Actividad ureásica en productos de soja.Propuesta de un nuevo método M.C. Olguin, M.I. Zingale, G.C. Revelant, M.E. Vignale Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. U.N.R. Suipacha - Argentina. RESUMEN Actividad ureásica en productos de soja. Propuesta de un nuevo método La evaluación de la actividad ureásica residual en productos de soja es habitualmente empleada como indicador de la eficacia del tratamiento de inhibición practicado. El propósito de este trabajo consistió en realizar una comparación entre el método propuesto por la AACC (22-90), basado en medir diferencias de pH y una técnica en la que se mide la actividad ureásica por su acción hidrolítica de la urea y posterior dosaje del amonio producido mediante la reacción de Berthelot. Se utilizaron los dos métodos para procesar 20 muestras de harina de porotos de soja sin tratar y con diferentes tratamientos térmicos de inactivación. El nuevo método correlaciona satisfactoriamente con el de la AACC, r = 0,9416, (p < 0.0001), asimismo, presenta mayor especificidad ya que mide la concentración del producto de la reacción y ofrece una respuesta más amplificada que el incremento de pH. Palabras clave: Harinas de soja, antinutrientes, actividad ureásica. 5. ANTIMETABOLITOS Y TOXINAS EN ALIMENTOS El valor nutricional de un alimento depende en gran medida de la calidad de los ingredientes utilizados, la cual se mide en función de su capacidad de promover el crecimiento y mantener en buen estado a los organismos. En este sentido, el origen y/o el tratamiento previo a que se someten los materiales influirá sobre su calidad, en función de la disponibilidad de nutrientes para usarse en las funciones metabólicas del animal, o también, el contenido de factores tóxicos endógenos característicos de cada material, particularmente aquellos de origen vegetal, que funcionan como antinutrientes afectando negativamente al organismo. En este sentido, existen varias técnicas que permiten conocer la disponibilidad de un nutriente determinado, principalmente aminoácidos, así como también, determinar el contenido de sustancias tóxicas a fin de eliminarlas o desechar el material. En este documento se incluyen los métodos para análisis de los antinutrientes más comunes encontrados en las proteínas vegetales. 5.1. Método Rápido Potenciométrico para Medir Actividad Ureásica en Harina de Soya Este método determina la ureasa residual en harina de soya y sus derivados de acuerdo al método Caskey-Knapp (1944) modificado por AACC (1969) y Quím. Leticia Comar (Nutrimentos del Sureste, Mérida, Yucatán, México). El resultado esta dado en unidades de pH proporcionales a la actividad ureásica. Los valores aceptables oscilan entre 0.05 y 0.5; valores menores indican sobrecocimiento y mayores falta de cocimiento. Reactivos • • • Solución bufer de fosfatos 0.05M. Disuelva 3.403g de fosfato de potasio monobásico g.r. (KH2PO4) en 100ml de agua destilada recién hervida. Disuelva 4.355g de fosfato de potasio dibásico g.r. (K2HPO4) en 100ml de agua destilada. Combine ambas soluciones, adicione 10ml de indicador rojo de fenol al 0.1% y afore a 1000ml con agua destilada. Ajuste el pH a 7.0 con un ácido o base fuerte antes de usarse. En refrigeración tiene una vida útil de 90 días. Solución bufer de urea. Disuelva 15g de urea g.r. en 500ml de sol. bufer de fosfatos. Ajuste el pH a 7.0 como en el caso anterior. Indicador rojo de fenol al 0.1%. Disuelva 0.1g de rojo fenol en 15ml de sol. de hidróxido de sodio 0.02N y afore a 100ml. Materiales y Equipo • • • • Baño maría con agitación, precisión ± 0.5°C. Medidor de pH con electrodo de vidrio y calomel adecuado para medir muestras de 5ml, precisión de ± 0.02 unidades de pH y compensación de temperatura. Tubos de ensaye, 20 × 150mm con tapón de hule Vasos de precipitado de 10ml Procedimiento 1. Pese 0.2g de harina de soya finamente molida (sin sobrecalentar) por duplicado y colocar en tubos de ensaye (A y B); adicione al tubo A 10ml de la solución bufer de urea. Tape, agite e incube en baño maría por 30 min a 30 ± 0.5°C. 2. Después de 5 min, adicione al tubo B 10ml de sol. bufer de fosfatos, tape, agite y coloque en el baño maría. 3. Agitar cada uno de los tubos cada 5 minutos (seis agitaciones en 30 min). 4. Retire el tubo A del baño maría, decante el sobrenadante en un vaso de pp de 10ml y mida el pH dentro de un período menor a 3 min. Repita el procedimiento con el tubo B 5 minutos después del A. 5. Calcule el índice de actividad ureásica como unidades de pH resultantes de la diferencia de las lecturas del tubo A menos el tubo B y determine la calidad de la muestra según la tabla de ejemplo incluida: IAU= pH tubo A (muestra + bufer urea) - pH tubo B (muestra + bufer fosfatos) Grado de cocimiento Cruda Subcocida Cocido adecuado Cocido adecuado Sobrecocida Unidades de pH 1.9 0.80 0.30 0.08 0.03 pH tubo A 8.80 7.60 7.10 6.98 6.93 pH tubo B 6.90 6.80 6.80 6.90 6.90 Color Rojo Rosa Rosa Rosa tenue Ambar aun cuando los peces aparentemente resisten mayores concentraciones del alcaloide debido al elevado contenido proteico de su dieta.FIGURA 24 Determinación de actividad ureásica en harina de soya y sus derivados. siendo necesario determinar su contenido debido a sus efectos adversos sobre los organismos alimentados con la semilla. Gosipol Libre en Harina de Semilla de Algodón Este antinutriente es característico de la harina de algodón.2. . En este documento se describen dos métodos. 5. el primero para harinas normales y el segundo para harinas que han sido tratadas químicamente y contienen dianilinogosipol. Diluya una de las alícuotas. En 700 ml de acetona y 300 ml de agua. Si se obtiene un color rojo-anaranjado profundo. proceda con el método 1. tape el matraz y agite por una hora. Adicione 75 ml de agua destilada.5ml de anilina purificada. caliente en baño maría (90–100°C) por 30 min. Estable por varios meses. filtre y divida el filtrado en dos. b. Adiciónele 2 ml de anilina purificada. adiciónele una lenteja de Hidróxido de Sodio y caliente en baño maría por unos minutos. junto con un blanco conteniendo 2 ml de anilina y un volumen de solución acuosa de acetona igual a la alícuota. cuidando de no sobrecalentarla. Tome aproximadamente 1 g de la muestra y agréguele 25 ml de acetona pura. Lea las muestras a una absorvancia de 400 nm en el espectrofotómetro. Espectrofotómetro Matraces erlenmayer de 250 ml Matraces Volumétricos de 25 y 250 ml Baño maría Procedimiento Muela la muestra para que pase la malla de 1 mm. Tome 50 ml de la solución (a). Agite por unos minutos. 7 partes de acetona en 3 partes de agua destilada (v/v). Solución de Acetona acuosa . indica la presencia de dianilinogosispol y requiere del método 2. en un matraz erlenmayer y adicione 2 ó 3 perlas de vidrio. Prepare diariamente. deseche los primeros mililitros de filtrado y luego tome dos alícuotas iguales (2–10 ml. afore con acetona y mezcle. Almacene refrigerada en un frasco ámbar de vidrio. Solución acuosa de alcohol isopropílico. Disuelva 25 mg de gosipol puro en acetona libre de anilina y transfiera a un matraz aforado de 250 ml. descartando el primero y último 10% del destilado. mezcle y diluya a 250 ml con acetona pura.Reactivos: • • • • • Acetona acuosa. Materiales y Equipo • • • • • Agitador mecánico. Ajuste el instrumento a 0 absorvancia con alcohol isopropílico acuoso y determine la . 8 partes de alcohol isopropílico + 2 partes de agua destilada (v/v).5–1 g de muestra. usando 100 ml de acetona. dependiendo del contenido de gosipol esperado) y páselas a matraces volumétricos de 25 ml. Destile anilina grado reactivo sobre una pequeña cantidad de polvo de zinc.02 mg de gosipol/ml y es estable por 24 h en oscuridad. Un extracto ligeramente amarillo que no cambia de color con el Hidróxido indica que la harina no ha sido tratada. adicione suficiente alcohol isopropílico acuoso para efectuar solución homogénea. adicione 0. y enfría a temperatura ambiente en un baño con agua. afore a volumen con alcohol isopropílico acuoso (solución a). 60 ml de agua destilada. Anilina purificada. Filtre. A una porción. Agregue 50 ml de solución de acetona acuosa. mientras la otra alícuota (solución b). Solución estándar de Gosipol: a.Anilina. dependiendo de la cantidad de gosipol esperada. La solución (b) contiene 0. Retire la solución b y el blanco. Afore con alcohol isopropílico acuoso. adicione 100 ml de acetona pura. Método 1 Pese 0. 4. Agregue alícuotas duplicadas del filtrado (de 2 a 5 ml. Método 2. agregue 50 ml de acetona acuosa. Gosipol libre % = 5(B . Gosipol libre % = 5G/WV Donde: G= Lectura en la Gráfica W= Peso de la muestra V= Volumen de la alícuota usada. 8 y 10 ml de estándar de gosipol 0. solución b . 5. solución a) Trace la curva estándar.A)/WV Donde: A = mg Gosipol libre aparente en alícuota (a) B= mg Gosipol libre aparente en alícuota (b) . de lo contrario repita el análisis usando anilina recién destilada. calentada junto con el estándar. 2. 3. agite y filtre como el anterior. Preparación de la Curva de Calibración. Diluya una serie (solución A) aforando con alcohol isopropílico acuoso y determine la absorvancia como en el anterior. Prepare un blanco de reactivos usando 2 ml de anilina y 10 ml de acetona acuosa.absorvancia de la solución (a) y el blanco de reactivo. 7. Determine absorvancias como en el procedimiento (1) y calcule la densidad óptica corregida para cada solución estándar: Absorvancia Corregida = (Abs. Tome alícuotas duplicadas de 1. Si el blanco está abajo de 0. Afore una de las alícuotas (solución a) con el alcohol isopropílico acuoso y déjelo reposar 30 minutos antes de leerlo en el espectrofotómetro. dependiendo de la cantidad esperada de gosipol libre) a matraces volumétricos de 25 ml. Calcule la absorvancia corregida de la alícuota: absorvancia de la solución (b) menos absorvancia de la solución (a).022 de absorvancia continúe con el análisis.Abs. Pese 1 g de muestra en un matraz erlenmayer. Afore la otra alícuota (solución b) como en el procedimiento (1). Determine la absorvancia de la solución (b) con el blanco de reactivo ajuste a 0 absorvancia. Calule % de gosipol libre en harinas normales. A la otra serie (solución b) adiciónele 2 ml de anilina purificada y proceda como anteriormente.02 mg/ml y colóquelas en matraces volumétricos de 25 ml. graficando absorvancia corregida contra concentración de gosipol en 25 ml. Para harinas químicamente tratadas. Determine los mg de gosipol libre presentes en la solución de la muestra usando la curva de calibración. determine las absorvancias de las soluciones a y b como el procedimiento anterior y calcule el contenido aparente de gosipol de ambas soluciones usando la curva de calibración. . 2. manteniendo el volumen constante.3. A 10 g de harina (desengrasada por extracción Soxhlet) adiciónele 250 ml de agua destilada. Filtre. Determinación de Tioglucósidos El método descrito proporciona el contenido aproximado de tioglucósidos pero no determina tioglucósidos e isocianatos individuales. reteniendo el filtrado y lave el residuo tres veces con 50 ml de agua caliente. . 5.FIGURA 25 Determinación de gosipol libre en harinas de semilla de algodón. hidrolice a 54°C por 1 h y caliente a ebullición por 2 h. agregando el líquido al filtrado inicial y afore a 600 ml. Reactivos y Aparatos • • • Solución Cloruro de Bario 5% Matraces volumétricos de 600 ml Baño de vapor Procedimiento 1. Calcine en una mufla y pese el precipitado. tioglucósido × Peso de BaSO4) × 100/M. Precipite el sulfato de bario por calentamiento y adicionando un exceso de solución de Cloruro de bario. wt.wt. Déjelo en un baño de vapor por algunas horas y filtre.3. BaSO4 × Peso Muestra . 4. Calcule el contenido aproximado de tioglucósido como: % Tiogl= (M. . R. 5. de Productos Tropicales de Londres. Examine la placa en un cuarto obscuro a 30 cm de la fuente de UV. para detalles del método. 6. déjela secar en luz tenue y luego vuélvala a revelar en mezcla de cloroformo/metanol hasta una altura de 10 cm desde la línea basal. será necesaria una extracción previa con soxhlet). Tropical Products Institute. Permiten distinguir marcas de aflatoxina de otras manchas fluorescentes que puedan estar presentes. Revele la placa en éter etílico a una altura de 12 cm. Lámparas UV pico de emisión a 365 Botellas de boca ancha de 250 ml Micropipetas Agitador Rotoevaporador Procedimiento 1. Se puede usar con este propósito harina de cacahuate conteniendo aflatoxina B obtenible en el Inst. refiérase a Methods of Aflatoxin Analysis por B. Materiales y Equipo • • • • • • Placas para cromatografía de capa fina 20 × 20 cm. London. Adicione 100 ml de cloroformo y agite por 30 min. tierra de diatomeas Gel de sílica “G” (Merck) Estándares Cualitativos. 3.D. . con un grosor de 509μ. Prepare placas de cromatografía agitando 100 g de gel de sílica “G” con 220 ml de agua por 20 min y aplicando la mezcla a las placas con el aparato apropiado.FIGURA 26 Determinación de tioglucósidos en ingredientes alimenticios.5 indica aflatoxina G.45 – 0.5–0. tome 20 ml del filtrado y llévelo a 25 ml (solución a).R. Reactivos: • • • • • • Cloroformo (G. Report No. así como para procedimientos alternativos. en una línea a 2 cm del fondo de la placa y al menos a 2 cm de cada lado. Realice la aplicación bajo luz tenue.) Mezcla cloroformo/metanol (95/5 v/v) Celita.) Eter etílico (G. 5. Análisis de Aflatoxinas El método que se incluye es adecuado para materiales como harina de cacahuate. Coloque gotas de 10 y 20 μl de solución b y 15 y 10μl de solución a en la placa. junto con una gota de estándar cualitativo. la presencia de una segunda mancha a Rf 0. 4. Tome otros 20 ml del filtrado y concéntrelos a 5 ml (solución b). harina de copra y harina de palma kernel. G70. La presencia de una mancha azul fluorescente a Rf 0. Pese 10 mg del material en un frasco de boca ancha y mézclelo con 10 ml de agua (si se usa material con alto nivel de grasa. 2. Jones (1972). Filtre el extracto a través de la celita.4.55 indica aflatoxina B (asegúrese de que la mancha del estándar se encuentre también en ese rango). Déjela reposar por 1 hora y seque a 100°C. 1951).La toxicidad de una muestra puede ser clasificada en términos de aflatoxinas B y G de acuerdo con la tabla siguiente: TABLA COMPARATIVA PARA DETERMINAR TOXICIDAD DE AFLATOXINAS B Y G Conc. B) 20 (sol. de Aflatoxina (mg/kg) Volumen aplicado (ml) No fluoresencia c/fluoresencia 5 (sol.5. Método Colorimétrico para la Determinación de Mimosina (Matsumoto y Sherman. 1980 FIGURA 27 Determinación cromatográfica de aflatoxinas en ingredientes alimenticios. . B) <1000 <500 <100 <50 >1000 500–1000 100–500 50–100 Toxicidad de fluorescencia observada Muy alta Alta Media Baja Tomado de Harris. A) 10 (sol. A) 10 (sol. 5. 5% y afore con agua. agregue 4 ml de solución de cloruro férrico al 0. Se obtiene una línea al graficar la lectura del Colorímetro contra la concentración. glauca recristalizada) Solución de Cloruro férrico al 0.1N y afore con agua. Coloque 1 ml de solución de mimosina en un matraz volumétrico de 100 ml y adicione 10 ml de HCl 0. Matraz Volumétrico de 100 ml. Agregue agua para llevar el volumen a 25 ml. Matraz Kitazato.5% en HCl 0. glauca.5 y 2.3.5. Reactivos • • • • Solución de Mimosina. consideradas excelentes fuentes de proteína para la alimentación animal.5% en HCl 0.1% en HCl 0. Lea la intensidad del color en el Colorímetro (espectro 535 nm). .1N dividido en tres porciones.1% de mimosina. El pH deberá ser entre 1. 54.1N (mimosina de L. Tubos de ensaye.25 g de hoja seca de leucaena en un Vaso de precipitado de 250 ml y digiera con 100 ml de HCl 0. provocando reducción del crecimiento. Materiales y Equipo • • • • • • • • Colorímetro (usar espectrofotómetro 535 nm) Klett-Summerson con Filtro No.1046 g de mimosina pura en HCl 0. La solución contiene 0. de 150 ml con 30 mg de Carbón. deje enfriar y filtre con vacío en el crisol de filtración.La mimosina es un aminoácido libre muy común en algunas leguminosas.4 y 5 ml de solución de mimosina. deje enfriar y transfiera todo a un matraz volumétrico de 250 ml. cúbralo con un vidrio de reloj y caliente a ebullición por 15 min. Use agua destilada como referencia y repita el procedimiento usando 2..1N y afore a 100 ml con el ácido. Crisol de Filtración. Vasos de precipitado de 250 ml. Determinación Colorimétrica: Transfiera el líquido obtenido a un matraz volumétrico de 100 ml. el filtrado es colectado en un tubo colocado en el matraz kitazato. Enjuague finalmente el crisol con 5 pequeñas porciones de agua. Vasos de precipitado de 150 ml.1N Carbón Activado.1N. 0. Su presencia limita el uso de las hojas y semillas en la alimentación de monogástricos. ya que afecta la función de la tiroides. Clarificación: Transfiera 10 ml de sobrenadante a un V. Enjuague el vaso de precipitado y el material en el crisol con 10 ml de HCl 0.1N y 4 ml de la solución de cloruro férrico al 0. Curva de Calibración: Disuelva 0.P. Lea en el Colorímetro y calcule la cantidad de mimosina en una curva de calibración.1N por hora con agitación constante. incluyendo a Leucaena leucocephala y L. Acido Clorhídrico 0. agite bien y deje reposar hasta que los sólidos se asienten en el fondo. Matraz Volumétrico de 250 ml. Procedimiento Extracción: Coloque 1. El método permite determinar la cantidad del antinutriente en ingredientes alimenticios. Reactivos • • • • Buffer fosfato 1 M.5 g de NaH2PO4. Es estable por una semana cuando se almacena en obscuridad a 0–4°C. Método Colorimétrico para la Determinación de Canavanina (Archibald. Mezcle 34.) contienen cantidades variables del aminoácido libre canavanina. Peróxido de hidrógeno (30% H2O2) Solución de carbonato de potasio al 20% . Se debe usar solución recién preparada. 5.H2O con 130.2.6. pH 7. el cual es tóxico para animales monogástricos.FIGURA 28 Determinación colorimétrica de mimosina.6g de K2PO4 y ajuste el volumen a 1 litro Solución de nitroprusiato de sodio al 2%. 1946) Las semillas y hojas de leguminosas y en particular las de canavalia (Canavalia ensiformis) y sesbania (Sesbania spp. 4 ml de H2O2 con 10ml de la solución de nitroprusiato.• • • Solución stock de canavanina. Después de 2 horas lea en un colorímetro o espectrofotómetro. Cálculos Se grafica la densidad óptica de cada estándar contra su cantidad correspondiente de canavanina y el contenido de canavanina de las muestras se calcula a partir de la curva. . 2.5 ml de buffer fosfato y 0. Lleve 1 ml de la solución stock a 10 ml con agua Reactivo de acuoprusiato. Ponga en un tubo de ensaye una muestra de 1 ml de extracto de la muestra. Deberá prepararse diariamente. conteniendo 0–0. Mezcle vigorosamente y guarde los tubos en un gabinete obscuro.2. El uso de cantidades mayores de peróxido disminuye el color obtenido con la canavanina. puede adicionarles hasta 10 ml de agua después de las 2 horas de incubación para desarrollo del color.5 ml de reactivo de acuoprusiato. se le adicionan 0.25 mg de canavanina. se desarrollará una coloración rojiza en presencia de canavanina. Materiales y Equipo • • • Tubos de ensaye Colorímetro Espectrofotómetro Procedimiento 1.8. Deje reposar por 30 min a temperatura ambiente (20–25°C).5. 3. 0. Puede usar cubetas del espectrofotómetro para desarrollar el color. y 1 ml de solución madre diluida y llevados a 1 ml con agua. si usa cubetas de más de 2 ml. ajuste a una longitud de onda de 520 nm y el blanco a una densidad óptica de cero. tratados con el fosfato y acuoprusiato. Almacenar en hielo seco Solución estándar de canavanina. 0. así como también un blanco de reactivos con 1 ml de agua. En este último. 2. Maneje de la misma manera blancos conteniendo 0.5ml de la solución de carbonato al 20% y 0. Mezcle 0.5mg de canavanina/ml. FIGURA 29 Determinación colorimétrica de canavanina en ingredientes alimenticios. . 88 g/ml) en dos volúmenes de agua. Si se desea.42g/ml) Solución de amonio: Prepare diluyendo un volumen de hidróxido de amonio (d=0.005g aproximadamente 20g de la muestra preparada. se libera el ácido mediante enzimas y se separa por destilación para colectarse en una solución de nitrato de plata acidificada. Determinación de Acido Cianhídrico El ácido cianhídrico se encuentra de manera natural en diferentes materiales como son la semilla de lino. 10 ml de solución de acetato de sodio y una gota de antiespumante. Reactivos • • • • • • • • Antiespumante (Silicona) Acido nítrico (d= 1.02N y 1ml de ácido nítrico. Materiales y Equipo • • • • • Estufa regulada a 37–38°C Aparato para destilación de vapor Matraz de fondo plano de 1000 ml con tapón esmerilado Baño de aceite Bureta graduada a 0. mezcle y filtre. adicione aproximadamente 1 ml de sulfato férrico amoniacal y titule el exceso de nitrato de plata con la solución de tiocianato de amonio. neutral a la fenoftaleína: 10g de acetato de sodio anhidro en 100 ml de agua destilada. la muestra se suspende en agua. harina de yuca y algunas semillas de leguminosas.5. Tape el matraz y póngalo en la estufa durante 16 horas a 37–38°C. Solución 0. Triture 20 almendras dulces blanqueadas en 100 ml de agua a 37–40°C. Colecte el destilado en un matraz erlenmayer protegido de la luz conteniendo exactamente 50ml de solución de nitrato de plata 0. para lo cual. Este método permite determinar el ácido libre o en forma de glucósido. Enfríe a temperatura ambiente.02N de nitrato de plata. adicione 50 ml de agua y 10 ml de suspensión de almendras dulces. . solución saturada Suspensión de almendras dulces. Transfiera el contenido del matraz erlenmayer a un matraz aforado de 500 ml y llévelo al volumen con agua. Remueva 250 ml del filtrado. Asegúrese de que la extensión del condensador esté sumergida en la solución de nitrato de plata.7.05 ml Procedimiento Pese con exactitud de 0. colóquela en un matraz de fondo plano de 1000 ml. adicione 80 ml de agua. Sulfato férrico amoniacal. Conecte el matraz al aparato de destilación y colóquelo en el baño de aceite previamente ajustado a una temperatura ligeramente superior a 100°C. destile 200– 300 ml de líquido pasando una corriente de vapor a través del matraz y calentando suavemente el baño de vapor. Asegúrese de que no existe ácido cianhídrico en 10 ml de la suspensión usando papel de picrato de sodio o corriendo un blanco testigo como se describe más adelante Solución de acetato de sodio. se puede correr un blanco siguiendo el mismo procedimiento con 10ml de suspensión de almendras dulces omitiendo la muestra.02N de tiocianato de amonio Solución 0. 02N AgNO3 ≡ 0. Exprese el resultado como porcentaje de la muestra. La formación de este precipitado consume solución de nitrato de plata y su efecto debe ser eliminado para el cálculo de contenido de HCN.Expresión de resultados Si el blanco indica que la solución de nitrato de plata ha sido consumida. se formará un precipitado negro de sulfato de plata. para lo cual. Lave el residuo en amoníaco diluido y determine su contenido de plata. Convierta el valor a ml de solución 0. NOTA: Si la muestra (ej. el cual se filtra junto con el depósito de cianuro de plata. . frijoles) contiene una elevada cantidad de azufre. trate el depósito sobre el papel filtro con 50ml de amoníaco a fin de disolver el cianuro de plata. reste su valor del volumen consumido por la destilación de la muestra.02N de solución de nitrato de plata y résteselo al volumen de solución de nitrato de plata consumida por el destilado de la muestra. 1 ml de 0.54mg de HCN. (Krishna y Ranjhan. Afectan la utilización de las proteínas debido a que ligan a la lisina. haciéndola indisponible para animales monogástricos. confiere sabor y olor indeseable a los alimentos. con un sabor agrio astringente. 1980) Los taninos son glucósidos de polipéptidos solubles en agua presentes en muchas plantas. 5.8 Taninos en Plantas y Forrajes. Reactivos .FIGURA 30 Determinación de ácido cianhídrico en ingredientes alimenticios. Disuelva 1.0008g 02 absorbido Solución de permanganato de potasio. hasta que cambie el color azul a verde. Solución índigo. 2. Hierva el residuo por 2 horas con 300ml de agua.006235 g de ácido quercitánico ó 0.1N de ácido oxálico. 1 ml a la vez. Diluya a 1 litro y filtre.• • • Solución 0. enfríe. titule una mezcla de 20ml de solución de índigo y 750ml de agua. enfría y adicione 50ml de ácido sulfúrico. 3.333g de KMnO4 en un litro de agua y estandarice contra el ácido oxálico. Adicione la solución estándar de permanganato. De manera similar. Mida 25 ml de la infusión dentro de una cápsula de porcelana de 2 litros. Disuelva 6g de indigotin disulfonato de sodio en 500ml de agua mediante calentamiento. adicione 20ml de la solución de índigo y 750ml de agua. Procedimiento 1. luego agregue otras gotas hasta que se torne de color amarillo dorado. Extraiga 2g de muestra durante 20 horas con éter anhidro. diluya a 500 ml y filtre. Multiplique la diferencia entre las titulaciones por el factor deseado para obtener ácido quercitánico u oxígeno absorbido. . 1 ml = 0. FIGURA 31 Método simple para la determinación de taninos en ingredientes alimenticios . Extraiga durante 30 min con 50 ml de solución al 3% de ATA bajo agitación constante. 3. Lleve el volumen a aproximadamente 30 ml con agua destilada y caliente en agua a ebullición durante 30 minutos. Caliente durante 45 min el tubo con la muestra en un baño maría a 90–100°C. avena. Lave dos veces el precipitado con 20–25 ml de solución de ATA al 3% dispersándolo bien y calentándolo en agua a ebullición por 5–10 min y centrifuge. Reactivos • • • • • • • Solución de ácido tricloroacético (ATA) al 3% Solución concentrada de FeCl3 Solución de sulfato de sodio al 3% en ATA Solución 1. Finalmente repita una vez el lavado con agua. Coloque en un matraz erlemayer de 125 ml una muestra finamente molida (40 mallas). afecta también la disponibilidad de calcio. Filtre en caliente (cuantitativamente) con un papel de retención moderada (Whatman 2 ó SyS 597). 5.5. Disperse el precipitado en un poco de agua destilada.5N de NaOH y mezcle. Agréguele 4 ml de la solución de FeCl3 preparada para contener 2 mg de Fe2 soplando rápidamente la pipeta. Su presencia puede provocar deficiencias de fósforo en monogástricos por ligar y formar fitatos indigeribles que hacen indisponible ese elemento.9. Método Simple para la Determinación de Acido Fítico (Wheeler y Ferrel. adicione 3 ml de la solución 1. Centrifuge la suspensión y transfiera una alícuota de 10 ml del sobrenadante a un tubo de centrífuga cónico. trigo.5N de hidróxido de sodio Solución 3. al 3% de sulfato de sodio en ATA y continúe con el calentamiento. cebada. Centrifuge por 10–15 min y decante con cuidado el sobrenadante. etc. sorgo. estimada para contener de 5 a 50 mg de fitato-P.ATA que contenga 2 mg de Fe2 en sol 3% ATA Materiales y equipo • • • • • • • • • Matraz erlenmayer de 125 ml Tubos cónicos para centrífuga Matraz volumétrico de 100 ml Baño maría Agitador mecánico Espectrofotómetro Centrífuga de laboratorio Embudos Papel filtro Whatman 2 Procedimiento 1.2N de HNO3 Solución 1. Si se desea hacer determinación de fósforo se puede usar el filtrado. . arroz. 4. 2. magnesio o el fierro con los que forma el complejo fitina. Si el sobrenadante no está claro después de 30 min adicione 1 ó 2 gotas de la sol. El ácido fítico se puede encontrar en algunas semillas como ajonjolí. Lave el precipitado con 60–70 ml de agua destilada caliente y deseche el filtrado.5M de KSCN Solución FeCl3 . 1971). 7. Enfríe la muestra a temperatura ambiente y afore con agua destilada. Lea de inmediato (dentro de un lapso de 1 min) en el espectrofotómetro a 480 nm. Calcule el contenido de fierro a partir de un estándar de Fe(NO3)3 corrido al mismo tiempo o mediante una curva estándar preparada con anterioridad. Transfiera una alícuota de 5 ml a un matraz volumétrico de 100 ml y diluya a aproximadamente 70 ml. 6. Corra un blanco de reactivos con cada muestra.Disuelva el precipitado en el papel con 40 ml de la solución 3. Lave varias veces el papel con agua destilada colectándola en el matraz. Cálculos Calcule el fitato-P a partir de los resultados de fierro. asumiendo una tasa molecular de 4:6 fierro:fósforo FIGURA 32 .2N de HNO3 pasándolo a un matraz volumétrico de 100 ml. Agregue 20 ml de la solución 1.5M de KSCN y afore con agua destilada. Mérida.5:1:2. lo que permite cuantificar cantidades muy pequeñas de saponina.10. resuspenda con una cantidad conocida de metanol (alrededor de 1 ml). es más recomendable concentrar la muestra.R. Metanol Solución n-butanol-metanol-amoníaco concentrado (3. Deje enfriar el extracto metanólico y llévelo a 250 ml con metanol. si no se va a usar de inmediato. (2) tratamiento con nitrato de plata seguido de hidróxido de sodio y (3) tratamiento con una suspensión de eritrocitos en buffer isotónico. habiéndose demostrado un efecto negativo sobre el crecimiento de monogástricos.5) Solución estándar de saponina purificada en metanol Solución de ácido sulfúrico en metanol (100 ml por litro) Materiales y equipo • • • • • • Extractor soxhlet Rotoevaporador Densitómetro con graficador Planímetro Desecador Placa de gel de sílica para cromatografía (Kieselgel 60 F-254 Merck) Procedimiento Muela finamente la muestra y séquela a peso constante. En lugar de llevarlo a 250 ml como sugiere el método original. Resuspenda el residuo con un mínimo de metanol y páselo a un vial previamente pesado. Yucatán. seque con nitrógeno y guárdelo en desecador. En este punto hay una modificación al método propuesta por Miriam Monforte (CICY.Método simple para la determinación de ácido fítico en ingredientes alimenticios. pase el extracto metanólico a un rotoevaporador y concentre a sequedad.5:1:2. . Cambie el solvente por metanol y continúe la extracción por al menos otras 24 horas. Pese el vial con la muestra seca y calcule el peso del residuo. 5. Para utilizar la muestra. México). soya y semillas de leguminosas. 1983) Las saponinas se pueden encontrar en una gran variedad de plantas incluyendo la alfalfa. Determinación de Saponinas en Vegetales y Alimentos (Fenwick y Oakenfull. para lo cual. Reactivos • • • • • Acetona G. etc. Es un antinutriente estable al calor. Se pueden aplicar tres diferentes métodos para identificar las manchas de saponina: (1) aspersíon con ácido acético-anisaldeido.5). Para mayores detalles consulte a Fenwick y Oakenfull (1981). pigmentos. Pese alrededor de 40 g y colóquela a reflujo con acetona en el extractor soxhlet por al menos 24 horas para remover lípidos. Cromatografía cualitativa en capa fina Coloque puntos del extracto sobre una placa de gel de sílica y revélelos con una solución n-butanol-etanol-amoníaco concentrado (3. Grafique R2 contra el volumen de la gota de extracto metanólico colocada en la placa. seguida de calentamiento a 110°C por 30 min. Mida la intensidad de las manchas de saponina por medio de un densitómetro y calcule las áreas de los picos en el graficador con un planímetro. los resultados son expresados como la relación (R) de las áreas de los picos de la muestra desconocida con respecto a la del estándar. Los puntos deben ser colocados de tal manera que cada punto de extracto vaya al lado de los de estándar de saponina. el contenido de saponina en la muestra. Se ha determinado que la concentración de saponina en la muestra (en μg) es proporcional al cuadrado de las áreas relativas (R2). La pendiente de la línea (calculada por el método de cuadrados mínimos). dará la concentración de la saponina en el extracto y de esa manera. Revele las placas de la misma manera que en el apartado anterior y las manchas deben ser visualizadas mediante la aspersíon de una solución de ácido sulfúrico en metanol. .Cromatografía cuantitativa en capa fina Coloque series de puntos con volúmenes conocidos del extracto y de una solución estándar de saponina sobre las placas de cromatografía. divido entre la pendiente de una línea obtenida de una curva patrón. El método puede tener un error experimental acumulado de ±20%. FIGURA 33 Determinación de saponinas en ingredientes alimenticios. .