| | 23 DE NOVIEMBRE DEL 2009UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONÓMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN LICENCIATURA DE QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO MICROBIOLOGÍA FARMACÉUTICA PROF: SOTO GUEVARA ALBERTO NATAHLIEL GRUPO: 1906 EQUIPO 7: MELISSA GARCÍA BALDERAS HERNÁNDEZ PATLÁN DANIEL SOLÍS CRUZ BRUNO TRABAJO DE INVESTIGACION PRODUCCI ÓN INDUSTRIAL DE AMI NOÁCI DOS ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN II. AMINOÁCIDOS III. PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS AMINOÁCIDOS IV. APLICACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS A NIVEL FARMACÉUTICO V. EMPRESAS QUE PRODUCEN O COMERCIALIZAN CON AMINOÁCIDOS VI. MÉTODOS DE PRODUCCIÓN Síntesis química Extracción de aminoácidos a partir de hidrolizados de proteína Producción microbiológica Fermentación directa de aminoácidos Conversión de productos intermediarios Uso de enzimas o células inmovilizadas VII. PUNTOS CRÍTICOS DEL PROCESO DE AMINOÁCIDOS VIII. CONTROL DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN IX. CEPAS UTILIZADAS EN LA PRODUCCIÓN MICROBIOLÓGICA DE AMINOÁCIDOS Mutantes auxotrofos Mutantes regulatorios Recombinación genética Fagos Plásmidos vectores Fusión de protoplastos X. RECUPERACIÓN DE PRODUCTOS Extracción con disolventes Electrodiálisis Precipitación XI. PRUEBAS DE SEGURIDAD DE LOS AMINOÁCIDOS Inmunogenicidad XII. REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍA I. INTRODUCCIÓN Las propiedades estimuladoras del sabor del ácido glutámico se descubrieron en Japón en 1908, pero no fue sino hasta 1957 que se descubrió el ácido glutámico como producto en el medio de cultivo utilizado durante el crecimiento de Corynebacterium glutamicum, convirtiéndose este microorganismo en la fuente principal de glutamato sódico e inmediatamente después comenzó la producción comercial de glutamato sódico a partir de hidrolizados ácidos de trigo y proteína de soja. Este descubrimiento fue un enorme impulso para la industria de fermentación en Japón, de tal manera que los procesos fermentativos para la producción de aminoácidos han sido casi exclusivamente desarrollos japoneses. Los aminoácidos se utilizan habitualmente como materias primas en diversos procesos de la industria química, alimentaria, cosmética y farmacéutica. Aproximadamente el 66% de los aminoácidos producidos se utilizan en la industria de alimentos, el 30% como aditivos de piensos (forrajes y herbajes) y solamente el 4% restante en medicina y cosmética así como material de partida en la industria química. En la industria de alimentos los aminoácidos se utilizan solos o en combinación para aumentar el sabor. Muchos aminoácidos se utilizan en medicina como ingredientes de soluciones de infusiones en el tratamiento post-operatorio (nutrición enteral). En la industria química los aminoácidos son utilizados como material de partida para la producción de copolímeros, como son las fibras de polialanina o las resinas de isocianato de lisina. El ácido urónico, utilizado como agente bronceador, se produce por biotransformación de la histidina. Otro aminoácido, la glicocola, se utiliza como material de partida para la producción del herbicida glifoxato. En general, la producción industrial de aminoácidos se realiza principalmente por fermentación microbiana, biosíntesis o bien mediante la hidrólisis de proteínas. En todos los casos se obtienen aminoácidos a bajas concentraciones en disoluciones acuosas diluidas y en presencia de un elevado número de compuestos químicos similares, por lo que su separación y posterior purificación utilizando métodos tradicionales, tales como intercambio iónico, cromatografía, adsorción, extracción líquido-líquido o evaporación es un proceso muy complejo, cuyo coste puede llegar a alcanzar hasta el 50% del coste total de producción. Actualmente pueden originarse aumentos adicionales en la producción de aminoácidos debido a las siguientes innovaciones: El aislamiento de cultivos de producción mejorada por el aislamiento de cepas derreprimidas mediante el aporte de técnicas de DNA recombinante y de fusión de protoplastos a los métodos actualmente utilizados de mutación. La combinación de síntesis química con procesos microbianos y enzimáticos. La adaptación de los procesos existentes para la utilización de materiales de partida más baratos. La optimización de las condiciones de salto de escala. II. AMINOÁCIDOS Los aminoácidos, péptidos y proteínas, componentes importantes de los alimentos, proporcionan los elementos necesarios para la síntesis proteica. Las proteínas constituyen uno de los grupos de moléculas de mayor transcendencia en los seres vivos, esenciales en funciones biológicas de biocatálisis (enzimas), de participación en mecanismos de defensa (anticuerpos), genéticos (nucleoproteínas) y de neurotransmisión, en procesos de transporte (hemoglobina, citocromos), en el almacenamiento de moléculas o iones (ferritina), y además las membranas celulares están formadas fundamentalmente por agregados de lípidos y proteínas con una organización determinada y específica. Asimismo, las proteínas son fundamentales en la estructura del hueso, el cartílago, la piel y otros tejidos conectivos en los que el colágeno es la proteína más abundante. Algunas proteínas actúan como hormonas y son liberadas por glándulas específicas y la albúmina participa en el mantenimiento del balance hidroelectrolítico. Se ha determinado que el cincuenta por cien del peso seco de las células lo constituyen las proteínas. Los aminoácidos son los componentes principales de las proteínas, aproximadamente veinte aminoácidos constituyen comúnmente las proteínas. Los aminoácidos de las proteínas están unidos por enlaces covalentes (enlaces peptídicos) en un orden predeterminado genéticamente. Desde el descubrimiento y caracterización en 1806 del primer aminoácido, la L-asparagina, tuvieron que pasar más de cien años hasta que en 1935 se aisló el vigésimo, la L-treonina, aminoácido de elevada importancia nutricional por estar asociado al crecimiento. En general, las proteínas influyen directamente en las propiedades físicas de los alimentos por su alta capacidad para formar o estabilizar geles, espumas, masas, emulsiones y estructuras fibrilares. Mientras que los aminoácidos y péptidos contribuyen directamente en el sabor de los alimentos y son precursores de los componentes aromáticos y las sustancias coloreadas formadas por reacción térmica y enzimática que tienen lugar en la obtención, preparación, maduración y almacenamiento de los mismos. Además, se utilizan como suplemento alimentario para diabéticos, hipertensos o pacientes que presentan insuficiencia digestiva a las proteínas (Belitz, 1997). Tradicionalmente, los aminoácidos se obtienen a partir de las proteínas, así, por hidrólisis ácida se obtienen los hidroxilados (por ejemplo 4-hidroxiprolina) y los n-metilados (por ejemplo n-metilhistidina), y en la descarboxilación espontánea de moléculas de proteínas con ácido g-carboxiglutámico aparece el L-glutamato (Kirk, 1992). Los aminoácidos son moléculas nitrogenadas simples con cadenas hidrocarbonadas de bajo peso molecular. Todos los aminoácidos, a excepción de la glicina, tienen dos formas estructurales o estereoisómeros: L y D. La fórmula general de un α-aminoácido se puede escribir como: Donde el asterisco significa la existencia de un carbono asimétrico y por lo tanto todos los aminoácidos, excepto la glicina, tienen dos isómeros enantiómeros ópticamente activos designados por D y L. Los aminoácidos de las proteínas son todos de la forma L, debido a que las células poseen enzimas estereoespecíficas que sintetizan únicamente estos estereoisómeros, eliminándose si existen los estereoisómeros D vía renal, y evitando así, una posible síntesis de péptidos tóxicos. A pesar de todo, en las células existe una cierta cantidad de D-aminoácidos aunque nunca formando parte de las proteínas. Otra característica importante es su carácter anfotérico, las moléculas de aminoácidos tienen dos cargas eléctricas iguales, de signo opuesto debidas al grupo amino y al carboxilo. La cadena lateral de los aminoácidos, R, puede ser desde un protón como en el caso del aminoácido más sencillo la glicina, hasta un resto alifático, aromático o heterocíclico portador de otros grupos funcionales. La cadena lateral es decisiva para las interacciones intra- e inter-moleculares de las proteínas y según las características de esta se puede realizar la siguiente clasificación: Los valores nutricionales de una proteína están controlados por el balance cuantitativo y cualitativo de cada aminoácido esencial, estos valores se pueden mejorar agregando los aminoácidos que la proteína posea en baja concentración. Todos los aminoácidos de las proteínas están disponibles comercialmente y su interés comercial es creciente, principalmente debido a su uso como potenciadores del sabor y edulcorantes en la industria alimentaria. El desarrollo reciente de nuevos fármacos y antibióticos ha fomentado el consumo de aminoácidos tales como el ácido glutámico, ácido aspártico, fenilglicina, etc. Los aminoácidos son moléculas nitrogenadas simples con cadenas hidrocarbonadas de bajo peso molecular. Todos los aminoácidos, a excepción de la glicina, tienen dos formas estructurales o estereoisómeros: L y D. En las proteínas animales todos los aminoácidos presentes pertenecen a la serie L. Sin embargo, en ciertos casos el animal dispone de la capacidad enzimática precisa para aprovechar la forma D, previa transformación a la forma L correspondiente. Acido glutámico Es el aminoácido de mayor consumo a nivel mundial; la sal sódica del acido glutámico, el glutamato monosódico (GMC) se usa como aditivo alimentario. Se producen aproximadamente por fermentación 370 000 toneladas anuales. El acido L-glutámico se produce por fermentación; para obtener la sal, el acido se neutraliza con hidróxido de sodio. Se obtienen 87 g/Lt de acido glutámico, lo que da un rendimiento de conversión azúcar-acido glutámico de 42.3 %, en tanto la conversión de acido glutámico a glutamato monosódico (GMS) es de 92%. L-treonina La L-treonina se obtiene preferentemente mediante un proceso fermentativo por microorganismos. También puede obtenerse por aislamiento a partir de hidrolizados de proteína para uso farmacéutico. Metionina Este aminoácido se usa principalmente en la formulación de alimentos balanceados típicamente en dietas de maíz y soya que tienen bajas concentraciones de Metionina y lisina. Para este fin, es utilizada la mezcla racémica D, L-metionina obtenida por síntesis química. Triptófano El triptófano es el segundo aminoácido limitante del maíz y el tercero en los alimentos balanceados de cerdos y pollos, pero debido a su alto costo su uso ha sido restringido. Sin embargo, los avances en el proceso de fermentación y en el desarrollo de rutas de producción alternativas, permiten suponer que su precio baje. L-lisina La producción de L-lisina se inicia simultáneamente a la de DL-metionina; por efecto de la devaluación e inflación creciente hubo, a partir de 1976, un desfasamiento en las inversiones y consecuentemente en la producción. La unidad diseñada para producir 3 000 toneladas por año logro satisfacer las necesidades del mercado durante los dos años siguientes al inicio de su operación comercial. En 1991 se estimó que se alcanzo 15 000 toneladas, exportándose 30% de la producción. Su principal mercado es en alimentos balanceados consumiéndose 70 000 toneladas anuales de grado alimenticio. La fabricación de L-lisina por fermentación es un proceso típicamente biotecnológico, este se inicia en el laboratorio, en donde se desarrolla el cultivo a partir de un liofilizado de Corynebacterium glutamicum. La bacteria se resiembra varias veces para preparar el inoculo que se envía a la planta, en donde es transferido a diferentes unidades hasta llegar al fermentados de 120 000 Lt de capacidad. El caldo de fermentado que contiene 90 g/Lt de L-lisina se acidifica y se pasa a través de resina de intercambio iónico. La lisina se eluye, concentra y neutraliza con HCl para obtener el monoclorhidrato, y se cristaliza. Los cristales se lavan, secan y pulverizan. En este proceso se tiene un rendimiento del 33% en relación con la fuente de carbono utilizada (mieles incristalizables de caña de azúcar). L-leucina La l-leucina es otro aminoácido que se produce en el país y que se utiliza como materia prima en la elaboración de L-lisina; se adiciona al medio de cultivo en una proporción de 20 Kg/Lt de L-lisina este proceso también se lleva a cabo por fermentación y el rendimiento de conversión de azúcar a L-leucina es de 14-16 %, obteniéndose 21 g/Lt de medio de cultivo. El método de producción es similar al de L-lisina, de hecho se usa el mismo equipo. En la fabricación de L-lisina, la leucina se utiliza tal como viene de los procesos de fermentación, no requiere de purificación; el medio de cultivo se alimenta directamente después de su esterilización. La capacidad de producción de L-leucina es, actualmente de 120 ton/año. Existen posibilidades de un mercado mayor en la medida en que aumente la producción de L-lisina. Este aminoácido solo se produce en Japón, EUA y México. Su potencial de desarrollo estriba en la exportación, los problemas técnicos por resolver son, principalmente, la separación y la cristalización, operaciones necesarias para lograr la forma en que deberá llegar al mercado. Las expectativas en la demanda de leucina por el mercado externo pueden alcanzar volúmenes de 500 y 600 ton/año, siendo factible duplicar este consume en corto plazo. III. PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS AMINOÁCIDOS Los aminoácidos tienen amplias aplicaciones industriales. Los aminoácidos se utilizan como materias primas en la industria alimentaria, farmacéutica, química y cosmética. Aproximadamente el 66% de los aminoácidos producidos se utilizan en la industria de los alimentos, el 31% como aditivos de piensos (alimento elaborado para animales) y solamente el 4% en medicina y cosmética, además de material de partida para la industria química. En la industria alimentaria se han utilizado los aminoácidos y sus derivados para edulcorar, salar, modificar o aumentar el sabor de los alimentos. Cada aminoácido y derivados tiene un sabor característico: dulce, amargo, agrio, salado. El D-glutamato es insípido y los ésteres de metil o etil glicina poseen un sabor muy salado. La glicina y L-alanina son débilmente dulces pero el aspartame (éster de metil L-aspartil-L-fenilalanina) es 200 veces más dulce que la sacarosa, utilizándose como edulcorante artificial. Recientemente ha aumentado el consumo de L-fenilalanina y ácido L-aspártico como materias primas para la síntesis de este éster. También la D-alanina junto con el ácido aspártico forma un edulcorante 12 veces más dulce que el aspartame. Además, muchos piensos domésticos no contienen los aminoácidos esenciales necesarios para el crecimiento equilibrado de los animales, y normalmente, es necesario introducir en la dieta suplementos alimenticios que contengan los aminoácidos esenciales, los más frecuentes son: DLmetionina, L-lisina, L- treonina. En la industria de cosméticos, los aminoácidos y sus derivados se utilizan para controlar o neutralizar las variaciones de pH en la piel y los efectos bacterianos. Por ejemplo, la serina se utiliza en cremas o lociones faciales y el glutamato de glucosa se emplea en champús y cremas como compuesto humectante del pelo y de la piel (Kirk, 1992). En la industria química los aminoácidos se emplean en campos muy diversos. Actualmente en relación a la protección del medioambiente, se presta especial atención a los poli aminoácidos, que son polímeros biodegradables. Entre otras utilidades estos polímeros se utilizan en la producción del cuero sintético y los polímeros biodegradables poli-(L-ácido aspártico-co-PEG) con aplicación en el campo de la biomedicina. Algunos derivados de aminoácidos se emplean como agentes de limpieza por ejemplo en la eliminación de aceites de efluentes industriales se está empleando un derivado del ácido glutámico. Los aminoácidos están teniendo una creciente demanda en la industria química. A medida que sus precios bajan, su uso es más diversificado, en la manufactura de polímeros sirven como materias primas, tal es el caso de las fibras de polialanina o bien las resinas de isocianato de lisina; el poli-gama-metilglutamato es usado como una capa superficial de la piel sisntetica, la glicina es la materia prima inicial para la producción del herbicida glifosato y la treonina para el aztreonam (antibiótico). La producción comercial de aminoácidos se resume en la siguiente tabla. Se han desarrollado procesos de fermentación para todos los aminoácidos a excepción de glicina y L-cisteína. Producción mundial de aminoácidos. Procesos de producción y aplicaciones. Aminoácido Producción anual (toneladas métricas) Métodos de producción Aplicación D, L-alanina 130 - Uso de enzimas o células inmovilizadas - Extracción de hidrolizados de proteínas Potenciador del sabor L-alanina 700 - Síntesis química Potenciador del sabor (Producción de bebidas) L-arginina 1000 - Fermentación directa - Extracción de hidrolizados de proteínas Infusiones Terapia (enfermedades del hígado) Cosméticos Ácido L-aspártico 4000 - Uso de enzimas o células inmovilizadas - Extracción de hidrolizados de proteínas Terapia Potenciador del sabor Producción de aspartame L-asparagina 50 - Extracción de hidrolizados de proteínas - Síntesis química Terapia L-cisteína 700 - Extracción de hidrolizados de proteínas Producción de pan Antioxidante Terapia (bronquitis) Ácido L- glutámico 370000 - Uso de enzimas o células inmovilizadas Potenciador del sabor L-glutamina 500 - Uso de enzimas o células inmovilizadas Terapia (ulcera) Glicina 5000-6000 - Síntesis química Componente de los edulcorantes L-histidina 200 - Fermentación directa - Extracción de hidrolizados de proteínas Terapia (ulcera) L-isoleucina 150 - Fermentación directa Infusiones L-leucina 150 - Extracción de hidrolizados de proteínas - Fermentación directa Infusiones L-lisina 70000 - Fermentación directa - Uso de enzimas o células inmovilizadas Aditivo de piensos Infusiones D, L-metionina 7000 - Síntesis química Aditivo de piensos L-metionina 150 - Uso de enzimas o células inmovilizadas Terapia L-ornitina 50 - Fermentación directa - Uso de enzimas o células inmovilizadas Terapia del hígado L-fenilalanina 3000 - Fermentación directa - Uso de enzimas o células inmovilizadas Infusiones Producción de aspartame L-prolina 100 - Fermentación directa Infusiones L-serina 50 - Transformación microbiana de precursores - Fermentación directa Cosméticos L-treonina 160 - Fermentación directa Aditivo de piensos L-triptófano 200 - Fermentación directa - Uso de enzimas o células inmovilizadas Infusiones L-tirosina 100 - Extracción de hidrolizados de proteínas - Uso de enzimas o células inmovilizadas Infusiones Precursor de la síntesis de L-DOPA L-valina 150 - Fermentación directa - Uso de enzimas o células inmovilizadas Infusiones IV. APLICACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS A NIVEL FARMACÉUTICO Los aminoácidos ópticamente puros, compuestos que presentan una pureza del cien por cien de una de sus variedades D ó L, poseen una elevada importancia biomédica debido a sus numerosas posibilidades. Entre sus ámbitos de aplicación destaca la industria farmacéutica, ya que están ligados a la fabricación de sueros, aditivos alimentarios, antibióticos, antitumorales y reactivos de aplicación en la síntesis orgánica, entre otros compuestos. En medicina, en pre- y post-operatorios, se están utilizado transfusiones de aminoácidos para mantener el nivel de nitrógeno necesario para el funcionamiento metabólico. Además, se han desarrollado distintas mezclas de aminoácidos especiales para el tratamiento de muchas enfermedades (Kirk, 1992). En la industria farmacéutica se utilizan con distintos fines. La L-glutamina y sus derivados se utilizan como remedio en úlceras de estómago o duodenales, el L-DOPA (L-3-(3,4- dihidroxifenil) alanina) es una droga muy efectiva en el tratamiento del Parkinson, el L- triptófano y el 5-hidroxi-L-triptófano se emplean como antidepresivos, el aspartato de potasio se utiliza para mejorar el equilibrio salino del metabolismo y el aspartato de calcio para suplir las deficiencias de calcio en el organismo. La p-hidroxi-D-fenilglicina, Dfenilglicina, D-cisteina y el ácido D-aspártico son importantes como precursores de antibióticos de las familias de penicilinas o cefalosporinas (Kirk, 1992). En concreto el aminoácido α-fenilglicina se emplea como precursor en la síntesis de antibióticos β- lactámicos, como las cefalosporinas. Estos antibióticos son, dentro de los productos farmacéuticos, uno de los grupos con mayor volumen de producción. Tabla 1. Producción en cultivos sumergidos de aminoácidos de interés farmacéutico Aminoácido Interés a nivel farmacéutico L-arginina Alivio de hiperamonemia (aumento agudo o crónico del amonio sanguíneo) y trastornos hepáticos mediante la estimulación de la arginasa Estimula secreción de insulina L-citrulina Alivio de hiperamonemia y trastornos hepáticos mediante la estimulación de la arginasa Estimula secreción de insulina L-ornitina Alivio de hiperamonemia y trastornos hepáticos mediante la estimulación de la arginasa Estimula secreción de insulina L-histidina Deficiencia vitamínica B 6 en el embarazo L-homoserina Enfermedades carenciales L-glutamina Deficiencia vitamínica B 6 en el embarazo Tratamiento de ulceras gástricas L-isoleucina Enfermedades carenciales L-leucina Enfermedades carenciales L-fenilalanina Enfermedades carenciales L-prolina Enfermedades carenciales L-treonina Tratamiento del sobrepeso L-valina Enfermedades carenciales L-cisteína Tratamiento de bronquitis e inyección intravenosa post-operatoria Uno de los mayores problemas reside en su producción. El método empleado con mayor eficiencia, denominado proceso de la hidantoinasa, se reduce a la síntesis de tan sólo dos compuestos, la D-fenilglicina y D-parahidroxifenilglicina, que permiten la elaboración de los antibióticos ampicilina y amoxicilina, respectivamente. Con el objetivo de mejorar la producción de aminoácidos, actualmente se ha adaptado este limitado proceso a la fabricación de cualquier D-aminoácido ópticamente puro. El aspecto más innovador del descubrimiento reside en el desarrollo de un nuevo organismo recombinante capaz de producir las tres enzimas necesarias en la síntesis de cualquier D- aminoácido ópticamente puro con una eficacia del 100%. El proceso consiste en introducir en la bacteria Escherichia coli un ADN plasmídico (material genético extracromosómico procedente de la bacteria parasitaria de plantas Agrobacterium tumefaciens) con el objetivo de incorporar los genes responsables de producir las enzimas (Martínez, 2009). En el año 2002, ya se había logrado producir cualquier D-aminoácido ópticamente puro con una eficiencia similar a la actual. Pero su elaboración precisaba de tres organismos, cada uno de ellos responsable de aportar una enzima, y cuatro biorreactores. Tres de ellos eran empleados en la obtención de las células productoras de las enzimas perseguidas; luego, éstas eran mezcladas en un cuarto reactor donde se añadía el sustrato necesario para la reacción y se obtenían los compuestos deseados. Gracias al desarrollo de este nuevo método que se ha patentado, se ha conseguido reducir el costo, tanto material como tiempo, de la fabricación de D-aminoácidos ópticamente puros al ser necesario un único organismo y, por tanto, un solo biorreactor. Actualmente este sistema de coexpresión enzimática para la producción de D-aminoácidos se utiliza para la obtención de D-aminoácidos, pero se tiene la intención de adaptarlo a la fabricación de otros dos tipos (los L-α y β ópticamente puros). Entre otras aplicaciones, estos últimos destacan por su ya reconocido efecto antitumoral. Este descubrimiento tiene una gran importancia a nivel farmacéutico ya que este sistema, similar para la producción de β-aminoácidos, puede aplicarse en el desarrollo de precursores de medicamentos antitumorales o en el tratamiento del Parkinson. Esto es debido a que la creación de un sistema enzimático capaz de producir un número más o menos amplio de este tipo de β-aminoácidos es muy interesante para la biomedicina. Una de las enzimas que se ha caracterizado, y que forma parte del sistema para la producción de β-aminoácidos, es la amidohidrolasa N-carbamoilbeta-alanina. Se ha publicado en Applied and Envirionmental Microbiology, que la β-alanina se distribuye de forma significativa en el sistema nervioso y actúa como análogo de diferentes inhibidores de neurotransmisores, por lo que podría estar vinculada a la transmisión sináptica. V. EMPRESAS QUE PRODUCEN O COMERCIALIZAN CON AMINOACIDOS En México existe una gran tradición en cuanto a la utilización de los seres vivos, sus productos o sus partes para la producción de satisfactores sociales y también en cuanto a la investigación de los sistemas biológicos. Un análisis general reveló que las empresas biotecnológicas identificadas presentan las siguientes características: Tienen una dependencia tecnológica casi total del extranjero y, en particular, a lo que se refiere a la infraestructura de investigación y desarrollo. En su mayoría son empresas identificadas dentro de la industria de alimentos, particularmente en la elaboración de productos lácteos, levadura para panificación y bebidas fermentadas. Los procesos que utilizan estas empresas son en su mayoría de fermentación o enzimáticos. La investigación y desarrollo que se realiza está asociado en gran medida al control de calidad de sus productos. Un grupo importante de empresas son las ubicadas en la industria químico- farmacéutica, entre las que predominan las productoras de antibióticos. Los procesos utilizados son fermentativos y/o enzimáticos; destacan en esta industria, empresas mexicanas como Cibiosa, S.A. de C.V. Sin embargo, en la industria farmacéutica la mayor parte de las empresas son transnacionales que realizan su investigación fundamental y desarrollo en su casa matriz (Upjohn, Abbott Laboratories de México, S.A. de C.V., etcétera). Productos como las enzimas son elaborados por empresas como: Enmex, S.A., Quimorgan, Efensa, S.A. de C.V., entre las más importantes; su actividad en investigación es realizada con sus socios en el extranjero. También hay empresas productoras de aminoácidos tales como Fermentaciones Mexicanas, S.A. de C.V. y Enzimóloga; esta última produce aspartame bajo licencia de Searle; sus actividades de I-D están relacionadas con el desarrollo de innovaciones en productos y/o procesos. Sinbiotik Internacional Aminas y Derivados Bioteksa Bíox de México Laboratorios Pisa Danamart Chemicals de México Química Foliar Alltech y Aplied Science para México Productos Tecnoquímicos Dorubiel Rosales America Alimentos Canamex Especialidades Químicas Laboratorios Avilab Baja-Ital Bio-Zoo Difac Global Health Care International Cyanamid de México VI. MÉTODOS DE PRODUCCIÓN Entre los productos obtenidos por fermentación destaca el mercado que ocupan los aminoácidos. Se han desarrollado procesos de fermentación para todos los aminoácidos excepto para glicocola, L-cisteína y L-cistina, pero no todos estos procesos de fermentación se encuentran en uso a nivel comercial. En la fabricación comercial de aminoácidos existen tres procesos: 1. Síntesis química. La producción de glicocola, D, L-alanina, D, L-metionina y D, L- triptófano siempre implica síntesis química. La síntesis química es más barata que la producción microbiana pero el producto químico es la mezcla ópticamente inactiva de los isómeros D y L. Por ello se han establecidos procesos enzimáticos para la resolución óptica. La aminoacilasa es la enzima que presenta mayores ventajas en la obtención de L-aminoácidos, ya que se cataliza la siguiente reacción: 2. Extracción de aminoácidos a partir de hidrolizados de proteína. Este método se utiliza para obtener L-cisteína, L-cistina, L-leucina, L-asparragina y L-tirosina. 3. Producción microbiológica. Dentro de esta existen tres enfoques: a. Fermentación directa de aminoácidos utilizando diferentes fuentes de carbono, como glucosa, fructosa, melazas, hidrolizados de almidón, n-alcanos, etanol, glicerol, acetato, propionato, obteniéndose altos rendimientos. Como ya se menciono, prácticamente existen para todos los aminoácidos procesos de fermentación desarrollados, pero en todos los casos se producen comercialmente por esa vía. Acido L-glutámico La producción de L-glutámico se realiza principalmente por fermentación. Se conocen numerosos microorganismos capaces de producirlo a partir de diferentes fuentes de carbono. La ruta biosintética para la obtención del acido glutámico es conocida, a partir de glucosa como fuente de carbono utilizando la ruta metabólica Embden-Meyerhof y el ciclo pentosa-fosfato se canalizan al ciclo de ácidos tricarboxilicos. Las cepas comerciales son mutantes en el ciclo tricarboxilico, con un bloqueo de la alfacetoglutarato deshidrogenas, lo cual permite acumulación de acido glutámico. La estequiometria de la reacción con base a glucosa es de 1 mol de aminoácidos por 1 mol de glucosa. Un proceso de fermentación típico de esta fermentación se presenta a continuación. En estos casos se logra que la bacteria convierte del 50 al 60 % de la fuente de carbono a acido L-glutámico, alcanzándose concentraciones de más de 100 g/Lt, con una productividad del orden de 20 toneladas por metro cubico de fermentación por año. Acido L-aspártico El acido L-aspártico se produce industrialmente a partir de acido fumárico y amonio por los métodos de fermentación o enzimático, empleando la reacción de la aspartasa: Inicialmente se utilizó aspartasa de E. coli inmovilizadas para operar un proceso continuo; sin embargo, debido a que el precio del acido aspártico es bajo se buscaron otros métodos alternativos. Como resultado de estas investigaciones se inmovilizaron células de E. coli con alta actividad de aspartasa en gel de poliacrilamida. Este proceso se comercializó operando en continuo con columnas empacadas de células inmovilizadas. Desde un punto de vista económico este proceso es más barato que la fermentación y los procesos enzimáticos en lote. Posteriormente la poliacrilamida fue sustituida por la K-carragenina como material de inmovilización de las células. I nhibición por retroalimentación en la biosíntesis de lisina y treonina L-alanina Este aminoácido se produjo en su inicio en un proceso lote a partir de acido L-aspártico usando la enzima L-aspartato 4-descarboxilasa de Pseudomona dacunhae. Posteriormente las células de P. dacunhae fueron inmovilizadas en K-carragenina pudiéndose tener un proceso continuo más eficiente. Con propósito de aumentar la productividad del sistema se inmovilizaron conjuntamente células E. coli con actividad de aspartasa y de P. dacunhae con actividad de 4-descarboxilasa alimentando como sustrato al reactor una solución de fumarato de amonio. Las células contienen la enzima L-aspartato β- descarboxilasa y el reactor se opera a alta presión con el objeto que se disminuya la liberación del CO2 que se forma como subproducto. En una columna de 1 metro cubico se pueden obtener 5.1 toneladas mensuales de L-alanina y 9.5 de acido D-aspártico. Esta productividad del acido D-aspártico es 6 veces más alta que la de un reactor con aminoacilasa inmovilizada. L-serina La enzima serina hidroximetiltransferasa convierte reversiblemente la glicina y el formaldehido en L-serina en presencia del cofactor, acido tetrahidrofóbico, de acuerdo con la siguiente reacción: Con el objeto de tener una cepa hiperproductora de la enzima se tradujeron copias múltiples del gene de la enzima de E. coli en Klebsiella aerogenes, lográndose que 10 % de la proteína total de la bacteria fuese la enzima. La producción de la enzima alcanzo los valores más altos de actividad específica cuando la fermentación se realizo manteniendo bajas concentraciones de oxigeno disuelto. El biocatalizador se prepara con células completas permeabilizadas o bien con lisados celulares. Se obtuvo una productividad de 10 g de L- serina por litro de biorreactor por hora con una conversión molar de 80 % de glicina a L- serina. La relación en concentraciones finales entre L-serina y la glicina residual es de 12:1, permitiendo la recuperación de la L-serina por cristalización fraccionada y reciclando la glicina al reactor. Alternativamente el efluente del reactor puede ser usado como sustrato en la producción de L-triptofano. L-triptófano El aminoácido esencial triptófano puede ser producido por síntesis química, fermentación a partir de azucares y métodos enzimáticos usando la triptofanasa o la triptófano sintetasa. La mayor parte de los métodos químicos producen mezclas D-L triptófano y aun cuando hay resolución enzimática se requieren pasos adicionales de proceso que incrementaba los costos. Se han descrito numerosas fermentaciones microbianas para la biosíntesis de triptófano incluyendo el uso de cepas modificadas por ingeniería genética. Por esta técnica se ha incrementado la productividad de la fermentación, pero la concentración al final de la fermentación continua siendo baja, 15 a 17 g/Lt. Producción enzimática de aminoácidos. Aminoácido Enzima Microorganismo productor de la enzima Reacción Rendimiento (g/Lt) Eficiencia (%) L-alanina Aspartato descarboxilasa Pseudomonas dacunhae L-asp → L-ala + CO 2 600 100 Ácido L-aspártico Aspartasa E. coli Fumarato + NH 4 + → Ácido L-aspártico 560 99 L-cisteína Cisteína desulfidrasa Bacillus sphaericus Β-Clor-L-alanina + Na 2 S → L-cisteína + NaCl + NaOH 70 80-85 L-DOPA (L-3,4 Dihidroxifenilalan ina) Tirosinasa Erwinia herbicola Pirocatecol + Piruvato + NH 4 + → L-DOPA + H 2 O 59 95 L-leucina L-leucina deshidrogenasa Bacillus sphaericus Ácido α-cetoisocaproico + NH 4 + + NADH → L- leucina + H 2 O + NAD + 42 Máx. 99.7 L-lisina D-amino caprolactama racemasa Achromobacter obae D,L aminocaprolactama + H 2 O → L-lisina 100 100 L-amino caprolactama hidrolasa Cryptococcus laurentii L-fenilalanina L-fenilalanina deshidrogenasa Brevibacterium sp. Fenilpiruvato + NH 4 + → L-fenilalanina + H 2 O 37 Acetamidocinna mato amido hidrolasa Bacillus sphaericus Ácido acetamidocinamico → L-fenilalanina 8 94 Fenilalanina amonio liasa Rhodotorula glutinis Ácido Trans-cinámico + NH 4 + → L-fenilalanina 18 70 Aspartato fenilalanina transaminasa E. coli L-aspartato + Fenilpiruvato → L- fenilalanina + Oxalacetato 30 98 D- hidroxicaproato deshidrogenasa Lactobacillus casei D,L Fenillactato → Fenilpiruvato - - L- hidroxicaproato deshidrogenasa Lactobacillus confusus L-fenilalanina deshidrogenasa Rhodococcus sp. Fenilpiruvato + NH 4 + → L-fenilalanina + H 2 O 28 - L-serina Serinhidroximet il transferasa Klebsiella aerogenes Glicina + HCHO → L- serina 450 88 L-triptófano Serinhidroximet il transferasa Klebsiella aerogenes Glicina + HCHO → L- serina 200 95 basado en indol Triptofanasa E. coli L-serina + Indol → L- triptófano + H 2 O L-tirosina Serinhidroximet il transferasa Klebsiella aerogenes Glicina + HCO → L-serina 26 61 basado en glicina β-tirosinasa Erwinia herbicola L-serina + Fenol → L- tirosina + H 2 O b. Conversión de productos intermediarios baratos, vía biosíntesis. Por ejemplo, la glicocola que es barata, puede ser convertida en L-serina. c. Uso de enzimas o células inmovilizadas, a veces en procesos continuos que implican reactores de enzimas unidas a membranas para la separación de una mezcla racémica. En la siguiente tabla se muestran varios de los principales sistemas inmovilizados (enzimas o células) utilizados en la producción de aminoácidos. Las más comunes reacciones de este tipo son: - La utilización de amino acilasas especificas de Aspergillus oryzae para cortar selectivamente un D, L aminoácido sintetizado químicamente, que había sido químicamente acetilado. De esta forma la forma L del aminoácido es liberada selectivamente. - Pueden producirse L-α-aminoácidos a partir de α-cetoácidos utilizando aminoácidos deshidrogenasas. La deshidrogenasa más utilizada es una enzima de cepas de Bacillus, como B. megaterium que requiere NADH como coenzima. - La D, L-5-hidantoinas monosustituidas que son producidas químicamente con facilidad pueden ser convertidas mediante cortes enzimáticos estereoespecíficos en aminoácidos Do L ópticamente activos. El corte de hidantoina por Do L- hidantoinasa conduce a la producción de D o L-N-carbamoilaminoácidos. El residuo carbamoilo es eliminado química o enzimáticamente con la carbamoilasa correspondiente. Las L-hidantoinasas han sido encontradas solamente en unas pocas bacterias, por ejemplo, Flavobacterium ammoniagenes, mientras que las D- hidantoinasas se encuentran en numerosas bacteritas, actinomicetos, levaduras y algunas cepas de Aspergillus. Además del uso de este enfoque para la producción de L-aminoácidos puede también ser utilizado para la fabricación de D-N-carbamoil aminoácidos y D- aminoácidos que tienen un papel importante como precursores para la producción de penicilinas y cefalosporinas. En la siguiente tabla se muestra un resumen de los metodos industriales para la obtencion de aminoacidos. Tecnología Proceso Fecha de Aplicación Fundamento Técnico-científico Materias Primas Utilizadas Productos Obtenidos Observaciones Ventajas / Inconvenientes Hidrólisis ácida de proteínas animales Mediados del siglo XIX Ataque de las proteínas con ácidos fuertes descomponiéndolas en péptidos y aminoácidos. Residuos de mataderos. Subproductos industrias lácteas. Péptidos y aminoácidos. Alto contenido de impurezas procedentes de los ácidos. Baratos. Uso muy limitado. Tecnología Rudimentaria. Hidrólisis enzimática de proteínas vegetales En la década de 1970 Desintegración de las proteínas por medio de enzimas. Residuos Vegetales. Proteínas Vegetales. Péptidos y aminoácidos derivados. Difícil control del proceso y de los productos. Relativamente baratos. Peligro de alteraciones en las células. Síntesis Microbiana Cultivo de microorganismos manipulados genéticamente 1960 Activación de microorganismos capaces de sintetizar aminoácidos. Tecnología japonesa. Microorganismos. - Brevibacterium. - Corinobacterium manipulados genéticamente. Solo nueve aminoácidos. Difícil eliminación de toxinas del caldo de cultivo. Aminoácidos baratos para alimentación ganadera. No apto para uso agrícola o médico. Síntesis química 1850 (A. Strecker 1956) Reacciones químicas. Unión de los elementos químicos. Diversos componentes químicos. Se obtienen aminoácidos puros no biológicamente activos en cantidades pequeñas, gran pureza y muy caros. Uso como patrones en cromatografía. Su elevado coste impide su uso en otras áreas. Ingeniería biológica 1982 Proceso INAGROSA Rutas biosintéticas celulares. Química del estado sólido. Cromatografía HPLC. Similares a las de pre síntesis celular (piruvatos). Todos los aminoácidos fundamentales. Muy puros y biológicamente activos. Oligopéptidos similar a los Factores de Transcripción Celular. Muy puros, biológicamente activos y estables. Uso Universal: agricultura, medicina, cosmética, etc. Precio Competitivo. VII. CONTROL DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN La producción de aminoácidos se lleva a cabo en procesos discontinuos durante 2-4 días en fermentadores que contienen hasta 450 m 3 . Se han desarrollado métodos que utilizan procesos continuos pero no han sido todavía implementados en plantas comerciales. Debido a la alta velocidad de degradación de los azúcares y a la alta actividad respiratoria durante la fermentación se produce un gran requerimiento de oxigeno. Las velocidades óptimas de aireación para cada proceso individual dependen de las cepas, el sustrato y la vía biosintética. El exceso de calor debe ser disipado simultáneamente ya que el proceso que se lleva a cabo a temperaturas de entre 28 y 38ºC. El pH se mantiene constante entre 6.8 y 8.0, dependiendo del proceso; frecuentemente se utiliza NH 3 gaseoso para el control del pH y se metaboliza simultáneamente como fuente de nitrógeno. Durante el proceso de fermentación de aminoácidos los parámetros críticos como la velocidad de aireación, la temperatura, el pH y la dosis de antiespumante son todos regulados automáticamente y en unos pocos casos están bajo el control de un ordenador (Crueger, 1993). Se han desarrollado biosensores que permiten la medida continua de la concentración de aminoácidos en el fermentador. Por ejemplo, se ha preparado un sensor de ácido glutámico utilizando como enzima glutamina sintetasa obtenida de la bacteria termófila Bacillus stearothermophilus. Se han desarrollado varios métodos para la evaluación de los aminoácidos en el caldo de cultivo. Estos métodos incluyen el análisis químico, cromatografía en papel, análisis colorimétricos, cromatografía gas-líquido, espectrometría de masas, espectroscopia de infrarrojo de intercambio iónico y la cromatografía líquida de alta resolución. También se han descrito métodos de cromatografía en papel utilizando un sistema disolventes compuesto por n-butanol, ácido acético y agua en una proporción de 2:1:1. VIII. PUNTOS CRÍTICOS DEL PROCESO DE PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS PORM FERMENTACIÓN Un proceso industrial se desarrolla con éxito cuando se pasa de manera adecuada desde la idea original, que se prueba a nivel de laboratorio, hasta el proceso a gran escala. Ello no consiste, simplemente en aumentar la cantidad de materia calculada para el proceso original, sino que se debe de tener en cuenta otros parámetros que consideren los problemas que surgen al trabajar a gran escala. Ello lleva consigo que las técnicas y materiales que se utilizan el proceso industrial son bastante diferentes de los utilizados en el sistema original a pequeña escala. Los fenómenos biológicos, por su parte, ofrecen un problema por sí solos, ya que operan a concentraciones muy diluidas tanto de los sustratos como de los productos aun después de intensificar el proceso. Para el desarrollo de los procesos biológicos el trabajo se centra principalmente en tres áreas: el desarrollo del organismo, el desarrollo del medio y la ingeniería de la fermentación. La ingeniería de la fermentación es la rama de la tecnología que estudia el desarrollo, construcción y operación de la planta y el equipo utilizado en los procesos biológicos a escala industrial. Las condiciones ambientales existentes dentro de un fermentador puede considerarse bajo tres aspectos diferentes: biológicas, químicas y físicas. El medio biológico es favorable para un proceso biológico cuando únicamente los organismos que contribuyen al proceso en cuestión se encuentran presentes, mientras que los no productivos, destructivos o no deseados se encuentran excluidos llevan consigo lo llevan también consigo que los organismos deseados se encuentran presentes en cantidades suficientes para llevar a cabo el proceso deseado a un ritmo que sea rentable, aunque se asume normalmente que ello de deriva, simplemente, de mantener unas condiciones ambientales adecuadas. Un sistema que contenga solamente el organismo deseado se dice que es aséptico. La asepsia se consigue en la práctica eliminando todos los organismos vivos, es decir, esterilizando, e introduciendo después el organismo deseado. Alcanzar las condiciones asépticas es caro, lo mismo que es mantenerlas, por lo que el diseño, construcción y operación de la planta no deberá de ser más riguroso de lo que sea estrictamente indispensable. Se deberá de tener en cuenta, por tanto, el riesgo de contaminación del proceso así como los costos que la contaminación trae consigo y el de prevención de la contaminación para obtener el balance más adecuado. La infección debida a bacteriófagos puede causar pérdidas considerables en la producción. Para evitar la infección fágica pueden ser utilizados mutantes resistentes a fagos y agentes químicos que inhiben la reproducción de fagos. Una investigación intensa sobre el mantenimiento de cultivos puros (esterilización del equipo, medio y aire) se ésta llevando a cabo; la esterilización de las soluciones de nutrientes tiene lugar generalmente en forma continua. El medio físico se refiere fundamentalmente a la temperatura del sistema que hace que su control se tenga muy en cuenta cuando se diseña un fermentador. Este requerimiento y la necesidad de mantener la uniformidad de las condiciones a lo largo del fermentador, lleva consigo la necesidad de una buena agitación, lo que a su vez provoca la ruptura de los organismos y sus agregados. Debe señalarse que cuando se mantiene un ambiente favorable, los parámetros ambientales no tienen que parecer constantes a lo largo del tiempo. La fermentación por cargas pasa por diferentes fases de crecimiento que tienen diferentes condiciones optimas, de modo que la fermentación parece estar programada de acuerdo con la disponibilidad de los nutrientes, que cambian a lo largo del tiempo, el pH o la temperatura, para que aparezcan, de acuerdo con estos cambios las sucesivas fases de crecimiento. Dentro del fermentador se deben de mantener un ambiente controlado y debidamente cerrado, al mismo tiempo que se mantenga una estrada y salida aséptica tanto para el medio del nutriente como para el aire y los fluidos de control, así como para los sistemas de calefacción, enfriamiento y agitación. Las reglas básicas para el diseño y construcción de plantas de funcionamiento aséptico se basan en el principio de que los microorganismo son muy pequeños, de un tamaño mucha menor que las tolerancias normales en ingeniería. Ello quiere decir que lo que se considera un cierre hermético en un sistema no biológico, puede permitir el paso libre de microorganismos. La aplicación estricta de las normas para el trabajo aséptico repercute en el costo y en la dificultad de construcción, operación y mantenimiento de la planta y deberá aplicarse solamente después de un estudio realista de los riesgos y costos resultantes en la contaminación. Cuando se opera de una forma estrictamente anaeróbica debe de mantenerse la integridad mecánica de la planta. Los puntos de entrada a las zonas asépticas de la planta, tales como las uniones de cierre mecánicos de los ejes de los agitadores y bombas, los cierres de las válvulas, los puntos de entrada para la toma de muestra, constituyen posibles puntos de contaminación y deberá de limitarse su número lo más posible. La estructura deberá sellarse en su totalidad sin cierres mecánicos tales como los cierres apretados o con tornillos que deben de sustituirse por uniones soldadas. Los problemas de mantenimiento que resultan de este tipo de instalaciones, en donde quitar o reemplazar un componente exige cortar y volver a soldar se justifican con los menores riesgos de contaminación debido a que las juntas mecánicas se sueltan por la vibración, o la expansión y contracción térmica que acompaña a los ciclos de esterilización. Cuando estos sierres no puedan sustituirse se debe rodear por una camisa de vapor. Todas las conexiones con la zona aséptica de la plata deben estar protegidas con vapor, lo que incluye a los vástagos de la válvula utilizadas para controlar el flujo del líquido en las tuberías y el flujo de vapor que va a los sistemas de salida de vapor, de la misma manera que no deben existir conexiones directas entre la zona estéril y no estéril de la planta. Las tuberías se deben de mantener bajo presión de vapor cuando no se usen y deben construirse con una pendiente que las haga verter sobre un determinado punto, de manera que no se acomode el líquido en su interior. El vapor se introduce en la parte superior de la pendiente de manera que la condensación se pueda drenar al final de la tubería. En algunas operaciones el drenaje se mantiene abierto para que fluya continuamente, aunque este vapor pueda crear una atmosfera enrarecida en la planta. El diseño de la plata en general debe evitar zonas de estanco, espacios muertos, bolsas, ramificaciones en las tuberías y ranuras que, no solo recolecten líquido estancado y microorganismos, sino también dificultan el proceso de fermentación aumentando también el riesgo de corrección. El material que se utiliza para la construcción de los fermentadores de gran tamaño es el acero inoxidable de la calidad adecuada. Dependiendo de su formulación, el acero inoxidable posee diferentes propiedades mecánicas, de resistencia a la corrosión, facilidad de fabricación, disponibilidad y costo. Las válvulas se requieren para regular el flujo líquido y debe resistir líquidos calientes y fríos que contengan partículas solidas en suspensión y vapor de agua. Puesto que estas son puntos de unión o cierre mecánico representan un cierto grado de infección y/o contaminación. Las válvulas de diafragma se emplean ampliamente en la fermentación mientras que, para las condiciones estrictamente asépticas, se emplean las válvulas de pistón con vástago sellado al vapor. Las bombas deben evitarse, en lo posible, debido a que implica componentes móviles que aumentan el riesgo de contaminación, aunque puede limitarse el riesgo interponiendo un punto de esterilización entre la bomba y la zona estéril. El movimiento del fluido debe realizarse mediante gravedad o por presión de gas estéril. Las bombas centrifugas se emplean en la industria biológica siendo la unión del eje móvil el punto de mayor riesgo, por lo que en los casos de condiciones estrictamente asépticas se deben utilizar bombas de pistón cerradas al vapor. Para facilitar la operación, las diferentes secciones de la planta deben esterilizarse independientemente, aunque estén conectadas a través de una válvula de presión para impedir que la zona no estéril de la planta entre en contacto con la estéril. Las válvulas se protegen mediante vapor que pasa a través de los vástagos, mientras que las tuberías que unen las unidades y se mantienen estériles pasando vapor a través de las válvulas y disponiendo de una salida para que salga el líquido procedente del vapor condensado. Una planta de gran tamaño puede tener un número elevado de sistemas de cierre de este tipo, de manera que la esterilización de las distintas unidades y la transferencia de material a través de la planta implican cientos de operaciones con válvulas, instrumentos y bombas. Las condiciones de asepsia estricta se controlan continuamente, lo mismo que se controla el estado físico de la planta, las secuencia de operaciones, el grado de preparación de operador, los riesgos de la planta y la integridad técnica de estar mediante un sistema de “choque continuo”. Ello implica comprobaciones de los cierres estériles, perdidas en los cierres, válvulas y soldaduras, sumidero de vapor, registro de temperatura, análisis de los riesgos de la esterilidad y mantenimiento. Esterilización del aire. La esterilización del aire que proporciona el oxigeno en un proceso aeróbico, además de ser vital, representa una demanda de energía muy importante. Un fermentador típico necesita varias toneladas de aire que deben, en principio, estar libre de microorganismos. Aunque durante la compresión del aire se produce una esterilización parcial, el método más utilizado es la filtración, en el que el aire pasa a través de una almohadilla de material fibroso. El efecto del espesor de la almohadilla es logarítmico con respecto a la eliminación de partículas ya que cada unidad de espesor del filtro elimina la misma proporción de partículas que pasan a través de él. Esto quiere decir que, aunque los filtros más espesos eliminan más partículas, se necesitaría un espesor infinito para eliminar todas las partículas del aire. El filtro se esteriliza normalmente pasando a través de él una corriente de vapor o bien calentándolo eléctricamente. Para conseguir una esterilización absoluta de aire habría que pasarlo a través de filtros con poros o aperturas suficientemente pequeñas para que impidan el paso de partículas tan pequeñas como una fracción de una micra, que atraparía a las esporas microbianas o a las partículas de virus. No obstante, tales filtros son caros, se obstruyen fácilmente y requieren ser sustituidos con frecuencia, lo que provoca una fuerte caída de presión. Los materiales que se utilizan para los filtros de esta naturaleza son el papel, la cerámica no viriada y el papel de parafina o los tapones de plástico poroso. IX. CEPAS UTILIZADAS EN LA PRODUCCIÓN MICROBIOLÓGICA DE AMINOÁCIDOS En 1908 se aisló el ácido glutámico de un alimento autóctono oriental por lo que se empezó a producir comercialmente a partir de la hidrólisis de proteínas. En 1957 se aísla una cepa microbiana capaz de producir y secretar al medio aproximadamente 1 g/ Lt de ácido glutámico. Desde entonces se aislaron muchas cepas capaces de acumular más de 30 g/Lt del aminoácido. Se utiliza un cierto número de bacterias Gram positivas, dependientes de biotina, de los géneros Corynebacterium, Brevibacterium, Arthhrobacterium y Microbacterium. Estos géneros no esporulados, inmóviles y con forma de coco o cocobacilo están taxonómicamente relacionados (contenido en guanosinacitosina del DNA 51.2 – 54.4 moles %) y se conocen como bacterias de ácido glutámico. Pueden emplear glucosa, acetato o etanol como fuentes de carbono. No crecen en metanol pero algunas cepas lo hacen en alcanos (Wiseman, 1986). Las cepas productoras de ácido glutámico se caracterizan por: Su requerimiento de biotina (auxotrofas) Por poseer una muy baja actividad de la enzima α-ceto glutarato deshidrogenasa. Predominio de las vías anapleroticas Cuando se cultivan estas bacterias dependientes de biotina en un medio limitante de biotina en biotina tiene lugar un descenso en el contenido de fosfolípidos de la membrana celular. La disminución que se produce en la permeabilidad de la membrana facilita la secreción de ácido glutámico. La permeabilidad puede aumentarse mediante la adición de penicilina y agentes surfactantes al medio, hasta el extremo de que a veces la producción puede tener lugar en presencia de un exceso de biotina. Regulación de la síntesis de lisina en Brevibacterium flavumn y Corynebacterium glutamicum. La represión impide la biosíntesis de la enzima, mientras que la retroinhibición interrumpe la actividad de la enzima. Corynebacterium glutamicum es una bacteria Gram-positiva del suelo que ha sido modificada para producir grandes cantidades de aminoácidos. Desde hace varias décadas, esta bacteria se utiliza en los procesos de fermentación industrial y proporcionar la totalidad de L-glutamato y L-lisina, de la producción mundial (cerca de 1.45 x 10 6 toneladas por año) (Bayan, 2003). C. glutamicum también se utiliza para producir otros aminoácidos de menor importancia industrial. C. glutamicum pertenece al suborden de las Corynebacterineae, un suborden de los actinobacterias que incluye micobacterias, corinebacterias, nocardia y rhodococcus. Aunque los microorganismos que excretan ácido glutámico se encuentran fácilmente en la naturaleza ha sido más difícil obtener aislados naturales que excreten otros aminoácidos para la producción a gran escala. Se ha llevado a cabo una intensa búsqueda para el aislamiento de solamente unas pocas cepas que excreten D, L-alanina y D-valina. Los microorganismos aislados naturalmente rara vez excretan estos aminoácidos, ya que el metabolismo celular regula su producción. En el desarrollo de cepas existen varios métodos para eliminar el control por regulación: a. El uso de mutantes auxotrofos que ya no pueden formar efectores o co-represores (generalmente productos finales) y excretan los intermediarios de la vía biosintética que se encuentran justo por delante del bloqueo. b. El uso de mutantes regulatorios. Por ejemplo, si se produce un exceso de producto al final de una vía biosintética ramificada pueden ser seleccionados mutantes con una enzima clave insensible a la autorregulación, bien a partir de cepas resistentes a antimetabolitos o a partir de una población de revertientes procedentes de auxotrofos. c. El uso de recombinación genética para combinar mutantes auxotrofos o regulatorios a partir de diferentes cepas en una cepa hibrida única. Estas cepas mutantes pueden obtenerse: Usando fagos Si dos fagos infectan a una misma bacteria, se dan las condiciones propicias para poder obtener entrecruzamientos y recombinación en el genoma vírico. Este fenómeno suele denominarse coinfección. Se obtienen en la progenie virus que poseerán el fenotipo parental y otros individuos que serán recombinantes. Cuando ocurre la coinfección, si los genomas no mantienen contacto, entonces no podrá darse entrecruzamiento. Se pueden hacer mapas según los datos de recombinantes que se obtengan. Usando plásmidos vectores Los plásmidos son moléculas de ADN circulares, presentes en el citoplasma de las bacterias que pueden extraerse de las mismas e incorporarse a otras, a través del proceso de transformación. Los plásmidos han sido modificados para ser empleados como “vectores”. Así, el gen de interés puede insertarse en el plásmido-vector e incorporarse a una nueva célula. Para seleccionar las bacterias que reciben el plásmido, éste lleva, además del gen de interés (el gen para la producción de un aminoácido específico), un gen marcador de selección (por ejemplo resistencia a un antibiótico), que le otorga a la bacteria que lo lleva la capacidad de sobrevivir en un medio de cultivo selectivo (medio con antibiótico, en este ejemplo). Las células que sobreviven se dividen y generan colonias, formadas por bacterias idénticas. Estas bacterias se denominan recombinantes o genéticamente modificadas. El plásmido recombinante puede aislarse de estas colonias y transferirse a otras células. Usando fusión de protoplastos para combinar cepas con características deseables (Genome shuffling) La técnica de fusión de protoplastos surge como especialidad o aplicación a partir de las técnicas de aislamiento y cultivo de protoplastos, que permiten la obtención de células desprovistas de pared celular gracias a la acción de enzimas líticos (celulasas, pectinasas) obtenidos de microorganismos (Aspergillus sp.; Trichoderma viride; Rhizopus sp.), y su posterior crecimiento (división celular, formación de microcallos y regeneración de plántulas por vía organogénica o embriogénica). Una de las principales dificultades para lograr la sobreproducción de aminoácidos por fermentación es que los aminoácidos son productos de vías multienzimáticas, por lo tanto, es preciso tener un gran conocimiento de la regulación de la vía para identificar la enzima que debe clonarse (García, 2004). Los experimentos iníciales se llevaron a cabo en E. coli. La siguiente etapa del desarrollo de metodologías recombinantes para hiperproducción de aminoácidos es para lela al desarrollo de los sistemas de clonación en corinebacterias. Inicialmente, se introdujeron genes de E. coli para tratar de incrementar el número de copias. Por otra parte, el desarrollo de vectores propios y de sistemas de transformación de protoplastos ha logrado hasta triplicar la producción de aminoácidos en Brevibacterium. Fusión de protoplastos para cepas que pueden recombinar en forma mitótica. En la siguiente tabla se presenta una lista de cepas que se utilizan para la producción microbiana de aminoácidos, sus características genéticas y los rendimientos obtenidos. Producción de aminoácidos por fermentación Aminoácido Cepa utilizada Características genéticas Rendimiento (g/Lt) Fuente de carbono D, L-alanina Microbacterium ammoniaphilum Arginina hidroxamato 60 Glucosa L-alanina Pseudomonas Nr. 483 Cepa silvestre 17.5 Glucosa L-arginina Serratia marcescens AT 428 (aru argR2 argA2) Transducción 50 Glucosa Ácido L- aspártico Escherichia coli Ki- 1023* Canavanina 56 Ácido fumárico Ácido L- glutámico Corynebacterium glutamicum Cepa silvestre 100 Glucosa Brevibacterium flavum 98 Acetato Arhrobacter paraffineus 82 n-alcanos L-glutamina Corynebacterium glutamicum Cepa silvestre 58 Glucosa, con alta biotina y contenido en NH 4 Cl L-histidina Serratia marcescens L120 (pSH 368) rDNA 40 Sacarosa L-isoleucina Brevibacterium flavum Etionina 30 Acetato L-leucina Brevibacterium lactofermentum Isoleucina Metionina 2-tiazolalanina 28 Glucosa L-lisina B. lactofermentum AJ 11204 S-(β-aminoacetil)-L- cisteína Alanina 70 Glucosa B. flavum Homoserina Treonina 75 Acetato L-metionina C. glutamicum KY 9276 Treonina Etionina Metionina hidroxamato 2 Glucosa L-ornitina C. glutamicum Arginina 26 Glucosa L-fenilalanina B. lactofermentum 5-metiltriptófano p-fluorofenilalanina Decoyinina Tirosina Metionina 25 Glucosa L-prolina C. acetoacidophilum Mutante no caracterizado 108 Glucosa + ácido glutámico L-serina B. lactofermentum Sulfaguanina 4.5 Glucosa L-treonina E. coli VL344 (pYN7) rDNA 55 Sacarosa L-triptófano E. coli JP4114 rDNA 23.5 Glucosa L-tirosina C. glutamicum Pr-20 p-fluorofenilalanina p-aminofenilalanina p-aminotirosina Tirosina hidroximato 18 Glucosa L-valina B. lactofermentu Nr. 487 2-tiazolalanina 31 Glucosa *Método utilizado para la producción de ácido L-aspártico entre 1960-1973. X. RECUPERACIÓN DE PRODUCTOS Los aminoácidos se encuentran presentes en caldos de fermentación o en corrientes de procesado en baja concentración y en presencia de otros compuestos químicos similares. Su separación y purificación son etapas cruciales en la optimización del proceso productivo de las industrias biotecnológicas. El número de etapas necesario para la recuperación de aminoácidos y bioproductos depende de la materia prima utilizada, de la concentración y propiedades físico-químicas del producto y del grado de purificación necesario (Blanch, 1996). Las operaciones unitarias de recuperación de aminoácidos pueden agruparse en las siguientes categorías: Etapas iníciales. Se realiza la separación de materiales insolubles tales como la biomasa celular, las proteínas agregadas y los nutrientes insolubles, empleando como operaciones de separación la sedimentación, centrifugación y filtración. Etapas intermedias. Hacen referencia al aislamiento del producto de interés, eliminando las impurezas. En esta categoría se emplean operaciones de extracción, ultrafiltración, intercambio iónico, cromatografía, diálisis y electrodiálisis. Purificación final. Los productos farmacéuticos, terapéuticos y alimentarios requieren una pureza elevada. En esta etapa se requieren operaciones de cristalización y precipitación, llevadas a cabo por modificación del pH del medio, adición de sales o de disolventes orgánicos, que producen una variación drástica de la solubilidad del aminoácido. El proceso de purificación finaliza con el secado del producto. A continuación se describen brevemente alguna de las técnicas más utilizadas para la separación y purificación de aminoácidos: 1. Extracción con Disolventes La extracción es una técnica muy utilizada en la separación de aminoácidos. La extracción reactiva de aminoácidos con disolventes conlleva la transferencia desde los caldos de fermentación o corrientes de procesado hacia una fase orgánica, que contiene generalmente un extractante selectivo, seguida de la reextracción y concentración del producto en una fase acuosa de reextracción, donde se obtiene el producto concentrado. La recuperación final normalmente se lleva a cabo mediante precipitación, cristalización o evaporación (Escalante, 1998). Otra aplicación de la extracción con disolventes es la extracción mediante micelas inversas. Las micelas inversas son micro gotas de disolución acuosa, dispersas en una fase orgánica continua y estabilizada por un surfactante. Esta tecnología ha sido aplicada a la extracción de proteínas y de aminoácidos (Dzygiel, 2000). Las unidades de proceso donde se realiza convencionalmente la extracción son baterías de mezcladores-sedimentadores o torres de extracción. Uno de los requisitos necesarios en estos equipos es la existencia de una diferencia de densidades entre las fases en contacto para que se produzca la separación de las mismas. La extracción con disolventes por contacto directo de las fases presenta la limitación de la formación de emulsiones estables que evitan la posterior separación de las fases, provocando la pérdida del producto de interés en la formación de terceras fases. En las torres de extracción, además, existen problemas relacionados con la inundación de la torre y la formación de caminos preferentes. Como alternativa a los procesos convencionales se pueden utilizar procesos híbridos de extracción con membranas con diferentes tecnologías: Microfiltración / Ultrafiltración de emulsiones y soluciones coloidales Se fundamenta en la acción de tamizado impuesta por la membrana para separar el permeado, formado por la fase de refinado, del retenido, formado principalmente por la fase de extracto. En el caso de la microfiltración se utilizan membranas de estructura simétrica, con tamaño de poro comprendido entre 0,05 μm y 10 μm, y la diferencia de presión intermembranal suele ser inferior a 2 bar. Las membranas de ultrafiltración son asimétricas, con tamaño de poro entre 0,05 μm y 1 nm. La diferencia de presión transmembranal suele ser inferior a 5 bar. Las técnicas de filtración con membranas tienen como principales inconvenientes el ensuciamiento de la membrana y la polarización por concentración. Membranas líquidas Las membranas líquidas consisten en una película líquida que separa dos fases entre sí. Estas fases pueden ser bien líquidas o gaseosas. La fuerza impulsora del transporte es un gradiente de potencial químico. La separación de los distintos componentes se va a producir debido a diferencias de solubilidad y difusividad en la membrana líquida (Mulder M., 1991). 2. Electrodiálisis En este proceso se utilizan membranas intercambiadoras de iones para eliminar solutos cargados de disoluciones acuosas. Entre el ánodo y el cátodo se colocan de forma alterna un número determinado de membranas intercambiadoras de aniones y de cationes. Estos sistemas utilizan una corriente eléctrica para transportar los iones a través de la membrana. La electrodiálisis se aplica a la separación de aminoácidos debido a su carácter anfotérico, a pH alto los aminoácidos tienen carga negativa y migrarán hacia el ánodo y a pH bajo los aminoácidos cargados positivamente migrarán hacia el cátodo. Si el pH es igual al punto isoeléctrico del aminoácido, el aminoácido no migrará. Así los diferentes aminoácidos pueden ser separados ajustando el pH de la disolución que los contiene. Esta tecnología ha sido aplicada a la separación de ácido glutámico, metionina y L-lisina utilizando dos tipos de membranas cargadas iónicamente (Kikuchi, 1995). El principal inconveniente de la electrodiálisis es que las membranas tienden a presentar problemas de hinchamiento permitiendo, así, el paso de solutos a través de las membranas por mecanismos de difusión. Otro problema habitual es el inherente a la electrolisis del agua, disminuyendo la eficacia de la separación. Además las membranas deben tener elevada conductividad eléctrica junto con una buena resistencia mecánica, lo que eleva los costos del proceso. 3. Precipitación La precipitación es una técnica comúnmente utilizada en la purificación de proteínas, aminoácidos, antibióticos y biopolímeros. La tendencia de los aminoácidos y proteínas a precipitar depende de varios factores, como son el disolvente, concentración de sal, constante dieléctrica, pH, la temperatura, la forma, tamaño y carga de la proteína (Blanch, 1996). Una de las estrategias más comunes de producir la precipitación de aminoácidos y proteínas es alterando las propiedades del disolvente. Los métodos de precipitación más comunes se describen a continuación: Variación del pH del medio El pH del medio es un factor decisivo en la solubilidad. Para valores de pH superiores o inferiores al punto isoeléctrico, la molécula de aminoácido se encuentra cargada y las moléculas de agua reaccionan con estas cargas favoreciendo la solubilización. Cuando el pH del medio se encuentra próximo al punto isoeléctrico las interacciones con el agua y sus cargas netas son mínimas, pudiendo conducir a su precipitación. La etapa final de recuperación de aminoácidos puede llevarse a cabo por precipitación, llevando la disolución a pH’s cercanos al punto isoeléctrico, donde la solubilidad es mínima, y el aminoácido precipita. Salting-out La adición de sales a disoluciones de proteínas tiene un efecto significativo sobre la solubilidad de las proteínas. A bajas concentraciones la solubilidad aumenta por efecto salting-in y disminuye para elevadas concentraciones, por efecto salting-out. Las sales neutras tienen, en general una doble influencia sobre la solubilidad. A concentraciones bajas actúan disminuyendo las interacciones electrostáticas aminoácido-aminoácido y aumentado la solubilidad. A concentraciones más altas, las sales neutras disminuyen la solubilidad de los aminoácidos y proteínas como consecuencia de la tendencia de los iones salinos a la hidratación. Al igual que las proteínas, la solubilidad de los aminoácidos es función de la concentración. Reducción de la constante dieléctrica del medio Uno de los métodos de precipitar aminoácidos y proteínas ha sido mediante adición de disolventes orgánicos, como etanol y acetona, los cuales disminuyen su solubilidad. La capacidad del etanol para precipitar aminoácidos y proteínas se debe a los cambios que produce en la constante dieléctrica del medio, aumentando las interacciones electrostáticas al disminuir la constante dieléctrica debido a la adición de etanol (Cohn, 1943). Este aumento de las interacciones electrostáticas se ha relacionado con el aumento de las interacciones aminoácido-aminoácido, lo que conduce a su precipitación XI. PRUEBAS DE SEGURIDAD DE LOS AMINOÁCIDOS Los aminoácidos obtenidos por fermentación microbiana no son otra cosa que productos biológicos. A estos productos se les llama de esta manera porque han sido elaborado con materiales de partida de origen biológico, tales como microorganismos, órganos y tejidos de origen vegetal o animal, células o fluidos de origen humano o animal y diseños celulares (sustratos celulares, sean o no recombinantes - incluidas las células primarias) así como otros de origen biotecnológico que se obtienen a partir de una proteína o ácido nucleico por tecnología de ADN recombinante. Este tipo de productos biológicos son extremadamente más complejos que la mayoría de los medicamentos convencionales ya que tienen un peso molecular mucho más alto y una complejidad mayor; pueden ser mezclas de muchas especies moleculares que tienen perfiles de impureza únicos, los cuales invariablemente dependen del proceso de manufactura. Por otro lado, la respuesta de los productos biológicos depende de los materiales con los que se haya comenzado su producción; Éstos están hechos a partir de sistemas vivos que inherentemente son variables. Cualquier cambio en el proceso de manufactura por menor que sea, conlleva a cambios en el producto que no necesariamente son detectables por la tecnología actual, pero pueden tener impacto potencial en la calidad, seguridad, y/o eficacia del producto. Para asegurar la consistencia en las características de los productos finales así como en los perfiles de seguridad y eficacia, tanto la fuente del material como los procesos de manufactura, la formulación y las condiciones de almacenaje deben ser cuidadosamente seguidos y controlados de acuerdo a las especificaciones que se necesitan para su aprobación regulatoria. Como ya vimos, los aminoácidos que deben de tener un control sobre su seguridad más riguroso son aquellos cuyo propósito es ayudar a restablecer la salud de los seres humanos a partir de terapias deficitarias. Por los motivos descritos en los párrafos anteriores, se puede inferir que para efectuar el registro de productos biológicos/biotecnológicos no deberían aplicarse los criterios estándares de cualquier medicamento común o suplementos alimenticios, tal como se lo conoce en la normativa actual de diferentes países; dichos criterios deben limitarse a los productos obtenidos por síntesis química. Sin embargo, este tipo de productos deben cumplir en criterios tanto de calidad, como de seguridad y eficacia tanto a niveles clínicos como no clínicos. Aunque la principal preocupación en los productos biológicos es la seguridad, es importante que tanto en los estudios clínicos como en el seguimiento de fármaco vigilancia post-comercialización se observen problemas potenciales como la inmunogenicidad y posterior falta de eficacia. Para establecer con un razonable nivel de certeza, que las diferencias en los procesos de producción del producto no afectarán la seguridad y/o eficacia del producto para los pacientes, no es suficiente tener sólo la experiencia en la elaboración de dicho producto sino que se requieren los siguientes controles: Control durante el proceso de producción. Estudios de toxicidad. Estudios de inmunogenicidad, ya que pequeñas variaciones en la molécula pueden generar reacciones alérgicas severas y de consecuencias imprevisibles. Lo más importante: estudios clínicos que demuestren la eficacia. I nmunogenicidad Los problemas de inmunogenicidad son quizá, las razones más convincentes para la imposición de pruebas clínicas humanas. (Salinas, 2007). Todas las proteínas tienen un potencial inmunogénico; esto implica la posible aparición de anticuerpos dirigidos contra las moléculas biológicas con el fin de desactivarlas ó incluso, la producción de anticuerpos que atacan el producto biológico original. De igual forma, es posible la aparición de una enfermedad autoinmune. La ruta de administración, es un factor potencial en la provocación de anticuerpos: la vía intravenosa produce menos inmunogenicidad que la ruta subcutánea ó intramuscular. Aún el mismo producto elaborado en diferentes lugares, ocasiona considerables diferencias en la inmunogenicidad - sin mostrar diferencias en las características físico-químicas. La calidad del bioproducto influencia la inmunogenicidad: un producto con grumos induce a que las células B produzcan anticuerpos, mientras que un producto soluble de alta calidad mantiene la tolerancia. Los factores que afectan la inmunogenicidad están básicamente relacionados con el producto y son principalmente: la secuencia de aminoácidos, glicosilación, pureza, excipientes, estabilidad, dosis y vías de administración, intervalo de dosis, sistema inmune del huésped y el almacenaje. Se ha demostrado, por ejemplo, que impurezas y contaminantes son la causa principal de la inmunogenicidad en la hormona de crecimiento humano y en la insulina. La importancia de la inmunogenicidad La inmunogenicidad se refiere al proceso mediante el cual, el cuerpo humano se encarga de generar una respuesta a la introducción de una proteína u otra sustancia extraña. La respuesta humana en estos casos, es producir anticuerpos que se ligan a las proteínas extrañas, desactivándolas y formando un complejo antígeno-anticuerpo que puede llevar a serias complicaciones y efectos adversos (Salinas, 2007). La inmunogenicidad representa la preocupación actual de seguridad más importante relacionada con los productos biológicos; principalmente se asume que es imposible de caracterizar, en ausencia de pruebas clínicas en humanos. XII. REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA Bayan, N. H. (2003). Mycomembrane and S-layer: two important structures of Corynebacterium glutamicum cell envelope with promising biotechnology applications. Journal of Biotechnology , 104, 55-67. Belitz, H.-D. y. (1997). Aminoácidos, Péptidos y Proteínas, en Química de los Alimentos (2a ed.). Zaragoza: Acribia. Blanch, H. y. (1996). Product Recovery, en Biochemical Engineering. New York: Marcel Dekker Inc. Cohn, E. (1943). The Solubility of Proteins, en Proteins, Amino Acids and Peptides. New York: Reinhold. Crueger, W. (1993). Biotecnología. Manual de microbiología industrial . Zaragoza, España. : Acribia. Dzygiel, P. y. (2000). Extraction of Amino Acids with Emulsion Liquid Membranes Using Industrial Surfactants and Lecithin as Stabilisers. Journal of Membrane Science , 172, 223-232. Escalante, H. A. (1998). Separation of L-Phenylalanine by Nondispersive Extraction and Backextraction. . Science Technology , 33 (1), 119-139. García, G. Q.-M. (2004). Biotecnoligía alimentaria . México, D.F. : Limusa. Kikuchi, K. G. (1995). Separation of Amino Acids by Electrodialysis with Ion- Exchange Membrane. Journal of Chemical & Engineering , 28 (1), 103-109. Kirk, O. (1992). Encyclopedia of Chemical Technology (4a ed., Vol. 2). New York: John Wiley & Sons. López Munguía A. (1993). “Producción en enzimas microbianas. Editorial Limusa. México, D.F. Capitulo 18.Martínez, S. R. (2009). Descubren un nuevo método de síntesis de aminoácidos. Diario médico , 15-16. Salinas, A. y. (2007). Productos biológicos y biosimilares. Diagnostico , 46 (4), 28-31. Wacher, C. (1993). “Alimentos y bebidas tradicionales”. Editorial Limusa. México, D. F. capitulo 9. Ward, O. (1991). “Biotecnología de la fermentación: principios procesos y productos”. Editorial Acribia. España, Zaragoza. Wiseman, A. (1986). Principios de biotecnología. Zaragoza, España: Acribia.