Guía de LaboratorioEXTRACION DE ADN Código: MC-2012-08-21 Versión: 03 Página: 1 de 5 Fecha de Emisión: Febrero - 2014 Título: FACULTAD DE SALUD – DPTO. DE CIENCIAS FISIOLÓGICAS FUNDAMENTOS DE BIOQUIMICA II Elaborado por: Profesional: Lic. Martha Solórzano Revisado por: Dra. Cecilia Aguilar de Plata Aprobado por: Dr. José Ma. Satizabal EXTRACCIÓN DE ADN 1. INTRODUCCION. El ADN no existe como molécula libre en las células, por el contrario se encuentra asociado con proteínas y RNA. Es por esto, que los procesos de extracción y aislamiento de DNA de una célula y de otras moléculas es el primer paso para muchos procedimientos de laboratorio. En biotecnología, biología molecular, genética e inmunología entre otras ciencias, estos procesos involucran generalmente, el rompimiento de las células, desnaturalización de proteínas y la precipitación del DNA como material fibroso. Una vez obtenido el DNA puede ser sometido a diferentes procedimientos como: estudios de paternidad, trabajos forenses para captura de criminales, la amplificación mediante PCR de secuencias específicas con fines comerciales o terapéuticos, el estudio de expresión de genes entre otros. Casi todas las células contienen ADN, pero la cantidad presente en algunos tejidos es muy pequeña de manera que no son una fuente particularmente conveniente. Algunos tejidos contienen alta actividad deoxirribonucleasa- ADNasa y el ADN es roto en pequeños fragmentos. Una fuente conveniente para el aislamiento del DNA debe contener una alta cantidad del material y tener baja actividad deoxirribonucleasica. El tejido linfoide es muy bueno en este aspecto y el timo es la mejor fuente, con el bazo como una buena alternativa. El ADN es rápidamente desnaturalizado y en consecuencia debe tenerse mucho cuidado con el objeto de obtener un producto que sea estructuralmente relacionado con el que se encuentra en la célula. La tensión mecánica y condiciones existentes físicas y químicas, deben evitarse y las nucleasas deben ser inhibidas. El citrato de sodio presenta en solución Ca ++ y Mg ++ , los cuales son factores para ADNasa y las etapas hasta la remoción de proteínas debe llevarse a cabo tan rápidamente como sea posible y en frío. La nucleoproteína es insoluble en agua y soluciones de baja fuerza iónica pero es soluble en soluciones de alta fuerza iónica. Se hace uso de esta propiedad en la extracción inicial. 2. OBJETIVO GENERAL: a. Conocer y familiarizarse con las técnicas y principios básicos de la biología molecular. b. Extraer una muestra de ADN, a partir del bazo de cerdo y cuantificar la concentración del ADN obtenido. Guía de Laboratorio EXTRACION DE ADN Código: MC-2012-08-21 Versión: 03 Página: 1 de 5 Fecha de Emisión: Febrero - 2014 Título: FACULTAD DE SALUD – DPTO. DE CIENCIAS FISIOLÓGICAS FUNDAMENTOS DE BIOQUIMICA II Elaborado por: Profesional: Lic. Martha Solórzano Revisado por: Dra. Cecilia Aguilar de Plata Aprobado por: Dr. José Ma. Satizabal c. Comprender la técnica de PCR conceptualmente y aplicaciones de la misma. d. Conocer y comprender algunas aplicaciones médicas de la investigación de genes, estudio de enfermedades hereditarias, huella genética, proteínas recombinantes, animales transgénicos, terapia génica 3. PROCEDIMIENTO. 3.1 EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE BAZO DE CERDO a. Tome 25 ml de homogenizado de bazo de cerdo en solución salina regulada con citrato de sodio. b. Centrifugue la suspensión durante 5 minutos, transfiera el sobrenadante en un beaker y descarte el precipitado. c. Agregue lentamente al sobrenadante 20 ml de etanol frío y con la ayuda de una varilla enrolle suavemente las fibras de ADN Trasfiera las fibras de ADN a 20 ml de solución salina 2M d. Nuevamente centrifugue por 5 minutos, transfiera el sobrenadante y descarte el precipitado. e. Agregue al sobrenadante lentamente 20 ml de etanol frío, espere que precipite el DNA y con cuidado transfiéralo a tubo de ensayo con 10 ml de solución salina 2M hasta el momento de su determinación con la difenilamina. Guía de Laboratorio EXTRACION DE ADN Código: MC-2012-08-21 Versión: 03 Página: 1 de 5 Fecha de Emisión: Febrero - 2014 Título: FACULTAD DE SALUD – DPTO. DE CIENCIAS FISIOLÓGICAS FUNDAMENTOS DE BIOQUIMICA II Elaborado por: Profesional: Lic. Martha Solórzano Revisado por: Dra. Cecilia Aguilar de Plata Aprobado por: Dr. José Ma. Satizabal NOTA: Es importante que todo el proceso anterior se realice en hielo. 3.2 CUANTIFICACION DE LA CONCENTRACION DE ADN MEDIANTE EL METODO DE DIFENILAMINA a. Preparación del reactivo difenilamina: 1 g de Difenilamina en 100 ml de ácido acético más 2.5 ml de ácido sulfúrico. Este reactivo debe prepararse en el momento de su uso. b. Si se pretende un análisis cuantitativo se deben preparar diferentes patrones de desoxirribosa. Para llevar a cabo la determinación y concentración de ADN, prepare los siguientes tubos: SOLUCION TUBO (ml) Blanco 1 MUESTRA 2 DNA ESTANDAR AGUA 0.5 ML 0 0 AC. TCA 10% 0.25 ML 0.25 ML 0.25 ML DEFINILAMINA 1.25 ML 1.25 ML 1.25 ML DNA 0 0.5 0.5 ABSORBANCIA 595 nm c. Caliente los tubos por 15 min en baño de agua hirviendo a 100 O C, hasta la aparición de color azul que indica la presencia de ADN d. Leer la absorbancia en el espectrofotómetro a 595 nm . La desoxirribosa (dR) del DNA, reacciona con difenilamina en medio ácido para dar un compuesto azul, determinable colorimétricamente a 595 nm. En el DNA sólo dan la reacción positiva las dR unidas a bases púricas, pues éstas se liberan y la dR adopta configuración abierta dentro de la cadena del DNA. Guía de Laboratorio EXTRACION DE ADN Código: MC-2012-08-21 Versión: 03 Página: 1 de 5 Fecha de Emisión: Febrero - 2014 Título: FACULTAD DE SALUD – DPTO. DE CIENCIAS FISIOLÓGICAS FUNDAMENTOS DE BIOQUIMICA II Elaborado por: Profesional: Lic. Martha Solórzano Revisado por: Dra. Cecilia Aguilar de Plata Aprobado por: Dr. José Ma. Satizabal 3.3 DETERMINACIÓN DEL ADN POR EL MÉTODO DE ELECTROFORESIS a. Prepare el gel de agarosa, deje que solidifique y luego ubíquelo en la cubeta de electroforesis b. Mezcle 3 ul de marcador molecular con buffer de carga. Tome 20ul de la muestra del ADN extraido con buffer de carga. c. Deposítela la muestra de ADN en los pocillos del gel de agarosa para ser sometido a electroforesis. Coloree el gel con bromuro de etidio. d. Corra la electroforesis por 40 minutos a 80 voltios e. Cuando finalice la electroforesis retire el gel y ubíquelo en el trasiluminador para revelar las bandas de ADN. Guía de Laboratorio EXTRACION DE ADN Código: MC-2012-08-21 Versión: 03 Página: 1 de 5 Fecha de Emisión: Febrero - 2014 Título: FACULTAD DE SALUD – DPTO. DE CIENCIAS FISIOLÓGICAS FUNDAMENTOS DE BIOQUIMICA II Elaborado por: Profesional: Lic. Martha Solórzano Revisado por: Dra. Cecilia Aguilar de Plata Aprobado por: Dr. José Ma. Satizabal PASOS DE LA ELABORACION DE ELECTROFORESIS DE ADN Guía de Laboratorio EXTRACION DE ADN Código: MC-2012-08-21 Versión: 03 Página: 1 de 5 Fecha de Emisión: Febrero - 2014 Título: FACULTAD DE SALUD – DPTO. DE CIENCIAS FISIOLÓGICAS FUNDAMENTOS DE BIOQUIMICA II Elaborado por: Profesional: Lic. Martha Solórzano Revisado por: Dra. Cecilia Aguilar de Plata Aprobado por: Dr. José Ma. Satizabal TALLER: 1. Calcule la concentración de DNA extraído en su grupo. C = 2. ¿Qué diferencia existe entre DNA Y RNA? 3. ¿Por qué deben inhibirse las nucleasas? 4. Consulte otro método de separación y análisis de Ácidos Nucleicos (ADN o ARN). 5. Consulte 4 aplicaciones clínicas de los ácidos Nucleicos. 6. ¿Cuál es el principio de la reacción de difenilamina? 7. Consulte las aplicaciones de los ácidos nucleicos en la medicina forense. 8. Qué función cumple el NaCl en método de extracción de ADN? 9. Qué función cumple el etanol en el método de extracción de ADN? 10. Qué función tiene el acido acético en la determinación de ADN?