bélgica) 3. Su costo es demasiado elevado para permitir el uso diario y suele ser reemplazado por materiales de referencia secundarios con propiedades certificadas por el laboratorio usuario mediante el uso de un material de referencia certificado. 4. Existen normas Internacionales y Nacionales vinculadas a distintos aspectos acerca de los materiales de referencia. 1.11. Características de desempeño de un método analítico. Es necesario contar con información completa de las condiciones experimentales debido a que cuanto más variadas sean estas, mayores serán las causas de variabilidad, mayor la dispersión del conjunto de resultados y menor precisión. Linealidad. Capacidad del método de producir resultados que son directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra. Rango Dinámico Lineal. Intervalo entre las concentraciones máximas y mínima del analito para las que se ha demostrado que el método tiene niveles aceptables de precisión, exactitud y linealidad. Robustez. Es una medida de la capacidad del método para no ser afectado por pequeños cambios deliberados en sus parámetros y provee una indicación de su confiabilidad durante su uso normal. Sensibilidad. La definición aceptada por (IUPAC), es la de sensibilidad de calibrado, que se define como la pendiente de la curva de calibrado a la concentración objeto de estudio. a. Límite de detección. Es la concentración de analito [C LD ] que corresponde a una señal Y LOD que puede distinguirse estadísticamente de una señal del blanco (Y Blanco ) y que se concreta matemáticamente en la expresión: Y LOD = Y B + 3σ B Siendo Y B la media cuando n > 30 blancos y σ B su desviaci{on etandar. Figura Nro. 53. Comparación de límites de detección. Fuente. analisisindustrial.wikispaces.com/.../Calibracion+univariada+y+AFOMs.ppt b. Limite de cuantificación. El límite instrumental de cuantificación, se puede definir como la cantidad más pequeña de un analito que se pueda cuantificar confiablemente en un instrumento. Generalmente se acuerda la cuantificación como la señal para una concentración igual a 10 veces la desviación estándar del blanco. Esto se llama el límite de la cuantificación o límite de la determinación, por ello: Y LOQ = Y B + 10σ B xx x y Q x M A s 2 / 1 3 1 28 . 3 LOD + + = A s y 3 LOD = Cstd/ppm Y/µV SY Figura Nro. 54. Limite de cuantificación. Fuente: analisisindustrial.wikispaces.com/.../Calibracion+univariada+y+AFOMs.ppt 0.1 mL de muestra de agua contaminada. Estándar de pesticida de 1000 ppm LD= 0.19 LC= 0.37 xx x y Q x M A s s 2 / 0 1 3 1 + + = Figura Nro. 55. Elaboración de la curva patrón, señalando sus componentes principales. Fuente: analisisindustrial.wikispaces.com/.../Calibracion+univariada+y+AFOMs.ppt 1.12. Evaluación de la calidad de un laboratorio analítico. La evaluación de la calidad debe realizarse de dos formas distintas e independientes mediante control de calidad interno y control de calidad externo. El control de calidad interno de un laboratorio es el conjunto de procedimientos llevados a cabo por el personal del laboratorio para controlar en forma continua la operación y los resultados de las mediciones a fin de decidir si los resultados son suficientemente confiables para ser emitidos. Puede utilizarse un MRC material de referencia certificada o un MRI material de referencia interno o secundario. Estos materiales deben ser en lo posible representativos de las muestras que se están ensayando en lo que respecta a composición de la matriz, el estado físico de preparación y el intervalo de concentración del analito. Tanto los materiales de control como aquellos usados para calibraciones debieran ser trazables a materiales de referencia certificados o por lo menos a un método de referencia reconocido. Procedimiento general: Se somete rutinariamente la muestra control a análisis completo en condiciones de reproducibilidad y luego se evalúan estadísticamente los resultados obtenidos. Se construyen diagramas de control que son trazos gráficos de los resultados de las pruebas con relación al tiempo o secuencia de las mediciones, se establecen límites estadísticos que pueden ser preventivos o de Peligro (±2σ) o límites de acción o rechazo (±3σ) Diariamente, se somete una alícuota de la misma muestra del MRC o MRI al análisis y se representa en la carta de control. Existen varias reglas destinadas a interpretar diagramas de control, una de las mas conocidas son las reglas de Shewhart. El control de calidad externo está a cargo de un grupo de laboratorios que participan de una ronda de análisis de un MRC o un MRI común, luego un organismo externo realiza las evaluaciones estadísticas de los resultados. De esta manera puede conocerse la exactitud de los resultados emitidos por un laboratorio respecto de los demás. Puede realizarse con distintos fines: a. Acreditación del Laboratorio b. Examinar el trabajo de los laboratorios: Proficienty Testing, doble comparación entre valores de los laboratorios participantes y con el valor certificado si es un MRC. 1.13. Acreditación de laboratorios. Es el reconocimiento formal, por una organización independiente con bases científicas, de que un laboratorio es competente para realizar pruebas específicas. Por lo general la acreditación es específica para probar sistemas, productos, componentes o materiales, para los cuales el laboratorio afirma ser competente. En Argentina existen instituciones gubernamentales y privadas que poseen atribuciones legales o licencias internacionales para realizar acreditaciones. El SENASA es el organismo oficial de acreditación de laboratorios para realizar determinaciones en alimentos a exportar. El Bureau VERITAS posee la licencia a nivel Nacional para acreditación de normas ISO. A su vez organismos internacionales que realizan sus propias acreditaciones como la FDA de US. 1.14. Problemas básicos de calibración. Técnicas instrumentales. Problema. Nro. 21. Los datos obtenidos en la calibración para determinar plomo a partir de su espectro de emisión de llama se analizaron por mínimos cuadrados y la ecuación obtenida fue: S = 1.12 c Pb +0.312 Siendo c Pb la concentración de plomo en partes por millón y S la señal de la intensidad relativa de la línea de emisión del plomo. Se obtuvieron los siguientes resultados en los replicados: Conc. Pb en ppm Nro. de replicados Valor medio de S s 10.000 10 11.6200 0.1500 1.000 10 1.1200 0.0250 0.000 24 0.0296 0.0082 Calcular (a) la sensibilidad de calibrado, (b) la sensibilidad analítica para 1 ppm y para 10 ppm de Pb y (c) el límite de detección. Solución: (a) La definición cuantitativa de sensibilidad aceptada por la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC), es la de sensibilidad de calibrado, que se define como la pendiente de la curva de calibrado a la concentración objeto de estudio. La mayoría de las curvas de calibrado que se usan en química analítica son lineales y se puede representar mediante la ecuación: S= mc + S bl en la que S es la señal medida, c es la concentración del analito, S bl es la señal instrumental de un blanco y m es la pendiente de la línea recta. El valor de S bl será la intersección de la recta con el eje y. Por lo tanto el valor de la pendiente es la sensibilidad de calibrado: m = 1.12 (b) Mandel y Stiehler proponen la siguiente definición para la sensibilidad analítica γ = m/S S siendo m pendiente y S S es la desviación estándar de las medidas. Para 10 ppm de plomo γ = 1.12/0.15 = 7.5 Para 1 ppm de plomo γ = 1.12/0.025 = 45 (c) El límite de detección es la mínima concentración o la mínima masa de analito que se puede detectar para un nivel de confianza dado. Este límite depende de la relación entre la magnitud de la señal analítica y el valor de las fluctuaciones estadísticas de la señal del blanco. S m = Ŝ bl + ks bl = 0.0296 + 3 x 0.0082 = 0.054 sustituyendo en la ecuación: c m = [S m - Ŝ bl ] / m = [0.054 -0.0296] / 1.12 = 0.022 ppm de Pb. Referencia: pag. 14 Skoog-Holler-Nieman Principios de Análisis Instrumental Problema Nro. 22. El coeficiente de selectividad para un electrodo selectivo de iones de K + con respecto a los iones Na + es de 0.052. Calcular el error relativo en la determinación de K + de una disolución que tiene una concentración 3.00 x 10 -3 M de K + si la concentración de Na + es (a) 2.00 x 10 -2 M; (b) 2.00 x 10 -3 M; (c) 2.00 x 10 -4 M. Suponer que S bl para una serie de blancos es cero. Solución. La selectividad de un método analítico indica el grado de ausencia de interferencias con otras especies que contiene la matriz de la muestra. El coeficiente de selectividad indica la respuesta relativa del método para la especie B cuando se compara con A: k AB = m B / m A . Un coeficiente similar para C con respecto a A será: k CA = m C / m A . Sustituyendo en S m = Ŝ bl + ks bl Conduce: S = m A (c A + k BA c B + k CA c C ) + S bl Luego: (a) S / m K+ = (c K+ + k Na+K+ c Na+ ) + S bl S/ m K+ = 3, 00 x 10 -3 +0.052 X 2.00 X 10 -2 = 4, 04 X 10 -3 Si no hubiera Na + S / m K+ = 3,00 x 10 -3 Para (b) S/ m K+ = 3, 00 x 10 -3 +0.052 x 2.00 x 10 -3 = 3, 104 x 10 -3 Para (c) S/ m K+ = 3, 00 x 10 -3 +0.052 x 2.00 x 10 -4 = 3, 0104 x 10 -3 Luego los errores relativos en c K+ será idéntico al error relativo en S/ m K+ (a) E rel = [(4,04 x 10 -3 – 3,00 x 10 -3 )/3,00 x 10 -3 ] x 100% = 35.00% (b) E rel = [(3,104 x 10 -3 – 3,00 x 10 -3 )/3,00 x 10 -3 ] x 100% = 3.46% (c) E rel = [(3,0104 x 10 -3 – 3,00 x 10 -3 )/3,00 x 10 -3 ] x 100% = 0.346% Referencia: pag. 15 Skoog-Holler-Nieman Principios de Análisis Instrumental Problema Nro. 23. Se pipetean varias alícuotas de 10 ml. De una muestra de agua mineral en matraces aforados de 50.00 ml. A cada uno se adicionan exactamente 0,00; 5,00; 10,00; 15,00 y 20,00 ml de una disolución patrón que contiene 11,1 ppm de Fe 3+ seguido de un exceso de ion tiocianato para dar el complejo rojo Fe(SCN) 2+ y se enrasan hasta 50,00 ml. Las señales del fotómetro para las cinco disoluciones fueron 0,240; 0,437; 0,621; 0,809 y 1,009, respectivamente (a) ¿Qué concentración de Fe 3+ hay en la muestra de agua? (b) Calcular la desviación estándar de la pendiente, de la ordenada en el origen y de la concentración de Fe 3+ Solucion: (a) Calculo de la concentración de Fe 3+ X(V) Y(S) X 2 XY Y 2 0 0,240 0 0 0.0576 5 0,437 25 2,185 0,19097 10 0,621 100 6,21 0,3844 15 0,809 225 12,135 0,6545 20 1,009 400 20,18 1,01808 E 50 3,116 750 40,71 2,30555 1/5 E 10 0,6232 150 8.142 0.46111 m = b = ¿ ¿ ÷ 2 2 X X 1/5 Y X - XY 1/5 = [(8,142 – 10 x 0, 6235)] / (150 – 100) = 0, 0382 X b - Y a = = 0, 6232 – (0, 0382)10 = 0, 2412 y = b x + a S = 0,0382V s + 0, 2412 La concentración C X se puede obtener a partir de los valores de b y a y los valores conocidos de: b = 0,0382 C S = 11,1 ppm Fe 3+ V X = 10,00ml y V S = a / b = V X C X /C S C X = a C S / b V X = (0, 2412 x 11, 1) / (0, 03820 x 10, 00) = 7, 01 ppm de Fe 3+ Este valor se puede determinar por extrapolación. El valor extrapolado representa el volumen de reactivo que corresponde a una señal en el instrumento y que en este caso es -6,31 mL La concentración desconocida de analito en la disolución original se puede calcular como sigue: C X = - [(V S ) O ]C S / V X = 6,31 mL x 11,1ppm / 10,00 mL = 7,01 ppm Fe 3+ 0.000E+00 2.000E-01 4.000E-01 6.000E-01 8.000E-01 1.000E+00 1.200E+00 1.400E+00 1.600E+00 0.000E+00 1.000E+01 2.000E+01 T í t u l o d e l e j e : A b s o b a n c i a Título del eje: Concentración grafica grafica Linear (grafica) (b) La desviación estándar de la pendiente S b y la desviación estándar de la ordenada en el origen S a la raíz cuadrada de esta ecuación da: √( ) ( ) S C √( ⟨ ⟩ ) ( ⟨ ⟩ ) S C Fe 3+ C X = 7.01 ± 0.12 ppm Referencia: pag. 18 Skoog-Holler-Nieman Principios de Análisis Instrumental Problema Nro. 24. En la determinación de una especie X por un método instrumental en el que la señal analítica se define como P = kCx, se obtuvieron los siguientes datos de calibración: Concentración de X i 0 2 6 10 14 18 Señal analítica P 0,031 0,173 0,422 0,702 0,956 1,248 a) Representa y calcula la ecuación de la curva de calibrado. b) Calcular la concentración molar de X en una muestra, si al medir la intensidad de la señal Analítica se obtiene un valor de P = 0,532. c) Sabiendo que la desviación estándar absoluta del blanco es s b = 0.0079, calcula el limite de detección y de cuantificación del compuesto X usando este método instrumental. d) Define la sensibilidad del calibrado y calcula la sensibilidad analítica del método propuesto. Dato: Pm (X) = 207.2 g mol-1 Respuesta: a) y = 0,0670x + 0.03001; b) 3.615x10-5 M; c)LOD = 0.353 y LOQ = 1.180; d) 0.067 y 0.143. Solución: Vamos a resolver este problema por dos procedimientos el manual y por el método regresión lineal por mínimos cuadrados según la fuente: : www.uclm.es/profesorado/pablofernandez/FAI/1-INTRODUCCION.pdf - ( ̅ ) ( ̅ ) ( ̅) ( ̅) ( ̅ )( ̅) 0 0.031 -8.33 69.3889 -0.557 0.310249 4.63981 2 0.173 -6.33 40.0689 -0.415 0.172225 2.7834695 6 0.422 -2.33 5.4289 -0.166 0.027556 0.38678 10 0.702 1.67 2.7889 0.114 0.012996 0.19038 14 0.956 5.67 32.1489 0.368 0.135424 2.08656 18 1.248 9.67 93.5089 0.66 0.4356 6.1715874 8.33 0.588 -4.33 243.3334 -0.004 1.09405 16.2585869 Procedimiento manual. El coeficiente de correlación “r” esta dado por: √ Donde: Fuente: www.uclm.es/profesorado/pablofernandez/FAI/1-INTRODUCCION.pdf - Línea de regresión: y = 0.0668x + 0.032 (Procedimiento manual) Linea de regresión: y = 0.06704x + 0.03001 (procedimiento según Fuente: www.uclm.es/profesorado/pablofernandez/FAI/1-INTRODUCCION.pdf -) b) Calcular la concentración molar de X en una muestra, si al medir la intensidad de la señal Analítica se obtiene un valor de P = 0,532. y = 0.0668x + 0.032 0.532 = 0.0668x + 0.032 x = 7.485 ppm. c) Sabiendo que la desviación estándar absoluta del blanco es S B = 0.0079, calcula el limite de detección y de cuantificación del compuesto X usando este método instrumental. LOD = = = 0.35479 ppm LOQ = = = 1.1826 ppm d) Define la sensibilidad del calibrado y calcula la sensibilidad analítica del método propuesto. 1. La sensibilidad del calibrado es el valor de la pendiente: b= 6.68x10 -2 2. La sensibilidad analítica se define como el valor de la pendiente entre la desviación estándar de las medidas: √ ∑ ( ̅) = √ = 0.1428 = 1.428x10 -1 Problema Nro. 25. Se llevo a cabo la determinación de un metal M en vinos mediante una técnica óptica (absorción atómica). Para ello, en cinco matraces aforados de 50 mL se pusieron 10 mL de vino y se le añadieron a cada uno de ellos 0, 5, 10, 15 y 20 mL de una disolución patrón de M conteniendo una concentración de 10 mg L-1 de dicho metal. Seguidamente, los matraces se enrasaron con agua des ionizada y se midió la absorbancia de cada una de ellas obteniendo los siguientes valores: 0.040, 0.062, 0.081, 0.102, 0.135. Realiza un esquema del experimento propuesto y explica brevemente que tipo de método de calibración se ha usado para la determinación del M. Finalmente calcula la ecuación de la recta de regresión y obtén la concentración del M en el vino (mg L-1). Solución: 8.26 mg L-1 de M Problema 26. Un acero de alto grado se analizo para ver su contenido en Mn, usando para su determinación Fe como estándar interno. Se preparo una muestra estándar que contenía Fe y 5 mg L-1 de Mn cuya lectura de intensidades absolutas fueron 8.0 (2933 A) y 10.2 (2932 A) respectivamente. Una muestra desconocida de acero se trato de la misma forma, es decir, se le añadió la misma concentración de Fe y se midieron las intensidades absolutas a las longitudes de onda correspondientes para cada metal obteniéndose valores de 8.2 y 12.5 para Fe y Mn respectivamente. Explica brevemente en que consiste el método de calibración usando patrón interno y calcula la concentración de Mn en la muestra de acero desconocida. Solución: 5.98 mg L-1 de Mn Cuadro Nro. 04. Uso de puntos experimientales Fuente: http://www.ebookpp.com/ej/ejercicios-de-regresion-no-lineal-resueltos-ppt.html. Comparación de límites de detección Antigua definición de IUPAC: Nueva definición de IUPAC: límite de cuantificación detección LOQ = 10 s 0 De este modo, el error estándar en la cuantificación es del 10% como máximo. En calibración univariada: Límite de cuantificación: cálculo Intervalos de Confianza y Regresión Lineal Tabla 21: Diversas Técnicas de Análisis empleadas según la fase de la Muestra. Fase Técnicas de Análisis que aceptan esta fase de la muestra Gas Espectrometría Infrarroja Raman (camino largo) Espectrometría UV-VIS Emisión y Absorción atómica Luminiscencia Espectrometría de microondas Cromatografía de Gases Espectrometría de masa Métodos radio químicos Espectrometría de movilidad de iones Disolución/liquido Cromatografia liquida Cromatografia de gás Cromatografia de fluidos supercríticos Volumetrias Ressonância magnética nuclear Espectrometria infrarroja Espectrometria Raman Espectrometria UV-VIS Resonancia de spin eletrônica Gravimétrica Métodos eletroquímicos Absorciòn, emisiòn atômica Espectrometria de masas Métodos de radiofrecuenccias Métodos radioquimicos Dispersiòn por luz de polímero Sólidos Fluorescencia de rayos X Cristalografía de rayos X Espectrometría infrarroja (reflexión y transmisión) Espectrometría Raman UV-Visible (reflexión y transmisión) Espectrometria fotoacústica Activacion neutronica Métodos radioquimicos Métodos de análisis térmico Resonancia magnética nuclear del estado sólido Técnicas de análisis de superficies(ESCA, Auger, microscopia de efecto túnel, microscopia de fuerza atómica, retrodifusion de Rutherford, Difracción electrónica) Espectrometría de Moosbauer Resonancia de spin electrónico 1.15. Prácticas de laboratorio. Práctica N° 1: Cifras significativas, propagación de errores y tratamiento estadístico de resultados. I. Objetivos. a. Determinar las cifras significativas experimentales , propagación de errores y eltratamiento estadístico de los resultados. b. Adquirir habilidad en el uso y aplicación de las herramientas estadísticas de naturaleza aleatoria. II. Fundamentos teóricos III. Materiales, Reactivos y Equipos. a. Clips, clavos, monedasbalanza analitica IV. Método operatorio a. Pesar las muestras proporcionadas por el profesor. b. Fórmula = ̅ √ c. Desarrollar los ejercicios de cifras significativas, incertidumbre con la cantidad correcta de cifras significativas y método de mínimos cuadrados para calcular la ecuación de la mejor recta. (del 1 al 13) V. Cálculos y resultados a. Presentar las respuestas para un L.C. al 97% VI. Bibliografia 1. Redondee cada número a la cantidad de cifras significativas, incertidumbre que se indica. a) 1,2367 a 4 c. s b) 1, 2384 a 4 c. s c) 0, 1352 a 3 c. s d) 2,051 a 2 c. s e) 2, 0050 a 3 c. s f) 2, 0150 a 3 c. s g) 2, 00501 a 3 c. s Respuesta: 1,237; 1,238; 0,135; 2,1; 2,00; 2,02; 2,01. 2. Escriba cada respuesta con la cantidad correcta de cifras significativas. a) 1,021 + 2,69 = 3,711 b) 12,3 – 1,63 = 10,67 c) 4,34 x 9,2 = 39,928 d) 0,0602 / (2,113 x 10 4 ) = 2,84903 x 10 -6 Respuesta: 3,71; 10,7; 40; 2,85 x 10 -6 . 3. Empleando la cantidad correcta de cifras significativas, calcule la masa molar de: a) cloruro de bario b) C 31 H 32 O 8 N 2 PA Ba = 137,327 g.mol -1 PA H = 1,00794 g.mol -1 PA Cl = 35,4527 g.mol -1 PA O = 15,9994 g.mol -1 PA C = 12,011 g.mol -1 PA N = 14,00674 g.mol -1 7. Escriba cada resultado con la cantidad correcta de cifras significativas: a) 1,0 + 2,1 + 3,4 + 5,8 = 12,3000 b) 106,9 - 31,4 = 75,5000 c) 107,868 - (2,113 x 10 2 ) + (5,623 x 10 3 ) = 5519,568 d) (26,14 / 37,62) x 4,38 = 3,043413 e) (26,14 / 37,62 x 10 8 ) x (4,38 x 10 -2 ) = 3,043413 x 10 -10 f) (26,14 / 3,38) + 4,2 = 11,9337 Respuesta: 12,3; 75,5; 5520; 3,04; 3,04 x 10 -10 ; 11,9. 8. Determine la incertidumbre absoluta y la incertidumbre relativa porcentual para cada cálculo. Exprese los resultados con una cantidad razonable de cifras significativas. a) 9,23 (± 0,03) + 4,21 (± 0,02) - 3,26 (± 0,06) = ? b) 91,3 (± 0,1) x 40,3 (± 0,2) / 21,1 (± 0,2) =? c) [4,97 (± 0,05) - 1,86 (± 0,01)] / 21,1 (± 0,2) =? d) 2,0164 (± 0,0008) + 1,233 (± 0,002) + 4,61 (± 0,01) =? e) 2,0164 (± 0,0008) x 10 3 + 1,233 (± 0,002) x 10 2 + 4,61 (± 0,01) x 10 1 = ? Respuesta: 10,18 (± 0,07) , 10,18 (± 0,7 %) ; 174 (± 2) , 174 (± 1 %) ; 0,147 (± 0,003) , 0,147 (± 2 %) ; 7,86 (± 0,01) , 7,86 (± 0,1 %) ; 2185,8 (± 0,8) , 2185,8 (± 0,04 %). 9. Para el cloruro de sodio. a) Demuestre que la masa molar del cloruro de sodio es 58,4425 (± 0,0009) g.mol -1 . b) Para preparar una disolución de cloruro de sodio, se tomó una masa de 2,634 (± 0,002) g y se disolvió en un matraz aforado de 100,00 (± 0,08) mL. Exprese la molaridad de la disolución resultante y su incertidumbre con la cantidad correcta de cifras significativas. PA (Na) = 22.989768 (± 0,000006) g.mol -1 . PA (Cl) = 35.4527 (± 0.0009) g.mol -1 . Respuesta: 0,4507 (± 0,0005) M ; 0,4507 (± 0,1 %) M. 10. Mediante el test Q, decida si el valor 216 debe descartarse del conjunto de resultados 192, 216, 202, 195, 204. Respuesta: No debe descartarse. 11. Empleando el método de mínimos cuadrados se calculó la ecuación de la mejor recta a partir de los puntos: (3,0 ; -3,87 x10 4 ), (10,0 ; -12,99 x 10 4 ), (20,0 ; -25,93 x 10 4 ), (30,0 ; -38,89 x 10 4 ), (40,0 ; -51,96 x 10 4 ). Los resultados son: m = -1,29872 x10 4 , b = 256,695, σ m = 13,190, σ b = 323,57. Exprese la pendiente y la ordenada en el origen y sus incertidumbres con la cantidad correcta de cifras significativas. Respuesta: y = [- 12987 (± 13) ] x + 257 (± 324) 12. Empleando el test Q, determine el número n más grande que podría conservarse en el conjunto 63, 65, 68, 72, n. Respuesta: 88. 13. Aplique el método de mínimos cuadrados para calcular la ecuación de la mejor recta que pase por los puntos: (1 ; 3), (3 ; 2), (5 ; 0). Exprese su respuesta en la forma y = [m (± σ m )]x + [b (± σ b )], con la cantidad correcta de cifras significativas. Respuesta: y = [ - 0,8 (± 0,1) ] x + 3,9 (± 0,5) Practica Nro. 02: Valoración potenciométrica I. Objetivo. PARTE A: Valoración de una disolución de NaOH empleando un patrón primario. PARTE B: Obtención de las curvas de valoración de un ácido fuerte y de un ácido débil. PARTE C: Determinación potenciométrica de la constante de acidez del ácido acético. a. El objetivo de la práctica es doble: por una parte, introducir al alumno en el campo cuantitativo donde, a diferencia del cualitativo, la medición exacta de todas las variables es de capital importancia; y por otra parte, ilustrar la utilización del método potenciométrico en dos de sus aplicaciones más importantes: (1) valoración potenciométrica ácido-base, obtención de la curva de valoración y (2) utilización de los datos potenciométricos obtenidos en una valoración para la determinación de una constante de acidez. b. Evaluación del punto de equivalencia utilizando los métodos analíticos instrumentales empleando la primera derivada, segunda derivada y método de Gran. II. Fundamento teórico. Figura Nro. 56. Patrones ácidos y patrones alcalinos. Fuente: http://www.powershow.com/view/292265YzAzY/VALORACIONES_CIDOBASE_powerpoint_ppt_presentation Figura Nro. 57. Forma de las gráficas de las Titulacionews Potenciométricas. Fuente: http://www.webdelprofesor.ula.ve/ciencias/rmhr/Index_archivos/Conductimetria-%20Potenciometria.pdf III. Materiales, reactivos y equipos. Materiales Reactivos Equipos Dos vasos de precipitados de 100, 400 mL (NaOH) y 3 de 100 mL de vidrio (HAc, HCl y “para Valor.pot.) Disolución de ácido clorhídrico aprox. 0.1 M para ser valorada. pHmetro con electrodo de vidrio Agitador magnético Erlenmeyer de 100 mL Pipeta de 5 mL y 2 propipeta Bureta de 50, 100 mL Papel milimetrado y calculadora Probeta 50 mL Pesasustancias 2 Espátulas por balanza Disolución de NaOH aprox. 0.1 M para ser valorada. Disolución de ácido acético aprox. 0.1 M para ser valorada. Disoluciones tampón de pH 4 y 7 para calibrar el pH-metro Ftalato ácido de potasio (C 6 H 4 C 2 HO 4 K). Fenolftaleina NaCl (s) Balanza digital IV. Procedimiento: Según el manual adicional de experimentos, Figura. Nro. 58: Esquema del sistema de valoración potencio métrica. Fuente: http://www.uv.es/fqlabo/QUIMICOS/GRADO/LQII/LQII_2012-2013/LQII_Practica_8_Valoracion_potenc.pdf V. Cálculos 1. Graficar los valores de pH vs V mL de HCl añadidos. 2. En la gráfica determine los puntos de equivalencia. Utilizando los métodos analíticos instrumentales empleando la primera derivada, segunda derivada y método de Gran. 3. Determine V A , V B, así como V A /2, V B /2 y calcule los valores de [ pK a y pK b ] Practica Nro. 03: Valoraciones conductivimétricas. I. Objetivo. a. Determinar las conductividades de varias muestras de agua. Agua destilada, Agua de servicio público, Agua de diversas fuentes de afloramiento en la provincia de Huaura, Agua de mar. b. Valorar una disolución básica mediante otra ácida de concentración conocida, empleando como método la variación de la conductividad eléctrica. c. Determinar el punto de equivalencia resolviendo las dos ecuaciones conductimétricas, evaluadas por regresión lineal por mínimos cuadrados. II. Fundamento teórico. Figura Nro. 59. Forma del gráfico de una Titulación Conductivimétrica. Fuente: http://www.webdelprofesor.ula.ve/ciencias/rmhr/Index_archivos/Conductimetria- %20Potenciometria.pdf Figura Nro. 60. Relación entre la conductividad y sólidos disueltos. Fuente: http://es.scribd.com/doc/37234683/CONDUCTIMETRIA-Y-POTENCIOMETRIA Figura Nro. 61. Relación entre la conductividad y Dureza del agua. Fuente: http://es.scribd.com/doc/37234683/CONDUCTIMETRIA-Y-POTENCIOMETRIA III. Materiales, reactivos y equipos. Materiales Reactivos Equipos Dos vasos de precipitados de 100, 400 mL (NaOH) y 3 de 100 mL de vidrio (HAc, HCl y “para Valor.pot.) Erlenmeyer de 100 mL Pipeta de 5 mL y 2 propipeta Bureta de 50, 100 mL Papel milimetrado y calculadora Probeta 50 mL Pesasustancias 2 Espátulas por balanza Muestras de aguas de diversas fuentes Disolución de ácido clorhídrico aprox. 0.1 M para ser valorada. Disolución de NaOH aprox. 0.1 M para ser valorada. Disolución de ácido acético aprox. 0.1 M para ser valorada. Disoluciones tampón de pH 4 y 7 para calibrar el pH-metro Ftalato ácido de potasio (C 6 H 4 C 2 HO 4 K). Fenolftaleina NaCl (s) Conductívimetro con electrodo de vidrio Agitador magnético Balanza digital IV. Método operatorio. Según el manual adicional de experimentos V. Cálculos. Mostrar gráficamente los datos reales y las evaluadas por regresión en papel milimetrado o a computadora con colores diferentes y la solución de las dos ecuaciones que dan el punto exacto de equivalencia volumétrica. VI. CUESTIONARIO: 1. ¿Qué información se puede obtener de una curva de titulación conductivetrica? 2. ¿Cuáles son los equilibrios a considerar en cada parte de esta titulación? 3. ¿Cómo se espera la curva de titulación del ácido acético? 4. ¿Cuáles son los equilibrios a considerar en esta titulación? Figura Nro. 62. Titulador automático y detalle de los dispositivos que se integran en la celda de valoración. Fuente: agrobioenmiendas.iespana.es/materialesymetodos.pdf Practica Nro. 04: Titulaciones potenciométricas de neutralización I. Objetivo. a. Determinar la concentración de soluciones problema de electrolitos fuertes y débiles por mediode titulaciones potenciométricas. b. Aplicar la potenciometria en la titulación de neutralización para determinar las constantes de disociación del ácido fosfórico. c. Conocer la aplicabilidad de la titulación potenciométrica para determinar la acidez total en muestras de vino. II. Fundamentos teóricos Figura Nro. 63. Esquema de un proceso de titulación Potenciométrica de neutralización. Fuente: http://www.slideshare.net/madridmgd/mtodos-volumetricos-de- anlisis III. Materiales, reactivos y equipos Vasos de precipitados de: 250,400, 100 mL. Bureta de 50, 100mL. Agitador magnético, potenciómetro Soluciones: NaOH 0.1N, H 3 PO 4 0.1M Solución tampón pH 4 y 7 para calibración del pH-metro Solución problema de ácido fosfórico Vino rosado o blanco. IV. Método operatorio a. Según el manual adicional de experimentos: .(Páginas 22-28 Manual de laboratorio de análisis instrumental Prof. Silvia Margarita Calderon y Prof. Aura Marina Gonzalez) b. Titulación de una solución de ácido fosfórico de concentración desconocida, Determiknación de la acidez total de una muestra de vino, Determinación de la acidez total de una muestra de vino. V. Cálculos. a. Derivación numérica para determinar los puntos de equivalencia en titulaciones potenciométricas. 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