Biotecnología en el SectorAgropecuario y Agroindustrial Revista de la Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad del Cauca PORTADA Dirección Revista Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad del Cauca Calle 5 No.4-70 Popayán, Colombia Teléfono (928) 245976 e_mail:
[email protected] pagina web: www.unicauca.edu.co/biotecnologia Revista Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial publica un volumen cada año en el que se emiten dos ediciones: Primera: Enero - Junio Segunda: Julio - Diciembre Suscripción a la revista e intercambio de revista comunicarse al teléfono (928) 245976 e_mail:
[email protected] [email protected] Inscribir a la pagina www.unicauca.edu.co/biotecnologia Vicerrectoría de Investigaciones Universidad del Cauca - VRI - ISSN - 1692-3561 Versión Impresa ISSN - 1909-9959 Versión Electrónica ASISTENTE EDITORIAL Leadith Alexandra Gutiérrez Vélez DISEÑO Y DIAGRAMACIÓN Maritza Martínez Andrade IMPRESO SAMAVA EDICIONES Calle 1 No.2-99 - Popayán - Colombia COMITÉ CIENTÍFICO Héctor Samuel Villada - Ph. D. Universidad del Cauca Departamento de Agroindustria Nelson Vivas Quila – M. Sc. Universidad del Cauca Departamento de Ciencias Agropecuarias Misael Cortés Rodríguez - Ph. D. Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín Maite del Pilar Rada. Ph. D. Universidad del Cauca Departamento de Química Alfredo Ayala Aponte Ph. D. Universidad del Valle Escuela de Ingeniería de Alimentos Xuebing Xu - Ph. D. Biocentrum. Instituto de Biotecnología de Dinamarca Vijaya Raghavan - Ph. D. Universidad de Mcgill de Canadá Byong Lee - Ph. D. Universidad de Mcgill de Canadá Francisco J. Moreno Andújar - Ph.D. Instituto de fermentaciones industriales Madrid, España Maria del Mar Villamiel G. Ph.D. Universidad Complutense de Madrid Jaime Ricardo Rosero Noguera - Ph.D. Universidad Nacional – Sede Medellín COMITÉ EDITORIAL Olga Lucía Hoyos – Ph. D. Universidad del Cauca Departamento de Química Silvio Andres Mosquera M. Sc. Universidad del Cauca Departamento de Agroindustria Sandra Morales Velasco M.Sc. Universidad del Cauca Departamento de Ciencias Agropecuarias Catalina Garcia M. Sc. Universidad del Cauca Departamento de Ciencias Agropecuarias Ángel Calle Collado M. Sc. Instituto de Sociología y Estudios Campesinos - Córdoba, España Jhon Wilder Zartha S. - M. Sc. Univerisdad pontificia bolivariana (UPB) Michael Peters – Ph.D. Universidad de Giessen – CIAT Ángel Pérez – Ph. D. Universidad de Holguín de Cuba José Ángel Gómez Ruiz – Ph.D Universidad Autónoma de Madrid,España Héctor Samuel Villada - PhD. Editor de la Revista Edición Especial No. 2 UNIVERSIDAD DEL CAUCA Rector JUAN DIEGO CASTRILLON ORREGO Vicerrector Académico EDUARDO ROJAS PINEDA Vicerrector Administrativo LUIS CARLOS AYALA CALDAS Vicerrector de Investigaciones HUGO COSME VARGAS Vicerrector de Cultura y Bienestar PALOMA MUÑOZ Secretaria General LAURA ISMENIA CASTELLANOS VIVAS FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Decano JOSÉ MANUEL TOBAR MESA Secretaria General TANIA MARITZA PABÓN RUÍZ Jefe Departamento Agroindustria JOSE LUIS HOYOS CONCHA Jefe Departamento Ciencias Agropecuarias SANDRA MORALES VELASCO Coordinador Programa Ingeniería Forestal JUAN CARLOS VILLALBA MALAVER Coordinador Programa de Ingeniería Agroindustrial ANA DE DIOS ELIZALDE Coordinador Programa de Ingeniería Agropecuaria FREDY JAVIER LOPEZ Coordinador Programa de Tecnología Agroindustrial RAQUEL DE LA CRUZ La Revista Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial es una publicación arbitrada perteneciente a la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad del Cauca, acepta trabajos originales producto de investigación en el campo de la ciencia, la ingeniería y la tecnología que tengan un impacto en el sector agrario regional, nacional e internacional. La revista acepta trabajos en: Agroindustria alimentaria y no alimentaria, Ciencias agrícolas y pecuarias, Ciencias Forestales, Energía y Medio Ambiente, Computación Aplicada, Biotecnología, Equipos y Procesos, Administración Industrial, en idiomas español, inglés, y portugués. Políticas editoriales Compromiso de tipo formal. Con el envío del trabajo a ser considerado para publicación, los autores aceptan la totalidad de las condiciones estipuladas en las normas. Compromiso de tipo ético. Con el envío del trabajo, los autores deben establecer un compromiso de tipo ético en cuanto a la originalidad del trabajo sometido a evaluación. En la carta de presentación se debe aceptar este compromiso: ‘’El autor(es) firmante(s) declara que el artículo presenta resultados originales de una investigación, que no han sido publicados ni están siendo considerados para publicación en otra revista, ajustándose además a las normas éticas internacionales de propiedad intelectual y autoría’’. En la carta se deben incluir los datos personales de cada uno de los autores: nacionalidad, escolaridad, correo electrónico, teléfonos para su ubicación o dirección postal y filiación institucional, o en su defecto, la dirección Web donde pueden ser consultados. Derechos de Autor. Con el envío de los trabajos, los autores(as) conceden “Derechos de Autor” a la revista, por lo que los trabajos no pueden tener derechos otorgados a terceros, a la fecha de envío del artículo. La concesión de Derechos de Autor significa la autorización para que la revista pueda hacer uso del artículo, o parte de él, con fines de divulgación y difusión de la actividad científica- tecnológica. En ningún caso, dichos derechos afectan la propiedad intelectual que es propia de los(as) autores(as). Tipos de artículos Artículos de investigación científica. Documento que presenta, de manera detallada, los resultados originales de proyectos terminados de investigación. La estructura generalmente utilizada contiene cuatro apartes importantes: introducción, metodología, resultados y conclusiones. Artículo de reporte de caso. Documento que presenta los resultados de un estudio sobre una situación particular con el fin de dar a conocer las experiencias técnicas y metodológicas consideradas en un caso específico. Incluye una revisión sistemática comentada de la literatura sobre casos análogos. Artículos de reflexión. Documento que presenta resultados de investigación terminada desde una perspectiva analítica, interpretativa o crítica del autor, sobre un tema específico, recurriendo a fuentes originales. Artículo de revisión (Review). Documento resultado de una investigación terminada donde se analizan, sistematizan e integran los resultados de investigaciones publicadas o no publicadas, sobre un campo en ciencia o tecnología, con el fin de dar cuenta de los avances y las tendencias de desarrollo. Se caracteriza por presentar una cuidadosa revisión bibliográfica de por lo menos 50 referencias. Artículo corto. Documento breve que presenta resultados originales preliminares o parciales de una investigación científica o tecnológica, que por lo general requieren de una pronta difusión. La extensión máxima es de 5 páginas. Cartas al editor. Posiciones críticas, analíticas o interpretativas sobre los documentos publicados en la revista, que a juicio del Comité editorial constituyen un aporte importante a la discusión del tema por parte de la comunidad científica de referencia. Editorial. Documento escrito por el editor, un miembro del comité editorial o un investigador invitado sobre orientaciones en el dominio temático de la revista, sobre aportes a los investigadores en cuestiones de presentación y estructura de sus artículos, sobre reflexiones sobre la presentación de documentos escritos, su normatividad, su importancia y otros. Forma y preparación de manuscritos Todo documento remitido a Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial debe cumplir con: Originalidad: el aporte debe ser totalmente inédito, no publicado en ninguna otra publicación, excepto casos justificados. Consistencia metodológica: en donde se haga evidente el uso de métodos y técnicas de investigación válidos. Significación del asunto tal que informe o ilustre situaciones relevantes en el sector Agropecuario y Agroindustrial. Impacto para un amplio sector de la academia, la investigación y estudiantes. Avance del campo: en el cual sea claro y evidente el aporte a consideraciones y prácticas de mejora en el campo de investigación Agropecuario y Agroindustrial. Consideraciones éticas. Estilo de redacción claro, conciso y ordenado, evitando jergas personales y expresiones locales. La estructura de los artículos debe ser: Los artículos de investigación científica, de reporte de caso y cortos, deben cumplir con la siguiente estructura: la INTRODUCCIÓN debe resaltar la importancia de la investigación, presentar la literatura relacionada y entregar antecedentes necesarios para comprender la hipótesis de los autores, terminando con un párrafo que indique claramente los objetivos de la investigación. El MÉTODO debe tener suficiente información que permita a otro investigador replicar el ensayo y lograr los mismos resultados, así como la inclusión del diseño experimental y el análisis estadístico. Los RESULTADOS se deben presentar en forma clara, apoyados con cuadros y figuras, con el análisis estadístico y los antecedentes de otros investigadores. Las CONCLUSIONES deben redactarse de acuerdo con los objetivos de la investigación explicando claramente los principales resultados de la investigación. Las REFERENCIAS deben contener todos los documentos consultados. Los artículos de reflexión deben mostrar: a)intención analítica; b) propósito interpretativo; c)posición crítica. La estructura: RESUMEN, INTRODUCCIÓN, DESARROLLO DEL TEMA, CONCLUSIONES y REFERENCIAS. Los artículos de revisión deben tener: RESUMEN, INTRODUCCIÓN, DESARROLLO DEL TEMA, CONCLUSIONES y REFERENCIAS. Los elementos normativos a seguir en todos los artículos son: UNIVERSIDAD DEL CAUCA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS REVISTA DE BIOTECNOLOGÍA EN EL SECTOR AGROPECUARIO Y AGROINDUSTRIAL NORMAS DE PUBLICACIÓN Extensión y formato. La extensión debe ser de mínimo cinco (5) y máximo de once (11) páginas tamaño carta (21,59 cm de ancho y 27,94 cm de alto), escritas con interlineado sencillo y su contenido a doble columna (7,5 cm de ancho de columna) a partir de la introducción, escrito en Arial recta (excepto los nombres científicos) de 11 puntos, márgenes de 3 cm en el borde superior, 2 cm en el inferior y 2,5 cm en las márgenes laterales. Título del artículo. Debe hacer referencia al contenido de una forma clara y concisa, escrito en Arial recta (excepto los nombres científicos) 11 puntos, mayúscula, negrilla y centrado; no debe exceder 15 palabras: si ello no es posible, deberá incluir un subtítulo luego de dos puntos; inmediatamente después deben ir las traducciones del idioma original. Información del autor (es).Debajo del título a dos interlíneas, centrada, en mayúscula e incluir primer y segundo nombre si lo tiene, primer apellido e inicial del segundo (si lo tiene y punto seguido). Los autores se nombran de acuerdo con la importancia de su contribución en la investigación o en la preparación del artículo, separados entre sí por comas y enumerados con superíndice. En nota de pie de página (Arial 8 puntos, justificada a ambos márgenes y en la parte inferior de la página) se indicará de cada autor: último título académico, institución, dependencia, grupo de investigación, ciudad y país, todos ellos separados por un punto. En otra línea, luego de la palabra Correspondencia (en negrilla) y dos puntos, debe aparecer el correo del autor elegido para el envío de correspondencia. Resumen. Debe ser conciso, escrito en Español, Inglés (ABSTRACT) y Portugués (RESUMO), en un solo párrafo justificado sin exceder de 200 palabras. Incluirá la justificación, objetivos, metodología, resultados precisos y conclusiones de la investigación haciendo énfasis en los logros alcanzados, así como los límites de la validez y las implicaciones de los resultados. Los títulos deben justificarse al margen izquierdo, en mayúscula y negrilla, iniciando la escritura luego de dos interlíneas. Palabras clave. Sirven para identificar el artículo en bases de datos internacionales de manera que un potencial usuario pueda llegar en forma efectiva al artículo. Van debajo del resumen, mínimo tres (3) y máximo cinco (5) palabras clave que no deben hacer parte del título del artículo, incluyendo en ellas los nombres científicos en cursiva. El título en mayúscula, negrilla, en Español (PALABRAS CLAVE), Inglés (KEYWORDS) y Portugués (PALAVRAS-CHAVE) seguido de dos puntos. La primera letra de cada palabra en mayúscula, separadas por coma y con punto al final. Cuadros y figuras.Deberán aparecer dentro del texto y procesarse en el formato original con buen contraste para evitar policromías y facilitar la diagramación, en blanco y negro, escala de grises o tono maté. El título va en la parte superior y no debe superar dos líneas, en Arial recta normal 9, separado por una interlinea y con punto final; debe incluir la palabra Cuadro o Figuraseguido del número arábigo consecutivo (en negrilla), un punto y una breve descripción (Ej: Cuadro 1. Título descriptivo). Se deben usar líneas horizontales y verticales para separar las entradas del cuadro y cada columna debe tener encabezado (en negrilla, con mayúscula inicial). El tamaño de fuente al interior de un cuadro es arial 9 puntos normal y, en el caso de necesitarse algún pie de cuadro/figura o fuente de consulta, debe estar escrito en Arial 8 puntos normal. Títulos.Los de segundo nivel se escriben con mayúscula inicial, Arial recta 11 puntos,negrilla y sin punto final, separados del texto por dos interlineas. Los títulos de tercer nivel se escriben con mayúscula inicial en arial recta 11 puntos y un punto, continuando el texto en el mismo renglón luego de un espacio. Formulas, expresiones matemáticas y números.Las fórmulas y expresiones matemáticas deben ser escritas dejando dos espacios sobre, debajo y entre cada una de ellas y se debe utilizar el editor de ecuaciones de MS Word. Deben seguir un formato uniforme, justificarse al margen izquierdo y usar la expresión (Ec.1) con números arábigos consecutivos justificada al margen derecho, citándolas en el sitio oportuno. Las ecuaciones de deben insertar en un cuadro de dos columnas (sin bordes) para ajustar su forma más fácilmente. El significado de las variables y sus respectivas unidades deben aparecer luego de que se utilicen por primera vez, para lo cual se sugiere seguir el Sistema Internacional de Unidades (SI).Las cifras decimales se separan con coma. Conclusiones. Se describen de forma clara y precisa las principales conclusiones del estudio presentado, derivado del análisis de los resultados. Agradecimientos. Si el autor(es) lo desea (n), se podrá incluir una sección de Agradecimientos, redactada en forma sobria, de no más de 4 líneas, justo después de las Conclusiones. Referencias. Evitar referencias innecesarias, tesis, informes locales y de poco alcance, y trabajos de congresos (denominada literatura gris), a menos que sea necesario; se debe dar preferencia a publicaciones recientes de los últimos cinco (5) años, en revistas científicas de corriente principal que puedan respaldar lo escrito. Deben citarse en el documento según el orden de aparición y encerradas entre corchetes [1,2], notación que se mantendrá en la sección de referencias. Se debe citas autor y año entre paréntesis redondos, por ejemplo: Villegas (2011) si es un autor, Villegas y Troncoso (2012) sin son dos autores y Villegas et al., (2014) cuando existan más de dos autores. En el listado de referencias se mencionan todos los autores del documento de acuerdo con el formato indicado. Si en el texto se mencionan más de dos referencias al tiempo, se citan como (Ruano et al., 2012; Prado, 2013; Zapata y Torres, 2014). Si los mismos autores tienen más de una referencia en el mismo año, se citan con el nombre del o los autores y con el año seguido de letras en orden correlativo: Prado et al. (2004a, 2004b). En la sección de referencias, se enumeran cronológicamente y se detalla la información de cada una de ellas en el siguiente orden: Autor (es). Apellido en mayúscula, luego la (s) inicial (es) del nombre (s) seguida (s) de un punto. Se deben citar todos los autores de la referencia separados entre sí por coma, excepto entre los últimos que incluye la conjunción en el idioma original (y, and, e). VIDAL, F.A. VIDAL, F.A. y YAYA, A. VIDAL, F.A., YAYA, A. and SOTO, E. Título. Luego de dos espacios, la primera letra se escribe con mayúscula, así como los nombres propios, de instituciones o en los casos que el idioma lo establezca. Los nombres científicos en cursiva. Subtítulo. Luego de dos puntos y un espacio. Nombre de la publicación. Luego de punto y un espacio se indica el nombre completo de la publicación, seguido de coma. Edición. Luego de un espacio se escribe con números arábigos seguido de la abreviatura ed. para el caso de libros. En el caso de revistas se escribe el volumen seguido del número entre paréntesis, ejemplo 4(5). Pie de imprenta. Luego de dos espacios siguen el lugar de la publicación (seguido de dos puntos): nombre del editor o de la imprenta sino existe el editor (seguido de coma), año de publicación (seguido de coma) y en números arábigos incluir el número total de páginas (89 p.) o las páginas consultadas (p. 34-35). Serie o colección. Cuando el documento forma parte de una serie o colección la mención se coloca entre paréntesis, separada del título por un punto y dos espacios así: número del libro, folleto o informe dentro de la serie, en números arábigos precedido por la abreviatura no., escrita con minúsculas y separada del título por un espacio, punto y coma (;) y un espacio. Artículo de revista SMITH, J.S., SORIA, R. and WEBBER, A. Chaos in a model offorced quasi-geostrophic flow over topography: an application of Melinkov’s method. Food Control, 2 (3), 1991, p. 511-547. Libro BILLAS, G.L. y GOSPS, J. Física cuántica. 4 ed. Madrid (España): Acribia, 1990, 450 p. Capítulo de libro LEWIS, P. and STEVENS, J.G. En: Time Series Prediction. Modeling time series by using Multivariate Adaptive Regression Spiines (MARS). 1 ed. Madrid (España): Iberoamericana, 1994, p. 297-318. Memoria de evento ÁLZATE, N., BOTERO, T. y CORREA, D. El arte de la escritura de artículos. Memorias XIX Congreso Latinoamericano de Ponencias Científicas. Córdoba (Argentina): Tomo II, 2000, p. 219-228. Normas técnicas AMERICAN SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS (AOAC). ASTM D1434–82: Standard test method for determining gas permeability characteristics of plastic film and sheeting. Pennsylvania (USA): 2009, 13 p. Reporte de un organismo o Gobierno COLOMBIA. MINISTERIO DE AGRICULTURA Y DESARROLLO RURAL. La situación de la provisión de alimentos en un mundo moderno. Bogotá (Colombia): 1997, 57 p. Tesis JACOBS J. Regulación of life history strategies within individuáis in predictable and unpredictable environments [Ph.D. Thesis Social Communication]. Seattle (United States): University of Washington, Faculty of Humanities, 1996, 345 p. Patentes MOREIRA, G.eMATOS, T.Embalagem biodegradável de amido de inhame.US 6.444.567, Clases 343, 356. Sao Paulo (Brasil): 2001. Artículo revista electrónica JUAREZ, T.R.Mejoramiento de las condiciones operación en plantas industriales[online]. RevistaAgrip, ISSN: 0655-6782, 37(3), 2003. Disponible: http://www.ciencia.mx/ aceites. htm. [citado 5 de Mayo de 2004]. Monografías electrónicas MACIAS, J.C., SANTOS, J.M. and WILD, E. Handbook of Nanomaterials [online]. 1996. Disponible: http://nano.hb/handbook/ kewat.com/ [citado 4 de abril de 2004]. Otras referencia electrónicas NOAA-CIRES. Climate Diagnostics Center. Advancing Understanding and Predictions of Climate Variability [online]. 2010. Disponible: http:// www.cdc.noaa.gov [citado 8 de Agosto de 1998]. ASHWELL, M. ILSI Europe Concise Series. Concepts of functional foods [online]. 2002. Disponible:http://www.ilsi.org/Europe/Publications/ C2002Con_Food.pdf. |citado 13 mayo de 2009|. Publicación artículos Costo de publicación. Cada artículo publicado tiene un costo de $150.000: el comprobante del pago debe ser enviado por correo electrónico (
[email protected] o biotecnofaca2009@ gmail.com.)una vez el artículo sea aprobado para publicación, como requisito para proceder a realizar el proceso indicado. Cuenta de ahorros del Banco Popular No. 290-72027-5 o Cuenta de Ahorros del Banco de Bogotá No.520-36672-5. Proceso de Evaluación y Edición. El proceso de aceptación y evaluación de los trabajos enviados inicia con la revisión por parte del Comité Editorial que se reserva el derecho de rechazar un artículo (que no cumpla las normas de publicación, citas y referencias adecuadas y pertinentes) o sugerir modificaciones con el objeto de lograr una mejor presentación e impacto en cuanto a título, resumen, palabras claves, figuras, cuadros y referencias. Si es aceptado el artículo, proseguirá con el proceso de asignación de árbitros quienes emitirán sus conceptos y sugerirán las correcciones al documento que nuevamente se remite con todas las consideraciones. La revista se reserva el derecho de no responder cuando no se cumplan las Normas establecidas para el envío de los trabajos. No se permitirá la evaluación simultánea de mas de dos artículos por cada autor proponente. Envío de manuscritos. El texto completo de los trabajos, incluyendo figuras y cuadros debe enviarse en formato Word a: Universidad del Cauca, Facultad de Ciencias Agropecuarias sede Las Guacas, Popayán, Revista Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial, Ph.D. Héctor Samuel Villada Castillo, por correo electrónico. Los autores deben enviar la Carta de Presentación (ver formatos) firmada, que incluye un compromiso ético relacionado con la autoría cuando por algún motivo esto sea imposible, basta con un correo electrónico del autor, en el que confirme su participación tanto en el artículo original como en el artículo corregido según las observaciones de los pares evaluadores. Acuso de recibo. Al recibo de los trabajos se enviará un acuso de recibo por correo electrónico. Una vez aceptado el trabajo para publicación se comunicará a los autores y una vez publicado en nuestros sitios en Internet se enviará una versión física. Evaluación. Los trabajos que cumplan con las normas serán evaluados por árbitros especializados quienes determinarán la calidad del artículo en cuanto a su atractivo científico y tecnológico, la rigurosidad del tratamiento del tema, el ajuste a las normas de la revista y su contribución al desarrollo de la ciencia, la ingeniería y la tecnología. Comunicación de los autores. Se mantendrá contacto permanente con el autor indicado para envío de correspondencia para intercambio de información. Se solicita a los autores dar un tiempo prudente para realizar en buena forma el proceso de evaluación que puede tomar entre 6 y 12 meses, dependiendo del cumplimiento de las normas y la agilidad de los árbitros. Envío de la versión corregida. Los autores cuyos trabajos hayan sido aceptados deberán hacer las correcciones solicitadas por los evaluadores y por el Editor, cuando les fue aceptado el manuscrito original. Junto con la versión corregida, los autores deberán enviar una carta explicando los cambios realizados con máximo detalle posible, de manera de facilitar la revisión final y no retrasar la aceptación y publicación. Si algunas de las sugerencias o cambios pedidos por los evaluadores no son atendibles se deberá explicar los motivos en forma clara y detallada. Suscripción Instrucciones para Suscribirse a la Revista (2 ediciones por año): 1. Con el número de cédula, solicitar a la dirección de la revista la generación del recibo según el concepto deseado. A vuelta de correo, se remitirá el formato para la cancelación respectiva y posterior devolución escaneada por via electrónica. 2. Consignar $ 35.000 por la suscripción anual o $ 20.000 por cada edición, en efectivo en la cuenta No. 520-366725 del Banco de Bogotá a nombre de la Universidad del Cauca. 3. Descargar Cupón de Suscripción Contenido 11 ARTICULOS SEMINARIO BIOEMPAQUES 12 ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y TECNOLÓGICA 12 BIOPROSPECCION DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA’S) EN EL DEPARTAMENTO DE NARIÑO Ivan Dario Otero-Ramírez, Pablo Fernández I., Mario Enríquez C., Reinaldo Velasco M., Alejandro Fernandez Q. 31 ESTUDIO FISICOQUÍMICO DE MEZCLAS DE ALMIDÓN TERMOPLÁSTICO (TPS) Y POLICAPROLACTONA (PCL) Jose Mina H., Alex Valadez G., Tanit Toledano T. 41 EL PROBLEMA DE LA HIDROFILICIDAD EN MATERIALES PLÁSTICOS DERIVADOS DE ALMIDÓN Alcy Rene Ceron M. 49 DESEMPEÑO DE UNA PELÍCULA DE MAÍZ AZUL EN EL ENVASADO DE UN QUESO DE HUMEDAD INTERMEDIA Cecilia Rojas de G., Grissel Trujillo de S., Carlos Patricio Saénz C., Andrea Valderrama S. 59 PROPIEDADES ÓPTICAS Y PERMEABILIDAD DE VAPOR DE AGUA EN PELÍCULAS PRODUCIDAS A PARTIR DE ALMIDÓN Diego Fabián Joaqui D. y Héctor Samuel Villada C. 69 IDENTIFICACIÓN DE CEPAS NATIVAS CON POTENCIAL PARA OBTENCIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATOS – (PHAS) EN LODOS ACTIVADOS Ana Lorena Arroyave R., Mariana Cardona B., Lina María Agudelo E. 77 ARTÍCULOS DE LA REVISTA 77 EVALUACIÓN MECÁNICA DE BIOPLASTICOS SEMIRRÍGIDOS ELABORADOS CON HARINA DE YUCA Diana Paola Navia P., Héctor SAmuel Villada C., Alfredo Adolfo Ayala A. 85 DETERMINATION OF GLYCOSIDES, IN EXPRESS HONEY OF STEVIA (Stevia Rebaudiana) BY LIQUID CHROMATOGRAPHY Luís Alberto Lenis V., Cristina Ruales C., Ricardo Benitez B. 92 EFECTO DE RECUBRIMIENTO A BASE DE ALMIDÓN SOBRE LA MADURACIÓN DE LA GUAYABA (Psidium Guajava) Sandra Marcela Achipiz, Astrid Eugenia Castillo, Silvio Andrés Mosquera, José Luís Hoyos, Diana Paola Navia 101 EL EFECTO SPILLOVER: IMPACTO SOCIAL DE LA INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO UNIVERSITARIO Carolina Delgado, Zamanta Correa, Yenni Angélica Conde 112 EFECTOS SIMULTANEOS DE LAS VARIABLES DE PROCESO SOBRE LAS PROPIEDADES DE FLUJO DEL SUERO COSTEÑO Diofanor Acevedo C., Aida Rodriguez S., Alejandro Fernandez Q. 118 EVALUACIÓN DE ÍNDICES DE CONVERSIÓN ENERGÉTICA EN LA PRODUCCIÓN DE GAS COMBUSTIBLE A PARTIR DE BIOMASA Gerardo Cabrera C., Santiago Madriñan M., Deyanira Muñoz M. 126 MANEJO INTEGRADO VS. MANEJO TRADICIONAL DE ANTRACNOSIS EN CULTIVOS DE FRÍJOL EN TIMBIO CAUCA Consuelo Montes R., Arnulfo Íbagon, Felipe Perafan. Luz Adriana Mambuscay M., William Andrés López A., Raúl Alberto Cuervo M., Francisco E. Argote V., Esteban Osorio C. 145 FENOLOGÍA DEL ROBLE (Quercus humboldtii bonpland) EN POPAYÁN (CAUCA, COLOMBIA) Cristian Andrés Pérez L., Juan Carlos Villalba M., Martha Isabel Almanza P. 155 DISEÑO DE UN GEN SEMISINTÉTICO CRY1AC Y ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA DE LA PROTEINA TRADUCIDA Cristina Diaz Granados D., Ana María Sandoval, Alejandro Chaparro-Giraldo 165 EVALUACIÓN DE DIFERENTES FORMULACIONES DE COMPOSTAJE A PARTIR DE RESIDUOS DE COSECHA DE TOMATE (Solanum lycopersicum) Carlos Andres Navia-Cuetia, Yuli Zemanate-Cordoba, Sandra Morales-Velasco, Fabio Alonso Prado, Noé Albán López Editorial Las tendencias a nivel mundial es disminuir los impactos ambientales ocasionados en los procesos industriales. Una estrategia innovadora es la elaboración de empaques biodegradables a partir de almidón de yuca y fibra de fique, que además busca proponer estrategias para lograr el fortalecimiento de cultivos autóctonos de la región. Es así como durante el 13 y 14 de junio del 2013, la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad del Cauca, Colciencias y el Centro Regional de Productividad e Innovación del Cauca - CREPIC llevaron a cabo el Seminario Internacional de Empaques Biodegradables, de donde se resalta como principales productos del evento los artículos: Bioprospección de Bacterias Productoras de Polihidroxialcanoatos (Pha’s) En el Departamento de Nariño, Estudio Fisicoquímico de Mezclas de Almidón Termoplástico (Tps) y Policaprolactona (Pcl), El Problema de la Hidrofilicidad en Materiales Plásticos Derivados De Almidón, Desempeño De Una Película De Maíz Azul En El Envasado De Un Queso De Humedad Intermedia, Propiedades Ópticas y Permeabilidad de Vapor De Agua En Películas Producidas A Partir De Almidón, Identificación De Cepas Nativas Con Potencial Para Obtención De Polihidroxialcanoatos – (Phas) En Lodos Activados; los cuales son publicados en la presente edición. Como parte complementaria la presente edición, se presentan artículos regulares de la revista, dentro de los cuales se publican resultados de investigación relacionados con la utilización agroindustrial de los subproductos de la yuca; Evaluación Mecánica de Bioplásticos Semirrígidos elaborados con Harina de Yuca; Efecto de Recubrimiento a Base de Almidón sobre la Maduración de la Guayaba (Psidium guajava). Otros artículos relacionados con la Biotecnología agroindustrial se presentan: Determination Of Glycosides, In Express Honey Of Stevia (Stevia rebaudiana) By Liquid Chromatography; Efectos Simultáneos de las Variables de Proceso Sobre las Propiedades de Flujo del Suero Costeño; Evaluación de Índices de Conversión Energética en la Producción de Gas Combustible a Partir de Biomasa; Diseño de un Gen Semisintético Cry1ac y Análisis de la Estructura de la Proteina Traducida. En esta publicación también se resaltan avancen en el sector agroforestal con los escritos: Manejo Integrado vs. Manejo Tradicional de Antracnosis en Cultivos de Fríjol en Timbio Cauca; Fenología del Roble (Quercus humboldtii bonpland) en Popayán (Cauca, Colombia); Evaluación de Diferentes Formulaciones de Compostaje a partir de Residuos de Cosecha de Tomate (Solanum lycopersicum). El Efecto Spillover: Impacto Social de la Investigación y Desarrollo Universitario. Sandra Morales Velasco Docente Facultad de Ciencias Agropecuarias Artículos Seminario Bioempaques 12 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (12- 20) BIOPROSPECCION DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA’s) EN EL DEPARTAMENTO DE NARIÑO BIOPROSPECTING OF POLYHYDROXYALKANOATES (PHA’s) PRODUCING BACTERIA IN THE DEPARTMENT OF NARIÑO BIOPROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA’s), NO DEPARTAMENTO DE NARIÑO IVAN DARIO OTERO-RAMÍREZ 1 , PABLO FERNÁNDEZ I. 2 RESUMEN Los polihidroxialcanoatos (PHA’s), gránulos intracelulares acumulados por bac- terias en ambientes con desbalance Carbono/Nitrógeno, Carbono/Fósforo tienen propiedades físico-químicas similares a plásticos convencionales, pero son bio- degradables. Sin embargo, los elevados costos de producción de los PHA’s con- llevan a la búsqueda de estrategias con la menor inversión posible; por ello, en esta investigación se exploraron diferentes ambientes del departamento de Nariño en búsqueda de bacterias productoras de PHA’s y se seleccionaron aquellas con potencial industrial. La detección presuntiva de bacterias PHA’s a partir de mues- tras de suelo y agua, se realizó utilizando Rojo Nilo, los aislamientos selecciona- dos se sometieron a una fermentación Batch y el polímero obtenido se caracterizó por cromatografía de gases y cromatografía de gases-espectrometría de masas. Aquellos aislamientos con mayor acumulación de polímero se caracterizaron me- diante pruebas bioquímicas y la secuencia parcial del gen rRNA 16S.Finalmente, se evaluó la producción de PHA’s utilizando como sustrato aguas residuales do- mésticas. Se obtuvo 189 aislamientos bacterianos que produjeron desde 0,01gL -1 Recibido para evaluación: 14-03-2013. Aprobado para publicación: 17-07-2013. 1 Biólogo, Investigador Grupo de Biotecnología Microbiana, Universidad de Nariño.
[email protected]. 2 Ph.D. Ciencias Biológicas Área Microbiología. Director Grupo de Biotecnología Microbiana, Universidad de Nariño. Correspondencia:
[email protected]. Artículos de Investigación Científica y Tecnológica 13 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (12- 20) hasta 5,24gL -1 del homopolimero Poli-3-hidroxibutirato o el copolímero Po- li-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato. Así mismo, se recuperó 0,111gL -1 de Poli-3-hidroxibutirato a partir de las aguas residuales. Desde esta pers- pectiva las bacterias silvestres productoras de PHA’s del departamento de Nariño tienen potencial en procesos ambientales e industriales. ABSTRACT The polyhydroxyalkanoates (PHA’s) intracellular granules accumulated by bacterial species in environments with imbalance in Carbon/Nitrogen, Car- bon/Phosphorus have similar physicochemical properties to conventional plastics, but are biodegradable. However, the high cost of PHA’s lead to strategies of production, but with the lowest possible investment, there- fore, in this study we explore different environments in Nariño department to search and selecting PHA’s producing bacteria with industrial potential. The presumptive detection of PHA’s bacteria isolated from soil and water samples were performed using the Nile Red dye, isolates selected were subjected to batch fermentation and the polymer obtained was characteri- zed by gas chromatography and gas chromatography-mass spectrometry. Those isolates with increased accumulation of polymer were characterized by biochemical tests and partial sequencing of the16SrRNAgene. Finally, was evaluated the production of PHA’s using as substrate domestic was- tewater. 189 bacterial isolates were obtained, which produce from 0,01gL -1 to 5,24 gL -1 of homopolymer poly-3-hydroxybutyrate or poly-3-hydroxybu- tyrate-co-3-hydroxyvalerate. Likewise, were recovered 0,111gL-1 of Poly- 3-hydroxybutyrate from wastewater. From this perspective, wild bacteria producing PHA’s isolated in Department of Nariño have different potential to advance environmental and industrial processes. RESUMO Polihidroxialcanoatos (PHA’s) são grânulos intracelulares acumulados por bactérias em ambientes com desequilíbrio de Carbono / Nitrogênio, Carbono /Fósforo, estes compostos têm propriedades físico-químicas semelhantes a os plásticos convencionais, mas são biodegradáveis. No entanto, os altos custos de produção dos PHA’s levam a estratégias no processo de produção com o menor investimento possível, portanto, no presente estudo, foram explorados diferentes ambientes em Nariño, na procura de bactérias produtoras de PHA’s com potencial de apro- veitamento industrial. A detecção presuntiva de bactérias produtoras de PHA´s isoladas a partir de amostras de solo e água foi realizada utilizando o corante Vermelho do Nilo, os isolados selecionados foram submetidos a uma fermentação em lotes (Batch), e o polímero obtido foi caracteri- zado por cromatografia em fase gasosa e espectrometria de massa-cro- matografia gasosa. Os isolados com maior acúmulo foram caracteriza- dos por provas bioquímicas e pelo sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. Finalmente, foi avaliada a produção de PHA’s usando como meio de cultura águas residuais domesticas. Foram obtidos 189 isolamentos bacterianos, os quais produzem desde 0,01gL -1 até 5,24gL -1 do homopo- límero Poli-3-hidroxibutirato ou do copolímero Poli-3-hidroxibutirato-co- PALABRAS CLAVES: Suelos de Nariño, Laguna de la Cocha, Río Pasto, Polihidroxibutira- to, Polihidroxivalerato, KEYWORDS: Soils of Nariño, Laguna de la Cocha, Río Pasto, Polyhydroxybu- tyrate, Polyhydroxyvalerate, PALAVRAS CHAVE: Solos de Nariño, Laguna de la Cocha, Río Pasto, Polihidroxibutira- to, Polihidroxivalerato, 14 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (12- 20) 3-hidroxivalerato. Do mesmo modo foram recupe- rados 0,111gL -1 de Poli-3-hidroxibutirato a partir de aguas residuais. Desde esta perspectiva as bactérias silvestres produtoras de PHA’s do departamento de Nariño apresentam potencial para adiantar diferentes processos ambientais e industriais. INTRODUCCIÓN Los polihidroxialcanoatos (PHA’s) son gránulos intra- celulares que se acumulan en diferentes especies bac- terianas bajo estrés nutricional generado por exceso en una fuente de carbono y déficit de otros nutrientes como nitrógeno, fósforo y magnesio [1]. Estos biopo- límeros tienen propiedades físicas, químicas y mecá- nicas similares a los plásticos de origen petroquímico, [2,3] por lo tanto, exhiben un amplio rango de aplica- ción en la industria, la medicina, la farmacología y la agricultura;sin embargo, al contrario de los polímeros convencionales como el polipropileno o el polietileno, los PHA’s se sintetizan desde recursos renovables [4, 5] son biodegradables, insolubles en agua, no tóxicos y exhiben propiedades termoplásticas [6, 7]. Dentro del grupo de microorganismos productores de PHA´s se destacan algunas bacterias Gram negativas (las más utilizadas a escala industrial) como Wau- tersiaeutropha, Methylobacterium Organophyllum, Pseudomonas Oleovoransy recombinantes de Esche- richiacoli, así como también se reportan algunas Gram positivas de los géneros Clostridium, Streptomyces, Staphylococcus, Corynebacterium, Nocardia, Rhodo- coccus[8] y Bacillus[9, 10, 11, 12, 13]. Aunque las ventajas de los PHA’s son evidentes, el cos- to de producción de estos biopolímeros es elevado;1kg de PHA’s cuesta entre 3.5 a 5 euros, comparado con 1 euro por kg de polipropileno [14]. Por esta razón, en los últimos años han surgido varias alternativas para mejorar la producción de PHA’s con la menor inversión posible; en este orden de ideas, es oportuno realizar un “screening” de bacterias silvestres productoras de PHA’s, pues si bien es cierto que las concentraciones naturales de este polímero bacteriano son significati- vamente bajas; se ha reportado que la microbiota de muestras ambientales puede ser inducida para mejo- rar significativamente su producción modificando el sustrato o la estrategia de alimentación empleada [15, 16]. Al respecto, Foster et al., [17], propone que el estrés generado por el ambiente puede aumentar de 14 a 40 veces la producción de PHA’s. En Colombia existen pocos grupos de investigación dedicados al estudio de las bacterias productoras de PHA’s y su potencial industrial; se han realizado algu- nos trabajos con cepas de referencia desaprovechan- do el potencial de las bacterias silvestres y limitando los procesos aplicados por los cuidados que se de- ben tener para evitar la propagación de microorga- nismos ajenos a un ecosistema en particular. En esta investigación se exploraron diferentes ambientes del departamento de Nariño en búsqueda de bacterias productoras de PHA’s y se seleccionaron aquellas con potencial para adelantar procesos en el campo indus- trial y ambiental. MÉTODO Muestreo En el desarrollo de este estudio se exploraron diferen- tes suelos del departamento de Nariño y ambientes acuáticos como la Laguna de la Cocha y el río Pasto. Las muestras de suelo se colectaron a 15cm de pro- fundidad en sentido horizontal a la superficie.Los mu- nicipios muestreados fueron:El Rosario, Chachagüí, El Tablón, Buesaco, Guaitarilla, Imués, Guachucal, Cumbal, La Florida, Sandona, Iles, Tuquerres, Ospina, Cumbal, Matituy y Pasto. Para las muestras de ambientes acuáticos,en la Lagu- na de la Cocha se ubicaron tres puntos de muestreo alrededor de la corota, de cada sitio se tomó un litro de agua a 10 cm de la superficie. Por otra parte, en el cauce principal del río Pasto se ubicaron cinco es- taciones de muestreo cuando este hace su recorrido por la ciudad; en cada estación se definieron parcelas de cinco metros de longitud con un ancho determi- nado por el cauce del río y se colectó una muestra compuesta, superficial hasta conformar cinco réplicas cada una con litro y medio de agua [18, 19]. Todas las muestras se refrigeraron y se llevaron al la- boratorio de Biotecnología Microbiana de la Universi- dad de Nariño en el menor tiempo posible. Aislamiento presuntivo de bacterias productoras de PHA’s De cada una de las muestras de suelo se tomaron diez gramos,se maceraron y se re-suspendieron ennoven- ta mililitros de agua destilada estéril. A continuación se 15 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (12- 20) prepararon dilucionesseriadas hasta 10 -6 y se realizó siembra por profundidad en cajas de Agar Plate Count suplementado con glucosa (15g L -1 ) y Rojo Nilo al 0,1%. Para el caso de las muestras tomadas en la Laguna de la Cocha se realizó diluciones seriadas hasta 10 -6 ; posteriormente, las diluciones pares se inocularon por superficie (0,1 mL) en un medio de cultivo compuesto por agar – agar (15 g L -1 ), agua de la cocha y Rojo Nilo al 0,1%. Finalmente, a partir de las muestras tomadas en el río Pasto se realizaron diluciones seriadas hasta 10 -8 ; de cada dilución se tomó 0,1 mL y se inoculó en cajas de Agar Plate Count suplementado con glucosa 15 g L -1 y Rojo Nilo al 0,1% [20]. En todos los casos las cajas se llevaron a incuba- ción por 72h a temperatura ambiente y la detección presuntiva de bacterias acumuladoras de PHA’s se evaluó cada 24h mediante observación de los culti- vos bajo luz ultravioleta en el equipo Benchtop 3UV Transilluminator. Las colonias que presentaron fluo- rescencia rosada o naranja se seleccionaron como positivas para la acumulación del polímero [21, 22]. Las colonias con fluorescencia positiva se purifica- ron en agar nutriente y se conservaron a -20°C en caldos con glicerol y a temperatura ambiente en tu- bos con agar nutritivo inclinado [23]. Selección de bacterias productoras de PHA’s Para evaluar la producción de PHA’spor los aislamien- tos seleccionados se realizó una fermentación tipo Batch en caldo base compuesto por peptona bacterio- lógica 2,5 g L -1 , extracto de levadura 2,5 g L -1 y glucosa 15 g L -1 ; se aplicó un diseño experimental de bloques al azar con tres réplicas por aislamiento [24].Las uni- dades experimentales fueron balones de 500 mL con 250 mL de caldo base y se utilizó un inóculo al 10% de los aislamientos bacterianos previamente activa- dos. Los balones se llevaron a incubación a 30°C y 100 rpm en un shaker termostatado marca DiES. Para cuantificar la producción de PHA’sse utilizó el protoco- lo descrito por Fernández et al.,[20] a partir de 10 mL de muestra. Caracterización del polímero acumulado por cro- matografía de gases (GC) y cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (GC- MS). El polímero obtenido a partir de los aislamientos que presentaron la mejor producción en g L -1 de PHA’s se diluyó en 1 mL de cloroformo y 1 mL de agente derivatizante metanol: ácido sulfúrico (85:15 v/v). Esta mezcla se sometió por dos horas a 90°C; se enfrióy se adicionó 1 mL de NaCl al 0,1%; finalmente, se eliminó la fase acuosa y se adicionó sulfato de sodio anhídrido para deshidratar completamente la muestra [25, 20]. El análisis de cromatografía de gases se realizó en los laboratorios especializados de la Universidad de Nari- ño; para esto, se inyectó 1 µL de la fase orgánica en el cromatógrafo de gases GC 17A Shimadzu, equipado con una columna capilar de sílica fundida MDN-5 de 30 m de longitud, 0,25 mm de diámetro interno y 0,25 µm de espesor de película (Supelco). El inyector y el detector de temperaturas de flama ionizante se confi- guraron a 250°C, como fase móvil se utilizó helio AP. El programa de temperatura fue de 60°C durante 2 minu- tos incrementándose 6°C por minuto hasta un máximo de temperatura de 220°C [20]. La confirmación por espectrometría de masas se reali- zó en un equipo GCMS – QP5000 Shimadzu. Los com- puestos se identificaron por comparación con la base de datos NIST y espectro de masas de un estándar de copolímero butirato - valerato. Caracterización bioquímica y molecular mediante la secuencia del gen 16S rRNA de los aislamientos bacterianos que presentaron la mayor acumulación de PHA’s El perfil bioquímico de los aislamientos selecciona- dos se estableció mediante pruebas API 50CHB. Este procedimiento se inicio activando los aislamientos en caldo nutritivo, después de 24h de incubación a 30°C se realizó la inoculación en las galerías API como lo in- dica el fabricante (BIOMEREUX).Los resultados fueron evaluados a las 24 y 48h de incubación a 30°C. Para la caracterización molecular la extracción de DNA bacteriano se realizó con el protocolo de Rivera et al., [26] modificando las gravedades (g) en la centrifu- gación. Para verificar la integridad del DNA se prepa- raron geles de agarosa al 1% [27]. Como marcador de tamaño molecular se utilizó lambda Hind III y las condiciones de corrida fueron 60V, 73mA, 37w por 2 horas y 15 minutos. El gel fue visualizado en el foto- documentador Benchtop 3UV Transilluminator. La amplificación del gen 16S rRNA se realizó con los primers 27F 5’ AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3’ [28] y 1041R 5’ CGG TGT GTA CAA GAC CC 3’ [29] los cuales amplifican un fragmento aproximado de 1500 pb. El volumen de PCR por reacción fue de 50 16 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (12- 20) µL utilizando Gotaq polimerasa (PROMEGA). En este procedimiento se utilizó un termociclador marca Lab- net MULTIGENE, modelo Multigene Gradient con las si- guientes condiciones de corrida: 95°C por 2 minutos; 30 ciclos de: 94°C por 2 minutos, 55°C por 1 minuto y 72°C por 3 minutos y una extensión final de 10 mi- nutos a 72°C [30]. Los fragmentos fueron visualiza- dos en geles de agarosa al 1% y comparados con el marcador de tamaño molecular 1kb Ladder (PROME- GA) para verificar el tamaño esperado del amplicon. Una vez obtenidas las secuencias se visualizaron en el programa Chromas lite versión 2.01 y se editaron con el programa BioEdit versión 7.0.4. Finalmente, la secuencia parcial final obtenida después del proceso de edición se comparo en las bases de datos del Gen- Bank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)[31]. Producción de PHA’s a partir de aguas residuales domésticas Para evaluar la producción de PHA’s a partir de un sustrato económico se utilizaron aguas residuales do- mésticas sin esterilizar obtenidas directamente desde el colector Juan 23 ubicado en el sector de Torobajo en la salida norte de la ciudad de Pasto.Este experi- mento se realizó en un bioreactor de flujo ascendente operado en un sistema de fermentación continua; el bioreactor tiene un volumen total de 5,5 L y un volu- men de trabajo de 2 L. Como inóculo del bioreactor se utilizó el aislamiento E1M10 RP obtenido desde las aguas residuales del río Pasto. En este sentido, para obtener PHAs a partir de aguas residuales, del bioreactor se colectó 90 mL de muestra y se centrifugó a 6461 g por 10 minutos, se eliminó el sobrenadante y el pellet se trató con hipoclorito de sodio al 5% y EDTA 10 mM, se llevó a baño maría por hora y media a 60°C, transcurrido este tiempo se cen- trifugó a 6461 g por 10 minutos, se eliminó el sobrena- dante y al precipitado obtenido se le realizaron lavados sucesivos con agua, acetona y metanol, realizando una centrifugación a 6461 g por 10 minutos entre cada lavado. Posteriormente, el pellet se llevó a secar a temperatura ambiente. A continuación el producto obtenido se resuspendió en cloroformo grado HPLC, se maceró y se centrifugó a 6461 g por 10 minutos, se recuperó el sobrenadante, se agregó igual volumen de metanol frío y se dejó a -20°C toda la noche. Al día siguiente se centrifugó a 6461 g por 20 minutos y el precipitado obtenido se dejó secar por 12h a tempera- tura ambiente.Finalmente, se realizó la caracterización del polímero por cromatografía de gases. Tratamiento estadístico Para establecer si existen diferencias estadísticamen- te significativas en la cantidad de bacterias totales y acumuladoras de PHA’s presentes en los ambientes muestreados; así como en la producción de PHA’s por los aislados seleccionados se aplicó la prueba no pa- ramétrica de Kruskal – Wallis. RESULTADOS Al analizar la cantidad de bacterias productoras de PHA’s presentes en las muestras analizadas se encon- traron diferencias estadísticamente significativas con un p<0,001. Se diferenciaron un total de 189 aisla- mientos bacterianos detectados como positivos para la acumulación de PHA’sal emitir fluorescencias na- ranja o rosada cuando se exponían las placas de petri a luz ultravioleta. De estos aislamientos el 71% (134) fueron obtenidos de los diferentes suelos del departa- mento de Nariño, el 6% (11) de la Lagua de la Cocha y el 23% (44) del río Pasto. El 51% (96) corresponden a bacterias Gram negativas, el 49% (93) a bacterias Gram positivas y con respecto a la morfología micros- cópica se encontraron Bacilos, cocos, estafilococos, diplococos, cocobacilos y bacterias filamentosas. Al evaluar la acumulación de PHA’s por los aisla- mientos obtenidos se encontró que existen diferen- cias estadísticamente significativas con un p valor = 0,0015 en la producción del biopolímero. La cantidad de polímero recuperada fue de 0,01 g L -1 a 0,88 g L -1 en muestras de suelo y desde 0,88 g L -1 hasta 5,24 g L- 1 en muestras provenientes de ambientes acuáticos (Laguna de la Cocha y río Pasto). Así mismo, los aná- lisis por cromatografía de gases indican que el 83% de las muestras evaluadas forman un pico con tiempo de retención similar al éster de metilo 3-hidroxibutirato y el 17% de las muestras forman dos picos con tiempo de retención similares a los éster de metilo 3-hidroxi- butirato: 3-hidroxivalerato. (Figura1a y 1b). Posteriormente, mediante análisis de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (GC- MS) se identificó que los PHA’s sintetizados por los aislamientos evaluados son: 3 metil hidroxibutirato y el copolímero 3 metilhidroxibutirato – co- 3 metil hi- droxivalerato (Figura 1c y 1d). Por lo tanto, se selec- cionaron el aislamiento FBL2 como mejor productor del copolímero P(3HB-co-3HV) y elaislamiento E1M10 RP como mejor productor del homopolimero P(3HB). 17 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (12- 20) El aislamiento FBL2 obtenido a partir de muestras de suelo, mediante el perfil bioquímico generado con pruebas API 50CHB se caracterizó como Bacillus mycoides FBL2 (%ID = 98,3 y T= 0,67); esta cepa al- canzó una producción del copolímero P(3HB-co-3HV) de 0,3 g L -1 . Por otra parte, el aislamiento E1M10RP obtenido del río Pasto alcanzó una roducción de 5,24 g L -1 del homopolimero P(3HB); este aislamiento se caracterizó mediante el gen rRNA 16S, al comparar la secuencia parcial final obtenida con la base del GenBank se encontró que tiene un 96% de identidad con Bacillus subtilis. Por lo tanto, se concluye que el aislamiento bacteriano E1M10 RP corresponde a una bacteria del genero Bacillus y tiene un 96% de proba- bilidad que pertenezca a la especie Bacillus subtilis. Entre los microorganismos productores de PHA’s las bacterias del genero Bacilluscomo: Bacillus sp. JMa5 [9], B. mycoides RLJ B-017 [10], B. amyloliquefaciens DSM7, B. laterosporus, B. licheniformis, B. macerans, coagulans, B. brevis, B. sphaericus ATCC 14577 [12], B. cereus, B. circulans, B. firmus G2, B. sphaeri- cus X3, B. megaterium Y6 [11], B. B. thuringiensis [13], entre otros, se han caracterizado por sintetizar diferentes homo y copolímeros tales como P(3HB), P(3HB-co-3HV), P(3HB-co-3HHx), P(3HB-co-4HB- co-3HHx), P(3HB-co-6HHx-co-3HHx). B. mycoides se ha reportado como una bacteria cuyo hábitat natural es el suelo y se ha reconocido como promotora del crecimiento de las plantas especialmen- te asociada a raíces de coníferas[32]forma filamentos radiales con giro levógiro o dextrógiro y su habilidad de formar esporas le confiere alta resistencia al estrés ambiental [33]. La particularidad de B. mycoides FBL2 es queacumu- lade manera natural y en un medio suplementado con glucosa el copolímero P (3HB-co-3HV) en una propor- ción 95:5, sin embargo, cuando al medio se le adicio- na propionato la proporción de la fracción valerato se incrementa en un 76%[20]. Con respecto a B. subtilis la información acerca este microorganismo como productor de PHA’s aún es es- casa [34, 35], en suelos de diferentes pastizales de Ankara en Turquía identificaron 8 cepas de B. subtilis que produjeron hasta 0,204 g L -1 de PHB en un me- dio con caldo nutritivo. Por su parte, Bello y Brandl [36], reportaron una producción de 3,337 g L -1 de PHB por la cepa B. subtilis 2344 en dos medios diferen- d c b a Figura 1. Cromatogramas a) éster de metilo 3- hidroxibutirato. b) estándar del copolímero P (3HB-co-HV) utilizado como patrón. c) espectro de masas de éster metílico del ácido 3-hidroxibutirico. d) espectro de masas del éster metílico del ácido 3-hidroxivalérico. 18 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (12- 20) tes compuestos por sacarosa y glucosa. Porwal et al., [37], reportaron la producción 0,19 g L -1 de PHB por B. subtilis en un medio suplementado con glucosa como fuente de carbono, y Tamdogan y Sidal, [38], determinaron que B. subtilis ATCC 6633 produjo 0,01 g L -1 con manitol como fuente de carbono. B. subtilis E1M10RP caracterizado en este estudio produce 5,24 g L -1 de P(3HB) a partir de glucosa; teniendo en cuenta los trabajos citados anteriormente la bacteria obtenida en este estudio alcanzó uno de los rendimientos más altos en producción del homopolímero P(3HB) y es posible que optimizando las condiciones de cultivo, el sistema de fermentación y los regímenes de alimen- tación se mejore significativamente la producción de este biopolímero. En este sentido, ya que B. subtilis E1M10 RP alcanzó una buena producción de PHB y es una bacteria aisla- da del río Pasto se utilizó como inóculo para evaluar la producción de PHA’s a partir de las aguas residuales que se vierten al río Pasto. Para esto se utilizó un bio- reactor de flujo ascendente operado bajo un sistema de fermentación continua, el tiempo de retención fue de 9h con un caudal de 222ml h -1 . Después de aplicar el protocolo de extracción de PHA’s se obtuvo 0,111 g L -1 de polímero, al realizar los análisis por cromato- grafía de gases se detectaron picos con tiempos de retención similares al del éster de metilo 3 hidroxibu- tirato observado en el patrón (4,850 minutos) (Figura 2). Por lo tanto, se puede concluir que en este trabajo fue posible recuperar P(3HB) a partir de las aguas re- siduales vertidas al río Pasto. Cabe aclarar que en esta investigación se utilizó agua residual sin esterilizar y aún hace falta optimizar las condiciones de fermentación, por lo tanto, es posible mejorar los rendimientos, ya que, bajo las condiciones del experimento realizado y teniendo en cuenta que el caudal de las aguas residuales que se vierten al río Pasto en promedio es de 3195 L s -1 se podrían ob- tener hasta 1,2 toneladas de polímero en 9 horas de tratamiento. De esta manera, los datos aportados en esta investi- gación se convierten en la base para adelantar otros procesos que permitan el tratamiento de las aguas residuales en el departamento de Nariño y recuperar un biopolímero con potencial industrial ya que, se ha establecido que los costos de obtención de los PHA’s se pueden reducir más de la mitad si se utilizan sub- productos o sustancias de desecho como sustrato para los microorganismos productores [39, 40, 41, 42, 43]. CONCLUSIONES A partir de la microbiota silvestre presente en diferen- tes ambientes del Departamento de Nariño se logró obtener biopolímeros de interés industrial como el poli-3-hidroxibutirato (hasta 5,24 g L -1 ) y el copolíme- ro poli-3-hidroxibutirato : poli-3-hidroxivalerato (hasta 0,3 g L -1 ). Algunas de las bacterias silvestres productoras de PHA’s del departamento de Nariño fueronBacillus mycoides FLB 2 y Bacillus subtilis E1M10 RP repor- tadas como microorganismos potencial en la produc- ción industrial de este biopolímero. Es posible obtener polihidroxibutirato a partir de aguas residuales y utilizando bacterias silvestres del departa- mento de Nariño. AGRADECIMIENTOS A Edith Mariela Burbano Ph.D. docente programa de Biología, Universidad de Nariño, por su apoyo y aseso- ría especialmente en los métodos moleculares. REFERENCIAS [1] ANDERSON, A. and DAWES, E. Occurrence, me- tabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial Polyhydroxyalkanoates. Rev. Microbiol., 54, 1990, p. 4450-4472. Figura 2. Cromatograma del éster de metilo 3- hidroxibutirato (pico 5, tiempo de retención 4,850 minutos) obtenido a partir de las aguas residuales vertidas al río Pasto. 19 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (12- 20) [2] RHU, D., LEE, W., KIM, J. and CHOI, E. Polyhy- droxyalkanoate (PHA) production from waste. Water Science and Technology, 48 (8), 2003, p. 221–228. [3] VOLOVA, T., GLADYSSHEV, I., TRUSOVA, Y. and ZHILA, N. Degradation of polyhydroxyalkanoates in eutrophic reservoir.Polymer Degradation and Stability, 92, 2007, p. 580 – 586. [4] RUIZ, A., ALMEIDA, A., LÓPEZ, I. y PETTINARI, J. Bioplásticos: una alternativa ecológica. Revis- taQuímicaViva,3, 2004, p. 122 – 133. [5] ANASTASSIOS, C., SISKA, H., CHOUHAN, B. and DIETER, J. Structural Basis of poly(3-Hidroxybu- tyrate) Hydrolysis by PhaZ7 Depolymerase from Paucimonaslemoignei. J. Mol. Biol., 382, 2008, p. 1184-1194. [6] LLANA, S. and JAY, D. 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Se determinó el grado de modificación de los almidones, se desarrollaron curvas de empastamiento de almidones, se obtuvieron propiedades térmicas mediante calorimetría de barrido diferencial (DSC) y termogravimetría (TGA) y se generaron espectros de absorción de los almidones por espectros- copía infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR). Respecto a los almidones nativos, se identificaron diferencias entre éstos en las curvas de empastamiento, en la temperatura de transición vítrea (Tg) y en la temperatura de fusión (Tm); en cuanto a los almidones modificados, se identificaron diferencias entre éstos en el grado de sustitución molar, en las curvas de empastamiento, en la Tg, la Tm y en los espectros obtenidos mediante FT-IR; en ambos casos estas diferencias fueron atribuidas al contenido de amilosa y amilopectina de los almidones. Respecto a las diferencias entre almidones nativos y modificados, el proceso de hidroxipropi- lación generó cambios en las propiedades estudiadas. Debido a su contenido de amilosa, menor viscosidad y Tg de su almidón modificado, la variedad CM 7138-7 1 Magíster en ingeniería de alimentos. Facultad de Ingenierías. Universidad Cooperativa de Colombia sede Popayán. 2 Magíster en administración. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Departamento de Agroindustria. Universidad del Cauca. 3 Doctor en Ciencia de los Alimentos. Escuela de Ingeniería de Alimentos. Universidad del Valle. 22 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (21- 30) fue aquella que posiblemente presentó mejor potencial para ser empleada en la elaboración de empaques biodegradables. ABSTRACT Physicochemical properties of native and hydroxypropylation cassava (Ma- nihot sculenta Crantz) starch varieties were studied. Starches from three cassava varieties were analyzed, codified as CM 7138-7, CUMBRE 3 and SM 707-17. The objective was to identify the changes in the physicoche- mical properties due to hydroxypropylation process. It was also obtained the pasting curves, thermal properties by differential scanning calorimetry (DSC) and thermogravimetry (TGA) and Fourier transform infrared spec- troscopy (FT-IR). The native starches exhibited differences in the pasting curves, glass transition temperatures (Tg) and fusion temperatures (Tm). The modified starches showed differences in the molar substitution degree, pasting curves, Tg, Tm and the FT-IR spectrum. The hidroxypropylation pro- cess did generate significant changes in the properties of native starches. In both cases, this differences could be attributed to starch amylose and amylopectin content. Respect to native and modified starches differences, hidroxypropylation process generated changes over studied properties. Due to amylose content and modified starch less viscosity and Tg values, was concluded that variety CM 7138-7 was selected as the one with pro- bably major package making potential. RESUMO Propriedades físico-químicas de três variedades de amido de mandioca (Manihot sculenta Crantz) nativas e modificadas por hidroxipropilação foram estudadas. As variedades estudadas foram nomeados com os códigos CM 7138-7, CUMBRE 3 e SM 707-17. Foi determinado o grau de modificação dos amidos, foram desenvolvidas curvas de empastamento, obtidas proprie- dades térmicas por calorimetria de varrimento diferencial (DSC), termogra- vimetría (TGA) e foram gerados espectros de absorção pela espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR). Em relação a amidos nativos, estes foram identificadas diferenças nas curvas de empastamento, nas temperaturas de transição do vidro (Tg) e nas temperaturas de fusão (Tm). Em relação a amidos modificados, diferenças foram encontradas entre o grau de substituição molar, curvas de empastamento, na Tg, na Tm e nos espectros obtidos por FT-IR. Em ambos os casos, estas diferenças foram atribuídas ao conteúdo de amilose e amilopectina do amido. Em relação a amidos nativos e modificados, o processo de modificação pela hidroxipropi- lação causou alterações das propriedades estudadas. Devido ao seu teor de amilose, inferior a viscosidade e a Tg do amido modificado, a variedade CM 7138-7 foi que possivelmente teve melhor potencial para serem utilizados na produção de embalagens biodegradáveis . PALABRAS CLAVE: Propiedades Fisicoquímicas, Cur- vas de Empastamiento, Propieda- des Térmicas, Espectroscopía In- frarroja. KEYWORDS: Physicochemical Properties, Pas- ting Curves, Thermal Properties, Infrared Spectroscopy. PALAVRAS-CHAVE: Propriedades Físico-químicas, Cur- vas de Empastamento, Proprieda- des Térmicas, Espectroscopia De Infravermelhos 23 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (21- 30) INTRODUCCIÓN Actualmente existe mucho interés por el desarrollo de empaques biodegradables a partir de fuentes renova- bles, con características que sean capaces de reem- plazar a los empaques derivados del petróleo [1]. El almidón es una de las materias primas que ha recibido mucha atención para el desarrollo de estos materiales, debido a que su capacidad de gelificar permite mol- dearlo y formar películas [2], además de ser un recur- so económico, de alta disponibilidad en diversas par- tes del mundo [3]. La yuca (Manihot esculenta Crantz) es una especie de raíces amiláceas que se cultiva en los trópicos y subtrópicos [4]. Existen gran cantidad de variedades de yuca en el mundo las cuales produ- cen almidón con propiedades fisicoquímicas variables atribuibles a diferencias en su relación de amilosa a amilopectina y variaciones en su estructura molecuar. Estas diferencias generan diversos comportamientos del almidón frente a los procesos a los que sean so- metidos. La modificación de los almidones se realiza con el fin de mejorarle a éstos algunas características como la resistencia térmica, resistencias al esfuerzo de corte, la descomposición térmica, disminuir su re- trogradación, entre otros [5]. Una forma de modifica- ción química es la hidroxipropilación. Por las razones anteriores, el objetivo de esta investigación fue estu- diar características fisicoquímicas de tres variedades de almidón de yuca tanto en estado nativo como hi- droxipropilados, para identificar aquella variedad con propiedades potenciales para la elaboración de un em- paque biodegradable. Para ello se trabajó con almidón obtenido a partir de las variedades de yuca codificadas como CM 7138-7, CUMBRE 3 y SM 707-17. MÉTODO Se obtuvo almidón de yuca procedente del municipio de Morales, departamento del Cauca. Las muestras de almidón se trituraron con un molino analítico y poste- riormente se pasaron por una malla 60 de Tamizadora MAXTECH con timer modelo TH3D. Modificación del almidón nativo de yuca mediante hidroxipropilación – oxidación Los almidones nativos se modificaron con óxido de propileno (> 99% de pureza, Merck) en presencia de NaOH (> 99% de pureza, Merck) y Na 2 SO 4 (> 99% de pureza, Merck) a pH 11,3, procedimiento seguido por Kaur, Singh y Singh [5]. Determinación del grado de sustitución molar por espectrofotometría de absorción UV– VIS Se determinó a través del contenido de grupos hi- droxipropil en el almidón; este contenido se calculó mediante el principio empleado por Jones y Riddick para determinar propilenglicol y/o polioxipropileno [6], el cual fue adaptado para la determinación del grupo hidroxipropil en almidón esterificado [7]. La concen- tración de propilenglicol en el almidón se calculó de la curva estándar convirtiendo a grupos hidroxipropil equivalente usando la ecuación 1: Grupos hidroxipropil (%)=(C x 0.7763 x 10 x f) _________________ w (Ec. 1) Donde C es la cantidad de propilenglicol en la solución de muestra (µg/mL), f es el factor de dilución (si es necesaria una dilución adicional) y w es el peso de la muestra. La sustitución molar se calculó mediante la ecuación 2: (Ec. 2) Donde MS es la sustitución molar, W es la cantidad de grupos hidroxipropil equivalentes en 100 g de almi- dón y M es el peso molecular del óxido de propileno (C 3 H 6 O). Curvas de empastamiento Se utilizó un reómetro marca TA Instruments modelo 1500 EX. Se pesaron 25 g de almidón en base seca los cuales se dispersaron en 25 mL de agua desti- lada; se agitó la mezcla y se introdujo en la celda de empastamiento de almidón del equipo. Posteriormente se inició una rampa de calentamiento a una velocidad de 12,2 °C/min hasta que la muestra alcanzó 90 °C de temperatura y se mantuvo constante durante un tiem- po de 2 minutos y 30 segundos. Luego se ejecutó una rampa de enfriamiento a una velocidad de 12,2 °C/min hasta que la temperatura de la muestra fue 50°C; se mantuvo constante ésta temperatura durante 2 minutos y finalmente la muestra fue enfriada hasta 30 °C. Calorimetría de barrido diferencial (DSC) Se utilizó un equipo TA Instrument, Q20 series bajo la norma ASTM D 3418-08, previamente calibrado bajo 24 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (21- 30) Cuadro 1. Sustitución molar de almidones de yuca Variedad Sustitución Molar (SM) Desviación CM 7138-7 0,008 ± 3,294x10 -4 CUMBRE 3 0,007 ± 2,9927x10 -5 SM 707-17 0,010 ± 2,0698x10 -3 Cuadro 2. Contenido de amilosa y amilopectina de los almidones estudiados Variedad Amilosa (g/100 g de almidón) Amilopectina (g/100 g de almidón) CM 7138-7 24,09 75,27 SM 707-17 22,58 76,85 CUMBRE 3 21,58 77,83 Fuente: [11] la norma ASTM D 968. Se realizó un barrido desde -150°C hasta una de 250°C. Análisis Termogravimétrico (TGA). Se utilizó un analizador termogravimétrico MODULE TGA Q50 W/MFC. Se trabajó de acuerdo con el proce- dimiento establecido por la norma ASTM E 1131 – 08. Infrarrojo con Transformada de Fourier (FT-IR). Se prepararon pastillas de almidones (2 mg) con bro- muro de potasio (KBr) (Uvasol®, Merck, < 50 mi- cras) y se introdujeron directamente en la celda del infrarrojo. Los espectros se trabajaron con 120 barri- dos cada uno. RESULTADOS Cuantificación del grado de sustitución molar El valor de la sustitución molar (SM) de los almidones modificados se presenta en el Cuadro 1. Esta reacción ocurre principalmente en las regiones amorfas del gránulo del almidón y la eficiencia de la hidroxipropilación está fuertemente influenciada por los reactivos usados, ya que una alta difusión del ca- talizador alcalino (NaOH) permite la penetración del óxido de propileno fácilmente dentro del gránulo; esta difusión está influenciada por la temperatura de reac- ción [7]. En los almidones de maíz y amaranto hidroxi- propilado se reportan resultados de sustitución molar de 0,133 y 0,142 [7]. Como puede observarse el nivel de modificación del almidón de yuca es inferior a lo reportado anteriormente, indicando reducida cantidad de grupos hidroxipropil en su estructura; estas diferen- cias en el grado de modificación están sujetas a varia- ciones en la susceptibilidad al óxido de propileno de cada almidón. Dicha susceptibilidad está influenciada por diversos factores asociados no solo con el origen botánico del almidón sino también con la variedad, en cuanto a tamaño, arquitectura del gránulo y distribu- ción de tamaño, entre otros [8]. Curvas de empastamiento Todos los almidones nativos presentaron dos picos de viscosidad en el proceso de formación de una pasta acuosa. Dicho fenómeno podría atribuirse a una dis- tribución amplia de tamaños de gránulos de almidón, es decir, la variabilidad en el tamaño de éstos es pro- bablemente el causante de tal comportamiento de la viscosidad [9]. Solo un pico de viscosidad se desarro- lló en las curvas de empastamiento cuando los almi- dones estaban hidroxipropilados. El almidón nativo de la variedad yuca CM 7138-7 presentó el mayor desa- rrollo viscosidad (viscosidad pico de 1,1 Pa*s) entre los almidones de las tres variedades (ver Figuras 1, 2 y 3). Esto podría atribuirse a la relación amilosa/amilo- pectina, pues se ha demostrado que la viscosidad dis- minuye al incrementar dicha relación. Almidones con mayor contenido de amilosa presentan mayor estabili- dad estructural debido a que existe mayor atracción de las cadenas poliméricas dada la alta estabilidad de los enlaces o-1,4 [10]. El Cuadro 2 presenta el contenido de amilosa y amilopectina de las tres variedades de almidón de yuca estudiadas. Al analizar las curvas de empastamiento de las tres va- riedades modificadas, se encontró que dos de las varie- dades disminuyeron su pico máximo de viscosidad res- pecto a sus variedades nativas y la temperatura a la cual se logró éste, mientras que una de éstas tuvo incremen- tos en ambos parámetros respecto al almidón nativo. La variedad CM 7138-7 fue la que logró menor pico de viscosidad y temperatura (0,527 Pa*s y 67,25 °C respectivamente) de las tres variedades modificadas, seguida de la variedad modificada CUMBRE 3 (0,642 Pa*s y 76 °C respectivamente) y la variedad SM 707- 17 (1,07 Pa*s y 83,5 °C) siendo ésta última la úni- ca variedad que luego de la modificación incrementó 25 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (21- 30) Figura 1. Curvas de empastamiento de almidón de la variedad CM 7138-7 nativo (o) y modificado () Figura 2. Curvas de empastamiento de almidón de la variedad SM 707-17 nativo (o) y modificado () Figura 3. Curvas de empastamiento de almidón de la variedad CUMBRE 3 nativo (o) y modificado () el pico de viscosidad respecto a la variedad nativa. Cuando se modifica un almidón por hidroxipropilación disminuye la temperatura de empastamiento de éste e incrementa el pico de viscosidad de los almidones [12]. En cuanto a las variedades CM 7138-7 y CUM- BRE 3, la disminución del pico máximo de viscosidad del almidón luego de la modificación es el resultado de un efecto en los gránulos de almidón durante el proce- so de modificación. Éste se refiere a un debilitamien- to de los enlaces inter e intramoleculares tales como los puentes de hidrógeno, reorganización estructural de la mayoría del componente amorfo y parte de la región cristalina, lo que sucede particularmente bajo un medio alcalino como el usado para la modificación del almidón por hidroxipropilación [13]. Con respecto a la variedad SM 707-17, es posible que la adición de Na 2 SO 4 en el proceso de modificación incrementara el pico de viscosidad máxima y disminuyera la lixiviación de cadenas poliméricas [14]. Las diferencias en los comportamientos de la temperatura y la viscosidad luego del proceso de modificación podrían atribuirse a posiblemente a las diferencias en el grado de modifica- ción de los almidones o a la diversidad en los tamaños de los gránulos presentes en los almidones. Morita y Vang Hung (2005), modificaron por hidroxipropilación almidón de trigo con dos tipos de tamaños de gránulo, encontrando en las curvas de empastamiento de és- tos que las propiedades del almidón con mayor con- tenido en amilosa como pico máximo de viscosidad y temperatura de empastamiento fueron superiores que su respectivo almidón nativo [12]. La disminución de las temperaturas de empastamiento en almidones con bajo grado de sustitución molar también ha sido reportada para almidón de papa [15, 16], almidón de maíz y de amaranto [7]. La viscosidad y temperaturas de setback fueron menores en dos de las tres varieda- des estudiadas. Esto indica que la retrogradación de cadenas de amilosa fue sustancialmente reducida por la hidroxipropilación [17]. Calorimetría de barrido diferencial (DSC) de almidones nativos y modificados de yuca A continuación se presenta el análisis hecho para los resultados obtenidos de temperatura de transición ví- trea (Tg) y temperatura de fusión (Tm). Temperatura de transición vítrea (Tg) En el Cuadro 3 se reportan los datos del comporta- miento de la Tg que presentaron las variedades de almidón nativo y modificado. De acuerdo con los resultados obtenidos anteriormente los valores de la Tg para todas las variedades tanto nativas como modificadas se encuentran por encima de la tem- peratura ambiente, indicando que los almidones se comportan como materiales vítreos a estas condi- ciones de almacenamiento [18]. El almidón modificado presentó un cambio en las propiedades térmicas como puede observarse en el 26 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (21- 30) Cuadro 4. Temperatura de fusión (Tm) de almidones nativos y modificados de yuca Almidón Nativo Almidón Modificado Variedad Tm (°C) (J/g) Tm (°C) (J/g) CM 7138 – 7 158,44 243,1 144,33 284,6 CUMBRE 3 178,02 221,1 142,61 266,9 SM 707 – 17 134,04 255,1 147,03 259,7 Cuadro 3 y en las Figuras 4, 5 y 6, en las cuales se ve que la Tg disminuyó para los almidones modifi- cados. Durante el proceso de modificación los gru- pos hidroxipropil que se introducen en las cadenas debilitan y desorganizan la estructura interna de las cadenas [19, 20], de esta manera al incorporar gru- pos hidroxipropil en los posibles sitios de sustitu- ción de las unidades de anhidroglucosa, se amplían los espacios entre las cadenas aumentando el volu- men libre entre estas, influyendo en la reducción de la temperatura de transición vítrea [21]. Temperatura de fusión (Tm) Se reportan sus temperaturas de fusión en el Cuadro 4 para almidones nativos y modificados. Los valores de Tm disminuyeron presentando igual comportamiento que la Tg para las variedades CM 7138 – 7 y CUMBRE 3. Esto podría deberse a que durante la modificación se presentó una reducción de las interacciones entre las cadenas de almidón [20], la presencia de grupos sus- tituyentes de origen hidrofílico logran un aumento en el volumen libre de la molécula haciendo que las cade- nas se muevan fácilmente causando una disminución en la temperatura necesaria para fundir los cristales y alterar la estructura del almidón [20]. Estos almidones modificados a pesar de disminuir su temperatura de fusión presentaron un aumento en su entalpía, como se puede ver en las Figuras 4 y 5; este aumento pudo deberse a que al incorporar los nuevos grupos fun- cionales en la cadena, posiblemente se formó algún tipo de enlaces secundarios requiriendo mayor energía para su desorganización [22]. La variedad SM 707 – 17 presentó aumento en su temperatura de fusión y la entalpía en el almidón modificado, esto posiblemente se deba a que la estructura cristalina es más estable y Cuadro 3. Temperaturas de transición vítrea (Tg) en almidón nativo y modificado de yuca Temperatura de Transición Vítrea Tg (ºC) Variedad Almidón Nativo Almidón Modificado CM 7138 – 7 137,58 129,54 CUMBRE 3 141,16 124,16 SM 707 - 17 127,63 124,85 Figura 4. Termograma de DSC para almidón de yuca variedad CM 7138 -7 nativo y modificado Figura 6. Termograma de DSC para almidón de yuca variedad SM 707 - 17 nativo y modificado Figura 5. Termograma de DSC para almidón de yuca variedad SM 707 - 17 nativo y modificado 27 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (21- 30) sus cadenas pueden ser más fuertes, lo cual demanda mayor energía para fundir [23], restándole cualidades para ser utilizado en la elaboración de empaques. Análisis termogravimétrico (TGA) de almidones nativos y modificados de yuca En los termogramas correspondientes al almidón na- tivo y modificado puede observarse un cambio en el inicio de la temperatura para alcanzar la máxima tasa de degradación de los almidones. Para la variedad CM 7138 – 7 y la variedad CUMBRE 3 (ver Figuras 6 a 9) se presentó una disminución en la temperatura, pasan- do de 260,27°C a 252,27°C para la variedad CM 7138 -7 y de 254,97°C a 249,67 para la variedad CUMBRE 3 (no se presenta su gráfica). La variedad SM 707 -1 7 presentó un aumento en esta temperatura pasando de 246,70°C a 260,64°C, indicando mayor estabilidad con respecto a las otras variedades. En los almidones modificados (CM 7138-7, CUMBRE 3, SM 707-17) se observa que las muestran son estables hasta cerca de los 252,44°C, 249,67 °C, 260.64 °C para cada varie- dad respectivamente. Aproximadamente entre 590 °C y 600 °C ocurre una descomposición de una estructu- ra entrecruzada del almidón o posibles anillos aromá- ticos formados por la descomposición térmica [24]. Espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier de almidones nativos y modificados (FT-IR) La Figura 11 muestra los espectros de una variedad de almidón nativo y modificado. La comparación entre los espectros infrarrojos de los almidones nativos y modificados de las variedades de yuca mostró una similitud entre sus bandas. Se pre- sentó un intervalo de absorción de una banda ancha y fuerte entre 3363 cm -1 y 3394 cm -1 ; estas bandas corresponden a los alargamientos de los grupos OH [24] de los grupos hidroxilo libres enlazados intra e intermolecularmente presentes en las unidades de an- hidroglucosa de la amilosa y la amilopectina, estruc- Figura 7. Termograma de TGA de almidón de yuca nativo variedad CM 7138-7 Figura 9. Termograma de TGA de almidón de yuca nativo SM707-17 Figura 8. Termograma de TGA de almidón de yuca modificado variedad CM 7138-7 Figura 10. Termograma de TGA de almidón de yuca modificado SM 707-17 28 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (21- 30) turas propias del almidón [25]. Se considera que la estructura del grupo hidroxipropil se adhiere a una mo- lécula de almidón sustituyendo un grupo hidroxilo de una unidad de anhidroglucosa después del proceso de modificación, por lo anterior el grupo metileno (-CH2-) es la única característica distintiva (longitudes de onda entre 2850 cm -1 - 3000 cm -1 , alargamiento CH), gene- rándose el fenómeno de absorción específico para el grupo metileno. En el almidón modificado, la banda a 2931 cm- 1 para SM 707-17, 2923 para CUMBRE 3 y 2915 para CM 7138-7 corresponden a este grupo fun- cional ya que se observa claramente un elevamiento de la banda en la frecuencia de estiramiento de este grupo, debido a la adición de óxido de propileno [26] (Figura 11). El comportamiento observado en la figura coincide con la identificación cualitativa de modifica- ción de almidones presentada por Forrest y Cove [26], en el cual se analiza cualitativamente la modificación por hidroxipropilación de almidón de maíz Waxy, pre- sentándose los picos más relevantes en una franja comprendida entre 1885 y 2974 cm -1 , valores equi- valentes a longitudes de onda. Rindlav et al., (1997), plantearon que de acuerdo a la absorbancia de una banda aguda ubicada en la región 1075 – 1020 cm -1 , se puede llegar a determinar el grado de cristalización de un almidón [27]; para los almidones nativos y mo- dificados se ubica en 1040 cm -1 ,1042 cm -1 y 1041 cm -1 para SM 707 -17, CUMBRE 3 y CM 7138 – 7, respectivamente. Al comparar la banda correspon- diente a las zonas cristalinas en los almidones mo- dificados se observa una mayor intensidad de esta, causado por la eterificación del almidón [28] por la in- troducción de grupos bloqueadores monofuncionales sustituyentes en la molécula del almidón, tales como el hidroxipropil [29]. CONCLUSIONES El grado de modificación de los almidones hidroxipropi- lados varió para cada variedad aunque la aplicación del proceso de modificación por hidroxipropilación para los almidones fue similar. Esto podría atribuirse al contenido de amilosa y amilopectina de cada una de las varieda- des lo cual influye en la reactividad del almidón. El proceso de modificación por hidroxipropilación ge- neró cambios en las propiedades de los almidones objeto de estudio. La viscosidad de las variedades CM 7138-7 y CUMBRE 3 disminuyó mientras que la visco- sidad de la variedad SM 707-7 incrementó. Se obser- vó igual comportamiento respecto a la temperatura de máxima viscosidad de los almidones. Se identificaron diferencias en las propiedades térmi- cas entre los almidones nativos y entre los almido- nes modificados. El proceso de modificación generó disminuciones de la Tg y de la Tm de los almidones estudiados. Sin embargo se presentó un comporta- miento contrario con la energía de fusión de los almi- dones modificados, en los cuales fue mayor que en los almidones nativos. Respecto a la prueba de ter- mogravimetría se identificaron cambios en la tempe- ratura de inicio de degradación de los almidones. Las variedades CM 7138 – 7 y CUMBRE 3 presentaron disminución en dicha temperatura, no así la variedad SM 707-17 que presentó comportamiento contrario en dicha propiedad. La aplicación de FT-IR generó espectros similares en- tre los almidones nativos y entre los almidones mo- dificados. Se identificaron cambios en los espectros de los almidones debidos al proceso de modificación, especialmente entre 3363 cm -1 y 3394 cm -1 , bandas que corresponden a alargamientos de los grupos OH. Los resultados obtenidos del estudio de las diversas características fisicoquímicas de los almidones na- tivos y modificados permiten, de manera preliminar, concluir que la variedad CM 7138-7 es la más reco- mendable para la elaboración de empaques biode- gradables, debido al menor contenido de amilosa de su variedad nativa, a la menor viscosidad y Tg de su almidón modificado, pues esto indica que en su proce- samiento térmico es necesario menor uso de energía para fundir y plastificar ésta variedad de almidón. Figura 11. Espectros FT-IR de almidón nativo y modificado de la variedad CM 7138 – 7 29 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (21- 30) AGRADECIMIENTOS Los autores expresan su agradecimiento a la Univer- sidad del Cauca y al Ministerio de Agricultura y Desa- rrollo Rural de la República de Colombia por el apoyo suministrado a esta investigación mediante el proyecto de investigación número 228-2008Z32308-7121. REFERENCIAS [1] VELASCO, R., ENRÍQUEZ, M., TORRES, A., PA- LACIOS, L. y RUALES, J. Caracterización mor- fológica de películas biodegradables a partir de almidón modificado de yuca, agente antimicro- biano y plastificante. Revista de biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial, 10 (2), 2012, p. 152-159. [2] ENRÍQUEZ, M., VELASCO, R. y ORTIZ, V. Compo- sición y procesamiento de películas biodegrada- bles basadas en almidón. Revista de biotecnolo- gía en el sector agropecuario y agroindustrial, 10 (1), 2012, p. 182-192. 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Acta Científica Venezolana, 55 (1), 2004, p. 86-90. 31 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (31- 40) ESTUDIO FISICOQUÍMICO DE MEZCLAS DE ALMIDÓN TERMOPLÁSTICO (TPS) Y POLICAPROLACTONA (PCL) PHYSICO-CHEMICAL STUDIED OF THERMOPLASTIC STARCH (TPS) AND POLYCAPROLACTONE (PCL) FÍSICO-QUÍMICAS ESTUDADA DE AMIDO TERMOPLÁSTICO (TPS) E POLICAPROLACTONA (PCL) JOSE MINA H. 1 , ALEX VALADEZ G. 2 , TANIT TOLEDANO T. 3 RESUMEN Se estudiaron las propiedades físico-químicas de un almidón termoplástico (TPS) de yuca, plastificado con glicerol, y el efecto de la incorporación de policaprolac- tona (PCL) en el desarrollo de tres mezclas binarias TPS-PCL a proporciones 60- 40, 50-50 y 40-60. El estudio inició con la preparación por extrusión del TPS y su posterior mezcla en caliente con la policaprolactona. El análisis de los resultados se enfocó principalmente a la identificación y seguimiento de la retrogradación, que se dio en el almidón termoplástico para diferentes tiempos de acondicio- namiento (a 54% H.R. y 25ºC). Con el proceso de plastificación del almidón se generó una masa predominantemente amorfa, evidenciada por los resultados obtenidos con SEM, DRX y FTIR. Con la incorporación de la PCL se obtuvieron mezclas inmiscibles, en las cuales el TPS se constituyó en la fase dispersa y Recibido para evaluación: 23-04-2013. Aprobado para publicación: 18-7-2013. 1 Ingeniero de Materiales, MSc., PhD. Grupo de Materiales Compuestos. Profesor Asociado. Facultad de Ingeniería. Universidad del Valle.
[email protected] 2 Ingeniero Químico, MSc., PhD. Investigador Asociado. Unidad de Materiales. Centro de Investigación Científica de Materiales (CICY).
[email protected] 3 Química Industrial. Unidad de Energía Renovable. Centro de Investigación Científica de Materiales (CICY).
[email protected] correspondencia:
[email protected] 32 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (31- 40) que conservaron una tendencia en la variación de las propiedades con el tiempo de acondicionamiento, similar a la observada en el TPS solo; indi- cando este hecho que las interacciones físico-químicas generadas entre el TPS y la policaprolactona no fueron lo suficientemente fuertes, como para incidir en la variación estructural del TPS, la cual se dio independiente del contenido de PCL. ABSTRACT The physicochemical properties of a thermoplastic cassava starch (TPS), plasticized with glycerol, and the effect of polycaprolactone incorporation in three TPS-PCL binary blends at 60-40, 50-50 and 40-60 was studied. The study began with the preparation by extrusion of TPS and subsequent hot blend with the polycaprolactone. Analysis of the results focused primarily on the identification and monitoring of structural change, or retrogradation, which occurred in the thermoplastic starch at different conditioning times (at 54% R.H. and 25°C). With the starch plasticization process an amor- phous mass was predominantly generated, it was evidenced by the results obtained with SEM, XRD and FTIR. With PCL it were obtained immiscible blends, with TPS being the dispersed phase and the trend in the variation of properties, with the conditioning time was similar to that observed in the TPS alone. These findings suggest that physicochemical interactions bet- ween TPS and polycaprolactone were not strong enough to affect the struc- tural behavior of TPS, which occurred independent of the content of PCL. RESUMO Estudaram-se as propriedades físico-químicas de um amido termoplástico de mandioca (TPS), plastificadas com glicerol, eo efeito da incorporação de Policaprolactona (PCL) no desenvolvimento de três misturas binárias de (PCL-TPS), com proporções 60-40, 50-50 e 40-60. O estudo começou com a preparação por extrusão de TPS e sua mistura quente posterior com a Policaprolactona. Análise dos resultados com foco principalmente na identificação e rastreio dos retrogradação, que ocorreu no amido ter- moplástico para tempos de condicionamento (a 54% de umidade relativa e 25°C). Com o processo de plastificação do amido é gerada predominan- temente massa amorfa, evidenciado pelos resultados obtidos com o SEM, XRD e FTIR. Com a adição de PCL foram obtidas misturas imiscíveis, onde a TPS é incorporado na fase dispersa e que manteve uma tendência na variação das propriedades, com o tempo de condicionamento, semelhante ao observado no TPS por si só, indicando que facto de as interações físico- químicas geradas entre TPS e Policaprolactona não eram suficientemente forte como para afetar a variação estrutural de TPS, que ocorreu indepen- dente do teor de PCL. INTRODUCCIÓN En la actualidad buena parte de los estudios de investigación en el área de materiales poliméricos, se están enfocando hacia el desarrollo de políme- PALABRAS CLAVES: Almidón de yuca, Retrogradación, Polímeros biodegradables. KEYWORDS: Cassava Starch, Retrogradation, Polycaprolactone, Biodegradable polymers. PALAVRAS-CHAVE: Amido de mandioca, Retrogra- dação, Polímeros biodegradáveis. 33 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (31- 40) ros biodegradables que se caractericen por proceder de fuentes renovables como almidones, proteínas, hidroxialcanoatos, etc. y por presentar biodegradabi- lidad completa en condiciones de compostaje [1,2]. A diferencia de los polímeros sintéticos tradicionales, estos materiales no son dependientes del petróleo y por tanto tienen valor agregado como una alternativa viable para la producción de polímeros medioambien- talmente amigables; esto es de gran importancia, so- bre todo, proyectándose a futuro cuando el petróleo como materia prima de los polímeros tradicionales co- mience a escasear. Entre esta familia de materiales se destacan, por la abundancia y bajo costo del almidón, los almidones termoplásticos [2,3]. Para convertir un almidón nativo en un material bioplástico es necesario romper y fundir la estructura granular semicristalina del mismo [4]. En este sentido, el almidón sin los adi- tivos adecuados (plastificantes) no tiene las propieda- des necesarias para trabajar como un termoplástico, caracterizándose por ser susceptible al envejecimiento y la recristalización, además de presentar alta absor- ción de agua. Los plastificantes incrementan la flexibi- lidad del almidón debido a su habilidad para reducir la interacción de los enlaces de hidrógeno internos en la cadena del polímero, además de aumentar el espacio molecular [5]. Cuando son calentados en presencia de un exceso de agua, los gránulos de almidón pa- decen una transición de fase orden-desorden llamada gelatinización; esta transición se da por encima de un intervalo de temperaturas que es característico de la fuente de almidón. Dependiendo de condiciones de procesamiento y almacenamiento como la tempera- tura y la humedad, el almidón amorfo sufre cambios estructurales después del enfriamiento, basados en: recristalización de la amilosa y la amilopectina en di- ferentes estructuras cristalinas, separación de fase y reorientación del polímero. Las interacciones molecu- lares (principalmente enlaces de hidrógeno entre las cadenas de almidón) que ocurren después del enfria- miento son llamadas retrogradación [4]. Para compensar las deficiencias del almidón termo- plástico, desde el punto de vista de la resistencia mecánica y sus cambios con el tiempo de almacena- miento, se han llevado a cabo investigaciones en torno al mejoramiento de los plastificantes usados para su modificación, la mezcla con polímeros biodegradables más estables y/o la incorporación de fibras naturales. Debido a la importancia de ampliar el conocimiento re- lacionado con las variaciones en las propiedades que sufre el TPS con el tiempo y, a su vez, cuantificar el po- sible mejoramiento de su desempeño al ser mezclado con un polímero biodegradable más estable, en este artículo se presentan los resultados obtenidos a partir de la preparación y caracterización físico-química de un almidón termoplástico de yuca, enfocando la inves- tigación al análisis del proceso de retrogradación que exhibió el material durante su almacenamiento a 54% de humedad relativa y 25ºC. De manera complemen- taria, se hicieron mezclas de éste almidón termoplás- tico (TPS) con policaprolactona (PCL) a proporciones TPS/PCL de 60/40, 50/50 y 40/60, y se caracterizaron en función del tiempo de almacenamiento, con el fin de cuantificar la posible incidencia de la PCL en el proce- so de retrogradación del almidón termoplástico. MÉTODO Materiales El almidón nativo de yuca (manihot sculenta Crantz) utilizado para la obtención del almidón termoplástico (TPS), fue de la variedad CM 4919 con un contenido de amilosa entre 22 – 26% y de amilopectina de 78 – 74%. Este material fue suministrado por la empresa Industrias del Maíz de Cali, Colombia y se trabajó en forma de partículas semicristalinas con geometría es- férica y un diámetro promedio de 14,4 µm. El Glicerol fue grado industrial y se adquirió en Farmacias Co- mercio en Mérida Yucatán, este material presentó una pureza del 98%. La policaprolactona empleada para la preparación de la mezcla binaria fue de la referencia CAPA 6800 de la empresa Perstorp UK Limited de In- glaterra. Este poliéster contó con una masa molecular de 80000 g/mol, una temperatura de transición vítrea (Tg) de –45ºC, una temperatura de fusión (Tm) de 56ºC, un máximo en la rapidez de pérdida de masa a una temperatura de 453ºC, y fue adquirido en forma de pellets de color blanco opaco. Preparación del almidón termoplástico De manera similar a procesos reportados en la literatura [1,6], el almidón de yuca después de ser sometido a un proceso de secado por 24 h a 80ºC, fue premezclado con glicerol a una relación 70:30 en masa. Este proce- so se llevó a cabo por 5 min, hasta que el material no presentó grumos, usando un mezclador de alta veloci- dad marca Black and Decker. Posteriormente, la mezcla se almacenó en recipientes cerrados de polipropileno durante 72 horas. Finalmente, el material se plastificó en un equipo de extrusión mono husillo, acoplado a un 34 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (31- 40) Plasticorder marca Brabender modelo PLE-330, provis- to con un tornillo de un diámetro de 19 mm, una rela- ción de compresión 4:1 y una relación L/D de 25. La rapidez de giro se mantuvo en 45 RPM y el perfil de temperaturas fue de: 115, 125, 130 y 135ºC para las tres zonas del tornillo y el cabezal respectivamente. Preparación de las mezclas de almidón termoplástico y policaprolactona (TPS–PCL) Después de secar previamente a 50ºC en un horno con presencia de vacío, el almidón termoplástico pe- letizado se mezcló manualmente con los gránulos de PCL a proporciones de 40, 50 y 60% en masa, estos valores se seleccionaron tomando como base trabajos similares reportados en la literatura [7,8]. Posterior- mente este material fue extruido en el mismo equipo que se describió previamente para la obtención del TPS a partir del almidón de yuca. En este caso las condiciones de procesamiento fueron: una rapidez de giro de 45 RPM y un perfil de temperaturas de 115, 125, 130 y 130ºC para las tres zonas del tornillo y el cabezal respectivamente. Al igual que con las muestras de almidón termoplásti- co, las mezclas binarias con policaprolactona se acon- dicionaron a 54% de humedad relativa y se les reali- zaron ensayos físico-químicos a diferentes tiempos de almacenamiento. Espectroscopia Infrarrojo por Transformada de Fou- rier (FTIR) Se empleó un equipo de espectro-fotometría de Infra- rrojo con Transformada de Fourier (FTIR), marca Nico- let modelo Protege 460 magna IR. Para el análisis del almidón sin plastificar se utilizó la técnica de la pastilla de KBr, mientras que en el caso de las muestras de TPS y las mezclas binarias TPS-PCL, se empleó un microscopio Inspect IR Plus, provisto del accesorio para reflectancia total atenuada (ATR). El análisis fue realizado a 100 barridos y una resolución de 4 cm -1 . Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) La morfología de las partículas de almidón de yuca sin plastificar, la superficie de fractura del almidón ter- moplástico y las mezclas binarias TPS-PCL, se obser- varon en un microscopio electrónico de barrido JEOL SEM Modelo LV 5400 operado a 20 keV. Las muestras fueron recubiertas previamente con oro. Figura 2. Espectros FTIR para el almidón sin plastificar y tres TPS acondicionados a diferentes tiempos. 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 (d) (c) (b) BANDA REGIÓN CRISTALINA (1047 cm -1 ) BANDA REGIÓN AMORFA (1022 cm -1 ) A b s o r b a n c i a Número de onda (cm -1 ) (a) Almidón sin plastificar (b) TPS 18 Días (c) TPS 82 Días (d) TPS 124 Días (a) Figura 1. Espectros FTIR para almidón sin plastificar y un TPS acondicionado a 17 días. Intervalos de: (a) 4000–2400 cm-1 y (b) 1400–850 cm-1. 4000 3500 3000 2500 (a) (b) 3 3 6 5 3 2 7 8 T r a n s m i t a n c i a Número de onda (cm -1 ) (a) Almidón termoplástico (b) Almidón sin plastificar (a) 1400 1300 1200 1100 1000 900 1078 1080 (b) (a) 1151 1155 T r a n s m i t a n c i a Número de onda (cm -1 ) (a) Almidón termoplástico (b) Almidón sin plastificar (b) 35 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (31- 40) Difracción de Rayos-X (DRX) Los patrones de difracción de rayos-X del almidón de yuca sin plastificar, el TPS, la PCL y las mezclas bi- narias TPS-PCL, se obtuvieron en un equipo Siemens D-5000 con geometría Bragg-Bentano, utilizando ra- diación CuKo (ì=1,5418Å) generada a 34 kV y 25 mA. Los especímenes de ensayo se ubicaron en un portamuestra rotatorio (30 RPM) y se registraron en uu |ule|va|o augu|a| de 2º±2u±GOº, ul|||/audo uu la- maño de paso de 0,02° y tiempo de paso de 3 s. El contenido de cristalinidad relativa de las muestras fue estimado en un intervalo angular entre 4 y 30º 2u, si- guiendo el método establecido por Nara & Komiya [9]. RESULTADOS Espectroscopía Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR) Con el proceso de plastificación, la banda corres- pondiente al estiramiento en tensión de los grupos hidroxilo –OH del almidón de yuca se desplazó des- de 3365 hasta 3273 cm -1 . De igual manera, la señal asignada al estiramiento C–O del enlace C–O–H tam- bién mostró un corrimiento hacia números de onda menores (de 1080 y 1155 a 1078 y 1151 cm -1 ), tal como se puede apreciar en los espectros de FTIR de las Figuras 1(a) y (b). Este comportamiento se debió a que con la incorpo- ración del glicerol, que actuó como plastificante, se modificaron las interacciones iniciales de los grupos hidroxilos al interior del material y se establecieron nuevas uniones tipo puentes de hidrógeno entre éste y las cadenas de almidón. Dichas uniones generaron mayor flexibilidad en el ma- terial debido a que por su tamaño las moléculas de gli- cerol presentaron menos impedimentos estéricos que las cadenas de almidón y, por tanto, su incorporación repercutió en una mayor separación de las cadenas y un incremento en la capacidad de rotación de la nueva estructura para el TPS formado. Así mismo, esta mayor facilidad de rotación contribuyó a que las vibraciones de los grupos hidroxilo se dieran a frecuencias meno- res. Resultados similares fueron reportados por Huang et al. [1] quienes estudiaron los cambios generados en los espectros obtenidos por FTIR para un almidón de maíz después de su plastificación con etanolamina. En la Figura 2 se presenta el intervalo de 800 a 1400 cm -1 de los espectros de FTIR para el almidón sin plas- tificar y almidones termoplásticos, a diferentes tiem- pos de acondicionamiento. Antes del análisis de estos espectros, vale la pena comentar que Smits et al. [10] señalaron que la banda a 1047 cm -1 está relacionada con la región ordenada (cristalina) del almidón, mien- Figura 3. Espectros FTIR para: (a) policaprolactona PCL; (b) almidón termoplástico TPS; (c) TPS40 - PCL60; (d) TPS50 – PCL50 y (e) TPS60 – PCL40. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 (e) (d) (c) (b) -C=O T r a n s m i t a n c i a Número de onda (cm -1 ) (a) Policaprolactona (PCL) (b) Almidón termoplástico (TPS) (c) Mezcla TPS - PCL (40-60) (d) Mezcla TPS - PCL (50-50) (e) Mezcla TPS - PCL (60-40) -OH (a) Cuadro 1. Bandas típicas en espectros FTIR, de las mezclas binarias PCL-TPS. Tipo de enlace Número de onda (cm -1 ) Valores experimentales Balmayor et al., [14] Estiramiento O–H del almidón 3331 3362 Estiramiento asimé- trico/simétrico CH 2 de la policaprolac- tona 2945/2866 2944/2864 Estiramiento C=O (éster policaprolac- tona) 1724 1724 Estiramiento asimé- trico C–O–C de la policaprolactona 1242 1244 Estiramiento enlace glicosidico C–O–C del almidón 1043/1029 1048/1021 36 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (31- 40) tras que la señal a 1022 cm -1 tiene que ver con las zonas desordenadas (amorfas). De tal manera, que teniendo en cuenta lo anterior en este trabajo, se trazó una línea base entre 1180 y 880 cm -1 y se midieron las alturas de estas bandas, con el fin de calcular la razón H 1047 /H 1022 como un índice de cristalinidad. Me- todologías de trabajo similares han sido reportadas por Rindlav et al. [11], quienes con un índice de cris- talinidad obtenido por FTIR estimaron los cambios de cristalinidad que se dieron en un TPS de papa a dife- rentes tiempos de almacenamiento. Se pudo concluir que existió una correlación entre dicho parámetro y el porcentaje de cristalinidad relativa, determinado con difracción de rayos-X. Con el análisis de los espectros FTIR de los materiales de estudio, se encontró que el almidón sin plastificar presentó un índice de 0,911, el cual con el proceso de plastificación disminuyó a un valor de 0,574, evalua- do a un tiempo de cuatro días de acondicionamiento a 54% de humedad relativa. Estos resultados indica- ron, como era de esperarse, que durante el proceso de plastificación por extrusión, los gránulos de almidón se desestructuraron por efecto del cizallamiento y el calor aplicados, de tal manera que las cadenas de amilosa y amilopectina quedaron más expuestas para interac- tuar con el glicerol mediante la formación de puentes de hidrógeno. El acomodamiento del glicerol entre las cadenas contribuyó a un aumento del volumen libre y la generación de irregularidades estructurales, que con- llevaron a la disminución de la cristalinidad del material. Mediante el incremento relativo de la banda a 1047 cm -1 se evidenció que con el transcurso del tiempo se produjo un aumento en el índice de cristalinidad del TPS, implicando esto que en el material se estuvieron presentando cambios estructurales, que promovie- Figura 4. Imágenes SEM de: (a) partículas de almidón sin plas- tificar; (b) superficie de fractura del TPS. Figura 5. Imágenes SEM de la superficie de fractura para: (a) TPS 40 – PCL 60; (b) TPS 50 – PCL 50 y (c) TPS 60 – PCL 40. ron un reacomodamiento parcial de la estructura ini- cial de las cadenas, principalmente, de amilopectina. Esta reaparición de zonas cristalinas se fundamentó en el fortalecimiento de las interacciones secunda- rias que se generan por la retrogradación del material y que dependen del tiempo, llevando a valores del índice de cristalinidad de 0,614; 0,633 y 0,711 para periodos de acondicionamiento de 18, 49 y 124 días, respectivamente. 37 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (31- 40) En la Figura 3 se presentan los espectros FTIR para el almidón termoplástico y la mezcla binaria TPS – PCL a 40, 50 y 60% en masa de policaprolactona, donde se resalta el incremento gradual de la banda a 3330 cm -1 correspondiente a los grupos hidroxilos –OH, conforme se fue aumentado el contenido del TPS en el material. En el Cuadro 1 se muestra la asignación de bandas de FTIR correspondiente a: el estiramiento en tensión de los hidroxilos O-H del almidón a 3331 cm -1 , el estiramiento del enlace C-H de la policaprolactona a 2945 cm -1 , el estiramiento en tensión del carbonilo C=O perteneciente al grupo éster de la policaprolac- tona a 1724 cm -1 , el estiramiento del enlace C-O-C de la policaprolactona a 1242 cm -1 y el estiramiento del enlace glicosídico C-O-C del almidón a 1043 cm -1 . Siendo estas algunas de las bandas con mayor in- tensidad encontradas en el espectro FTIR correspon- diente a la mezcla TPS-PCL (50-50% en masa). Las señales encontradas coinciden en alto grado con los resultados reportados por Balmayor et al. [12] para una mezcla de almidón de maíz-PCL (30-70% en masa), caracterizada por FTIR empleando la técnica de la pastilla de KBr. Debido a que el almidón termoplástico cuenta con gru- pos hidroxilos, que se pueden considerar como dona- dores de protones, y la policaprolactona tiene grupos carbonilos clasificados como aceptores de protones, en principio se podría esperar que la mezcla binaria de estos materiales presentara puentes de hidrógeno que implicarán la posible formación de una mezcla mis- cible. No obstante, en la Figura 3 se puede observar que la banda correspondiente a la vibración en tensión de los carbonilos C=O no se desplazó en ninguno de los tres espectros de las mezclas binarias TPS-PCL, identificados en las curvas (c), (d) y (e), con relación a la policaprolactona pura. Esta falta de corrimientos indicó que no se formaron los enlaces de hidrógeno y por tanto, el sistema se caracterizó por ser predomi- nantemente inmiscible. Vale la pena resaltar que para sistemas de mezclas binarias similares, Cesteros [13] planteó igualmente una relación entre la miscibilidad de mezclas poliméricas y los desplazamientos de la banda de los carbonilos a números de onda menores. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) En la Figura 4(a) se presenta una micrografía de la morfología correspondiente a las partículas de almi- dón de yuca, empleadas en el proceso de plastifica- ción. De acuerdo con lo expresado por Wurzburg [14], la geometría de este tipo de almidones tiende a ser esférica, diferenciándose de otras fuentes botánicas, para las cuales dicha forma puede ser elíptica, ovala- da, lenticular ó poligonal. Así mismo, la presencia del plastificante y los esfuerzos de cizallamiento típicos del proceso de plastificación por extrusión condujeron al rompimiento de la estructura granular del almidón. No obstante, de acuerdo a la mi- crografía de la Figura 4 (b), aún se presentan evidencias de algunos pocos gránulos que no fueron totalmente desestructurados, indicando esto que es posible mejo- rar las condiciones de proceso seguidas en la produc- ción del material. Esta última micrografía fue tomada en la sección transversal de una probeta de TPS, ensayada previamente a tensión, después de 17 días de acondi- cionamiento a un 54% de humedad relativa. Las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM), presentadas en la Figura 5, hacen referen- cia a la superficie de ruptura en tensión de especí- menes de ensayo fabricados con la mezcla binaria TPS–PCL, a los tres porcentajes trabajados. Aquí se pudo observar, para todas las composiciones, la for- mación de una fase continua de policaprolactona y una fase dispersa de TPS, distribuida aleatoriamente, que dejaron claro la naturaleza predominantemente inmiscible del material. Cabe aclarar que hasta para la relación TPS60–PCL40, la policaprolactona resultó ser la matriz aunque se encontraba en menor pro- porción que el almidón termoplástico, esto se debió a que por su baja temperatura de fusión (56ºC), a las condiciones de procesamiento seguidas la PCL Figura 6. Difracción de rayos-X del almidón de yuca sin plasti- ficar y los TPS acondicionados a 5 y 26 días. 10 20 30 40 50 60 Tipo C Tipo V H Tipo V H (c) (b) I n t e n s i d a d ( U . A ) Ángulo de difracción (2 ) (a) Almidón sin plastificar (b) TPS acondicionado a 5 días y 54% de H.R. (c) TPS acondicionado a 26 días y 54% de H.R. (a) Tipo C 38 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (31- 40) presentaba una mayor fluidez que el TPS y la tenden- cia durante la mezcla, fue la de rodear las partículas de almidón termoplástico, constituyéndose en la fase continua. El efecto de la viscosidad y la rapidez de corte en la morfología de mezclas binarias, ha sido estudiado por Tsuji et al. [15] quienes indicaron en su estudio, que no necesariamente el componente de mayor proporción resulta ser la fase continua. Para mezclas de almidón de sago-PCL, a proporcio- nes similares a las trabajadas en el presente estudio, Ishiaku et al. [16] encontraron, mediante imágenes tomadas por SEM, igualmente la formación de dos fases a partir de la mezcla binaria. Así mismo, los in- vestigadores indicaron que en la superficie de ruptura de una muestra previamente ensayada a tensión, se presentaron huecos o surcos que fueron evidencias de desprendimientos o arrancamientos de la fase dis- persa compuesta por el almidón. Se presentaron mor- fologías similares a las que se muestran en la Figura 5 y se planteó que con el calentamiento prolongado entre el almidón y la PCL durante el moldeo, se formó vapor de agua que a su vez generó espacios vacíos alrededor de las partículas de almidón, reduciendo la adhesión interfacial y repercutiendo en el detrimento de las propiedades mecánicas del material. Difracción de Rayos-X (DRX) En la Figura 6(a) se muestra el difractograma de rayos- X para el almidón de yuca sin plastificar. Aquí se pue- den ver los principales ángulos 2u que caracterizan los planos de difracción de la forma cristalina C, típica de los almidones procedentes de raíces como fuente botánica [17]. Así como se había establecido previamente con la técnica de FTIR, el difractograma del TPS de la Figu- ra 6(b) indicó que con el proceso de plastificación el material adquirió una estructura predominantemente amorfa, disminuyéndose notablemente la intensidad de las señales correspondientes a los planos de di- fracción, encontrados en el almidón antes del proceso de plastificación. Los vestigios de los picos encontra- dos a 22,79 y 17,7º 2u se asociaron a cristalinidad residual en el TPS, debiéndose fundamentalmente a las partículas de almidón que no se desestructuraron completamente, cuando se llevó a cabo la extrusión del material, tal y como se observó previamente por SEM en la Figura 4. Después de la plastificación del almidón apareció una nueva señal a 19,8º 2u, revelan- do que una forma diferente de cristalinidad se generó en el material. Este fenómeno se puede atribuir al re- ordenamiento que surge en las cadenas poliméricas, principalmente de amilosa, por la formación de dobles hélices que se da durante el proceso de plastificación por extrusión. Resultados similares han sido reporta- dos por Van Soest et al. [18], quienes estudiaron el proceso de retrogradación de un almidón de papa, en- contrando que esta nueva fase cristalina correspondía al tipo V H , asociado a cristales de amilosa con estruc- tura helicoidal simple. Conforme aumentó el tiempo de almacenamiento, el almidón termoplástico experimentó un incremento en la cristalinidad, tal como se puede observar en el di- fractograma correspondiente al TPS con 26 días de acondicionamiento (Fig. 6c). Se presentaron cambios estructurales por reacomodamientos de las cadenas poliméricas, originando pequeños aumentos en la in- tensidad de las señales a 22,7; 15,1 y 17,8º 2u, que a su vez implicaron el incremento en los planos de di- fracción correspondientes a la forma cristalina C del almidón sin modificar. La cristalinidad relativa del almidón sin plastificar, de- terminada mediante el método de Nara & Komiya [9] fue de 32,6%, siendo este porcentaje un poco menor al 38% reportado por Atichokudomchai et al. [19] para Cuadro 2. Cristalinidad relativa del almidón sin plastificar, el TPS y las mezclas binarias TPS-PCL. Material Cristalinidad relativa (%) Almidón sin plastificar 32,6 Policaprolactona (PCL) 49,6 TPS a 5 días de acondicionamiento 12,7 TPS a 26 días de acondicionamiento 20,2 TPS60-PCL40 a 5 días de acondicionamiento 34,2 TPS60-PCL40 a 26 días de acondicionamiento 37,8 TPS50-PCL50 a 5 días de acondicionamiento 36,7 TPS50-PCL50 a 26 días de acondicionamiento 39,7 TPS40-PCL60 a 5 días de acondicionamiento 41,7 TPS40-PCL60 a 26 días de acondicionamiento 44,2 39 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (31- 40) almidón de yuca. Vale la pena resaltar que este pará- metro depende de la variedad de la yuca y a su vez del contenido de amilosa y amilopectina, por lo tanto no necesariamente deberá de ser igual para materiales procedentes de continentes diferentes. Otros valores de cristalinidad que se encuentran reportados en la li- teratura corresponden a cristalinidad relativa de 36,1% para almidón de ñame [20] y 30,3% para almidón de maíz [21], ambos estimados igualmente por el método de Nara & Komiya [9]. Con el proceso de plastificación se presentó una dis- minución de la cristalinidad relativa desde el 32,6% para el almidón nativo, hasta un 12,7% para el TPS con 5 días de acondicionamiento (Cuadro 2). Así mis- mo, con el aumento del tiempo de almacenamiento a 26 días, se generó un incremento de la cristalinidad relativa a un valor de 20,2%, debido a que el almidón termoplástico se está retrogradando, como se había comentado previamente con el análisis por FTIR. Para la policaprolactona pura se estimó una cristalini- dad relativa del 50% mediante el empleo del método de Nara & Komiya [9], el cual fue utilizado previamente en el estudio del almidón termoplástico solo. Este valor en la cristalinidad resultó ser similar al 54% reportado por Choi et al. [22] y al 46% referenciado por Rosa et al. [23], quienes lo determinaron a partir de la aplica- ción de ensayos de calorimetría diferencial de barrido (DSC). A su vez, este valor se puede considerar alto en comparación con el TPS que presentó una cristalinidad relativa del 12%, para 5 días de acondicionamiento. Al realizar la mezcla binaria con el almidón termoplásti- co, se presentó una disminución en la cristalinidad con respecto a la policaprolactona pura. Dicho descenso fue mayor en la medida que la mezcla tenía un porcen- taje de PCL menor, pasando desde 41,7 hasta 34,2% de cristalinidad relativa, para contenidos de polica- prolactona de 40 y 60%, respectivamente. Estos da- tos se presentan en el Cuadro 2. Con el aumento en el tiempo de acondicionamiento de 5 a 26 días, se apre- ció en todas las mezclas binarias un incremento de la cristalinidad (Cuadro 2). Este aumento osciló en el 3% y fue ligeramente superior para las muestras que con- tenían una mayor cantidad de almidón termoplástico. Debido a que la PCL no presenta cambios estructurales significativos en las condiciones de almacenamiento seguidas en el estudio, las variaciones en la cristali- nidad exhibidas por las mezclas binarias se atribuyen exclusivamente a los reacomodamientos estructurales que sufre el TPS. De igual manera, vale la pena recor- dar que con FTIR no se detectaron interacciones entre el almidón termoplástico y la policaprolactona, lo cual demuestra que la incorporación de la PCL no afectó apreciablemente el comportamiento del TPS presente al interior en la mezcla binaria. CONCLUSIONES Después del proceso de plastificación del TPS se man- tuvo un pequeño porcentaje de cristalinidad residual, evidenciado por el análisis de rayos-X, FTIR y SEM. Este hecho sugiere que es posible optimizar el proceso para disminuir la cristalinidad residual. Las mezclas binarias TPS-PCL fueron predominante- mente inmiscibles, a pesar de que por la estructura química del almidón termoplástico y de la polica- prolactona se podría haber esperado la formación de enlaces de hidrógeno, que repercutieran en un incre- mento de la miscibilidad. La influencia de la incorporación de la PCL en el proceso de retrogradación de las mezclas binarias fue despre- ciable, indicando esto que las interacciones secundarias entre las fases TPS y PCL no fueron lo suficientemente significativas para incidir en los cambios estructurales, que continuaron dándose al interior del TPS. AGRADECIMIENTOS El trabajo se llevó a cabo con el soporte del Centro de Investigación Científica de Yucatán de México y la Universidad del Valle de Colombia; adicionalmente los autores expresan su agradecimiento a la empre- sa Industrias del Maíz por suministrar el almidón de yuca empleado. REFERENCIAS [1] HUANG, M., YU, J. and MA, X. 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Para disminuir los problemas provocados por el agua en los productos plásticos derivados de almidón, causados por la alta hidrofilicidad de este polímero, se han planteado di- versas estrategias tales como la modificación química del almidón, la asociación del almidón con otros polímeros menos hidrofílicos y la modificación superficial de los productos finales. En la presente revisión se presentan ejemplos de tra- bajos investigativos relacionados con cada una de las estrategias mencionadas, centrando la atención en la modificación superficial, que permite disminuir con efectividad la hidrofilicidad de los productos derivados de almidón sin afectar apreciablemente las características internas del material. ABSTRACT Starch is a renewable and cheap natural polysaccharide from that is easily to make biodegradable plastic products. However, its products have low mechanical pro- perties and tend to change its properties in the presence of water. For reduce the problems caused for water in the plastic product derived from starch, originate Recibido para evaluación: 30-04-2013. Aprobado para publicación: 31-07-2013. 1 Químico. Grupo de investigación CYTBIA. Universidad del Cauca. Correspondencia:
[email protected] 42 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (41- 48) from de high hydrophilicity of this polymer, are diverse strategies such as the chemical modification of starch, the blend of starch with minor hydro- philic polymers and the superficial modification of the final products. In the present review is presented some examples of investigations related with the mentioned strategies, focused the attention in superficial modification that allow decrease the hydrophilicity of plastic products based on starch without affect the internal characterizes of material significantly. RESUMO Amido é um polissacárido natural renovável, económica e a partir do qual os produtos são plásticos biodegradáveis . No entanto, os produtos obtidos a partir de amido e possuem baixas propriedades mecânicas tendem a alterar as suas propriedades, na presença de água. Para aliviar os pro- blemas causados pela água em produtos de plástico derivados de amido, causada pela elevada hidrofilicidade do polímero, várias estratégias têm sido propostos, tais como a modificação química do amido, a associação de amido com outros polímeros e modificação menos hidrofílico superfície dos produtos finais. Nesta revisão, apresentamos exemplos de projetos de pesquisa relacionados a cada uma das estratégias acima, com foco em modificação da superfície, o que reduz eficazmente a hidrofilicidade dos produtos amiláceos sem afectar significativamente as características internas do material. INTRODUCCIÓN A inicios del siglo veinte surgió un nuevo tipo de materiales, los polímeros sintéticos, producidos a partir de compuestos químicos derivados de fuen- tes fósiles, los cuales se fueron desarrollando lentamente hasta la segunda guerra mundial, después de la cual se expandió la industria petroquímica y se impulso la síntesis de nuevos polímeros que rápidamente se difundieron y reemplazaron a otros materiales en diversas aplicaciones, llegando a ser tal su uso que algunos han denominado a este fenómeno la era del plástico [1, 2]. Los plásticos sintéticos de origen fósil son los materiales que domi- nan en la actualidad la mayoría de aplicaciones debido a su bajo costo, baja densidad, fácil transformación y aceptables propiedades mecánicas y de barrera [3]. No obstante, a pesar de sus ventajas, estos materiales pueden provocar graves inconvenientes de contaminación para el medio ambiente cuando son empleados en aplicaciones de corto uso y rápida eliminación, tal como es el caso de los empaques para alimentos [4]. La razón principal de lo anterior es su alta persistencia en el medio ambiente, algunos de estos plásticos pueden durar muchos años sin sufrir descomposición significati- va, que ocasiona su acumulación descontrolada[5]. Como alternativa de solución a los problemas ambientales de los plásticos sintéticos ha surgido un nuevo grupo de polímeros fácilmente degradables y provenientes de fuentes naturales renovables, denominados plásticos o polímeros biodegradables [6]. Los plásticos biodegradables son materiales que mediante la acción de microorganismos o enzimas son degradados a compuestos de bajo peso molecular aprovechables por organismos pre- PALABRAS CLAVE: Polímeros Biodegradables, Modi- ficación Superficial, Absorción de Agua KEYWORDS: Biodegradable Polymers, Superfi- cial Modification, Water Absorption PALAVRAS-CHAVE: Polímeros Biodegradáveis, Modifi- cação da Superfície, Absorção da Água 43 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (41- 48) sentes en el medio ambiente[7, 8]. Estos plásticos son elaborados a partir de polímeros presentes en la naturaleza, tales como algunas proteínas y polisacári- dos, como también a partir de polímeros obtenidos a través de procesos sintéticos orgánicos, tal como po- lilactonas y polilactidos [9, 10]. Uno de los polímeros naturales de los cuales se pueden elaborar plásticos biodegradables es el almidón, el cual es un polímero renovable, económico y de fácil transformación a di- versos productos [11, 12]. Una de las principales limitaciones que poseen los plásticos derivados de almidón, es la elevada tenden- cia de estos materiales a absorber agua del ambiente, que provoca cambios en el comportamiento físico y mecánico de los productos finales, afectando su es- tabilidad en uso y en almacenamiento [13-15]. Para disminuir esta característica negativa del almidón se han planteado diversas estrategias, de las cuales se expondrán algunas de las más importantes en el pre- sente artículo. LA HIDROFILICIDAD DEL ALMIDÓN La afinidad por el agua de los plásticos biodegradables derivados de almidón se debe esencialmente a la es- tructura y naturaleza química del almidón. El almidón es un polisacárido conformado por dos po- límeros: amilosa y amilopectina. La amilosa es un po- límero principalmente lineal, con presencia de algunas ramificaciones, que consta de moléculas de glucosa unidas por enlaces glucosídicos o-D-(1-4), el número de unidades varía entre los diferentes tipos de almido- nes pero generalmente se encuentra entre 1000 unida- des de glucosa por molécula de amilosa y tiene forma de espiral (Figura 1) [16]. La abundancia de grupos hidroxilo en la amilosa le otorga propiedades hidrofílicas a este polímero, im- partiéndole afinidad por el agua, sin embargo, la ami- losa tiende a agruparse muy estrechamente en forma paralela mediante la formación de enlaces de hidróge- no entre los grupos hidroxilo adyacentes reduciendo esta afinidad [17, 18]. La amilopectina es un polímero ramificado formado por cadenas lineales constituidas por 15 a 35 moléculas de glucosa unidas por enlaces o-D-(1-4) y ramificaciones con enlaces o-D-(1-6) (Fi- gura 2). La amilopectina tiene entre 5 a 6 por ciento de enlaces o-D-(1-6) y está constituida por alrededor de 100000 moléculas de glucosa. El gran tamaño y naturaleza ramificada de la amilopectina reduce la movilidad de los polímeros e interfiere su tendencia a orientarse muy estrechamente para permitir niveles significantes de enlaces de hidrógeno[19, 20]. La afinidad por el agua de los plásticos biodegradables derivados de almidón se debe esencialmente a la natu- raleza hidrofílica del almidón, que puede ligar y retener moléculas de agua en su estructura a través de fuertes interacciones de enlaces de hidrógeno [21, 22]. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que algunos de los aditivos que se agregan para la fabricación de produc- tos plásticos derivados de almidón, también pueden presentar tendencia a ligar en su estructura agua y por tanto pueden aumentar la absorción de agua de los productos. Por ejemplo, Godbillot y su grupo de trabajo [23] analizaron la capacidad de enlazamiento de agua de películas de almidón de trigo plastificadas con diferentes concentraciones de glicerol, encon- trando un efecto directo del contenido de este plasti- ficante sobre la absorción de agua de las películas, la hidratación dependió de la cantidad del plastificante y de la humedad relativa externa. En el anterior caso, el glicerol actúa como un elemento adicional que capta agua en su estructura a través de interacciones de hi- drógeno favorecidas por los grupos hidroxilo que po- see [24]. Se considera que en el caso de aditivos, por ejemplo plastificantes, su efecto hidrofílico dependerá de la fortaleza de la interacción con el almidón, una interacción fuerte puede disminuir el número de sitios disponibles para el agua y por tanto puede contribuir con la disminución de la absorción de agua, mientras que una interacción débil puede proveer sitios adicio- nales para la adsorción de agua [14, 25]. Figura 1. Estructura de un fragmento de amilosa. O OH HO HO O OH HO O O OH HO HO O O OH HO HO O O OH HO HO O O O OH HO HO O O Figura 2. Estructura de un fragmento de amilopectina 44 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (41- 48) ESTRATEGIAS PARA DISMINUIR LA HIDROFILICIDAD DEL ALMIDÓN Para disminuir y controlar la hidrofilicidad de los plás- ticos derivados de almidón, actualmente se trabaja en tres estrategias principales: la modificación química del almidón, la asociación del almidón con otros po- límeros menos hidrofílicos y la modificación superfi- cial de los productos finales [26, 27]. La modificación química de los almidones es generalmente aplicada mediante reacciones de esterificación, eterificación, oxidación, cationización e injerto en los grupos hidro- xilo del almidón, que genera nuevos grupos funciona- les con menor hidrofilicidad [27-29]. La asociación del almidón con otros polímeros se realiza preferiblemente con polímeros biodegradables que posean un carácter menos hidrofílico y que además mejoren las propie- dades mecánicas del almidón, esta asociación puede darse mediante conformación de mezclas o mediante productos multicapa [19]; los polímeros mayormente empleados para este propósito han sido poliésteres como la policaprolactona (PCL), poliesteramida (PEA), copolímeros de polihidroxibutirato con hidroxivalera- tos (PHBV), copolímeros de polihidroxibutirato con hidroxioctanoato (PHBO), polibutilensuccinato/adipato (PBSA), copolímeros de polibutilenadipato tereftalato (PBAT), ácido poliláctico (PLA) y polihidroxiestereter (PHEE) [30-37]. La modificación superficial única- mente intenta afectar las propiedades hidrofílicas su- perficiales del producto derivado de almidón bien sea mediante modificación química o física. De estas estrategias, la modificación superficial es la más interesante, y en esta se centra la presente revi- sión, puesto que a través de ella únicamente se alteran las propiedades superficiales de los plásticos sin in- fluir apreciablemente en la composición y característi- cas internas del material [38, 39]. La modificación su- perficial de los productos derivados de almidón puede realizarse mediante dos forma principales: la reacción química entre un reactivo externo y los grupos superfi- ciales del almidón, y la deposición de una capa protec- tora sobre la superficie del producto (recubrimiento). Sobre estas dos formas de modificación superficial se profundiza a continuación. MODIFICACIÓN SUPERFICIAL POR VÍA QUÍMICA Las modificaciones de tipo químico superficial se efectúan esencialmente mediante la conversión de los grupos hidroxilo del almidón a grupos funcionales me- nos hidrofílicos, principalmente éster y éter, a través de reacción con diversos compuestos. Bengtsson y sus colaboradores [40], efectuaron la esterificación superficial de películas de almidón de papa mediante la reacción de muestras del produc- to inmersas en soluciones de cloruro de octanoilo con piridina, obteniendo disminución en la veloci- dad de transmisión de vapor y en la absorción de agua del material modificado respecto al material sin tratamiento, por ejemplo, mientras para las pelícu- las sin tratamiento químico se encontró un valor de transmisión de vapor de agua de 13,9 g/m 2 h y una absorción de agua de 63%, para películas con un grado de sustitución de 2,11 se obtuvo un valor de 7,8 g/m 2 h para la transmisión de vapor de agua y de 42% para la absorción de agua, adicionalmente se observó una disminución lineal de estos parámetros respecto al aumento del grado de sustitución de los grupos hidroxilo del almidón. Carvalho y colaborado- res [41], trataron películas de almidón de maíz con diferentes reactivos, entre ellos algunos isocianatos, copolímeros de estireno con glicidilmetacrilato y cloruro de estearoilo, determinando el grado de hi- drofilicidad de los películas mediante la medición del ángulo de contacto superficial con agua, técnica en la cual se deposita una gota del líquido de ensayo sobre la muestra y se determina el valor del ángulo formado entre la superficie y la línea tangente a la superficie curva de la gota en el punto de contacto de las fases [42], para las películas tratadas con los reactivos se obtuvo valores mayores a 80° en tanto que para la película no tratada el ángulo de contacto fue de 32°, un incremento en el ángulo de contacto de una superficie con agua está relacionado con una disminución en el grado de hidrofilicidad del material [43, 44], de tal forma que los reactivos mostraron un efecto positivo en el descenso de la afinidad super- ficial de la película por agua. Zhou y su grupo de tra- bajo [45] modificaron películas de almidón de maíz a través de esterificación superficial de los grupos hidroxilo del almidón con anhídrido succínico de do- decenilo, logrando reducción en un 22% en el conte- nido de humedad en equilibrio del producto a un 95% de humedad relativa y un aumento en un 82% en el ángulo de contacto superficial con agua. La modificación química superficial también se ha efectuado mediante la ayuda de métodos físicos. Zhou y sus colaboradores [38] irradiaron láminas de almidón de maíz con luz ultravioleta, en presencia de 45 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (41- 48) benzoato de sodio como fotosensibilizador, que indujo entrecruzamientos moleculares en la superficie de los productos, los resultados de la medición del ángulo de contacto con agua y la absorción de humedad mostra- ron una disminución significativa del carácter hidrofíli- co de la superficie de las láminas y un aumento de la resistencia del material hacia el agua, mientras la lámi- na sin tratamiento presentó un valor de 59° de ángulo de contacto, las láminas irradiadas alcanzaron valores de 95°, en tanto la absorción de humedad disminuyó un 17% para las muestras irradiadas respecto a las muestras sin tratamiento. Andrade y colaboradores [46], modificaron la superficie de películas de almi- dón de maíz mediante la deposición de una película delgada de carbono hidrogenado amorfo, obtenida por exposición del producto a un plasma de baja presión de 1-buteno, generado en un equipo de sputtering de radiofrecuencia con sistema de diodo, el tratamiento logró disminuir la absorción de agua en un 54% y el án- gulo de contacto paso de valores menores a 40° para las películas sin tratar a alcanzar valores superiores a 80°, mostrándose una reducción del carácter hidrofí- lico de las películas de almidón. Bastos y su grupo de trabajo [47], trataron películas de almidón de maíz con plasmas de bajo poder de hexafluoruro de azufre (SF 6 ), logrando la incorporación superficial de flúor y azufre que ocasionó un cambio importante en el comporta- miento hidrofílico del material, alcanzando ángulos de contacto con agua hasta de 130° que correlacionan con un material hidrofóbico. En trabajos realizados por Han y colaboradores [48], se sometieron bandejas elaboradas con almidón a plasmas de hexafluoruro de azufre con tetrafluoruro de carbono encontrándose la formación de capas superficiales enriquecidas en flúor en las bandejas, que debido a su alta hidrofobicidad presentaron ángulos de contacto con agua hasta de 150°, la absorción de agua bajo hasta un 88% y la transmisión de vapor de agua disminuyó hasta 80%, de tal forma que la capas de flúor superficiales for- madas restringieron la adhesión y el paso del agua al interior de la matriz de la muestras tratadas. MODIFICACIÓN SUPERFICIAL MEDIANTE APLICACIÓN DE RECUBRIMIENTOS Además de emplearse modificaciones químicas para cambiar las características hidrofílicas superficiales de productos plásticos de almidón, otra tendencia im- portante ha sido la incorporación de recubrimientos, preferiblemente biodegradables, sobre la superficie de los productos. Glenn y colaboradores [49], recubrie- ron con películas de aluminio (foil), alcohol polivinílico y cloruro de polivinilo, bandejas espumadas moldea- das con almidón de trigo, logrando en los productos finales valores de absorción de agua y permeancia al vapor de agua muy similar a la de bandejas elaboradas con poliestireno expandido, polímero sintético tradi- cional utilizado para estos productos. Bangyekan y su grupo [50], recubrieron películas de almidón de yuca con quitosano en diferentes concentraciones, encon- trando mejoras apreciables en las propiedades físicas de las películas, sobre todo reducción en la humecta- bilidad de los productos y disminución en su permea- bilidad al vapor de agua, la presencia de grupos acetilo hidrofóbicos en el quitosano genera una superficie menos hidrofílica en las películas. Jayasekara y sus colaboradores [51], prepararon mezclas de almidón y alcohol polivinilo de las cuales obtuvieron películas que fueron recubiertas con quitosano, los productos obtenidos presentaron valores de ángulo de contacto de 76° que respecto a las muestras sin recubrir con valores de 44°, evidenciaron productos menos hidrofí- licos. Importantes también son las investigaciones con recubrimientos formados a partir de resinas naturales, tal como el trabajo de Phan y colaboradores [52] que recubrieron películas comestibles de almidón de yuca con goma Shellac, alcanzando valores del ángulo de contacto con agua hasta 92° y una reducción de hasta veinte veces en la capacidad de absorción de agua del producto, en el caso de esta resina fue necesaria la incorporación de polietilenglicol como agente plastifi- cante para aumentar la flexibilidad del recubrimiento y evitar su fractura. CONCLUSIONES El almidón es un polímero natural que posee gran cantidad de grupos hidroxilo en su estructura que le confieren una gran hidrofilicidad, la cual se mantiene en los productos plásticos biodegradables obtenidos a partir de él. Para lograr disminuir esta tendencia ha- cia la absorción de agua y evitar los efectos negativos de este comportamiento, se han efectuado diversas investigaciones concentradas principalmente en la modificación del almidón natural mediante reacciones químicas que alteran los grupos hidroxilo, asociándolo con otros polímeros menos hidrofílicos o modificando la superficie de los productos finales para alterar por vía química los grupos hidroxilo exteriores o median- te vía física empleando sistemas de bloqueo como recubrimientos superficiales. La modificación super- ficial de los productos derivados de almidón permite 46 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (41- 48) una disminución importante de la hidrofilicidad sin afectar apreciablemente las propiedades del material, empleando tratamientos menos severos y únicamente externos al producto, que tienen la posibilidad de ser más económicos y sencillos. REFERENCIAS [1] NACEUR BELGACEM, M. and GANDINI, A. eds. Monomers, polymers and composites from re- newable resources. Oxford (United Kingdom): Elsevier Ltd, 2008, p. 1-3. [2] YOUNG, R. and LOVELL, P. Introduction to poly- mers. 3 ed. Boca Raton (USA): CRC Press, 2011, p. 3-4. [3] ROSATO, D. Plastics end use applications. New York (USA): Springer, 2011, p. 11-18. [4] GROSS, R. and KALRA, B. Biodegradable poly- mers for the environment. Science, 297 (5582), 2002, p. 803-807. [5] SATYANARAYANA, K. G., ARIZAGA, G. and WYPYCH, F. 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Debido a su sensibilidad al agua y baja resistencia mecánica para contener alimen- tos de humedad intermedia; se reformuló la matriz biopolimérica para mejorar ambos parámetros.La película derivada de la reformulación fue caracterizada mecánicamente (ASTM D1708), se midió el “swelling” y se observó mediante microscopía electrónica de barrido.El desempeño de la película fue evaluado envasando un alimento perecedero: un queso semimadurado,sometiéndolo a almacenamiento refrigerado durante 2 meses. Control: se emplearon queso del mismo lote envasado al vacío en película alta barrera. Durante los estudios de estabilidad en anaquel se evaluaron parámetros críticos microbiológicos como fisicoquímicos para el alimento envasado.Se observó que si bien las películas activas controlaron la carga microbiana, la integridad del envase se vio alterada Recibido para evaluación: 18-04-13 Aprobado para publicación: 18-09-13. 1 Dra. Cecilia Rojas de Gante. Departamentode Ingeniería en Biotecnología. Tecnológico de Monterrey, Campus Ciudad de México. 2 M.C. Grissel Trujillo. Escuela de Biotecnología y Alimentos. Tecnológico de Monterrey. 3 M.C. Carlos P. Saénz. Escuela de Biotecnología y Alimentos. Tecnológico de Monterrey. 4 M.C. Andrea Valderrama. Escuela de Biotecnología y Alimentos. Tecnológico de Monterrey. Correspondencia:
[email protected] 50 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (49- 58) debido a absorción de agua por contacto con el alimento, observándose ruptura de la estructura e integridad del biopolímeroy en consecuencia, exposición del producto y término de su vida útil. ABSTRACT Patent application PCT/MX2009/000092 describes a method to obtain bio- films from cereals flours through casting and their use as antimicrobial pads and thermo-sealable packages for dry food products. Because of its sensitivity to water and low mechanical resistance to contain products with intermediate moisture, the biopolymeric matrix was reformulated to impro- ve both parameters. The film obtained from the reformulation was studied by measuring tensile resistance (ASTM D1708), the swelling and were ob- served my scanning electron microscopy. The performance of the bio film was studied by packaging one perishable food (cheese) and subjecting it to a two months storage period. As a control, product of the same batch was vacuum packaged using a high barrier film. Microbiological and phy- sicochemical parameters were evaluated for the cheese as critical factors during the stability study. The active films controlled the microbial load but package integrity was altered due to water absorption from the products, which led to the rupture of the structure of the biopolymer film and conse- quently the exposure of the product and ending of its shelf life. RESUMO A patente PCT/MX2009/000092 descreve um método para a obtenção de biofilmes de farinha de cereais utilizando o método de “casting” e a sua utilização como almofadas antimicrobianas e termo-selável embalagens para alimentos secos.Devido à sua sensibilidade à água e baixa resistência mecânica para conter alimentos com humidade intermédia, a matriz de biopolímeros foi reformulado para melhorar os parâmetros. O filme obtido a partir da reformulação foi estudado através da medição da resistência à tensão (ASTM D1708) e o “swelling”. O desempenho do biofilme foi estudado por uma embalagem de um alimento perecível (queijo) e se su- jeitado a um período de armazenamento de dois meses. Como controlo, os produtos do mesmo lote foram embalados a vácuo utilizando um filme de alta barreira. Parâmetros físico-químicos e microbiológicos foram ava- liados para o queijo como fatores críticos durante o estudo de estabilidade. Os filmes ativos controlados a carga microbiana, não eram uma barreira de água adequada, o que provocou a perda de água do produto e a deterio- ração de certos parâmetros de qualidade do produto. INTRODUCCIÓN En la industria de envasado de alimentos por un lado, los polímeros plásti- cos han traído grandes beneficios en su conservación, manejo y distribu- ción de los alimentos. Los polímeros termoplásticos comerciales utilizados comúnmente son hidrofóbicos y biológicamente casi inertes, lo que los ha hecho esenciales en su venta. Esto es una gran ventaja desde el punto de PALABRAS CLAVE: Biomateriales, Cereales, Harina, Vida útil KEYWORDS: Biomaterials, Cereals, Flour, Shelf life PALAVRAS CHAVE: Biomateriais, Cereais, Farinha, Vida da prateleira 51 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (49- 58) vista conservación del alimento, pero la problemática ambiental actual exige disminuir los residuos genera- dos o que su confinamiento se vea reducido y en par- ticular, que los materiales con los que están fabricados puedan biodegradarse. Esta misma industria enfrenta un problema de dependencia tecnológica por falta de alternativas en materia de envases y particularmente, en la tecnología de envasado al vacío. Se puede aseve- rar que la totalidad de los derivados tanto de productos lácteos como cárnicos, en particular, quesos frescos, madurados y productos embutidos son dependientes de la tecnología del envasado al vacío. Adicionalmente, el envasado de alimentos se ha defini- do como una barrera pasiva que retarda los efectos ad- versos del ambiente sobre el alimento almacenado. Sin embargo, las tendencias actuales involucran el desa- rrollo de materiales de envasado que interactúen con el ambiente y con el alimento, jugando un papel activo en la conservación. Estos nuevos sistemas de envasado para alimentos han sido desarrollados como respuestas a las tendencias y exigencias de los consumidores en cuanto a conservación de frescura, apariencia, sabor, vida útil, entre otros.Todos estos factores se presentan como un reto para la industria del envase que fija sus esfuerzos en desarrollar nuevos conceptos que extien- dan la vida útil al mismo tiempo que garanticen la segu- ridad y la calidad del alimento envasado. De esta forma, el envasado activo se ha definido, como una técnica que pretende algún tipo de interacción favorable entre el envase y el producto, con objeto de mejorar su calidad, aceptabilidad y aumentar su tiempo de vida. Se puede decir que un envasado es activo cuando, además de ser una barrera entre el alimento y el exterior, ayuda de algu- na otra forma a conservar el producto. La novedad que conlleva esta nueva técnica es que su finalidad no va a consistir en disminuir el grado de deterioro dentro del envase, sino efectuar un cambio positivo en el alimento envasado. Ello incluye tanto aspectos de calidad como de seguridad alimentaria. La inclusión de aditivos antimicrobianos de amplio es- pectro en polímeros plásticos y/o en biopolímeros me- diante la tecnología propia generada en el Tecnológico de Monterrey logró por ejemplo, se obtuvieran a escala laboratorio envases activos que redujeron los riesgos biológicos por envasado manual o semimanual(riesgos de contaminación con patógenos como Listeria mono- cytogenes, E. coliO157:H7)[1,2]. Por otro lado, existe gran interés en el desarrollo e investigación de biopo- límeros obtenidos a partir de fuentes agrícolas. Las matrices más comúnmente empleadas para obtener este tipo de biopolímeros son almidón, proteínas y otros polisacáridos. Algunos ejemplos son: zeína de maíz, gluten y gliadina de trigo, proteínas de soya, kafirina de sorgo, mucílagos de nopal y distintos tipos de almidón (maíz, papa, plátano, tapioca, chícharo, almidón ceroso, de alto contenido de amilosa, entre otros) [3, 4, 5, 6]. Dos biopolímeros presentes en el maíz con capacidad filmogénica son el almidón y la zeína, siendo el primero el más abundante en este grano. Existe una cantidad im- portante de reportes publicados sobre películas a partir de almidón de maíz y zeína; se han evaluado el efecto de distintos aditivos, co-polímeros y procesos sobre el desempeño de las películas para distintas aplicaciones. Gran parte de las investigaciones se dirigen a aplica- ciones como coberturas o envases para alimentos (incluyendo envases activos), sin embargo también existe interés por emplear estos materiales en inge- niería tisular o como dispositivos de liberación de fármacos [7, 8, 9, 10]. En el 2009 México produjo 29,4 millones de tonela- das de maíz utilizando un 38,5% de su superficie total cultivada. La producción de este grano ha mostrado un aumento de su tasa media anual de crecimiento de 2,1% en el periodo de 1994 a 2008. De la producción total de maíz en el 2008, 92% fue maíz blanco, 7% maíz azul y 1% de otras variedades. Básicamente, el maíz blanco se destina a consumo nacional, el amari- llo a exportación y el resto de las variedades común- mente se producen para autoconsumo de poblaciones rurales. Entre el 1% de las variedades no definidas, se encuentra el maíz azul (Zea mays Amylacea) [11, 12]. El maíz azul (Zea mays Amylacea) es un tipo de maíz rico en antocianinas (responsables de su pigmenta- ción) y de endospermo harinoso. Se cultiva en zonas de clima seco y demanda mínimos cuidados. A pesar de su potencial nutracéutico, el maíz azul es única- mente producido por comunidades rurales para auto- consumo debido a su devaluado valor comercial, pues las zonas urbanizadas consumen principalmente pro- ductos de maíz blanco y amarillo. Entre los escasos usos actuales del maíz azul, se encuentra la extracción de antocianinas para emplearlas como colorantes ali- menticios naturales y antioxidantes [13]. Entre los procesos estudiados para obtener películas a partir de fracciones del maíz están el casting, distin- tos tipos de extrusión (de tornillo doble/dado plano, tornillo simple/dado plano, extrusión/calandrado, en- 52 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (49- 58) tre otros), estiramiento de resinas de zeína y prensa- do por calor [3, 14, 15, 16]. Los efectos de diversos aditivos y tratamientos químicos, por ejemplo agentes plastificantes, hidrofóbicos, co-polímeros y uso de al- midones químicamente modificados sobre las carac- terísticas estructurales, moleculares, térmicas y des- empeño mecánicos y de barrera, han sido estudiados ampliamente [8, 10, 16, 17, 18, 19, 20]. En el caso del sorgo, el cultivo de este cereal es me- nos demandante en términos agronómicos que el maíz (agua y nutrientes) [21, 22]. El sorgo es el quinto grano más importante en el mun- do, siendo Estados Unidos el país con mayor produc- ción en el mundo, seguido de la India y Nigeria. Para el año 2010 México contribuyó con el 10,5% de la pro- ducción total mundial, equivalente a 6.250 miles de toneladas métricas [21, 22]. En México, el sorgo es el segundo grano más importan- te en producción después del maíz, durante el periodo 1996-2006, la producción de sorgo contribuyó con un 22% de la producción total de cereales [23].En México, este cereal se destina principalmente para alimento de ganado y secundariamente para alimentación humana y obtención de insumos como almidón, alcohol, glu- cosa, acetona y butanol. Una de las grandes ventajas del sorgo es que presenta la capacidad de adaptarse a condiciones climáticas áridas y semiáridas cálidas y ser resistente a la sequía durante períodos largos [21]. En trabajos previos, Schausse y Rojas [1], lograron demostrar que a partir de harina de sorgo se pueden obtener películas activas antimicrobianas. Los biopolímeros obtenidos por esta vía mediante una técnica y proceso patentado por el Tecnológico de Monterrey como PCT [24] tienen la ventaja de ser biodegradables debido a que su estructura química es primordialmente a base de proteínas y almidones. Adi- cionalmente, cuentan con la posibilidad de formar pelí- culas con plasticidad (flexibilidad a la medida) y de ser formuladas también a la medida de los requerimientos del producto a envasar. Adicionalmente, de ser capaces de termosellarse para formar bolsas de diferentes di- mensiones o de no sellarse y actuar como almohadillas o pads“activas” en combinación con otros envases. Además de las ventajas en términos de sustentabili- dad, el interés por emplear estas fuentes para producir biopolímeros reside en añadir a los productos agríco- las un valor agregado[1, 25]. Es importante hacer notar que para cualquier aplicación de dicha tecnología se requerirá realizar una adecuación de las formulaciones y del proceso para satisfacer los requerimientos específicos de protección para cada ali- mento a envasar. Por lo que se plantea demostrar en este trabajo que los envases tipo película obtenidos mediante adecuación de las formulaciones y proceso de dicha patente publicada, funcionan para conservaren refrigeración durante 30 a 45 días una presentación co- mercial en rebanadas de queso semimadurado. MÉTODO En estudios preliminares, se estudiaron dos tipos de cereales como fuentes de biopolímeros (almidón y proteínas) para elaborar envases flexibles tipo película y envasar un alimento de humedad intermedia (que- so semimadurado): sorgo blanco (Sorghum bicolor Moench)y maíz azul (Zea mays Amylacea).Así mismo, se estudiaron 2 diferentes agentes plastificantes: glice- rol, y polietilenglicol, y otros aditivos, como el aceite de coco, glutaraldehído como reticulante y la carragenina como agente cohesivo de la matriz polimérica base aplicando el proceso tanto de obtención de la harina como el proceso de colada descrito en la patente PCT/ MX2009/000092[24] para obtener películas flexibles. El sorgo blanco empleado se obtuvo del campo ex- perimental de la Universidad de Texas A&My el maíz azul fue proporcionado por la Unión de Productores de maíz de Atlacomulco, México. En una primera etapa del estudio se reformularon las harinas obtenidas para encontrar los agentes plasti- ficantes y de textura que lograran conferir a la matriz de las películas una mayor resistencia a la tensión y elongación y, que disminuyeran su capacidad de absorción de agua. Como agentes antimicrobianos se emplearon nisinay natamicina a una concentra- ción de 106 ppm y 154 ppm respectivamente para obtener las películas activas. Adicionalmente siguiendo las normas nacionales de métodos de prueba (NOM y NMx) fue caracterizada bromatológicamente la harina de maíz azul de malla 150 mesh empleada en la fabricación de las películas seleccionadas para el envasado del queso. La película que mostró mejores características se analizó de acuerdo a la norma ASTM D1708[26] (de microtensión) empleando una máquina de ensayo uni- 53 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (49- 58) versal (TensileT2020–AlphaTecnologies, USA) y un micrómetro digital marca Mitutoyo. El % de “swelling” se calculó por triplicado de acuerdo a la Ecuación 1. La película se pesó (peso inicial) se sumergió en agua bidestilada durante 10 minutos y se registró el peso (peso final). (Ec.1) Se realizó una observación de la microestructura de la fractura transversal de película mediante microscopía electrónica de barrido (SEM por sus siglas en inglés) empleando un microscopio FEI Quanta 200 FEG. La película fue fracturada empleando nitrógeno líquido y metalizada con oro-paladio empleando el equipo Bal- tec MED 020 Coating System. Estudio de envasado de queso y comportamiento en almacenamiento refrigerado Esta parte del estudio, se enfocó a estudiar el desem- peño y aplicabilidad de las películas seleccionadas y fabricadas, empleándolas como envases biopolimé- ricos activos (antimicrobianos) mediante pruebas de envasado y almacenamiento de queso. Se seleccionó un queso semimadurado (contenido de humedad de 42% y Aw intermedia 0,8), obtenido de un productor nacional de alimentos, quien proporcionó la cantidad suficiente proveniente de un sólo lote. El envasado se llevó a cabo en sala blanca de planta piloto de la compañía de alimentos y se envasaron en cada envase, 200g de producto previamente rebanado. Las rebanadas fueron de 3 mm de espesor con di- mensiones de 13X7 cm y un peso aprox. 25,2g por rebanada. Se colocaron dos (2) hileras con 4 rebana- das empalmadas cada una (con una separación entre ellas de 1cm) en cada envase, fueron selladas en una termoselladora de cabina marca Multivac a una tem- peratura 6°C y con vacío. Las muestras fueron trasladadas al laboratorio del Tecnológico en Monterrey, se almacenaron en refrige- ración a 4°C por espacio de 60 días. Como control, se envasaron al vacío 200g del producto, empleando un envase plástico coextruído de alta barrera. Para determinar el tiempo máximo de estabilidad en ana- quel refrigerado, se tomaron muestras por triplicado cada 7 días y se realizaron análisis microbiológicos (cuenta total, presencia de hongos y levaduras y desa- rrollo de bacterias ácido lácticas) al queso y pruebas fisicoquímicas: % humedad por método gravimétrico, color(L*,a*,b*) CIELAB usando un colorímetro marca Minolta, prueba de fundido entre las presentadas en este trabajo. El estudio se realizó mediante un diseño experimental estadístico, para comparar la estabilidad obtenida en ambos envases (envase biopolimérico activo versus el envase al vacío actual) para cada pro- ducto estudiado. RESULTADOS La aplicación de la PCT/MX2009/000092[24] tanto para obtener harina, la formulación así como el proce- so de obtención de películas activas empleando sorgo blanco ceroso y maíz azul mediante el proceso de co- lada arrojó los siguientes resultados. La caracterización bromatológica de la harina malla 150demostró la riqueza biopolimérica del maíz azul, la cual contenía 6,77% de proteínas, 84,61% de carbo- hidratos además de 6,29% de grasa, 0,51% de fibra cruda y 10,78% de humedad, (Cuadro 1). Lo anterior confirma como en trabajos anteriores [1, 27]que los cereales como el sorgo y el maíz son una valiosa fuente de biopolímeros con capacidad filmogénica, en parti- cular de proteínas y de almidones. El principal reto para la fabricación de películas por el proceso de casting usando una fuente que contiene ambos biopolímeros, es la estrategia de solubilización de la principal y más abundante prolamina en dichos cereales (zeína en maíz y kafirina en sorgo), la cual le puede conferir mayor estabilidad frente al agua. La del maíz, la zeína la cual juega un papel importante en las propiedades mecáni- cas y de absorción de agua de la película [28, 29]. En base a los resultados de resistencia a la tensión y absorción de agua que presentaron las diferentes for- mulaciones estudiadas a partir de harina de sorgo y maíz azul (datos no mostrados en este documento), se seleccionaron las películas a base harina de maíz azul plastificadas con glicerol y reforzadas con carragenina debido a que, sin envasar,mostraron mayor resistencia a ambos parámetros. La formulación con lasque se lograron obtener el me- jor desempeño de resistencia a la tensión y menor capacidad de absorción de agua fue la siguiente, po- límero base: harina maíz azul malla 150; aditivos: Gli- cerol 10% (p/p) Carragenina, 31,6% (p/p), nisina 106 ppm y natamicina 154 ppm (antimicrobianos) todos adicionados tomando como base la cantidad de harina 54 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (49- 58) empleada (3%). Los disolventes usados fueron etanol al 70% y agua bidestilada. La temperatura y tiempo de secado de las películas fue de 85°C y 12 horas respectivamente. La película activa de maíz azul formulada con carrage- nina y glicerol presentó una fuerza máxima a la tensión de 2,84±0,03 MPa y una elongación a la ruptura de 0,35±0,02 mm/mm. La Figura 1 muestra el compor- tamiento esfuerzo deformación que presentó la pelícu- la de maíz azul y tabla de resultados correspondiente. La capacidad de absorción de agua de la película fue de 104,2 ± 5,4%. La Figura 2 muestra las micrografías de las películas de maíz azul obtenidas por SEM. Las imágenes se muestran libres de gránulos de almidón casi en su totalidad, indicando que la gelatinización fue comple- tada durante el proceso de elaboración de la solución filmogénica. Sin embargo, pueden apreciarse zonas segregadas de carragenina no incorporada en su tota- lidad con la matriz biopolimérica de la harina. La micro estructura no se observa homogénea ni continua en su Cuadro 1. Caracterización bromatológica de harina de maíz azul malla 150 Parámetro Método Resulta- do %b.s. Resultado% b.h. Humedad NOM-116- SSA1-1994 N.A. 10,78 Cenizas NMX-F-066- S-1978 1,82 1,62 Proteínas NMX-F-068- S-1980 6,77 6,04 Grasas NMX-Y-332- SCFI-2002 6,29 5,61 Fibra cruda NMX-Y-094- SCFI-2001 0,51 0,46 Carbohidra- tos Diferencial 84,61 75,49 Valores representan las medias de tres (3) repeticiones independientes Figura 1. Comportamiento esfuerzo deformación de película de maíz azul 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 00 .1 0.20 .3 0.4 E s f u e r z o ( M P a ) Deformación (mm/mm) Valores representan las medias de tres (3) repeticiones independientes Figura 2. Micrografías SEM de películas de maíz azul totalidad, lo cual podría deberse a la inmiscibilidad de algunos componentes de la formulación o de la propia matriz biopolimérica. 55 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (49- 58) Esta película se empleó en el envasado de queso se- mimadurado. Si bien el comportamiento mecánico sin envasar de las películas de maíz azul, mostraron las mejores pro- piedades de resistencia a la tensión y elongación, así como la menor capacidad de absorción de agua antes del envasado; durante su desempeño con el alimento éstas solamente resistieron mecánicamente el enva- sado industrial y traslado a laboratorio pero durante el almacenamiento refrigerado absorbieron agua del alimento en un período entre 24 a 48 horas máximo. Lo anterior, trajo como consecuencia la ruptura de la matriz del envase biopolimérico en los lugares de plie- gue de la matriz, en parte al daño provocado al aplicar vacío y principalmente a la absorción de agua del pro- ducto; lo cual no permitió continuar con el estudio de almacenamiento de este producto. Las flechas horizontales indican la presencia de grá- nulos de almidón; la flecha vertical señala una zona segregada de carragenina. A la semana de estudio, algunos envases presentaron ruptura en las partes de pliegues formados durante el envasado al vacío, lo cual se adjudica principalmen- te a la falta de cohesividad de la estructura almidón- proteína acelerada por la inclusión de agua en la matriz biopolimérica proveniente del alimento. Ciertos au- tores han demostrado mediante análisis por micros- copía electrónica la falta de cohesividad de la matriz polimérica entre almidón y proteínas principalmente (existencia de poros). Algunos investigadores se han interesado en desarrollar compositos almidón-zeína basados en la hipótesis de que la zeína, gracias a su carácter hidrofóbico, debiese otorgar al composito mayor estabilidad frente al agua. A pesar de que la zeína se percibía como un co-polímero favorecedor para compositos con almidón, se ha obser- vado que éstos materiales (compositos almidón-zeína) presentan incompatibilidad de fases, lo cual comprome- te negativamente su desempeño [4, 28, 29, 30]. En el caso del queso semimadurado, los envases bio- polimericos activos se mantuvieron herméticos a lo largo de todo el estudio (no ruptura visual del envase ni del termosello).Los envases permanecieron intactos durante todo el periodo de las pruebas (60 días). Los resultados de estabilidad en anaquel refrigerado del queso en lo que se refiere a la capacidad de control que ejercieron los antimicrobianos empleados en este estudio (nisina y natamicina) a través del envase bio- polimérico activo frente a hongos y levaduras fue eficaz a lo largo de todo el almacenamiento comparado con el envasado al vacío (control). Los resultados de las cinéticas microbianas a lo largo del almacenamiento refrigerado para la cuenta hongos y levaduras(Figuras 3) mostraron la efectividad del envasado activo. El de- sarrollo de hongos y levaduras se mantuvo controlado, mostrando la efectividad de esta tecnología emergente de conservación de alimentos. A pesar que los envases permanecieron intactos du- rante todo el periodo de las pruebas (60 días), los en- vases no mostraron barrera a la humedad (Figura 4). En ella se puede constatar que a la primera semana, el queso ha perdido hasta el 50% de agua comparado Figura 3. Evolución de hongos (a) y levaduras (b) de queso envasado Barras negras: control; barras bicolor: muestra. *No se observócrecimiento. 56 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (49- 58) con el queso en envase control. Al perder humedad el producto, se incrementó notablemente su dureza (fuerza de cizallamiento) tal y como lo muestran los resultados obtenidos en la Figura 5 respecto al control. Con ello, se aumentó la fuerza necesaria para el corte y se disminuyó la capacidad de fundido del queso (re- sultados no mostrados). La transferencia de agua a través de las paredes del envase impactó otros parámetros de calidad parti- cularmente en cambios de color L*,a*,b* del queso envasado con respecto al control envasado al vacío (Figura 6). Uno de los mayores retos en la obtención de bioma- teriales a partir de fuentes naturales, particularmente de almidón, es mejorar sus propiedades mecánicas, de barrera y estabilidad en el tiempo, pues su natura- leza hidrofílica conduce a un bajo desempeño de estas propiedades [30]. Aunado a esto, los plastificantes (por ejemplo: glicerol, sorbitol y polietilenglicol) que se emplean para lograr una película flexible, elástica y cohesiva, generalmente disminuyen las propiedades de barrera a gases y vapor de agua del material debido a que inducen a una mayor tensión intramolecular en el polímero incrementando los poros moleculares por donde difundirá más fácilmente el permeante. Otra explicación a los resultados encontrados de bajo desempeño mecánico es debida a la incompatibilidad entre el almidón y las prolaminas y que en trabajos re- cientes ha sido demostrado al desarrollar compositos almidón-zeína basados en la hipótesis de que la zeína, gracias a su carácter hidrofóbico, debiese otorgar al composito mayor estabilidad frente al agua. A pesar de Figura 4. Evolución contenido humedad en queso Barras negras: control; barras bicolor: muestra. Figura 6. Evolución de los parámetros de color L*a*b* en queso Barras negras: control; barras bicolor: muestra Figura 5. Evolución de fuerza de cizallamiento en queso Barras negras: control; barras bicolor: muestra 57 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (49- 58) que la zeína se percibía como un co-polímero favore- cedor para compositos con almidón, se ha observado que éstos materiales presentan incompatibilidad de fases, lo cual compromete negativamente su desem- peño [4, 28, 29, 30]. Finalmente, si bien el empleo de harina de cereales eli- mina pasos en la obtención de ambos biopolímeros (almidón y proteínas con capacidad filmogénica) por el otro presenta retos en el método de obtención de biopelículas por casting debido a que presenta limita- ciones que interfieren con su escalamiento industrial, tales como tiempos prolongados del proceso, uso de solventes y sistemas deficientes de secado [6, 17, 18, 31, 32]. CONCLUSIONES Se lograron obtener formulaciones de películas con mejor desempeño mecánico y menor capacidad de absorción de agua de ambas harinas, sorgo blanco ceroso y maíz azul. El mejor desempeño lo presenta- ron las películas formuladas usando la harina de maíz azul, carragenina y glicerol como aditivos. Los resultados de las pruebas de envasado y alma- cenamiento del alimento con contenido de humedad intermedia,mostraron el desempeño real de los en- vases biopolimericos estudiados, los cuales por un lado, tuvieron un excelente desempeño en cuanto a su acción activa antimicrobiana mostrando los bene- ficios de esta tecnología emergente de conservación pero desafortunadamente por el otro, su desempeño mecánico fue muy bajo así como el efecto sobre la protección hacia parámetros físicoquímicos inheren- tes y críticos de la calidad del producto, como son, humedad, color, textura del alimento (fuerza de cizalla- miento en caso del queso estudiado) y que sufrieron fuertes cambios por efecto de pérdida de agua a través del envase. AGRADECIMIENTOS Agradecemos el apoyo al Centro de Biotecnología FEM- SA, al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CO- NACYT) por el financiamiento al programa de posgrado en el Tecnológico de Monterrey (CVUs: 256730,269263 y 256822), Campus Monterrey, Cátedras de investiga- ción del Tecnológico de Monterrey: Nutracéuticos y Nu- trigenómica y Qualtia Alimentos SA de CV. REFERENCIAS [1] SCHAUSE, A. and ROJAS DE GANTE, C. Active edible films from sorghum starch and flour with ni- sin. In Worldpak 2002. Improving the Quality of Life through Packaging Innovation. Proceedings of the 13th IAPRI Conference on Packaging. East Lansing (USA): Volume I, Book 2, 2002, p. 819-825. [2] VALDERRAMA-SOLANO, A.C. and ROJAS DE GANTE, C. Two different processes to obtain anti- microbial packaging containing natural oils. Food Bioprocess Technol., 5, 2012, p. 2522-2528. [3] WANG, Y.and PADUA, G.W. Tensile properties of extruded zeinsheets and extrusion blown films. Ma- cromol. Mater. 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Por otra parte la mayoría de películas conservaron sus aspectos de color presentando valores de L entre 83,92 y 87,89 y los parámetro a* y b* estuvieron cercanos a 0, dando como resultado películas con una ligera tendencia al color amarillo. Con respecto al brillo los valores oscilaron entre 16,06 y 21,98 GU durante el envejecimiento. Este estudio encontró que el envejecimiento influye significativamente en las propiedades óp- ticas y la PVA. Recibido para evaluación: 16-04-2013. Aprobado para publicación: 04-09-2013 . 1 Ingeniero Agroindustrial. Centro Regional de Productividad e Innovación del Cauca CREPIC. diego_
[email protected] 2 Ingeniero Agroindustrial. Ph D. Ingeniería de Alimentos. Docente Facultad de Ciencias Agropecuarias. Departamento de Agroindustria. Universidad del Cauca, Popayán.
[email protected] Corresponencia:
[email protected] 60 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (59- 68) ABSTRACT In this work it was studied the optical properties and water vapor permea- bility (WVP) in biodegradable films made from two thermoplastic cassava starch varieties native and hydrolyzed, polylactic acid and polycaprolacto- ne. The films were obtained by extrusion process, and their properties were rated for 1, 8, 60 and 120 days. The PVA for 120 days was between 2, 18 x 10-11 and 9, 12 x 10-11 g / Pa * s * m. Almost all the films retained their color issues with values of between 83,92 and 87,89 L, the parameter a * and b * were close to 0, resulting films with a slight tendency to yellow. The gloss values varied between 16,06 and 21,98 GU during the aging. This study found that aging affected significantly the optical properties and the WVP. RESUMO Neste trabalho estudaram-se as propriedades ópticas e a permeabilidade de vapor de água (PVA) nos filmes biodegradáveis feitos de duas variedades de amido termoplástico de mandioca nativa e hidrolisado, ácido poliláctico e policaprolactona. Os filmes foram obtidos mediante o processo de ex- trusão, a este se avaliaron as propriedades mencionadas anteriormente du- rante 1, 8, 60 e 120 dias. A PVA durante 120 dias, esteve entre 2,18 x 10-11 e 9,12 x 10-11 g / Pa * s * m. Além disso a maioria dos filmes mantivemos seus aspectos de cor com valores de L entre 83,92 e 87,89 e os parâme- tros a* e b* foram perto de 0 resultando filmes com uma ligeira tendência a cor amarelo. Com respeito ao brilho, estes oscilarem entre 16,06 y 21,98 GU durante o envelhecimento. Este estudo concluiu que o envelhecimento influencia significativamente as propriedades ópticas e o PVA. INTRODUCCIÓN Los plásticos convencionales producidos a partir de derivados del petróleo consumen recursos finitos y no renovables, contribuyendo a la problemática global de distribución de residuos en el medio ambiente [1], por tal razón el uso de materiales amigables al medio ambiente permitirá en un futuro próximo disminuir el impacto ambiental generado por los desechos de los polímeros sintéticos, en este sentido la utilización de materias primas re- novables es una alternativa en el desarrollo de bioplásticos [2]. Una fuente renovable de materia prima es el almidón, el cual proviene principalmente de los cereales, las raíces y tubérculos. El almidón es sometido a modifi- caciones entre las que se encuentran reacciones de descomposición como hidrólisis [3]. Dichas modificaciones son necesarias debido a que son una alternativa importante para producir polímeros, alterando de manera positiva las propiedades de los biopolímeros producidos por almidones nativos [4]. El almidón es un biopolímero que proviene de fuentes renovables, para ob- tener el almidón termoplástico (TPS) el almidón se mezcla con un plasti- ficante [5], en donde la cantidad de plastificante y la fuente botánica de almidón influyen en las propiedades de barrera de las películas [6 y 7]. La mezcla se realiza por medio de un proceso mecánico de extrusión [8]. En PALABRAS CLAVES: Envejecimiento, Extrusión, Biode- gradables. KEY WORD: Aging, Extrusion, Biodegradable. PALAVRAS-CHAVE: Envelhecimento, Extrusão, Biode- gradável. 61 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (59- 68) el TPS la migración del plastificante al ambiente au- menta la fragilidad del material, generando problemas de estabilidad estructural incrementándose con el en- vejecimiento debido a la disminución del volumen libre y la retrogradación del almidón [9], además los TPS son hidrofílicos, presentando propiedades mecánicas y de barrera inferiores a los termoplásticos de origen fósil [10]. Por tal razón para superar estas debilidades y mantener la biodegradabilidad, una alternativa es mezclar el TPS con otro polímero biodegradable [11]; como el ácido poliláctico (PLA), esta mezcla es una de las más prometedoras ya que el TPS es un biopolí- mero abundante y económico, y el PLA además de ser biodegradable aumenta las propiedades de barrera a la película [12], dando como resultado final un bioplás- tico con una baja absorción de agua [11]. Otro bio- polímero utilizado para mezclar con el TPS mejorando las propiedades de la película es la policaprolactona (PCL) [13], la cual es un polímero alifático miscible con una gran variedad de polímeros [14]. Por otra par- te las propiedades ópticas como brillo y color son fac- tores estéticos que mejoran el aspecto general de un producto, así como la aceptación del consumidor [15] sobre todo al tener un impacto directo en la apariencia del producto cubierto [16]. Esto hay que considerarlo en la producción de películas debido a que el conteni- do de almidón en la película influye en las propiedades ópticas [17]. El propósito de este trabajo fue desarrollar y estudiar el envejecimiento de películas compuestas de TPS, PLA y PCL las cuales se sometieron a un envejecimiento por 1, 8, 60 y 120 días, evaluando la permeabilidad al vapor de agua (PVA) y propiedades ópticas como brillo y color. MÉTODO Obtención de la película biodegradable Este proceso se realizó por medio de un extrusor de tornillo simple (Thermo Scientific, Haake Polylab OS) provisto con un barril de un diámetro de 19 mm, un tornillo con una relación de compresión 5:1 y relación L/D de 25. Para la obtención de las películas se nece- sitó de los siguientes procesos: Elaboración del almidón termoplástico (TPS). Se pro- cesaron dos variedades de almidón de yuca (CUMBRE 3 y SM 1498-4). Se mezcló 75% de almidón y 25 % de glicerol, se dejó en reposo durante 24 horas. Una vez acondicionado el material este fue termoplastificado mediante el uso de un dado de cordón y una boquilla con 1 mm de diámetro en su abertura. Las condicio- nes de temperatura y velocidad de tornillo fueron en promedio de 103,3 °C y 50 rpm. El cordón de TPS se llevó a secado a 45 °C durante 24 horas y se peletizó. El mismo proceso se utilizó con almidón hidrolizado de las mismas variedades con una dextrosa equivalente (DE) de 10. Para identificar los cuatro TPS se utilizó la simbología presentada en el Cuadro 1: Elaboración de la mezcla binaria (MB). Se realizó de la siguiente manera: relación 70/30 de PLA/PCL, 2% de anhídrido maléico con respecto al peso de PLA/PCL, perfil de temperatura promedio de 152, 5 °C, velocidad de tornillo de 30 rpm, un dado de cordón y una boqui- lla con 1 mm de diámetro en su abertura. Producción de la película flexible a partir de una mez- cla ternaria (TPS + MB). Se realizó una mezcla entre el TPS y la MB con composiciones que se aprecian en el Cuadro 2; en donde previamente se ajustó la tempe- ratura a cada mezcla ternaria, estas fueron extruidas mediante las siguientes condiciones de proceso: dado de soplado con una abertura de 70 µm, una velocidad de tornillo de 30 rpm y un conjunto de rodillos. Evaluación de la permeabilidad de vapor de agua y propiedades ópticas durante el envejecimiento Las películas se almacenaron en una cámara ambien- tal (BINDER) a 23 °C y 50 % HR, y se evaluaron la per- meabilidad de vapor de agua y las propiedades ópticas a 1, 8, 60 y 120 días. Permeabilidad de vapor de agua (PVA). Se seleccionó el método desecante según norma ASTM-96 [18]. En una cápsula de vidrio se agregó sílica gel (0 % HR), se cubrió con los films, posteriormente esta cápsula fue ingresada en un desecador (50 % HR) a una tempera- tura controlada de 23 °C. Las cápsulas se pesaron en una balanza analítica RADWAG XA 110/X. Se registró el peso cada hora obteniendo una correlación mayor a Cuadro 1. Simbología para la representación de almidón termoplástico Variedad de almidón de yuca Simbología TPS SM 1498-4 nativo TPSN1 SM 1498-4 hidrolizado TPSH2 CUMBRE 3 nativo TPSN3 CUMBRE 3 hidrolizado TPSH4 62 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (59- 68) 0,95, igualmente cada hora se determinó el porcentaje de humedad y la temperatura. A partir de la pendiente de la curva peso vs. tiempo (J) se calculó la velocidad de transmisión de vapor de agua, VTVA, (Ec. 1) y con las presiones parciales de vapor de agua en ambas ca- ras de la película y el espesor de la película se calculó la PVA (Ec. 2): (Ec.1) (Ec.2) Donde PVA es la permeabilidad al vapor de agua (g/ Pa*s*m); L es el espesor promedio de la película [m]; A es el área de permeación [m2]; (RH1-RH2) es la di- ferencia de humedades relativas y Pw es la presión par- cial de vapor de agua a la temperatura de ensayo [Pa]. Propiedades ópticas. Para determinar las propiedades ópticas de brillo y color se utilizó un espectrofotóme- tro portátil de esfera (X-Rite SP-64). Se utilizaron tres muestras de 5 x 5 cm realizando tres mediciones. La determinación de brillo en las películas se realizó según norma ASTM D2457 [19], se utilizó un ángulo de 45 ° y un fondo de color negro. Los datos arrojados fueron en unidades de brillo (GU). Mientras que el color en las películas se determinó mediante un iluminante D65 y un ángulo de observación de 10 º. Se utilizó un fondo de color blanco. Se registraron las coordenadas L*, a*, b* de la escala CIE. Diseños experimentales Se realizaron diseños completamente al azar con tres réplicas, donde el factor de entrada fue el día de en- vejecimiento (1, 8, 60 y 120 días). La variable de res- puesta fue el parámetro de color (a*, b*, L*). En otro diseño la variable de respuesta fue el valor de PVA y el valor de brillo (GU). Estos diseños se ejecutaron a las cuatro películas (SM 1498-4 N, SM 1498-4 H, CUMBRE 3 N y CUMBRE 3 H). Los datos fueron ana- lizados en el paquete estadístico SPSS versión 14.0. Se empleó la prueba de comparación múltiple Tukey con un nivel de significancia del 5%. También se rea- lizó un diseño completamente al azar, donde el factor de entrada fue la película (SM 1498-4 N, SM 1498-4 H, CUMBRE 3 N y CUMBRE 3 H), y como variable de respuesta se tomó el parámetro de color (a*, b*, L*), brillo (GU) y PVA (g/Pa*s*m) solamente con valores del día 1. Se utilizó un nivel de significancia del 5% y se empleó la prueba de comparación múltiple Tukey. RESULTADOS Evaluación de la permeabilidad de vapor de agua (PVA) en películas elaboradas a partir de TPS, PLA Y PCL En el Cuadro 3., se presentan los valores de PVA de las películas en los días de envejecimiento. La compara- ción del envejecimiento se hizo con cada variedad por separado y la comparación entre variedades se realizó con los datos de PVA obtenidos en el día 1. La PVA de las cuatro películas en el día 1, estuvo en- tre 7,39 x10-11 g/Pa*s*m y 9,12 x10-11 g/Pa*s*m, estos valores al compararlos con antecedentes que se muestran en el Cuadro 4, indica que el proceso de ex- trusión disminuye la PVA, además las mezclas entre TPS y biopolímeros comerciales mejora la PVA, de- mostrando que se acerca a valores de PVA caracterís- ticos de los polímeros sintéticos. Los resultados de los Análisis de varianza (ANAVA), mostraron diferencias Cuadro 2. Formulación y simbología utilizada para las películas Formulación de TPS 75 % y MB 25 % Simbología de la película Temperatura de extrusión promedio ºC TPSN1 + MB SM 1498-4 N 145 TPSH2 + MB SM 1498-4 H 145 TPSN3 + MB CUMBRE3 N 141,25 TPSH4 + MB CUMBRE 3 H 137,5 Cuadro 3. Permeabilidad de vapor de agua de las películas PVA (g/Pa*s*m) Día SM 1498-4 N CUMBRE 3 N SM 1498- 4 H CUMBRE 3 H 1 7, 39 x 10- 11 ± 1, 6 x 10-12 9, 12 x 10- 11 ± 1, 0 x 10-12 8,21 x10- 11 ± 1,0 x10-12 8,94 x10- 11 ± 1,6 x10-12 8 5,79 x10- 11 ± 1,4 x10-12 8,32 x10- 11 ± 6,1 x10-13 7,71 x10- 11 ± 1,2 x10-12 8,12 x10- 11 ± 9,0 x10-13 60 4,73 x10- 11 ± 8,0 x10-13 7,82 x10- 11 ± 9,0 x10-13 7,35 x10- 11 ± 6,0 x10-13 4,61 x10- 11 ± 4,3 x10-13 120 4,73 x10- 11 ± 8,0 x10-13 4,93 x10- 11 ± 7,5 x10-13 3,93 x10- 11 ± 6,8 x10-13 2,18 x10- 11 ± 6,1 x10-13 63 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (59- 68) significativas (o ± O,O5) eu |a PVA cou |especlo a| eu- vejecimiento, como también por la variedad en el día 1. Uno de los factores más importantes que afecta la permeabilidad de vapor de agua, es el uso de plastifi- cantes [20], ya que cuanto mayor contenido de plasti- ficante, mayor será la PVA [15], esto debido a que su presencia disminuye las fuerzas intermoleculares en las cadenas del polímero, dando una mayor movilidad molecular, aumentando su permeabilidad al agua [28]. Igualmente los plastificantes incrementan el volumen libre, en consecuencia existe más espacio para que las moléculas de agua migren, además los plastificantes hidrofílicos como el glicerol son compatibles con el material polimérico que forma la película y aumentan la capacidad de sorción de moléculas polares tales como el agua, por tal razón aumenta la permeabili- dad de los mismos [27]. Durante el envejecimiento el contenido de plastificante disminuye debido al despla- zamiento de este a la superficie y posteriormente al medio ambiente [29], lo que posiblemente generó una disminución en la PVA con respecto al envejecimiento tal como se observa en el Cuadro 3. En las películas SM 1498-4 N y CUMBRE 3 N, la prueba de Tukey agru- pó a estas dos películas en diferentes conjuntos en el día 1, indicando que el uso de diferentes variedades de almidón termoplástico nativo influye significativamen- te en la permeabilidad de vapor de agua, demostrando que el comportamiento de PVA también difiere en el contenido de amilosa amilopectina [23], debido a que la variedad de almidón SM 1498-4 posiblemente pre- senta mayor contenido de amilosa. Esto coincide con un estudio de TPS producido a partir de amilosa y ami- lopectina, en el que se analizaron las propiedades de barrera, las cuales mostraron una alta permeabilidad al O2 y disminución al vapor de agua en TPS de amilosa comparados con los elaborados a partir de amilopec- tinas [7]. En las películas SM 1498-4 H y CUMBRE 3 H, se encontró un comportamiento similar. Con respecto a la utilización de TPS nativo e hidroliza- do de la misma variedad, la prueba de Tukey distribuyó en diferentes grupos las películas SM 1498-4 H y SM 1498-4 N, esta diferencia se debió principalmente a la depolimerización de las cadenas de amilosa y amilo- pectina ocasionadas por el proceso de hidrólisis [30], mientras que las películas CUMBRE 3 N y CUMBRE 3 H, no presentaron diferencias significativas (o ± 0,05). Otro factor a tener en cuenta en la disminución significativa de la PVA en las películas, es el posible- mente aumento de la cristalinidad en las películas, lo que ocasiona una disminución del “volumen libre”, el cual es definido como el espacio libre, que no es ocu- pado por la microestructura de la molécula del políme- ro [6], esto se debe a que inicialmente los polímeros no se encuentran en un equilibrio termodinámico pre- sentándose un volumen libre, el cual se relaja con el tiempo de envejecimiento hasta llegar a su estado de equilibrio, generando que el envejecimiento disminu- ya significativamente la PVA, por una disminución del agente plastificante y la misma recristalinizacion del almidón. [31]. Evaluación del color en películas elaboradas a partir de TPS, PLA Y PCL Los parámetros de color de las películas y sus respecti- vos valores de envejecimiento se muestran en el Cuadro 5. Las películas presentaron valores de L entre 83,92 y 87,89 durante los 120 días sin ningún cambio significa- tivo, se puede apreciar que las variedades hidrolizadas presentaron mayor luminosidad en comparación con sus respectivas variedades de origen nativo en el día Cuadro 4. PVA de diferentes películas de origen sintético y biodegradable Composición Método PVA (g/ Pa*s*m) Almidóna casting 2,17 x10-9 Almidón de plátanob casting 1,98 x10-10 Almidón de ñamec casting 9,89 x10-11 Tunad casting 3,25 x10-10 Almidón oxidado de plátanoe extrusión 7,77 x10-10 Maízf extrusión 0,88-1,41 x10- 10 Maízg extrusión 2,19 x10-9 Yucah extrusión 8,33 x10-11 PCLj extrusión 3,81 x10-13 PLA j extrusión 6,81 x10-13 PLA k extrusión 1,11 x10-12 PLA + |-cyclodextrinak extrusión 3,58 x10-12 LDPLj extrusión 4,2 x10-14 LDPLk extrusión 9,81 x10-13 LDPLl extrusión 7,3–9,7 x10 -13 HDPLk extrusión 2,3 x10-13 HDPLl extrusión 2,4 x10-13 Fuente: a. [20]; b. [6]; c. [21]; d. [22]; e. [23]; f. [3]; g. [24]; h. [25]; j. El autor, 2011; k. [26]; l. [27] 64 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (59- 68) 1, esto pudo deberse a la temperatura utilizada en la fabricación de cada película (ver Cuadro 2), ya que las películas CUMBRE 3 N y SM 1498-4 N, fueron obteni- das con un perfil de temperatura promedio de 145 °C, mientras que la película SM 1498-4 H se procesó a una temperatura de 141,25 °C y la película CUMBRE 3 H solo necesitó de una temperatura de 137,5 °C, existien- do una relación inversa entre temperatura y luminosidad debido a que los carbohidratos y proteínas, durante el proceso de extrusión intervienen generando reacciones de Maillard, las cuales producen compuestos colorea- dos llamados melanoidinas contribuyendo al oscureci- miento de las películas [23], sin embargo esta diferen- cia (o ± O,O5) uo lue s|gu|l|cal|va. Con respecto al parámetro a* la mayoría presentó va- lores negativos, ubicados en la fracción verde a ex- cepción de los días 60 y 120 de la película CUMBRE 3 N, sin embargo esto cambios no fueron significativos. Los valores a* están cerca al valor de 0, por lo tanto tienen más tendencia a un color neutro en el parámetro a*. Así mismo al comparar las películas en el día 1, estas no tuvieron diferencias significativas (o ± O,O5) con respecto al parámetro a*. El parámetro b* tuvo una tendencia positiva, si bien fue un valor que os- ciló entre 4,62 y 7,90 los cuales son mayores que el parámetro a*, siguen siendo valores pequeños dando como resultado películas con una ligera tendencia al color amarillo. Al comparar las películas en el día 1, la película SM 1498-4 N fue la que tuvo el valor más alto, presentándose diferencias significativas (o ± O,O5) entre las películas SM 1498-4 H y CUMBRE 3 H. Con respecto al envejecimiento las películas SM 1498- 4 N y CUMBRE 3 N no presentaron cambios con un o±O,5, m|eul|as que |as pe||cu|as SN 1498-4 h y CUMBRE 3 H mantuvieron sus valores constantes del parámetro b* solo hasta el día 60, ya que en el día 120, según la prueba de Tukey estos días fueron distribuidos en grupos diferentes. Esto indica que las películas hechas con almidón nativo mantuvo el pará- metro b*, mientras que las películas hidrolizadas au- mentaron el valor b*. Los datos del sistema CIELab indican que las pelícu- las son estables con respecto al color hasta el día 60, Cuadro 5. Parámetros de color de las películas respecto al envejecimiento Película Día L* a* b* SM 1498- 4 N 1 85,04±3,65 -0,49±0,47 7,90±0,19 8 85,00±2,72 -0,45±0,36 7,73±0,02 60 85,05±1,02 -0,54±0,15 7,67±0,35 120 85,74±0,29 -0,41±0,05 7,31±0,18 CUMBRE 3 N 1 86,21±1,90 -0,27±0,30 5,88±1,34 8 86,28±0,88 -0,25±0,18 5,94±0,80 60 83,92±0,75 0,37±0,50 7,84±1,34 120 84,17±1,10 0,31±0,32 7,38±1,33 SM 1498- 4 H 1 87,58±0,73 -0,50±0,16 4,82±0,18 8 87,74±0,43 -0,53±0,12 4,94±0,48 60 87,73±0,76 -0,59±0,07 4,62±0,20 120 87,29±0,52 -0,56±0,11 6,28±0,23 CUMBRE 3 H 1 87,78±1,25 -0,24±0,29 5,24±0,82 8 87,89±1,23 -0,29±0,25 5,34±0,31 60 87,47±0,22 -0,21±0,09 5,65±0,32 120 85,82±0,14 -0,07±0,06 7,55±0,30 65 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (59- 68) a excepción de la película CUMBRE 3 N, prolongando su estabilidad hasta el día 120. La luminosidad de las películas fue alta y el envejecimiento no generó ningún cambio, el parámetro a* no tuvo cambio relevante du- rante el envejecimiento. El parámetro b* fue el que en realidad tuvo influencia entre las variedades de pelícu- las y durante el envejecimiento, ya que las variedades hidrolizadas presentaron una tendencia a aumentar el valor de b*, mientras que solamente una película de almidón nativo tuvo la tendencia a disminuir éste pará- metro. Sin embargo estos valores son bajos, además cabe destacar que los bajos valores de color registrados para las películas a base de almidón indican que estos materiales son prácticamente incoloros [3], por ende se puede afirmar que las películas no son amarillas ni mucho menos verdes por el valor negativo del paráme- tro a*, simplemente son neutras en el parámetro a* y tienen una leve tendencia al amarillo por los valores de b*, con una tonalidad alta y una saturación baja, dan- do como resultado películas con un leve color amarillo y con una blancura elevada. Esto es muy importante en el momento de comercializar el producto, debido a que el color blanco es una propiedad física primordial de los almidones y en muchas aplicaciones industriales esta característica es muy significativa como parámetro de calidad [6], sin embargo los parámetros de color de estas películas no son apropiados para el desarrollo de empaques en los cuales el producto empacado requiere visibilidad tales como vegetales mínimamente procesa- dos, donde la visibilidad condiciona la aceptabilidad del producto [3]. Evaluación del brillo en películas elaboradas a partir de TPS, PLA Y PCL El Cuadro 6 presenta el brillo de las películas durante los 120 días de envejecimiento, los cuales oscilaron entre 16,06 y 21,98 GU. Estos bajos valores se debie- ron posiblemente a la naturaleza hidrofóbica del PLA y de la PCL e hidrofílica del almidón ya que puede existir poca interacción interfacial dando como resultado una disminución de brillo [14], sin embargo al comparar- los con una película de TPS, el brillo es mayor en la película TPS + MB (ver Cuadro 7). Al determinar el brillo en las películas en el primer día de envejecimiento, se encontró una diferencia signifi- cativa con un o±O.O5. Seguu |a p|ueba de Tu|ey |as películas SM 1498-4 N y SM 1498-4 H fueron distri- buidas en grupos diferentes. El brillo en las cuatro pe- lículas presentó una disminución significativa de esta propiedad óptica durante el envejecimiento. En la película CUMBRE 3 H según la prueba de Tukey el día 120 fue distribuido en un grupo diferente de lo demás días, presentándose una pérdida de brillo en el día 120, mientras que la película CUMBRE 3 N la prueba de Tukey generó 3 grupos presentándose una disminución de brillo en los días 60 y 120. Entre tanto las películas elaboradas con almidón de la variedad SM 1498-4 H, la prueba de Tukey agrupó cada día en conjuntos diferentes y en la película SM 1498-4 N, la disminución de brillo se presentó en los días 60 y 120 debido a que la prueba de Tukey los distribuyó en grupos diferentes. La diminución de brillo durante el envejecimiento de las películas puede deberse seguramente al envejecimien- to del TPS, debido a que a medida que pasa el tiempo, la rugosidad en el TPS aumenta [29]. En un estudio se utilizó microscopía de fuerza atómica (AFM) para Cuadro 6. Brillo de las películas durante el envejecimiento BRILLO (GU) Día SM 1498-4 N CUMBRE 3 N SM 1498-4 H CUMBRE 3 H 1 20,15+0,69 21,13+0,71 21,98+0,09 21,3+0,09 8 19,77+0,98 20,72+0,34 20,89+0,18 20,89+0,18 60 18,01+0,47 19,14+0,79 18,45+0,63 20,74+0,2 120 16,06+0,27 18,3+0,47 17,3+0,5 19,83+0,41 Cuadro 7. Brillo de TPS, PLA, PCL y LDPL Brillo G.U. Material TPS 13,19±3,45 PLA 84,97±0,79 PCL 85,97±0,13 LDPL 85,01±0,3 66 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (59- 68) caracterizar la estructura superficial de TPS, dando como resultado cambios en la rugosidad con respecto al tiempo en almidones termoplásticos agrios de yuca y nativos de papa [32], y se ha encontrado que la ru- gosidad de la superficie de las películas influye en el brillo [33], ya que al aumentar la rugosidad disminuye el brillo en las películas [6], esto ddebido a un creci- miento de las zonas cristalinas en la superficie de la película induciendo una mayor superficie de rugosi- dad, lo que conduce a la dispersión de la luz y pérdida brillo [24]. Otra posible causa de la disminución de bri- llo puede deberse a la perdida de plastificante durante el envejecimiento, ya que el contenido de plastificante disminuye a medida que transcurre el tiempo [16], y se ha establecido que la adición de plastificante dismi- nuye los parámetros de rugosidad de las superficies películas [3]. Igualmente el contenido de almidón en la película influye en propiedades ópticas [17]. Durante los 120 días de envejecimiento las películas hechas con almidón hidrolizado tuvieron siempre valores por encima en comparación con películas fabricadas con almidón nativo. Esto puede deberse a que las películas al tener un proceso extra como la hidrólisis tienden a tener menos impurezas, además almidones modifica- dos permiten desarrollar películas con superficies más suaves con menos rugosidades [3]. CONCLUSIONES La permeabilidad de vapor de agua y el brillo de las películas disminuyeron con respecto al tiempo debido a la migración del glicerol, a la recristalización y au- mento en la rugosidad superficial. Las películas hidrolizadas y nativas en general no presentaron grandes diferencias, concluyendo que el proceso de hidrólisis no mejoró significativamente las propiedades de la película en comparación con pelícu- las trabajadas con almidón nativo. La utilización de una mezcla entre PLA y PCL, mejoró en gran medida las propiedades de permeabilidad de vapor de agua del TPS, además de aumentar el brillo. Este tipo de películas son aptas para ser utilizadas como barrera al vapor de agua ya que inicialmente tie- nen una baja PVA y al transcurrir el tiempo tienden a ser menos permeables. El color un factor comercial importante mantiene por buen tiempo sus características iníciales, no obstan- te el brillo otro factor llamativo para el consumidor es bajo y disminuye al transcurrir el tiempo. REFERENCIAS [1] CONTÓ, K., BALSAMO, V., LÓPEZ C. y FEIJOO, J.L. Modificación química de almidones carboxi- metilados con bromuro de hexaciltrimetilamonio. Revista Iberoamericana de Polímeros, 9 (3), 2008, p. 197-200. [2] YU, L. Biodegradable polymer blends and com- posites from renewable resources. New Jersey (USA): John Wiley & Sons, Inc, 2009, p. 1-15. [3] LÓPEZ, O.V. Desarrollo, caracterización y aplica- ción de envases biodegradables a partir de almi- dón. [Tesis Doctor en Ciencias Exactas, Área Quí- mica]. La Plata (Argentina): Universidad Nacional de La Plata, Facultad de Ciencias Exactas, 2011, p. 183-201. [4] BARRIOS, S.E., CONTRERAS, J.M. y LÓPEZ CARRASQUERO, F. 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ANA LORENA ARROYAVE R. 1 , MARIANA CARDONA B. 2 , LINA MARÍA AGUDELO E. 3 RESUMEN Los Polihidroxialcanoatos son poliésteres naturales que se han convertido en una excelente alternativa para remplazar los plásticos convencionales. Son bio- compatibles y biodegradables y en corto tiempo pueden ser reducidos a dióxido de carbono y agua. Son sintetizados intracelularmente por diferentes bacterias y pueden ser obtenidos a partir de una gran variedad de sustratos, en los que se incluyen algunos desechos agroindustriales. Con el objetivo de identificar cepas nativas con potencial para la producción de Polihidroxialcanoatos se llevó a cabo una bioprospección en los lodos de la Planta de Tratamiento de Aguas Residuales de San Fernando (Itagüí-Antioquia). Se aislaron en agar selectivo 19 colonias, de las cuales se seleccionaron las colonias con oxidasa positiva. Se realizó la activación y siembra de las bacterias en medio mínimo de sales (MSM) líquido, para establecer el porcentaje de acumulación de los Polihidroxialcanoatos. Las Recibido para evaluación: 17-04-2013. Aprobado para publicación: 7-10-2013. 1 Microbióloga Industrial y Ambiental. Escuela de Microbiología. Universidad de Antioquia 2 Magister en Ingeniería. Grupo de Biotransformación. Universidad de Antioquia 3 PhD en Ingeniería. Grupo de Biotransformación. Universidad de Antioquia Correspondencia:
[email protected] 70 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (69- 76) cepas LM-3D, LAR-4D, LAR-5B, LAR-5E, presentaron un porcentaje de acumulación de PHAs de 2, 10, 4, 3 %, respectivamente y la cepa LM-3F presentó un porcentaje de acumulación del 25%, con respecto a los otros aislados. Tras el análisis bioquímico se determinó que las cepas produc- toras de PHAs fueron Shingomonas paucemobilis, Aeromonas hydrophila y Aeromonas sobria. ABSTRACT Polyhydroxyalkanoates are natural polyesters with excellent characteristics to replace conventional plastics. They are bio-compatibles and biodegrada- bles and in a short time they can be reduced to carbon dioxide and water. They are intracellular synthetized by different bacteria and they can be ob- tained from a large variety of substrates, including some agriculture was- tes. The main target is to identify native strains with potential to produce polyhydroxyalkanoates. A bio-prospection was performed in the sludge of San Fernando’s waste water plant (Itagüí-Antioquia). 19 colonies were iso- lated in a selective agar, and then the colonies with positive oxidase were selected. The activation and cultivation were carried in a liquid minimum salt medium (MSM) to establish the biopolymer accumulation rate. The strains LM-3D, LAR-4D, LAR-5B, LAR-5E exhibited a pHAs accumulation rate of 2, 10, 4, 3% respectively, and the strain LM-3F exhibited a 25% of biopolymer accumulation rate against others. Upon the biochemical analy- sis it was established that polymer producer strains were Shingomonas paucemobilis, Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria. RESUMO Polihidroxialcanoatos são poliésteres naturais com excelentes característi- cas para substituir os plásticos convencionais. Eles são bio-compatíveis e biodegradáveis e num curto espaço de tempo que podem ser reduzidos a dióxido de carbono e água. Eles são sintetizados intracelular por diversas bactérias e podem ser obtidos a partir de uma grande variedade de subs- tratos, incluindo alguns resíduos agrícolas. O objetivo principal é identificar cepas nativas com potencial para a produção de polihidroxialcanoatos. A bioprospecção foi realizada no lodo de águas residuais da fábrica de San Fernando (Itagüí-Antioquia). 19 colônias foram isoladas em ágar seletivo, e, em seguida, foram selecionadas as colônias com oxidase positiva. A ativação e cultivo foram realizados em um meio sal mínimo líquido (MSM) para estabelecer a taxa de acúmulo de biopolímeros. As cepas LM-3D, LAR-4D, LAR-5B, LAR-5E exibiu uma taxa de PHAs acúmulo de 2, 10, 4, 3%, respectivamente, ea tensão LM-3F exibiu a 25% da taxa de acúmulo de biopolímeros contra os outros. Após a análise bioquímica foi estabelecido que as cepas produtoras de polímeros foram Shingomonas paucemobilis, Aeromonas hydrophila e Aeromonas sobria. PALABRAS CLAVES: Biopolímeros. Bioprospección. Aguas residuales. Aislamiento. Lodo activado recirculado (LAR). Licor mixto (LM). KEYWORDS: Biopolymers. Bio-prospection. Wasted wáter. Isolation. Activated slugde. Mixed liquor. PALAVRAS-CHAVE: Biopolímeros. Bioprospecção. Desperdício de água. Isolamento. Ativado slugde. Licor misto. 71 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (69- 76) INTRODUCCIÓN Los polímeros derivados del petróleo se han converti- do en elementos indispensables para la vida cotidiana gracias a las diversas propiedades mecánicas y fisico- químicas que presentan [1]. La capacidad global total de producción de productos plásticos se incrementó dramáticamente de 1,5 millones de toneladas en 1950, a 245 millones de toneladas en 2008. La producción en 2011 fue cerca de 280 millones de toneladas y se estima que la tasa de crecimiento anual sea de 9% [2,3,4]. Los plásticos son empleados en múltiples in- dustrias y generalmente tienen un tiempo de uso cor- to; y debido a que no son degradados fácilmente por medio de procesos naturales, se acumulan y perma- necen en el ambiente por mucho tiempo, generando así uno de los mayores problemas de contaminación ambiental [5,6,7,8]. Como alternativa, muchas investigaciones alrededor del mundo están siendo orientadas hacia el desa- rrollo de plásticos biodegradables con propiedades similares a los plásticos convencionales, pero con tiempos de degradación más cortos [9,10,11]. Den- tro de estos materiales se encuentran los Polihidro- xialcanoatos (PHAs), que son poliésteres naturales sintetizados por diferentes bacterias. Los PHAs son biocompatibles y biodegradables lo que representa ventajas con relación a los plásticos derivados del petróleo [12]. Estos biopolímeros pueden ser sinte- tizados por una gran cantidad de microorganismos a partir de diferentes sustratos agrícolas. Existen más de 300 clases de bacterias productoras de PHAs, de las cuales se pueden obtener hasta 150 tipos de es- tos materiales con diferentes propiedades [13,14]. Las características del biomaterial y su aplicación final dependerán del microorganismo y la fuente de carbono utilizados para su obtención. Aunque son muchos los microorganismos los que pueden sintetizar PHAs, sólo unos cuantos son ca- paces de producirlo a gran escala [3]. La elección del microorganismo para la producción industrial del biopolímero varía dependiendo de factores como la habilidad celular para utilizar fuentes de carbono no costosas, la velocidad de crecimiento, la velocidad de síntesis del biopolímero, la calidad y cantidad de PHA y el costo de los procesos de recuperación [15]. A nivel industrial se emplean cepas como la Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas oleovorans, Paracccus denitrificans, Protomonas extorquens y E. coli recombinante [11]. El objetivo de esta investigación fue el aislamiento y caracterización de cepas nativas con potencial para la obtención de biopolímeros Polihidroxialcanoatos (PHAs), que puedan ser empleadas a futuro en pro- cesos biotecnológicos de producción a gran escala. Las muestras fueron aisladas de los lodos activados de una planta de tratamiento de aguas residuales, que han sido establecidos como nichos óptimos para el crecimiento de microorganismos productores de es- tos biopolímeros [16]. MÉTODO Recolección de muestras de lodos Las muestras de los lodos fueron obtenidas de la Plan- ta de Tratamiento de Aguas Residuales de San Fernan- do, ubicada en el municipio de Itagüí adscrito al Área Metropolitana del Valle de Aburrá. Con el fin de lograr obtener una mayor variedad en el tipo de microorga- nismos aislados las muestras fueron recolectadas en dos puntos diferentes de la planta. La primera muestra fue tomada del Lodo Recirculado o de Retorno (LAR); correspondiente al lodo de los sedimentadores finales que es recirculado a los tanques de aireación. La se- gunda muestra fue tomada del Licor Mixto (LM); co- rrespondiente al lodo activado del tanque de aireación mezclado con aguas residuales en el tanque de sedi- mientación secundario. Las muestras fueron recolec- tadas y almacenadas en frascos tapa rosca y fueron conservadas a 4°C durante el traslado hacia el Labora- torio de Biotecnología Microbiana y Biología Molecular de la Universidad de Antioquia y fueron procesadas inmediatamente. Aislamiento de los microorganismos Para el aislamiento de los microorganismos se tomaron muestras de cada lodo (lodo activado recirculado (LAR) y licor mixto (LM)) y se realizaron diluciones seriadas desde 10 -1 hasta 10 -5 utilizando agua peptonada estéril. En placas con medio selectivo Mc.Conkey se inocula- ron por dispersión 100µl de cada dilución. Las placas se incubaron a 35°C por 48 horas, el procedimiento fue realizado por duplicado para cada dilución. Una vez finalizado el tiempo de incubación se realizaron los análisis macroscópico y microscópico de las placas. El agar Mc.Conkey es un medio selectivo y diferencial que permite aislar y diferenciar bacilos entéricos fermenta- dores y no fermentadores de lactosa. Las colonias ais- ladas de bacterias que fermentan la lactosa presentan 72 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (69- 76) una coloración rosada y las colonias que permanecen incoloras no la fermentan. A partir del aislamiento en el medio Mc Conkey se seleccionaron las colonias in- coloras no fermentadoras de lactosa. Este criterio de selección fue basado en las bacterias reportadas en la literatura como mayores productoras de PHAs tales la como Pseudomonas, Rhizobium, Ralstonia, Alcalige- nes que presentan esta característica. Las bacterias no fermentadoras de lactosa seleccio- nadas fueron posteriormente aisladas en medio TSA (Tripticasa Soya Agar). A los cultivos puros obtenidos se les realizó la prueba de tinción Gram para determi- nar si eran Gram-negativas o Gram positivas y estable- cer su morfología microscópica. También se les reali- zó la prueba de oxidasa para establecer si los aislados corresponden a las Pseudomonas (oxidasa positiva) o al grupo de las Enterobacterias (oxidasa negativa). Esta prueba consistió en colocar una gota grande de agua destilada estéril en una placa de Petri, y sobre ésta se suspendió una porción del cultivo a analizar, luego sobre el cultivo se colocó un disco indicador de oxidasa (disco Taxo N), que contienen los compo- nentes de la reacción. La aparición de una coloración púrpura a los 5 minutos del contacto fue tomada como una reacción positiva. Los bacilos Gram negativos no fermentadores de lactosa, positivos para la prueba de oxidasa fueron seleccionados como microorganismos potenciales para la producción de los biopolímeros Determinación de Bacterias productoras de Polihidroxialcanoatos (PHAs) Debido a que los microorganismos fueron conser- vados en medio sólido, la activación se llevó a cabo en 25mL de Caldo Enriquecido Tripticasa Soya (TSB- marca Merck) que contiene por litro, 17,0 g de Peptona de caseína; 3,0 g de Peptona de harina de soya; 2,05 g de Glucosa; 5,00 g de NaCl y 2,5 g K 2 HPO 4. La fer- mentación para determinar la producción de PHAs fue realizada en 50mL de Medio Mínimo de Sales (MSM) líquido, que contiene por litro, 6,7 g de Na 2 HPO 4 .7H 2 O; 1,5 g de KH 2 PO 4 ; 1,0 g (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0,2 g de MgSO 4 .7 H 2 O; 60 mg de Citrato de Hierro y Amonio; 10 mg de CaCl 2 .2H 2 O y 1 mL de elementos traza (0,3 g de H 3 BO 3 ; 0,2 g de CoCl 2 .6H 2 0; 0,1 g de ZnSO 4 .7H 2 O; 30 mg de MnCl 2 .4H 2 O; 30 mg de NaMoO 4 .2H 2 O; 20 mg de NiCl 2 .6H 2 O; 10 mg de CuSO 4 .5H 2 O [17]; y con 10 g/L de glucosa como fuente de carbono. Las fermentacio- nes fueron realizadas a 30°C por 72 horas. La deter- minación de la acumulación del biopolímero se realizó mediante la técnica de tinción con Sudan Black [18]. Caracterización de aislamientos bacterianos Las cepas que presentaron acumulación del biopolí- mero fueron caracterizadas utilizando el Kit API #20 NE (Biomerieux) específico para bacterias Gram-ne- gativas no fermentadoras de Lactosa. Para la deter- minación del género y familia de los microorganis- mos aislados se empleó la base de datos ApiwebTM (Biomerieux) [19] Conservación de microorganismos productores de Polihidroxialcanoatos (PHAs) La conservación de las cepas se realizó siguiendo el protocolo de crioconservación descrito por Simione, et al. (1998) [20]. Los microorganismos fueron acti- vados en tubos tapa rosca con 10 mL demedio Luria Bertani (LB) que contiene por litro, 10,0 g de Triptona; 5,0 g de Extracto de Levadura y 10,0 g de NaCl. La activación fue realizada durante 8 horas a 35°C. Una vez transcurrido el tiempo de activación se tomaron 0,7 mL del cultivo y se transfirieron a un criovial de 2 mL, que contenía 0,3 mL de glicerol al 10% y que fue adicionado como agente crioconservador. Luego de una vigorosa mezcla en vórtex los crioviales fueron guardados en nevera a -20°C para su uso en posterio- res experimentaciones. RESULTADOS De la siembra del lodo activado recirculado (LAR) en agar Mc.Conkey, fueron aisladas ocho colonias posi- bles productoras de PHAs y del Licor Mixto (LM) se aislaron once colonias. En la Figura 1 se presentan las imágenes de las colonias del lodo activado recircula- do (LAR) sembradas en el agar Mc. Conkey en cajas Petri. Como se observa en la Figura 1b se aprecian una gran cantidad de cepas fermentadoras de lactosa que han producido un coloración rosa característica en el cultivo. En la Figura 1a y 1c se aprecian colo- nias individuales a las que a partir de la descripción macroscópica del crecimiento se lograron establecer características como el borde la forma, la elevación, la superficie, el tamaño, el color y el contraste con la luz. En la Figura 2 se observan las imágenes de los cultivos correspondientes a las cepas aisladas del Lico Mixto. Al igual que en las muestras de lodo LAR se aprecian ambos tipos de cepas: las productoras de lactosa que pueden ser apreciadas en algunas partes de las cajas Petri en las Figuras 2b y 2c; y las no productoras de 73 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (69- 76) lactosa como se observa en la Figura 2a. También en estas imágenes es posible apreciar algunas diferen- cias en las características macroscópicas de las ce- pas aisladas. Se observan diferencias en el color, la elevación y el contraste a la luz, algunas de las cepas son blancas, cremosas y elevadas y otras son amari- llentas, opacas y planas. Se logró la purificación de las cepas lactosa negativas mediante la siembra en agar TSA; y empleando la tin- ción Gram se logró establecer que todas las 19 colo- nias aisladas son cepas Gram negativas. A partir del análisis microscópico se estableció que la morfología corresponde a bacilos largos para 7 cepas y 12 cepas corresponden a bacilos cortos Mediante la prueba oxidasa positiva se lograron selec- cionar 5 colonias del lodo LAR y 6 colonias del lodo LM. En la Figura 3 se presenta una imagen de la prue- ba oxidasa realizada a las colonias aisladas. Como se aprecia la coloración lavanda la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la pre- sencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxíge- no molecular que produce agua o peróxido de hidróge- no según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sis- tema citocromo-oxidasa sólo se encuentra en los or- ganismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de activi- dad oxidasa [21]. A partir de las fermentaciones realizadas en medio MRS con las 11 cepas seleccionadas y mediante la técnica de tinción con Sudan Black se lograron de de- tectar 5 cepas con potencial de producción de polihi- droxialconoatos (PHAs). Las cepas LAR-4D, LAR-5B, Figura 2. Crecimiento bacteriano en placa de la siembra del lodo LM en Agar Mc.Conkey Figura 1. Crecimiento bacteriano en placa de la siembra del lodo LAR en Agar Mc.Conkey. 74 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (69- 76) LAR-5E, provenientes del lodo activado recirculado y las cepas LM-3D, LM-3F aisladas del licor mixto fue- ron positivas para la tinción, lo que es un indicativo de la acumulación del biopolímero en las células bac- terianas. Haciendo una estimación de la cantidad de colorante acumulado por las bacterias se logró esta- blecer un porcentaje de acumulación del PHAs en las células. Las cepas LM-3D, LAR-4D, LAR-5B, LAR-5E presentaron porcentajes de acumulación de 2, 10, 4, 3 %, respectivamente. La cepa LM-3F presentó un por- centaje de acumulación de 25%, lo que la convierte en la cepa nativa más prometedora en la producción de PHAs aislada de estos lodos. Empleando el sistema comercial API #20 NE (Biome- rieux), se logró la identificación de las cepas, las cua- les se identificaron como Shingomonas paucemobilis, Aeromonas hydrophila y Aeromonas sobria. En el cua- dro 1 se presentan las 5 cepas caracterizadas con los respectivos porcentaje de identificación (% Id) que el sistemas API asigna para cada caso. Como se aprecia la cepa LM-3F que presentó mayor acumulación de PHA, corresponde a la Shingomonas paucemobilis y fue aislada a partir del licor mixto (LM). Aunque las muestras fueron tomadas a partir de lodos diferentes (Licor Mixto y Lodos Activados Recirculados), no se observan diferencias en las especies aisladas, se ob- tuvieron Aeromonas sobria y Shingomonas paucemo- billis en ambas muestras. Existen reportes en la literatura que demuestran que estas especies pueden acumular diferentes PHAs y pueden utilizar una variedad de fuentes de carbono. Lee, et al, 2000 [22], reportó que la Aeromonas hy- drophila aislada de muestras de aguas residuales pro- duce 95,7 g/L de P(3HB-co-3HHx) al utilizar diferentes fuentes de carbono como ácido laúrico o ácido oleico. Por su parte, Giavasis et al., 2006 [23], reportó la acumulación de 12,4 g/L de PHB en células de Shin- gomonas paucemobilis, valores que pueden son com- parables con los reportados para Ralstonia eutropha. Aunque son pocos los reportes enfocados en el po- tencial de utilización de bacterias nativas de lodos ac- tivados en la producción de PHAs, los lodos activados son considerados como ecosistemas ricos y diversos en bacterias acumuladoras de PHAs [24]. Las bacterias empleadas en la producción de PHAs se pueden dividir en dos grupos dependiendo de las condiciones de cultivo requeridas para la síntesis. En el primer grupo se encuentran las bacterias que produ- cen el biopolímero mediante un medio de cultivo limi- tado de alguno de los nutrientes esenciales tales como el N, P, Mg y S y con un exceso de fuente de carbono. Entre ellas se encuentran las bacterias A. eutrophus, Protomonas extorquens, y Protomonas oleovorans. En el segundo grupo se encuentran las bacterias que no requieren de un medio de cultivo limitado de nu- trientes esenciales para la síntesis de PHAs y que pue- den acumular el polímero durante el crecimiento. Entre ellas se tienen a la Alcaligenes latus, una cepa mutante de Azotobacter vinelandii, y la cepa E. coli recombi- nante [11,13,25]. CONCLUSIONES A partir de las muestras de lodos activados de una planta de tratamiento de aguas residuales, se aislaron cinco cepas nativas con potencial para la producción de polihidroxialcanoatos (PHAs). Las cepas aisladas Figura 3. Prueba oxidasa Cuadro 1. Caracterización de aislamientos bacterianos. CEPA IDENTIFICACIÓN PORCENTAJE IDENTIFICA- CIÓN (%ID) LM-3D Aeromonas sobria 84,8 LM-3F Shingomonas paucemobilis 98,9 LAR-4D Shingomonas paucemo- billis 98,9 LAR-5B Aeromonas hyddrophila 95,5 LAR-5E Aeromonas sobria 96,8 75 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (69- 76) fueron identificadas como Areomonas sobria, Shin- gomonas paucemobilis y Aeromonas hydrophila. Aunque existen algunos reportes en la literatura sobre la producción de biopolímeros a partir de estas bac- terias es necesario establecer el verdadero potencial de producción de biopolímeros de las cepas nativas aisladas. Mediante la evaluación de los medios de cultivo y las condiciones de operación a emplear en las fermentaciones se podrá establecer a qué grupo pertenecen. Esta investigación constituye solo la etapa inicial del proceso que se requiere en la obtención de cepas nativas productoras de biopolímeros. REFERENCIAS [1] CORTÉS, L. 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La variedad de yuca apropiada para el uso de la harina en el desarrollo del material fue MPER 183, con resultados de resistencia última al esfuerzo de tensión y flexión de 1,8 ± 0,2 MPa y 3,5 ± 0,2 MPa, respectivamente y resistencia al impacto de 21,2 ± 0,1 J/m. Las muestras, moldeadas por compresión, obtenidas en este trabajo son tecnológi- camente factibles, y presentan características funcionales favorables como al- ternativa al uso del poliestireno expandido aplicado en empaques alimentarios. Recibido para evaluación: 30-04-2013. Aprobado para publicación: 18-07-2013. 1 Magister en Ingeniería de Alimentos, Docente Facultad de Ingeniería, Universidad de San Buenaventura Cali,
[email protected] 2. Doctor en Ingeniería de Alimentos, Docente Departamento de Agroindustria, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad del Cauca. Popayán-Colombia 3. Doctor en Ciencia e Ingeniería de Alimentos, Docente Escuela de Ingenieria de Alimentos, Universidad del Valle. Cali-Colombia Correspondencia:
[email protected] Artículos de la Revista 78 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (77- 84) ABSTRACT A bioplastic semirrigid material was developed from native flour of four cassava varieties (MBRA 383, MPER 183, CM 4574-7 and CM 7951-5), incorporating fique dust, by thermo-compression technique. The material was obtained by subjecting the raw material mixture in a mold and subse- quently it was compressed at 200°C. The cassava variety suitable for use in the material development was MPER 183, with results of last tensile and flexural resistance of 1,8 MPa ± 0,2 and 3,5 ± 0,2 MPa, respectively, and resistance to impact of 21,2 ± 0,1 J/m. Compression molded samples, obtained in this work are technologically feasible and favorable performan- ce characteristics presented as an alternative to the use of polystyrene foam food packaging applied. RESUMO Nós desenvolvemos um material bioplástico semi-rígida a partir de farin- ha nativo de quatro variedades de mandioca (MBRA 383, MPER 183, CM 4574-7 e CM 7951-5), incorporando poeira fique, por termo-compressão técnica. O material foi obtido submetendo a mistura da matéria-prima num molde em seguida comprimida a 200 °C. A variedade de mandioca ade- quados para uso no material de farinha desenvolvimento foi MPER 183, com os resultados de resistência última às tensões e de flexão de 1,8 ± 0,2 MPa e 3,5 ± 0,2 MPa, respectivamente, a resistência e a impacto de 21,2 ± 0,1 J/m. As amostras, moldadas por compressão, obtido neste trabalho são as características de desempenho tecnologicamente viáveis e favoráveis apresentadas como uma alternativa para o uso de embalagens de alimentos de espuma de poliestireno. INTRODUCCIÓN En los últimos años, los cambios en los hábitos alimenticios han generado un incremento en el consumo de bebidas y comidas rápidas para las que usualmente se utilizan utensilios como platos, vasos y cubiertos desecha- bles, afectando negativamente el ambiente por el aumento en la cantidad de desechos sólidos dispuestos en el mismo. Existen desarrollos en el sector de materiales biodegradables para menaje en alimentos como los basados en biopolímeros obtenidos por técnicas como moldeo por inyección, moldeo por compresión, los cuales se espera sustituyan dichos productos elaborados a partir de poliestireno o polipropileno, por sus ventajas ambientales [1]. El uso de polímeros a partir de recursos renovables ha generado grandes expectativas en los últimos años, ya que los materiales obtenidos de estas fuentes ofrecen una alternativa para mantener el desarrollo sostenible con tecnologías ecológicamente atractivas. Los materiales biodegradables son aquellos que se descomponen en un periodo de tiempo corto, bajo la ac- ción de microorganismos hasta desaparecer visiblemente. Su característica de biodegradabilidad, generada por las fuentes naturales de las que proce- den, es relevante en el campo ambiental. Su disposición y descomposición final evita acumulaciones en los rellenos, contribuyendo a la disminución de PALABRAS CLAVE: Biocompuestos, Bioempaques, Esfuerzo, Elasticidad. KEYWORDS: Biocomposites, Biopackaging, Stress, Elasticity. PALAVRAS-CHAVE: Biocompósitos, Bioembalagens, Esforço, Elasticidade. 79 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (77- 84) la contaminación de los ecosistemas, diferente de los materiales sintéticos como los plásticos provenientes de fuentes fósiles [2, 3, 4]. Además de la biodegradabilidad, otras razones por las cuales dichos materiales han propiciado interés industrial y académico son la conservación de ma- terias primas fósiles, la reducción en el volumen de desechos y compostabilidad natural, así como las posibilidades de uso de recursos agrícolas para la producción de estos materiales [5]. El desempeño, procesabilidad y costos son los mayo- res desafíos para los polímeros biodegradables para ser efectivos y cumplir las funciones requeridas duran- te su vida útil y disposición final del producto, dónde el empaque plástico basado en petróleo será paulatina- mente reemplazado [5]. Este trabajo, contiene la caracterización del comporta- miento mecánico de muestras bioplásticas semirrígidas obtenidas por la técnica de termo-compresión, con el fin de identificar sus posibles aplicaciones y ofrecer una alternativa para la obtención de materiales de origen bio- lógico con propiedades funcionales específicas. MÉTODO El estudio se desarrolló en materiales biocompuestos obtenidos por termo-compresión, a partir de harina de yuca, polvillo de fique (malla 60 AISI 304) y plastifi- cante (glicerol USP comercial, pureza 99,0%, Sigma- Aldrich). La harina fue obtenida en un molino de marti- llos (Penagos, TP8) a partir de trozos secos de raíces de yuca de las variedades MPER 183 (MPER), MBRA 383 (MBRA), CM 7951-5 (CM 79), y CM 4574-7 (CM 45) cultivadas en el municipio de Caloto (Cauca, Co- lombia). El polvillo de fique suministrado por la empre- sa Empaques del Cauca de Popayán (Cauca, Colom- bia) fue procesado de la misma forma que la harina. Preparación de los Biocompuestos La harina de yuca (HY) el polvillo de fique (PF) y el glicerol (G) con proporción 60, 25 y 15%, respectiva- mente, se homogenizaron en una mezcladora indus- trial (KitchenAid, USA) durante 30 minutos con adi- ción de 60 % de agua (p/p), posteriormente la mezcla fue termo-comprimida (Prensa Plasmega, Colombia) a 200°C durante 3 minutos [5]. De forma similar se elaboraron muestras de los bioplásticos sin polvillo de fique para establecer la influencia del mismo sobre la evaluación mecánica. Evaluación mecánica Las pruebas de resistencia a la tensión fueron evalua- das de acuerdo a la norma ASTM D638-10. Se deter- minó el esfuerzo en la rotura (sT) y el modulo elástico (ET) en muestras tipo I, acondicionadas durante diez días a 23 ± 1ºC y 50 ± 1% de humedad relativa pre- viamente a la prueba. Se evaluaron 10 muestras por tratamiento y cada tratamiento se realizó por triplicado. La resistencia a la flexión se evaluó bajo las especifi- caciones de la norma ASTM D790-10. Se determinó el esfuerzo en la rotura (ou) y el modulo elástico (EF) en muestras acondicionadas durante diez días a 23 ± 1ºC y 50 ± 1% de humedad relativa previamente a la prueba. Se evaluaron 5 muestras por tratamiento y cada tratamiento se realizó por triplicado. Para la evaluación de las pruebas de tensión y flexión se utilizó un texturómetro (Shimadzu, EZ Test L, Ja- pón), equipado con una celda de carga de 500 N. Se evaluó la resistencia al impacto de acuerdo a la nor- ma ASTM D256-10, en un equipo Izod (Impact Tester TNI No. 43-1, Testing Machines Inc). Se determinó la energía (J/m) de la rotura de la muestra impactada. Se evaluaron 8 muestras por tratamiento y cada trata- miento se realizó por triplicado. Se empleó un diseño experimental de un factor “va- riedad de yuca” con cuatro niveles (cuatro variedades de yuca). Los resultados fueron analizados con el pro- grama SPSS versión 20, mediante análisis de varianza (nivel de confianza del 95%) y prueba de tukey para la comparación de medias. Las muestras de poliestireno expandido usadas como patrón de comparación fueron obtenidas de bandejas comerciales (Darnel®) con las dimensiones requeridas para cada prueba según las normas ASTMD empleadas. RESULTADOS Tensión La figura 1, muestra que los materiales elaborados con harina de yuca de variedad MPER 183 presentaron mayor s T y E T , comparado con las otras variedades 80 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (77- 84) y la muestra patrón de poliestireno expandido PS. Las muestras de PS presentaron E T de 60,4MPa y s T de 1,15MPa. En general, las muestras de bioplás- ticos presentaron valores superiores al patrón de comparación en cuanto a s T y E T , destacándose la variedad de yuca MPER 183 con 1,75 MPa y 366,7 MPa respectivamente. Otros estudios mostraron valores de E T menores a 250 MPa, en barras moldeadas por compresión ela- boradas con almidón termoplástico de papa con glice- rol y agua [6]. Los valores promedio de propiedades mecánicas de tensión de los bioplásticos a base de harina de yuca MPER 183 son cercanos a los reporta- dos por Reolón [7], quien evaluó muestras de bande- jas moldeadas por compresión a base de almidón de yuca, cal y fibras celulósicas, y encontró valores de s T de 1,7 MPa en muestras de 3 mm de espesor con 15% de fibra y comprimidas a 200°C durante 3 minu- tos; en otro estudio realizado en espumas extruidas a partir de almidón de papa y fibra de coco para uso como material de empaque, se reportaron valores de s T <1 MPa [8]. Sin embargo, comparados con otro tipo de compuestos biodegradables, los valores de s T y E T de las muestras moldeadas basadas en ha- rina de yuca, son bajos. Un estudio en compuestos biodegradables moldeados por compresión a base de Mater-Bi® (mezcla comercial de almidón, celulosa y aditivos) con refuerzos de fibra de sisal, encontró va- lores de s T de 16,8 MPa y E T de 2,2 GPa [9]. Por otra parte, de acuerdo con Janssen y Moscicki [10], la excesiva expansión y la presencia de poros afecta adversamente los valores de s T de los mate- riales termoplásticos; en las muestras valoradas la presencia de porosidades se evidencia con las mi- crografías tomadas con la técnica MEB (Microscopía Electrónica de Barrido), como se aprecia en la figura 2. En la imagen, se observan grietas y espacios intersti- ciales en la superficie del material, y también se apre- cia una incompleta plastificación de los gránulos de almidón en el material moldeado, lo que pudo influir en la respuesta a la tensión observada. Se ha reportado que los valores más bajos de E T fueron obtenidos en muestras extruidas basadas en almidón de maíz por causa de la presencia de poros en los extruidos [10]. Los resultados del análisis de varianza para determinar el efecto de la variedad de yuca sobre la resistencia última de tensión (o T ), y módulo de elasticidad (E T ) ob- tenidos tras la tracción de las muestras determinaron diferencias significativas (p<0,05) entre las varieda- des evaluadas y los valores F indicaron que la “varie- dad de yuca” afectó en mayor medida el E T y en menor medida el o T . Se realizaron pruebas de tensión de muestras mol- deadas por compresión sin adición de fibra de fique, obteniéndose valores promedio de 1,1 MPa y 164 MPa para o T y E T respectivamente. La inclusión de fique en la matriz termoplástica de harina de yuca incremen- tó la resistencia a la tensión en 37,2%, 36,2%, 35,1% y 12,1% y el módulo elástico en 119,7%, 108,7%, 104,1% y 76,5% para las muestras elaboradas con variedades MPER 183, MBRA 383, CM 4574-7 y CM 7951-5, respectivamente. Esto indica que la fibra ac- túa como refuerzo en la matriz termoplástica, dado el incremento de dichas propiedades mecánicas al ser incorporada como componente en la mezcla. Otro pa- Figura 1. Propiedades de tensión de los bioplásticos Figura 2. Micrografía MEB de la superficie del bioplástico 81 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (77- 84) rámetro que justifica la cualidad reforzante de la fibra de fique en las muestras valoradas es la razón de pro- porción o de aspecto “aspect ratio” de la fibra [11], la cual está dada por “L/D” donde “L” es la longitud de la fibra y “D” su diámetro. Los valores de razón de aspecto menores a 10 son indicativos de que la fibra no refuerza el material, sino que actúa como relleno; valores entre 10 y 50 representan un efecto moderado de la fibra al incrementar la resistencia tensil y flexural de la matriz a la que se añaden, y valores superiores a 50 ratifican el incremento significativo de dichas pro- piedades mecánicas por efecto de la fibra incorporada [12]. De acuerdo con los resultados de la morfometría de fibra de fique realizada por la técnica de microsco- pía óptica de alta resolución MOAR [5], las fibras con longitud promedio de 860 µm y diámetro promedio de 36,2 µm presentaron razón de aspecto de 23,8, indicando que ejercen un incremento moderado de la resistencia a la tensión y flexión de los bioplásticos basados en harina de yuca termo-comprimidos. Al incorporar el 25% de fibra a la mezcla para elaborar el bioplástico, se presentó un aumento del 37% en el o T y el 105,3% en el E T , con respecto a las muestras sin fibra de fique. Este incremento es un indicativo del alto nivel de adhesión entre las fibras de fique y las matriz de harina de yuca plastificada con glicerol y agua, dado su similitud química, la cual favorece el proceso de termoplastificación durante el moldeo por compresión y posteriormente la unión entre los enla- ces de hidrógeno. Este fenómeno de compatibilidad en materiales amiláceos reforzados con fibras naturales también se ha reportado en otros estudios [13,14]. Flexión En la figura 3 puede notarse que las muestras del tra- tamiento MPER 183, mostraron un comportamiento superior en cuanto a o F (3,5 MPa) y E F (380,5 MPa), frente a las muestras fabricadas con harina de las va- riedades restantes. Se realizaron ensayos de flexión para el patrón de comparación de PS y se encontraron valores de E F : 78,9 MPa y of: 0,96 MPa, lo que permi- te deducir que las muestras objeto de estudio fueron superiores al patrón de comparación. Algunos investigadores han reportado estudios de propiedades flexurales para espuma de PS comercial (E F : 124 MPa; o F : 1,6 MPa) y cartón (o F : 3,1 MPa) (Shey et al., 2006); al comparar las muestras basadas en harina de yuca éstas fueron superiores en propie- dades mecánicas de flexión, dado que o F estuvo entre 1,95 y 3,50 MPa y E F mostró valores entre 222 y 380 MPa. Estos mismos investigadores reportaron similar comportamiento en materiales basados en almidón de papa, trigo y maíz elaborados por moldeo compresión, en condiciones similares de acondicionamiento, con valores de E F entre 64 y 225 MPa y o F entre 1,45 y 3,7 MPa [15]; y Aguilar y otros autores [8], reportaron va- lores de E F entre 14 y 351 MPa en materiales amiláceos obtenidos por extrusión reforzados con fibra de coco. Adicionalmente se realizaron ensayos de flexión en muestras elaboradas sin adición de fibra de fique, resultados que validan el efecto de refuerzo que está ejerciendo la fibra en las muestras evaluadas, ya que al incorporarla, la resistencia o F incrementó en 115,2%, 105,5%, 94,8% y 20,2% y el módulo elástico y E F en 99,2%, 91,1%, 81,6% y 16,6% para las muestras con harina de variedades MPER 183, CM 4574-7, MBRA 383 y CM 7951-5, respectivamente. Sin embargo, los valores más altos de propiedades mecánicas flexurales obtenidos en el presente trabajo en muestras manufacturadas con harina de variedad de yuca MPER 183, son inferiores comparados con otros materiales con aplicaciones similares como espumas biodegradables con 10% de humedad obtenidas por cu- rado a partir de almidón de yuca reforzadas con fibra de yute, en las que el o F en muestras con 1% y 10% de contenido de fibra estuvo entre 3 y 3,5 MPa, y entre 6,5 y 7 MPa respectivamente, siendo L/D=28,8; conjunta- mente, cuando L/D aumentó a 287,5 el o F en muestras con contenido de 10% de fibra resultó por encima de 10 MPa [16]. En otro estudio de compuestos biodegrada- bles elaborados por moldeo compresión reforzados con fibras de sisal se obtuvieron valores de E F : 2,8 GPa al incorporar 15% de fibra [9]. Figura 3. Propiedades de flexión de los bioplásticos 82 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (77- 84) El análisis de varianza indico que la “Variedad de Yuca” afectó significativamente (p< 0,05) el o F y E F obteni- dos en la prueba de flexión de las muestras moldea- das por compresión, evidenciándose el mayor efecto sobre o F y menor sobre E F . Impacto La figura 4 muestra que las probetas elaboradas con harina de la variedad de yuca MPER 183, fueron las que mayor Resistencia al Impacto (RI) presentaron, mientras las elaboradas con harina de CM 7951-5 fue- ron las de RI más bajo. A diferencia de las pruebas de tensión y flexión, los ensayos de impacto son ensayos de rotura a elevada velocidad en los que se aplica a una probeta de material una cantidad de energía de forma puntual con el fin de provocar su ruptura, de- terminándose la energía necesaria para ello [17, 18]. En los ensayos de tensión, las velocidades de defor- mación son muy lentas, por lo que las moléculas de la muestra polimérica tienen la oportunidad de des- lizar sus cadenas entre sí, logrando altos niveles de deformación; en la prueba de impacto, la velocidad de deformación es extremadamente rápida, por lo que el tiempo es insuficiente para que estos mecanismos ocurran y la muestra se fractura de forma instantánea reflejando la fragilidad de la muestra [19]. Las muestras basadas en harina de yuca presenta- ron valores superiores frente a compuestos no bio- degradables elaborados por curado a partir de resina epóxica reforzados con fibra de sisal y vidrio cuya RI estuvo entre 10 y 12.8 J/m [20]. De forma similar, los bioplásticos elaborados con harina de yuca presenta- ron valores de impacto más altos que materiales cura- dos a base de resina epóxica y aceite epoxidisado de soya cuyo RI fue de 16 y 20 J/m y compuestos bio- degradables obtenidos por inyección-moldeo a partir de MaterBi® reforzados con cañamiza (subproducto industria caña) con valores de RI entre 8,7 y 18,6 J/m [21]. Otro estudio realizado en muestras de resina de poliéster reforzadas con fibra de rastrojo de piña, re- portó valores de RI de 8 J/m [18]. La literatura reporta que los valores de RI están muy influenciados por la elección fibra/matriz [22, 23]. Los valores presenta- dos en la figura 4 reflejan una alta adherencia entre los componentes de la mezcla: fibras y matriz termo- plástica, evidenciando la respuesta más alta para las muestras elaboradas con harina de variedad MPER 183. Usualmente, los compuestos reforzados con fi- bras presentan alta resistencia al impacto, debido a que los altos pesos moleculares del polímero generan entrelazamientos entre sus cadenas, por lo tanto, su movilidad relativa se reduce y la adherencia entre la fibra y la matriz polimérica aumenta, y esto, a su vez aumenta la capacidad de absorción de energía de los compuestos [24]. Para comprobar el efecto de la adición de fibra en las propiedades de impacto de las muestras, se realizaron ensayos con muestras sin adición de fibra, determi- nando que efectivamente la adición de fibra incremen- tó en 23,5% la RI de las muestras valoradas. Sin em- bargo, frente al patrón de PS, las muestras con fibra evidenciaron una disminución del 2,12% en la RI, lo cual se justifica por la gran cantidad de aire presente dentro de la matriz del PS expandido versus el material basado en harina de yuca, ya que el aire actúa como “amortiguador” en el material, incrementando la can- tidad de energía requerida para impactar la muestra del mismo. El análisis de varianza mostró que el factor “Variedad de Yuca” afectó significativamente (p<0,05) la RI de las muestras moldeadas por compresión. CONCLUSIONES Las muestras moldeadas por compresión elaboradas con harina de variedad de yuca MPER 183 presentaron valores más altos en propiedades de tensión, flexión y resistencia al impacto, frente a las elaboradas con harina de las variedades MBRA 383, CM 4574-7, CM 7951-5, siendo esta última la que presentó las propie- dades más bajas. Figura 4. Resistencia al “impacto izod” de los bioplásticos Las letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos (p<0,05). 83 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (77- 84) Se evidenció un incremento en las propiedades mecá- nicas de tensión, flexión e impacto con la incorpora- ción de fibra de fique a la matriz termoplástica de harina de yuca en los bioplásticos elaborados con las cuatro variedades de yuca. De igual forma, las muestras con fibra presentaron mayores valores en la evaluación mecánica comparadas con el patrón de PS, favore- ciendo consecuentemente sus propiedades técnicas y funcionales para sus posibles aplicaciones agroin- dustriales, como los empaques tipo bandeja, vasos y recipientes cuyo soporte mecánico sea similar al del PS; también podría evaluarse su uso como recipiente para el cultivo de plántulas en el sector hortofrutícola. AGRADECIMIENTOS Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural y la Uni- versidad del Cauca por su apoyo en el desarrollo de la investigación. REFERENCIAS [1] RAZZA, F., FIESCHI, M., INNOCENTI, F. and BAS- TIOLI, C. Compostable cutlery and waste mana- gement: An LCA approach. Waste Manage, 29 (4), 2009, p. 1424–1433. [2] TUNJANO, V., SALCEDO, F., JIMÉNEZ, I., MEDI- NA, J., ALVAREZ, O. y PRIETO, E. Estudio de las propiedades térmicas y mecánicas del almidón termoplástico (TPS) reforzado con nanoarcilla. Revista latinoamericana de metalurgia y materia- les. S1, 2009, p. 29-36. [3] BEHERA, AK., AVANCHA, S., SEN, R. and AD- HIKARI, B. Development and Characterization of Plasticized Starch-Based Biocomposites with Soy Pulp as Reinforcement Filler. Journal of Applied Polymer Science, 127 (6), 2013, p. 4681–4687. [4] JANSSEN, L. and MOSCICKI, L. Thermoplas- tic Starch. Weinheim (Germany): Wiley VCH, 2010, 242 p. [5] NAVIA, D. 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To deter- mine their degree of incorporation, the diterpene glycosides were identified and quantified both in the prepared syrups and in the honey obtained by the analytical technique of high performance liquid chromatography (HPLC) using a NH 2 column (Zorbax-Agilent) and, as a mobile phase, a mixture of acetonitrile: water (70:30) with ultraviolet detection to 194 nm. Quantification was performed by means of a calibration curve where high rates of incorporation, exceeding 97% for stevioside and rebaudioside A, were found. For the standardization of the analytical techni- que, parameters were determined such as linearity, analytical sensitivity, detec- tion limit, quantification limit and precision, showing that the method developed is Recibido para evaluación: 26-03-2013. Aprobado para publicación: 24-07-2013. 1 Ph D. Grupo de Investigación de Química de Productos Naturales (QPN), Departamento de Química, Universidad del Cauca. Calle 5 No. 4-70. Popayán, Colombia. Tel: 0057-2-8209900 Ext. 2334 - 2320. Fax: 0057-2-8209900 Ext. 2306. 2 M Sc. Grupo de Investigación de Química de Productos Naturales (QPN), Departamento de Química, Universidad del Cauca. Calle 5 No. 4-70. Popayán, Colombia. Tel: 0057-2-8209900 Ext. 2334 - 2320. Fax: 0057-2-8209900 Ext. 2306. * Corresponding:
[email protected] 86 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (85- 91) simple, fast and reliable within the established limits, and levels up to 0,08 ppm for stevioside and 0,09 ppm for rebaudioside A. RESUMEN El objetivo del presente trabajo fue incorporar de forma natural en la miel los principales glicósido diterpenos dulces de la Stevia rebaudiana, de- nominados esteviósido y rebaudiósido A, con el fin de reunir las propie- dades edulcorantes de estas dos sustancias; para comprobar su grado de incorporación se identificaron y cuantificaron los glicósido diterpenos tanto en los jarabes preparados como en la miel obtenida mediante la técnica analítica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) usan- do una columna NH 2 (Zorbax-Agilent) y como fase móvil una mezcla de acetonitrilo:agua (70:30) con detección en el rango ultravioleta a 194 nm. La cuantificación fue realizada por medio de una curva de calibración en- contrándose porcentajes de incorporación altos, superando el 97 % para esteviósido y rebaudiósido A; para la estandarización de la técnica analítica se determinaron parámetros como: linealidad, sensibilidad analítica, límite de detección, límite de cuantificación y precisión, demostrándose que el método desarrollado es simple, rápido y confiable, dentro de los límites establecidos, se detectaron niveles hasta de 0,08 ppm para steviósdio y 0,09 ppm para rebaudiósido A. RESUMO O objetivo deste estudo foi o de incorporar um doce mel natural diterpenes as principais glicósido de Stevia rebaudiana, estévia e apelou rebaudiósido A, a fim de satisfazer as propriedades edulcorantes destas duas subs- tâncias, a fim de verificar seu grau de incorporação foram identificados glicósido diterpenes quantitated e em preparações, como xaropes de mel obtidas pela técnica analítica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), utilizando uma coluna NH 2 (Zorbax, Agilent) como fase móvel e uma mistura de acetonitrila: água (70:30) com detecção no ultravioleta gama em 194 nm. A quantificação foi realizada por meio de uma curva de calibração foi encontrado altas taxas de incorporação, superior a 97% para estéviosido e rebaudiosido A; para a padronização dos parâmetros analíti- cos foram determinados: linearidade, sensibilidade analítica, de detecção, limite identificação e precisão, mostrando que o método desenvolvido é simples, rápido e confiável dentro dos limites foram detectados níveis de até 0,08 ppm e 0,09 ppm para steviósdio para rebaudiósido A. INTRODUCTION Stevia rebaudiana Bertoni, a Paraguayan herb also known as Kaa Hee or “sweet herb”, has attracted a lot of interest as a potential source of natural non-caloric sweetener for use as a substitute for synthetic sweeteners. This plant is being used as a great deal in Brazil, Argentina, Paraguay, Chi- na, Korea and Japan. Stevia rebaudiana contains six diterpene glycosides with a strong sweet taste, the most abundant and important of which is ste- KEYWORDS: Stevioside, Rebaudioside A, HPLC, Quantification. PALABRAS CLAVES: Steviósido, Rebaudiósido A, HPLC, Cuantificación. PALAVRAS-CHAVE: Steviósido, Rebaudiósido A, HPLC, Quantificação rápida. 87 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (85- 91) vioside, with a sweetening power 300 times greater than sucrose. Rebaubioside A is second in abundance and is 400 times sweeter than sucrose. The rest is of less commercial interest: rebaudioside C and dulco- side A and at trace level, rebaudioside E and D [1-3]. It has been shown that stevioside directly stimulates pancreatic B cells to considerable insulin secretion, so it is ideal for diabetics [4-8]. They are commonly used as natural sweeteners in beverages and foods [13-15], with their main properties including thermal stability up to 238ºC, resistance to acid hydrolysis, they are not fermentable and, most importantly, non- toxic, making them quite attractive as additives in food and clinical applications [16-19]. Figure 1 presents their structures. In this case Stevioside and Rebaudioside A are used for the preparation of syrups in the food of bees, es- pecially in winter time or when flowering is scarce. In the Alps Apiary of the company Productos Naturales Arroyave, located in the Department of Cauca (Colom- bia), studies have been undertaken feeding bees with fruit juices and commercial sugar, from which honeys have been produced which are known commercially as honey express or frutimiel. There has been success with express honeys such as soybean, eucalyptus, milk, guava, passionfruit and Stevia. The main feature of this product is the combination of the properties of the honey and the juice added [20]. A wide range of analytical techniques have been used to identify and/or quantify the steviosides in foods, drinks and different matrices [21-24] which include TLC [26], capillary electrophoresis, enzymatic and infrared spectroscopy techniques. The most common analytical method is high pressure liquid chromatography (HPLC) [27-30] in which the detection is performed using the UV-Vis detector, and the separations using columns such as C 18 , Hidroxiapatite and amino. The aim of this work is to obtain a honey which con- tains greater sweetening power than natural honey, called express honey from Stevia, besides achieving the standardization of the HPLC methodology for the identification and quantification of stevioside and re- baudioside A present in this honey. METHOD This research was conducted in two stages, the first in the field and the second in the laboratory. Fieldwork The fieldwork was carried out following the methodo- logy described by Benítez et all. to obtain express ho- ney, with selected hives. [31] Selection of the hives. We worked with bees of genus Apis mellifera, using six large hives. Preparation of the syrups. All of the required sugar was dissolved in boiling water, and then Stevia extract was added and the mixture was allowed to boil again Figure 1. Structure of stevioside and rebaudioside A CH 3 CH 2 H C=O O H O H 3 C O OH HO HO HOH 2 C O HO HOH 2 C O OH HO HO HOH 2 C O HO CH 3 CH 2 H C=O O H O H 3 C O OH HO HO HOH 2 C O HO HOH 2 C O OH HO HO HOH 2 C O O HO HO HO HOH 2 C O Table 1. Formulations for the preparation of Stevia-based syrups and sugar trade. Formulation Ingredients Double strength sweetness Triple strength sweetness Kg of water 1,000 1,000 Kg of sugar 1,300 1,300 Kg of Stevia extract 0,005 0,010 Hives 1, 2, 3 4, 5, 6 88 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (85- 91) for 5 minutes. Table 1 shows the amounts of each of the ingredients. The dates according to the calendar to provide food for the bees are associated with periods of rain or lack of bloom throughout the year. Express Honey Harvest. The harvest of express ho- ney was made when there were cells of sealed honey, using the same criteria as for normal honey, following the methodology described by Benítez et all. [31] Working in the laboratory Samples were taken to the laboratory for analysis as indicated below Chromatographic analysis. We used a high performan- ce Hewlett-Packard 1100 Liquid chromatograph, UV-Vis detector, analytical column Agilent Zorbax NH 2 - 5µm x 4,6 x 250 mm, wavelength 194 nm, mobile phase acetonitrile:water (70:30) in isocratic mode, with flow of 0,6 mL/min. Conditions developed in the QPN laboratory. Stevioside and rebaudioside A ITI Miami International Inc., Florida. standards were used. The Stevia extract was pur- chased from Bio-Stevia SA © , Santiago de Cali-Colombia). Sample preparation. 0,020 g of Stevia honey was weighed, diluted to 10,0 mL, and passed through a nylon filter of 0,45 µm for identification by HPLC . RESULTS The retention times for Stevioside and rebaudioside A were determined in the HPLC column, it can be seen in the table 2. In the chromatographic profile, in figure 2, it is shown that these two glycosides can be separated with a resolution to baseline level under the experimen- tal conditions described above. Calibration curve The coefficients of determination (R 2 ) and the equation of the curve, it can be seen in the table 2, were calcu- lated yielding R 2 values very close to 1,0, indicating that the curve presents a linear behavior and is directly proportional, with a low dispersion of values. Accuracy (Repeatability). To determine the accuracy of the method the area of two standard solutions of ste- vioside and rebaudioside A of 40 ppm was measured ten times consecutively and standard deviations were calculated based on the average area, in order to as- sess repeatability. According to the results obtained, one can observe that the values of RSD, under a para- meter of confidence of 95% are low, so the method for quantification of stevioside and rebaudioside A by HPLC showed repeatability. It can be seen in the table 2. Reproducibility. To determine the reproducibility of the method, a standard solution of 10 ppm concentration of the two glicosides was used, the measurements were carried out in triplicate for thirty days, with values less than 1,5% relative standard deviation (RSD) indi- cating that the chromatographic method is reproduci- ble and reliable, it can be seen in the table 2. Figure 2. Chromatographic profile of the standards for stevioside and rebaudioside A Table 2. Parameters found in the standardization of the method Parameter Stevioside Rebaudoside A Retention time (tr) (min) 8,5 10,3 R 2 0,9984 0,9982 Curve equation Y=8,998x + 5,225 Y=18,643x - 2,387 RSD (repeatability) (%) 1,34 0,25 RSD (reproducibili- ty) (%) 0,41 0,74 Recovery rate (%) 99,58 99,11 LD detection limit (mg/L) 0,08 0,09 LQ Quantification limit (mg/L) 0,28 0,32 89 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (85- 91) Accuracy. The recovery by this method is high sur- passing 99% for stevioside and rebaudioside A, thus verifying the accuracy of the system, It can be seen in the table 2. Detection limit and quantification limit. To assess the sensitivity of the instrument and to calculate the minimum concentration detected of stevioside and rebaudioside A, two additional calibration curves are constructed in a concentration range of 1-5 mg/Kg for these glycosides. The values of both the detection limit and quantification limit are quite low indicating that the proposed methodo- logy is sensitive and the UV detector is ideal because it has a good sensitivity to generate a minimum signal of these compounds, it can be seen in the table. The table 3 presents the percentage of incorporation of stevioside and rebaudioside A found in honey samples with double and triple Stevia sweetening power for the six hives evaluated, an amount which exceeds 97% for stevioside and rebaudioside A. In figure 3 the chroma- togram is shown for a sample of Stevia honey. With these results, it was shown that it was possible to incorporate the main glycosides of Stevia into the honey. In order to determine whether the increased sweetness present in Stevia honey was detected by consumers, a sensory evaluation was performed. By carrying out this study it could be determined that the bees properly assimilated the main glycosides of the Stevia, which was shown by high percentages of incorporation exceeding 97% for stevioside and rebau- dioside A. CONCLUSIONS This research and the results obtained in it have allowed us to find a new way of producing express honey, obtaining a product with added value and fea- tures that make it attractive to the different national markets and with a high profile international. The high performance liquid chromatography (HPLC) with UV detection proved to be a good technique and a useful tool for confirmation of the existence of stevioside and rebaudioside A in samples of honey and Stevia and for quantitative determination. We managed to optimi- ze the chromatographic parameters such as linearity in the working range, precision, accuracy and sensi- tivity of the method for standardization of analytical methodology that allowed the determination of the pre- sence of stevioside and rebaudioside A in Stevia honey samples efficiently and reliably. ACKNOWLEDGEMENTS The authors would like to thank the Vice-Chancellor of Research at the Universidad del Cauca and the Andres Bello Agreement - Universidad del Cauca Contract # 005, for funding this research. Table 3. Amount of stevioside and rebaudioside A found in honey samples with double and triple Stevia sweetening power (DPE and TPE) H i v e C o n c e n t r a t i o n Syrup (mg/g sample) Stevia Honey (mg/g sample) % I n c o r p o r a t i o n S t e v i o s i d e % I n c o r p o r a t i o n R e b a u d i o - s i d e A S t e v i o s i d e C o n c e n t r a t i o n S t e v i o s i d e C o n c e n t r a t i o n S t e v i o s i d e C o n c e n t r a t i o n R e b a u d i o s i d e A C o n c e n t r a t i o n 1 D P E 1,44 3,12 1,41 3,06 97,9 97,4 2 1,39 3,07 1,35 3,05 97,1 99,4 3 1,31 3,18 1,29 3,14 98,5 98,7 4 T P E 2,87 6,11 2,79 5,90 97,2 96,6 5 2,77 6,08 2,72 5,90 98,2 97,0 6 2,62 6,00 2,57 5,78 98,1 96,8 Figure 3. Chromatograms for a sample of Stevia honey. 90 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (85- 91) REFERENCES [1] PÓL, J., HOHNOVÁ, B. and HYÖTYLÄINEN, T. 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Biotecnologia en el sector agropecuario y agroindustrial, 3(1), 2005, p. 70-73 92 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (92 - 100) EFECTO DE RECUBRIMIENTO A BASE DE ALMIDÓN SOBRE LA MADURACIÓN DE LA GUAYABA (Psidium guajava) EFFECT OF STARCH-BASED COATING ON THE MATURATION OF GUAVA (Psidium guajava) EFEITO DA REVESTIMENTO À BASE DE AMIDO NO AMADURECIMENTO DE GOIABA (Psidium guajava) SANDRA MARCELA ACHIPIZ 1 , ASTRID EUGENIA CASTILLO 2 , SILVIO ANDRÉS MOSQUERA 3 , JOSÉ LUÍS HOYOS 4 , DIANA PAOLA NAVIA 5 RESUMEN El objetivo del proyecto de investigación fue desarrollar un recubrimiento comes- tible a partir de almidón de papa (Solanum tuberosum L), aloe vera (Aloe barba- densis Miller) y cera de carnauba (Copernicia cerífera) y evaluarlo en guayaba (Psidium guajava) para prolongar la vida útil a temperatura ambiente. La aplicación del recubrimiento se realizó por inmersión de los frutos en los respectivos trata- mientos durante 30 segundos y secado durante 5 minutos a 35 ºC. Las guayabas fueron almacenadas en condiciones de la ciudad de Popayán, Departamento de Cauca, Colombia (1737 msnm, 19 ºC y HR de 77,75%), sobre bandejas de acero inoxidable previamente lavadas y desinfectadas. Se desarrollaron 4 tratamientos: la muestra testigo sin almidón y los recubrimientos con 2, 3 y 4% de almidón Recibido para evaluación: 22-01-2013. Aprobado para publicación: 25-05-2013. 1 Ingeniera Agroindustrial. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad del Cauca. Popayán. Cauca. Colombia 2 Ingeniera Agroindustrial. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad del Cauca. Popayán. Cauca. Colombia 3 Magíster en Ingeniería. Profesor titular. Departamento de Agroindustria. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad del Cauca. Popayán. Colombia.
[email protected] 4 Magíster en Ingeniería de Alimentos. Profesor asociado. Departamento de Agroindustria. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad del Cauca. Popayán. Colombia. 5 Magíster en Ingeniería de Alimentos. Profesora Facultad de Ingeniería. Universidad San Buenaventura. Cali. Colombia. Correspondencia:
[email protected] 93 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (92 - 100) respectivamente. Se evaluó la pérdida de peso, la tasa de respiración, la firmeza, el contenido de vitamina C y ácido predominante, encontrando que el tratamiento 4 mostró un efecto favorable frente a la pérdida de peso, la reducción de la tasa respiratoria, la firmeza y un significativo manteni- miento del contenido de vitamina C y de ácidos orgánicos del fruto a los 10 días de almacenamiento, en comparación con la muestra testigo. ABSTRACT The aim of the investigation project was to develop an edible coating starch from potato (Solanum tuberosum L), aloe vera (Aloe barbadensis Miller) and carnauba wax (Copernicia cerifera) and evaluate it in guava (Psidium guajava) to prolong life at room temperature. The coating application was made by fruit immersion in each of the respective treatments for 30 se- conds, and dried for 5 minutes at 35 o C. Guavas were stored in conditions of the city of Popayán, Departamento de Cauca, Colombia (1737 meters above sea level, 19 ºC and 77,75% RH) on stainless steel trays previously washed and disinfected. 4 treatments were developed: the control sample without starch and the coatings with 2, 3 and 4% starch respectively. Was evaluated the weight loss, respiration rate, firmness, vitamin C content and the predominant acid, finding that treatment 4 showed a favorable effect against weight loss, reduced respiratory rate, firmness and maintaining a significant content of vitamin C and fruit organic acid after 10 days of storage as compared with the control sample. RESUMO O objetivo do projeto de pesquisa foi desenvolver um revestimento co- mestível de amido de batata (Solanum tuberosum L), aloe vera (Aloe bar- badensis Miller) e cera de carnaúba (Copernicia cerifera) e avaliá-lo em goiaba (Psidium guajava) para prolongar a vida prateleira ambiente. A apli- cação do revestimento foi realizado por imersão do fruto em respectivos tratamentos durante 30 segundos e secagem durante 5 minutos a 35 ° C. Goiabas foram armazenadas em condições de a cidade de Popayan, Cauca Department, Colômbia (1737 m, 19 º C e 77,75% de umidade rela- tiva) em bandejas de aço inoxidável previamente lavados e desinfectados. 4 tratamentos foram desenvolvidos: a amostra de controlo sem amido e revestimentos com 2, 3 e 4% de amido, respectivamente. Foi avaliada a perda de peso, a taxa de respiração, a firmeza, o teor de vitamina C e o ácido predominante, considerar que o tratamento 4 mostrou um efeito favorável contra a perda de peso, redução da taxa respiratória, firmeza e manutenção significativo conteúdo de vitamina C e de ácidos orgânicos a partir da fruta, após 10 dias de armazenamento, em comparação com a amostra de controlo. INTRODUCCIÓN La guayaba es una planta tropical que crece en regiones tropicales de Amé- rica, Asia y Oceanía [1] cuyas partes contienen mucílago, pectina, prótidos, PALABRAS CLAVES: Poscosecha, Aloe vera, Cera de carnauba, Papa, Fisiología vegetal KEYWORDS: Postharvest, Aloe vera, Carnauba wax, Potato, Plant physiology PALAVRAS-CHAVE: Pós-colheita, Aloe vera, Cera de carnaúba, Batata, Fisiologia vegetal 94 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (92 - 100) lípidos, minerales (potasio, calcio, hierro y fósforo, en- tre otros), vitaminas A, B, y especialmente la G [2]. El mercado mundial de exportación en fresco es menor al 0,1% en tanto que el comercio de sus derivados es mucho mayor y cobra importancia especialmente en Europa [3]. Colombia posee condiciones agroecológicas favorables para el cultivo y la producción, siendo los de- partamentos de Santander y Boyacá (60% del total nacio- nal), Tolima (10%), Cundinamarca (9%), Huila, Antioquia, Cauca, Nariño y Atlántico, los de mayor producción. Des- afortunadamente, este cultivo presenta un retraso tecno- lógico que se refleja en bajos rendimientos y altos costos de producción, deficiencias de calidad y en la inestabi- lidad de la oferta, pues la mayoría de plantaciones son artesanales y se enmarcan en una economía campesina, donde buena parte de la mano de obra es familiar [4] lo que incrementa los riesgos de deterioro debido a su elevado grado de perecibilidad, problemas que pueden se resueltos mediante el uso de recubrimientos comestibles que crean una barrera semipermeable a los gases (O 2 y CO 2 ) y al vapor de agua, mejoran las propiedades mecá- nicas ayudando a mantener la integridad estructural del producto, a retener compuestos volátiles y también pue- den llevar aditivos alimentarios (agentes antimicrobianos, antioxidantes, entre otros) [5] elaborados a partir de pro- teínas, almidones hidrolizados, lípidos, gomas, pectinas, carragenanos y alginatos, entre otros [6]. Entre las opciones se tiene el aloe vera que cuenta con aproximadamente 300 especies con principios activos que les permiten el uso como antioxidante, antiinflama- torio, estimulador de los procesos digestivos, activador del sistema inmunológico (células), como ingrediente en alimentos funcionales [7,8] y en la preparación de recubrimientos para frutas como es el caso de la aplica- ción en cereza que logró retardar la maduración, reducir la pérdida de peso y disminuir la tasa de respiración du- rante el almacenamiento poscosecha [9]. Otro componente inportante es la cera de carnauba se obtiene de las hojas de la palma Copernicia cerífe- ra [10] y es reconocida por sus propiedades de brillo y dureza con resistencia al desgaste. Se usa para la elaboración de ceras resistentes al agua o emulsifica- das para el encerado de frutas y prolongar la vida de anaquel, tal como sucedió en guayaba que permitió controlar las variables de derioro al conservar la apa- riencia y lozanía al disminuir la transpiración [11]. La materia principal es el almidón que es excelente para modificar la textura y consistencia de los alimentos y su funcionalidad depende del peso molecular promedio de la amilosa y la amilopectina [12], así como de la orga- nización molecular de estos glucanos dentro del gránulo [13], por lo que se usa como adhesivo, ligante, entur- biante, formador de películas, estabilizante de espumas, agente anti-envejecimiento de pan, gelificante, glaseante, humectante, estabilizante, texturizante y espesante [14]. Las limitaciones de los almidones nativos se superan modificando la estructura por métodos químicos, fí- sicos y enzimáticos y obtener propiedades deseables como la optimización en la retención de agua, aumen- tar la estabilidad, mejorar la sensación al paladar y el brillo, gelificar, dispersar o conferir opacidad; además, los almidones modificados muestran mejor claridad de pastas, mejor estabilidad, incrementada resistencia a retrogradación e incremento en la estabilidad al ciclo congelación-descongelación [15]. En la papa los carbohidratos son el principal constitu- yente (85% en base seca) [16] y los gránulos de almi- dón contiene aproximadamente 24% de amilosa [17], además contiene aproximadamente 4,04% de cenizas, 10% de proteína, 0,39% de lípidos. Estos últimos for- man complejos con la amilosa, lo cual puede ser favo- rable en la elaboración de recubrimientos [16]. Se evaluaron recubrimientos a base de almidón de yuca sobre la maduración de los frutos de papaya Formosa “Tainung1” a temperatura ambiente [18], la vida útil del pepino (Cucumissativus L.) [19], la vida poscosecha de mango ‘Sorpresa’ (Mangifera acutigemma) [20] y el color superficial y la actividad de las enzimas PPO y POD en batatas (Ipomoea batatas) mínimamente pro- cesadas respectivamente [21], analizado la pérdida de peso, color, firmeza, sólidos solubles (SS), acidez titula- ble (AT), la relación SS/AT y pH, encontrando un retraso significativo en la maduración, en la pérdida de peso, cambios de color de la piel, la firmeza, sólidos solubles y acidez titulable. También se ha usado la combinación de calcio con cera comestible [22] en mangos “Kent” (Mangifera indica L), demostró que reduce la tasa respiratoria, la pérdida de peso y mejoran la apariencia externa sin afectar los parámetros de calidad de los frutos durante el almacenamiento. Otra sustancia que ha contribuido es la cera de carnauba en guayabas la cual redujo la pérdida de peso y la degradación de la clorofila, impidió la aparición de enfermedades oca- sionadas por patógenos y el aumento de los azúcares [11]. Se investigó el comportamiento de una película 95 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (92 - 100) a base de mango sobre mangos mínimamente pro- cesados [23], la cual proporcionó una buena barrera contra el oxígeno, redujo la pérdida de peso y amplió el período de maduración extendiendo la vida útil en 5 y 6 días más de lo normal. El propósito de la investigación fue medir el efecto de un recubrimiento a base de almidón de papa (Solanum tuberosum L), gel de aloe vera y cera de carnauba sobre la calidad de la guayaba a temperatura ambiente. MÉTODO La investigación se desarrolló en los laboratorios de Reología y Biotecnología y en la planta piloto de Frutas y Verduras de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad del Cauca, Vereda las Guacas del Muni- cipio de Popayán (Cauca) a 1760 msnm, temperatura promedio de 19 ºC y humedad relativa de 77,75% [24]. Materiales La guayaba fue cosechada de forma manual con color verde y visos amarillos hacia la zona ecuatorial y color amarillo en la zona apical [25]. Se usó almidón de papa variedad ICA Nariño, modificado enzimáticamente con alfa amilasas (10% dextrosa equivalente DE); Aloe vera especie Miller; cera de carnauba densidad de 0,995 g/ mol y punto de fusión de 84 °C; glicerina Dissan con pu- reza del 99,9% como agente plastificante [26] y Tween como agente surfactante. Métodos Se seleccionaron y clasificaron 120 frutos de 6 cm de diámetro, forma ovalada y sin pedúnculo; se sumergie- ron en agua potable durante 30 minutos en solución de hipoclorito de sodio a 5 mg L -1 durante 15 minutos [26] y se secaron. Se dividieron en grupos de 30 unidades por tratamiento y se dispusieron en bandejas de acero inoxidable. La sábila se desinfectó en solución de hipo- clorito de sodio a 5 mg L -1 por 10 minutos, se separó el cristal de la corteza y se licuó a 2000 rpm durante 1 minuto [27]. La cera de carnauba se maceró hasta obtener polvo y se sometió a baño maría a 84°C. El recubrimiento se preparó al baño María (entre 85 y 90 °C durante 5 minutos y posterior enfriamiento a temperatura ambiente [24]) mezclando 20% (p/v) de aloe vera, 0,1% de cera de carnauba, 2% (p/v) de gli- cerina y 0,02% de tween, con la cantidad de almidón (según el tratamiento) [28]. Los tratamientos fueron: T1 los frutos sin recubrir (muestra testigo) y frutos con recubrimiento al 2% (T2), 3% (T3) y 4% (T4) de concentración de almidón. Se tomaron los frutos y se recubrieron por inmersión, sosteniéndolos durante 30 segundos hasta homogenización y se secaron por convección forzada a 35 o C durante 5 minutos. Se realizó la evaluación durante 20 días bajo con- diciones ambientales (19 ºC y 77,75% humedad relativa), registrando datos cada 2 días, usando 12 unidades por tratamiento. Se midieron las siguientes variables por triplicado: Pérdida de peso. En balanza analítica RADWAG con precisión de ± 0,05 mg para determinar la variación de peso en el tiempo (ecuación 1): (Ec.1) Donde: Peso promedio, Peso inicial, Peso final. Tasa de respiración. Se usó el montaje de respirómetro que consta de trampas de CO 2 , tubo Petenkoffer, moto- res, mangueras, cámara de respiración, pinzas Hoffman y soportes universales, con ácido oxálico 0,1 N como agente valorante del Ba(OH) 2 , capturando el CO 2 libera- do por el fruto e indicando la intensidad de respiración en mg CO 2 /Kg.h (ecuación 2) [24]. (Ec.2) Donde: V m = Volumen ácido oxálico para titular la muestra (mL); V b = Volumen ácido oxálico para ti- tular el blanco (mL); N = Normalidad ácido oxálico (meq/L); 22 = Peso CO 2 (g/meq); 60 = Factor con- versión para el tiempo (min/h); t = Tiempo barrido (min); W = Peso de la muestra (Kg). Firmeza. Se desarrolló en la máquina universal Shimad- zu EZ-L, valorando la fuerza ante la compresión ejercida con celda de 500 N y velocidad de penetración de 1 mm/seg, perforando 10 mm del fruto, 2 veces por fruto. Sólidos solubles totales. Se pesaron 50 g de pulpa y 200 g de agua destilada, se licuaron para obtener 10 mL de jugo que se centrifugó a 5000 rpm por 15 mi- nutos. Se usó un refractómetro Atago escala 0-32 gra- dos Brix, depositando una gota de jugo para la lectura. 96 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (92 - 100) Vitamina C. Se tomaron 10 mL de agua destilada, 2 mL de muestra y 1 mL de H 2 SO 4 (10%). Se tituló con so- lución de Iodo al 0,001 N como indicador, con almidón al 1% hasta un cambio de color traslucido a azul [29]. Acidez titulable. Por titulación de 10 mL de jugo con NaOH 0,1 N y con 0,5 mL de fenolftaleína como indi- cador, hasta coloración rosada constante. Diseño experimental Se utilizó un diseño completamente al azar, con 4 tratamientos, variando la concentración de almidón de papa (AP). Se aplicó un nivel de significancia de o = 0,05 para rechazar o aceptar la hipótesis nula y se aplicó la prueba comparación múltiple de Tukey para la selección de medias mediante el uso del software SPSS versión 17. RESULTADOS Pérdida de peso Hubo diferencias significativas (Cuadro 1) y la prueba de Tukey indicó pérdida similar en los tratamientos T2 y T3, a diferencia de T4 que fue más eficiente a partir del día 8 (Figura 1). Los frutos de los tratamientos T2, T3 y T4 perdieron 35,08%, 32,71% y 22,21% respec- tivamente, menores que T1 con 40,13%, observando que la pérdida de peso es inversamente proporcional a la concentración del almidón [18, 20, 30]. Tasa de respiración Los frutos de T1 alcanzaron el pico climatérico luego de 12 días (Figura 2), en tanto que los frutos de T2 aumentaron su respiración hasta el día 16 con leve disminución hacia el día 18 indicando la posible ocu- rrencia del pico climatérico; los frutos de T3 mostraron aumento a partir del día 14 y los de T4 a partir del día 18, sin alcanzar el pico climatérico que se presentó luego de 9 días en tomate [26] y luego de 3 días con el uso de zeína [31]. Este comportamiento se relacio- Cuadro 1. Análisis de varianza para las variables evaluadas Suma cuadrados df Cuadrado medio F Sig. Pérdida de peso Entre grupos En el grupo Total 1127,844 14637,883 15765,727 3 116 119 375,948 126,189 2,979 0,034 Tasa de respiración Entre grupos En el grupo Total 2481584,336 1,201E7 1,449E7 3 116 119 827194,779 103517,567 7,991 0,000 Grados Brix Entre grupos En el grupo Total 11,811 58,405 70,216 3 116 119 3,937 0,503 7,819 0,000 Firmeza Entre grupos En el grupo Total 10965,367 55186,834 66142,201 3 92 95 3651,189 599,857 6,088 0,001 Vitamina C Entre grupos En el grupo Total 7117,146 98149,944 105267,090 3 116 119 2372,382 846,120 2,804 0,043 Acidez titulable Entre grupos En el grupo Total 0,216 0,483 0,699 3 116 119 0,072 0,004 17,313 0,000 Figura 1. Pérdida de peso (%) de la guayaba 97 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (92 - 100) na con la presencia de oxígeno como potenciador de la degradación y síntesis de metabolitos en el fruto, el cual se afecta por la barrera física que ejercen los recubrimientos [32]. Sólidos solubles totales Hubo diferencias significativas (Cuadro 1) entre los tratamientos (p<0,05) y la prueba de Tukey formó dos grupos: el primero con T2, T3 y T4 cuyas medias no difirieron significativamente (p=0,148) y el segundo con T1 que difiere de los anteriores. Se observó el in- cremento de 0,83, 0,56 y 0,50 grados Brix en los fru- tos de T1, T2 y T3 respectivamente, entre los días 0 y 6, mientras que en T4 se mantuvieron constantes, lue- go de lo cual se mantuvo tendencia creciente en todos los tratamientos por la degradación de los carbohi- dratos de cadena larga, dentro de los que se destacan los polisacáridos de la pared celular y el almidón, los cuales, se degradan en azúcares simples que pueden ser utilizados como sustrato en reacciones metabó- licas de respiración [24, 37]. La disminución de los gardos Brix en los frutos recubiertos puede estar rela- cionado con la menor tasa de respiración exhibida por estos frutos respecto a la muestra testigo, afectando la síntesis y degradación de compuestos de reserva en el ciclo de Krebs, que en el caso de los frutos son los azúcares y los ácidos orgánicos [36]. Firmeza El ablandamiento es atribuido a la degradación de los componentes de la pared celular, principalmente pec- tinas, por acción de enzimas como la pectinesterasa y la poligalacturonasa [34], esto además puede facilitar la pérdida de agua de los tejidos [34]. Hubo diferen- cias significativas (p<0,05) (Cuadro 1) y la prueba de Tukey generó dos grupos: uno con los frutos recubier- tos cuyos frutos presentaron mayor resistencia mecá- nica y el otro con T1. El comportamiento observado en los frutos se relaciona con la formación de una barrera superficial en el fruto generada por el recubrimiento, modificando la composición gaseosa interna, lo cual disminuye la tasa de respiración [35] y la degradación de los compuestos de la pared celular [31], mante- niendo su condición inicial medida en la oposición que ejerce el tejido a ser penetrado. El día 18, los frutos de T1 y T2 presentaron reducción de 90% y 70% respec- tivamente y los de T3 y T4 de 50% y 70%, lo que indi- ca que la concentración de almidón del recubrimiento fue inversamente proporcional a la pérdida de firmeza, comportamiento similar al encontrado con almidón de yuca al 4% en tomate [24] que presentó la menor pér- dida luego de 22 días. Vitamina C Hubo diferencias significativas entre los tratamientos (Cuadro 1) y la prueba de Tukey generó dos grupos: uno con T1 y otro con T2, T3 y T4 que presentaron mayor pérdida de vitamina C frente a los frutos de T4. Se observó disminución al día 18 en todos los trata- mientos, sin embargo, los frutos de T4 presentaron un valor promedio de 82,13 mg/100 g, seguido de los del T3 con 70,4 mg/100 g, los de T2 con 66,73 mg/100 g y los de T1 con 29,33 mg/100 g (Figura 3), comporta- miento relacionado posiblemente con la menor tasa de respiración exhibida por tratamientos con recubrimien- to respecto a la muestra testigo, modificando la sínte- sis y degradación de los metabolitos como vitaminas en el fruto [36]. Acidez Total Titulable Hubo diferencias significativas (p<0,05) entre los tra- tamientos (Cuadro 1) y la prueba de Tukey generó dos Figura 2. Comportamiento de la tasa de respiración Figura 3. Pérdida de vitamina C en los frutos 98 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (92 - 100) grupos: el primero con t1 que obtuvo la mayor dismi- nución con 0,59% al final de la prueba y el segundo con los restantes tratamientos con disminución de 0,67%, 0,69% y 0,73% respectivamente, debido a la menor tasa de respiración, y por tanto, menor consumo de sustratos de reserva de las guayabas recubiertas [37]. CONCLUSIONES Los tratamientos presentaron diferencias significati- vas frente a la muestra testigo en donde fue evidente la aceleración en la maduración y la pérdida en la calidad, observando que el recubrimiento con 4% de almidón fue el más eficiente al incrementar en 10 días la vida útil respecto al tratamiento sin recu- brimiento. Los cambios presentados en la textura y la pérdida de peso muestran el efecto favorable del recubrimiento al presentarse menor pérdida en los frutos debido a las propiedades de barrera y el retraso en la tasa de respiración, evidenciando un menor grado de deterioro de las muestras. AGRADECIMIENTOS Los autores expresan su agradecimiento a la Univer- sidad del Cauca por el apoyo en el suministro de re- curso humano y de infraestructura para adelantar la investigación. REFERENCIAS [1] ALBAN, R., FLORES, A. y TOBALINA, C. Proyec- to de inversión para la implementación de una planta procesadora de pulpa de fruta congelada ubicada en la CDLA. Urbano, en el mercado de Guayaquil (Tesis Maestría]. Guayaquil (Ecuador): Escuela Politécnica del Litoral, Facultad de Cien- cias Humanísticas y Económicas, 2006. [2] BONILLA, L. y PEÑA, P. Boletín técnico No 8: Cul- tivo de la Guayaba. Santo Domingo (República Dominicana): Fundación de Desarrollo Agrope- cuario (FDA) Inc., 1992. [3] COLOMBIA. 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Medellín (Colombia): Universi- dad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Ingeniería Agrí- cola y de Alimentos, 2009, 83 p. 101 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (101 - 111) EL EFECTO SPILLOVER: IMPACTO SOCIAL DE LA INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO UNIVERSITARIO THE SPILLOVER EFFECT: THE SOCIAL IMPACT OF THE UNIVERSITY RESEARCH AND DEVELOPMENT O EFEITO SPILLOVER: IMPACTO SOCIAL DA PESQUISA E DESENVOLVIMENTO DA UNIVERSIDADE CAROLINA DELGADO 1 , ZAMANTA CORREA 2 , YENNI ANGÉLICA CONDE 3 RESUMEN La función de la universidad pública en términos de investigación y desarrollo gira en torno a procesos de consolidación y socialización del conocimiento. La Univer- sidad no apropia todos los beneficios resultantes de sus procesos investigativos, sino que estos se trasladan a terceros en forma de externalidades positivas, fe- nómeno denominado Spillover. El objetivo del trabajo fue determinar si el efecto spillover se produce al interior de una universidad pública, utilizando un enfoque metodológico mixto, integrando elementos de la investigación modo 1, fuentes documentales, para establecer las variables y la Modelación lógica del sistema I&D de la universidad y la elaboración de perfiles de efecto Spillover; y del modo 2, panel de expertos, para la construcción de la matriz del efecto spillover de la I&D universitaria. Los resultados indican que: i) en la universidad se presentan las tres Recibido para evaluación: 27-09-2012. Aprobado para publicación: 27-05-2013. 1 Administradora de Empresas. Magíster en Ingeniería Industrial. Facultad Ciencias Contables, Económicas y Administrativas. Departamento de Ciencias Administrativas. Universidad del Cauca.
[email protected]. 2 Psicóloga. Magister en Administración de Empresas. Facultad de Ciencias Contables, Económicas y Administrativas. Departamento de Ciencias Administrativas. Universidad del Cauca. zcorrea@ unicauca.edu.co 3 Administradora de Empresas. Magíster en Psicología Organizacional y del Trabajo. Facultad de Ciencias Contables, Económicas y Administrativas. Departamento de Ciencias Administrativas. Universidad del Cauca.
[email protected] Correspondencia:
[email protected] 102 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (101 - 111) categorias de efecto spillovers (conocimiento, red, mercado) y se presenta el efecto combinado a través de la propiedad intelectual; ii) los articulos y libros de investigación publicados en bases de datos como Scienti podrían ser importantes mecanismos de transmisión de externalidades positivas. iii) Los productos de investigacion que producen docentes durante su for- mación postgradual son un importante canal de difusión de Spillovers de conocimiento. ABSTRACT The role of the public university in terms of research and development focu- ses on the processes of consolidation and socialization of knowledge. The University does not capture all the benefits resulting from the processes of research and these are transferred to third parts in form of positive spillo- vers, this is known as the Spillover phenomenon. In this effort it creates benefits that get transferred to the society impacting the quality of life of the communities involved. The Project aims to determine if the spillover effect occurs within a public University integrating elements of the research type 1, documentary sources, to establish the variables and the logical modeling of the University system of R&D and elaborating the profiles of the spillover effect, and using the research type 2, panel of experts, for the construction of the spillover effect matrix for the University R&D. The results indicate that: i) The University presents the three categories of the spillover effect (knowledge, network, market) and presents the combined effect through intellectual property; (ii) The articles and the research papers published in databases such as Scienti could be important mechanisms of transmission of positive externalities. (iii) the products of research that the teachers pro- duced during their postgraduate education are an important channel for the dissemination of knowledge Spillovers RESUMO O papel das universidades públicas em termos de pesquisa e desenvolvi- mento centra-se na construção de processos e de socialização do conhe- cimento. No entanto, a Universidade não se apropria de todos os benefícios de seus processos de pesquisa, mas estes são transferidos a terceiros na forma de externalidades positivas fenômeno chamado Spillover. O objetivo foi determinar se o efeito spillover é produzido dentro de uma universidade pública, usando uma abordagem metodológica mista, integrando elemen- tos da modalidade de pesquisa 1, documnetales fontes, para definir as va- riáveis e a modelagem lógica do sistema de P&D da universidade e perfil de efeito spillover, e modo 2, painel de especialistas, para a construção da matriz de efeito spillover de P&D da universidade. Os resultados indicam que: i) na Universidade são dadas as três categorias de efeito spillover (conhecimento, rede e de mercado) e é apresentado o efeito combinado através da propriedade intelectual, ii) artigos e livros de pesquisa publica- dos nas bases de dados como ScienTI poderia ser importantes mecanis- mos de transmissão de externalidades positivas. iii) produtos de pesquisa que os professores desenvolven durante a formação postgradual são um importante canal para a divulgação dos spillovers de conhecimento. PALABRAS CLAVE: Spillovers, Conocimiento, Mercado, Redes, Externalidades. KEY WORDS: Spillovers, Knowledge, market, net- working, externalities. PALAVRAS-CHAVE: Spillovers, Conhecimento, Merca- do, externalidades, redes. 103 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (101 - 111) INTRODUCCIÓN Algunas ciencias sociales, entre ellas la economía, plantean que las actividades de investigación y de- sarrollo emprendidas por universidades públicas generan beneficios que se rebasan, es decir, que se trasladan a terceros sin retribución o cargo, para ser disfrutados por las comunidades y por la sociedad en general. Dicho “exceso” o valor extra de la tasa social de retorno sobre la tasa de retorno universi- taria es descrito como spillovers o externalidades positivas. En economía, la externalidad es definida como una interdependencia no compensada, califi- candola como un beneficio o un costo que no refleja su precio real en el mercado [1]. El perfil actual de la sociedad, que se ha denomina- do sociedad del Conocimiento, se basa en la gene- ración, difusión y utilización de manera intensiva de los distintos tipos de conocimiento y son las uni- versidades las instituciones clave para generarlo a través de la investigación, transmitirlo mediante la formación, transferirlo a la sociedad por medios de innovación tecnológica y explotación económica, y difundirlo mediante la divulgación y el impulso a la creatividad sociocultural [2]. La universidad no debe participar como agente de cre- cimiento económico basado en I&D, dado que estas actividades desvían a los investigadores académicos de las funciones sociales donde son más eficientes, como proveedores de un bien colectivo, es decir, el conocimiento científico y tecnológico [3]. Por su parte, el llamado efecto Spillover plantea que algunos de los beneficios de las actividades de in- vestigación son trasladados a otros agentes de la sociedad distintos al grupo que emprende la investi- gación, por ejemplo los compradores de productos o servicios más baratos y mejores, los grupos y personas externas que imitan los procesos diseña- dos por los investigadores que se ahorran el camino de la investigación, sus riesgos y costos [4]. Algunos investigadores de las ciencias sociales han logrado identificar las características del entorno y particularmente del ambiente tecnológico que hacen que el efecto Spillover sea más o menos probable. En la medida en que la universidad modele la ges- tión de sus procesos de investigación y rastree los impactos de las investigaciones abordadas, se hará más factible concretar la relación directa entre los factores potenciadores de impactos y la predicción o análisis de probabilidad de ocurrencia del efecto Spillover [4]. Efecto spillover El efecto spillover de conocimiento. Ha sido amplia- mente estudiado por las ciencias económicas [4]. Los primeros aportes fueron presentados por Marshall en 1920, refiriéndose a este fenómeno como el conjunto de sucesos que toman lugar cuando el conocimiento creado por un agente puede ser usado por otro sin compensación alguna, o con una compensación de menor valor al correspondiente [4]. Durante los procesos de investigación Universitaria se genera y valida nuevo conocimiento que no se re- tiene dentro de los grupos de investigación, sino por el contrario, dada la función universitaria, empieza a compartirse de manera gratuita y pública, generando y trasladando un valor para los otros grupos de investi- gación, estudiantes receptores y comunidad. El efecto spillover de mercado. Su nombre se deriva de la existencia de un “mercado” para la investigación y desarrollo. Para la observación de este efecto en la universidad pública y poderlo diferenciar del efecto Spillover de conocimiento, se hace necesario tener en cuenta que el “riego” o rebase de los beneficios crea- dos por el grupo de investigación se da explícitamente a través de las fuerzas del mercado, más que por el flujo por sí mismo del conocimiento [4]. El efecto puede evidenciarse en diferentes canales, por ejemplo, cuando los trabajos de investigación conclu- yen en la generación o mejoramiento de productos o servicios innovadores que benefician a los consumi- dores, las poblaciones y la sociedad en general [3], en el caso que nos ocupa, sin retribución directa hacia la universidad. El efecto spillover de red. Puede evidenciarse cuando el resultado de una investigación es fuertemente de- pendiente del desarrollo de un juego o combinación de tecnologías o conocimientos relacionados. La función pública nuevamente cobra sentido cuando se entien- de que existen realidades tecnológicas que requieren de “complementos” para ser utilizadas por los con- sumidores. En estos casos, los organismos privados pueden decidir abstenerse de realizar este tipo de in- vestigaciones por que no quieren que su éxito dependa de la conjugación de terceros en el mercado. Así pues, 104 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (101 - 111) la Universidad puede asumir los proyectos que dados sus requerimientos de masa crítica, no son abordados por los entes privados [4]. En este proceso, cada grupo de investigación crea be- neficios que se rebasan o salen de su propio grupo y se trasladan a los otros grupos y a los consumidores de los mismos [4]. MÉTODO Se realiza una primera fase de análisis documental, para establecer las variables de la I&D y la modelación lógica del sistema I&D y la construcción de los perfiles efecto spillover. Se consultaron fuentes de información relevantes como proyectos de investigación de la misma univer- sidad [6,7] y fuentes documentales presentes en la literatura especializada, que permitieron la elaboración de los perfiles de efecto spillover [4]. La segunda fase de la investigación, desde el punto de vista de la investigación cualitativa, utiliza una meto- dología de paneles de expertos, con el fin de validar el modelo creado para medir el efecto spillover de la I&D en la universidad a través de los insumos construidos en la fase documental (modelación lògica, variables de I&D y perfiles de efecto spillover). El panel de expertos es una técnica que posibilita el tratamiento de numerosos temas y cuestiones diferen- tes en una sola sesión, permitiendo el contraste de las distintas visiones y perspectivas existentes sobre los mismos [8]. En el panel se incluyó un total de seis expertos, inte- grantes de los grupos de investigación GTC y GICEA de la Universidad del Cauca, seleccionados con in- dependencia de los títulos o nivel jerarquico, sobre la base del conocimiento en los temas consultados. Las etapas que se siguieron con el panel de exper- tos, que se realiza en dos encuentros fueron: Etapa I análisis modelo lógico, análisis de las variables I&D y análisis de los perfiles efecto spillover; Etapa II confor- mación matriz de las variables o indicadores de I&D, teniendo en cuenta la modelación del sistema de in- vestigaciones y el perfil del efecto spillover, empleando la escala 0 No efecto, 1 Efecto bajo, 2 Efecto Medio, 3 Efecto Fuerte, 4 Efecto Muy Fuerte; Etapa III identifica- ción efecto spillover en cada una de las variables por cada uno de los integrantes del panel; Etapa IV selec- ción de variables de I&D que miden el efecto spillover de la investigación y desarrollo universitario, teniendo en cuenta el consenso del panel; Etapa V: análisis del comportamiento de cada variable seleccionada, res- pecto al efecto spillover en la Universidad del Cauca. Una vez obtenidas las respuestas de los expertos se procesaron para determinar el nivel de concordancia, considerándose aceptable si el coeficiente de concor- dancia es mayor a 70%, siendo eliminadas, las res- puestas que obtiene valores en el coeficiente de con- cordancia menores a 70%, por baja concordancia o poco consenso entre los expertos [9]. RESULTADOS Se presentan dos categorías de resultados, la pri- mera categoría la constituyen aquellos resultados derivados de la revisión de literatura especializada sobre el tema y que sirvieron como base para tra- bajar las sesiones con los expertos. La segunda categoría de resultados la constituyen aquellos re- sultados derivados del panel de expertos. Se utiliza- ron graficas y cuadros como elementos adicionales para presentar los resultados. Modelación lógica del sistema I&D En el cuadro 1 se relacionan las variables utilizadas en la modelación del Sistema de Investigaciones Universitario [5]. Es importante mencionar, que el modelo emplea ins- trumentos internacionales ampliamente conocidos y difundidos, principalmente los aportados por la (Orga- nización para la Cooperación y el Desarrollo Económi- co) OCED como son: Manual de Frascati. Balanza de Pagos de Tecnología (BPT). Manual de Oslo y Manual de Bogotá. Y Manual de Canberra [10]. Adicionalmen- te, se emplea como base la batería de Herramientas propuesta por el Instituto Norteamericano de Estánda- res y Tecnología. A Toolkit for Evaluating Public R&D Investment. Models, Methods and Findings from ATP’s Fistr Decade. US Department Of Commerce [11]. De igual manera, es necesario resaltar como los im- pactos de la investigación, son el mismo efecto “spi- llover”, que incluye los de conocimiento, los de mer- cado y los de Red [4]. 105 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (101 - 111) En cuanto a los involucrados o grupos de interés de la investigación, para establecerlos se propone partir de una observación de los elementos que conforman el Sistema Nacional de Innovación el cual es “una red de instituciones, en el sector público y privado, cuyas ac- tividades e interacciones inician, importan, modifican y difunden nuevas tecnologías” [12]. Finalmente, es relevante precisar como la línea de interfaz, es concebida como una interacción o unión establecida en el entorno o su área de influencia que dinamiza los componentes o elementos que conecta y fomenta y cataliza las relaciones entre ellos [13]. Establecimiento de variables de la I&D El cuadro 2, incluye las variables encontradas en el Proyecto de Medición de Capacidades de Investiga- ción, en el cual se hizo una primera clasificación de dichas variables según su naturaleza, relacionadas al capital intelectual de la Investigación y Desarrollo Universitario y de acuerdo a la modelación en inputs, outputs, outcomes e impactos [7]. Elaboración de perfiles de efecto spillover Identificados de acuerdo a la teoría de Jaffe, [4]. La fi- gura 1, ilustra la forma en que se empiezan a construir los perfiles de las variables de los efectos Spillover de conocimiento, de mercado y de redes. Perfil del efecto spillover de conocimiento. Este efecto se observa en sucesos de “ingeniería inversa” o reverse technology dentro de la investigación, donde un grupo parte de un producto o servicio accesible al público e investiga con el fin de determinar, entre otras cosas, su composición, mecanismos de operación y funcionamiento y modo de fabricación. También puede darse el efecto spillover en situaciones menos direc- tas pero igualmente importantes como es el caso de grupos de investigación que abandonan ciertos pro- yectos o líneas de investigación señalándole a otros que dicho proyecto es improductivo y ahorrándoles el gasto y el desgaste de aprenderlos a través de su propia experiencia. La evidencia quizá más común de spillovers de conocimiento en la universidad pública se puede observar en la publicación de la productividad aca- démica fruto de la investigación. De hecho, este efecto es intencional y surge en la búsqueda de la diseminación del nuevo conocimiento dentro de la función universitaria. También se observa un efecto Spillover de cono- cimiento en la suscripción de patentes de inven- ción, a través de las cuales, se esperaría que el grupo de investigación innovador protegiera su invención de la explotación pública, logrando sin embargo, a través de la publicación de la patente, diseminar y compar tir el conocimiento que con- tiene la misma y ahorrando a grupos, algunas veces competidores, que invier tan en el proceso inicial de generación de dicho conocimiento, lo Cuadro 1. Modelación Lógica Sistema I&D Finalidad del sistema de evaluación Objetivo del sistema de evaluación Estrategia del sistema de investigaciones Misión del Sistema de Investigaciones Mecanismos Operacionales del Modelo Resultados esperados Evaluación del sistema Inputs Proceso Outputs o productos de la investigación Outcomes o resultados de investigación Impactos de la investigación Involucrados o grupos de interés de la investigación Teoría de soporte al modelo Línea de interfaz Figura 1. Variables en los efectos Spillover 106 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (101 - 111) cual los faculta para par tir desde un nuevo estado del ar te enriquecido por el grupo de investigación que inicialmente patentó la innovación. Perfil del efecto spillover de mercado. Muchos de los bienes y servicios que resultan de los pro- cesos de investigación salen al mercado a precios que no capturan totalmente el valor en superioridad de la innovación en relación a los satisfactores que existían antes de su lanzamiento. Esta s ituación se agrava por la falta de mecanis- mos de valoración tecnológica para asignar pre- cios a la innovación, pues muchos de los grupos de investigación, en la ausencia de patrones de precio para realizar comparaciones, desconocen el valor real de lo que ha sido inventado, calculan- do precios con base en metodologías mas orien- tadas hacia el costeo que hacia los beneficios reales generados a los usuarios. Como resultado, los consumidores ganan por la introducción de los bienes y servicios citados. Este aumento en su bienestar es un beneficio social que no se re- tribuye a la universidad. Existe otro medio de generación de efecto rebase de mercado o spillover de mercado, cuando una universidad realiza investigaciones para el mejora- miento de procesos productivos, lo cual redunda en muchas ocasiones en una disminución de los costos de producción o servucción, impactando de manera positiva en una reducción de precios que beneficia al consumidor. Perfil del efecto spillover de redes. Este efecto ocurre en situaciones donde los productos o servi- cios que salen al mercado requieren de bienes com- plementarios o cuando se observan colaboraciones efectivas entre grupos de investigación, resaltando que verdaderamente se presenta si se decide abor- dar la necesidad de generación de conocimiento en masa crítica a través de lazos colaborativos y no a través de subcontrataciones. Si se da el caso de las subcontrataciones, conocidas en el campo de la in- vestigación como asesorías especializadas o servi- cios técnicos, lo que estaría ocurriendo no cabe en el campo de las externalidades y puede ser registra- do como un caso de internalización de los costos, donde los beneficios capturados si han generado un costo que es en últimas el pago de la asesoría o del servicio técnico. Matriz de variables o indicadores de I&D y selección de las variables que miden el efecto spillover de la I&D universitario El panel de expertos con base en los perfiles identificó cuales de las variables de I&D con que cuenta la Univer- sidad pueden ser catalogadas como externalidades en sus tres categorías, de conocimiento, de mercado y de redes, a partir del Sistema de Indicadores para la Medi- ción de las Capacidades de Investigación de la Univer- sidad del Cauca desde la perspectiva de la Gestión del Conocimiento los cuáles se muestran en el cuadro 2. Observación del efecto spillover de conocimiento. La evidencia de este efecto, puede analizarse en el núme- ro de becarios de doctorado, maestría y especializa- ción financiados por la Universidad, que entre los años 2003-2010 asciende a 277, siendo el 48% becarios de Maestría, el 38% becarios de Especialización y el 14% becarios de Doctorado. En los años 2010, 2008 y 2006 se concentra el mayor número de becarios con porcen- tajes de 16% y 15% respectivamente. También, en el número de productos a partir de inves- tigación del grupo relacionados con la formación de investigadores registrados en Scienti-Colciencias, que asciende a 1087 productos entre los años 2003 y 2009, siendo el más representativo el año 2006 con el 18% de productividad registrada. En cuanto a la divulgación y socialización de resul- tados de investigación, a través de diversos medios tales como: eventos académicos, cursos, seminarios simposios entre otros, los grupos de investigación de la Universidad del Cauca principalmente dirigen sus investigaciones hacia eventos (completos o resu- men) y a la presentación de trabajos en congresos, seminarios, simposios, talleres o encuentros. La figu- ra 2, muestra el número de productos relacionados con la extensión de actividades de investigación del grupo y difusión de los resultados: categoría: apro- piación social de conocimiento De manera representativa, se empleó el dato sobre el número de artículos reportados entre el 2003 – 2009 al igual que el número de cocitaciones, autores y coautores pertenecientes a la Universidad del Cauca y coautores ex- ternos, que se visibiliza en la Figura 3, que permite visua- lizar la utilización por terceros de los artículos producidos en la Universidad así como el reconocimiento en la co- munidad académica investigativa y empresarial/ laboral. 107 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (101 - 111) Cuadro 2. Indicadores en torno a la generación del efecto Spillover de la I&D universitario INDICADORES DESCRIPCIÓN CLASIFICACION DE LOS INDI- CADORES SEGÚN EL MODELO I N P U T S O U T P U T S O U T C O M E S IMPACTOS O EFECTOS SPILLOVER C O N O O C I M I E N T O M E R C A D O R E D C A P I T A L H U M A N O No de investigadores activos vinculados con la Universidad del Cauca. Número de docentes y/o personal vinculado a la Universi- dad del Cauca que realiza algún proceso de investigación. * No de docentes de planta que participa en actividades de investigación. Número de docentes de planta que participa en proyectos de investigación. * No de personal administrativo vin- culado a Grupos de Investigación o proyectos de investigación. Número de personas que participan en el apoyo de las actividades de investigación según el rol desempeñado. 70% Número de grupos de investigación. Cantidad de grupos de investigación de la Universidad existentes y activos. * Número de integrantes de los grupos de investigación. (investigadores, estudiantes) Número de integrantes de los grupos de investigación incluyendo investigadores, administrativos y estudiantes. 70% Número de estudiantes auxiliares de investigación en pregrado y posgrado, en proyectos. Cantidad de estudiantes de programas de pregrado y posgrado que participan en proyectos de investigación. 80% Número de estudiantes de doctora- do, maestría y especialización- Cantidad de estudiantes según nivel de formación (docto- rado, maestría y especialización) * Graduados de programas de docto- rado, maestría y especializaciones. Cantidad de estudiantes graduados según nivel de formación. * Número de Becarios de doctorado, maestría y especialización. Cantidad de estudiantes que han obtenido becas financia- das por la Universidad del Cauca para adelantar estudios de posgrado en la misma Universidad 80% C A P I T A L R E L A C I O N A L Número de docentes en comisión de estudio. Docentes en formación académica superior con algún tipo de comisión, beca, convenio interinstitucional ó de cooperación académica según modalidad nacional e internacional y discriminando motivo, institución y país * Número de comisiones académi- cas Número de docentes de la Universidad del Cauca en otras instituciones nacionales e internacionales * Número de convenios internacio- nales Numero de suscripción de Convenios Internacionales 80% Número de docentes con forma- ción de postgrado en universidades nacionales y extranjeras Docentes con formación de Postgrado en universidades nacionales y extranjeras, discriminado año de obtención del título, en formación o pendiente del título, y país de origen de la formación. * Convenios de los institutos de postgrado Redes entre IES y otras organizaciones para el desarrollo de postgrados en la Universidad del Cauca 80% Número de premios por la labor investigativa Número de reconocimientos, premios y distinciones externos otorgados por la labor investigativa de la institu- ción según tipo: Nacional o internacional. Solo se inclu- yen reconocimientos derivados de la labor investigativa * Número de afiliaciones en la publi- cación de artículos según base de datos Scopus Reporte de la Base de Datos Scopus acerca de las afilia- ciones de los articulados publicados por investigadores * 80% 108 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (101 - 111) Número de trabajos de grado en postgrados vinculados con el sector productivo Cantidad de trabajos de grado en modalidad proyecto de investigación de los programas de postgrado relacionados con el sector productivo * 90% Número de redes de investigación Numero de redes e instituciones con las que participan docentes investigadores de la Univer- sidad del Cauca discriminadas en nacionales e internacionales 80% C A P I T A L E S T R U C T U R A L Total de recursos econó- micos para investigación (propios+públicos+privados) Cantidad de dinero de origen propio, público y privado destinado para las actividades de investi- gación. Clasificado y detallado según rubros * Total Presupuesto aprobado-ejecutado (gastos de personal no está incluido). Relación de porcentaje del presupuesto aprobado y ejecutado. * Total de recursos económicos desti- nados para la formación doctoral de docentes. Presupuesto destinado a la formación de docen- tes específicamente hacia el área doctoral. * Número de Proyectos presentados a entidades financiadoras estatales (Col- ciencias -MADR, Ministerios, Banco de la República, etc). Número de proyectos presentados y aprobados por distintas fuentes financiadoras. * 80% Recursos económicos del sector privado y sector público que apoyan proyectos de investigación. Porcentaje de financiación destinado a la investi- gación por parte del sector público y privado * Recursos económicos del sector públi- co que apoyan proyectos de investi- gación/ Total de recursos económicos para investigación Cantidad de recursos económicos del sector publico en relación al total de fondos disponibles para la investigación. * Recursos económicos del sector priva- do que apoyan proyectos de investi- gación/ Total de recursos económicos para investigación Cantidad de recursos económicos del sector privado en relación al total de fondos disponibles para la investigación. * 80% 70% Productos o resultados que generen nuevo conocimiento Número de artículos de nuevo conocimiento producidos por los grupos de investigación que pueden ser: artículos, libros, normas, registros de propiedad ,etc. * 80% Número de productos a partir de actividades de investigación del grupo relacionadas con la formación de investigadores Actividades orientadas a la formación de nuevos investigadores * 70% Número de productos relacionados con la extensión de las actividades de investigación del grupo y de sus resultados: apropiación social del conocimiento. Cantidad de productos de productos derivados de la extensión de las actividades de investiga- ción realizadas por los grupos de investigación. * 80% Número de proyectos por año y tipo de financiación. Número de proyectos de investigación que han ejecutado en cada año , discriminando la fuente de financiación. * Número de Revistas indexadas publica- das por la institución Cantidad de revistas con un nivel de indexación originadas en la Universidad del Cauca * 80% 70% Número de artículos de Scopus Número de artículos de la registrados en Scopus * 80% Número de cocitaciones de artículos en Scopus Número de citaciones por otras instituciones o autores a los artículos producidos por la Universidad 80% Número de solicitudes de registro de propiedad intelectual de la Universidad del Cauca Número de solicitudes de registro de propiedad intelectual * 80% 80% Fuente: elaboración propia 109 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (101 - 111) Observación del efecto spillover de mercado. De los resultados obtenidos en el trabajo de campo, fue posi- ble seleccionar dentro de esta categoría a las dos re- vistas indexadas publicadas por la Institución: Revista Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindus- trial. ISSN – 1909 – 9959. y la Revista FSC - Facultad Ciencias de la Salud. ISSN 0124 – 308X Observación del efecto spillover de red. Se puede ana- lizar en la composición de los grupos de investigación en el periodo comprendido entre los años 2003 a 2009, en los cuales se observa que existe participación de perso- nal diferente a los docentes de planta como estudiantes e investigadores externos, facilitando los flujos de cono- cimiento hacia el exterior fruto de la investigación (Figura 4). Entre los años 2003-2006 la participación de estu- diantes y personal externo ha sido mayor que la de los docentes de planta. Esta relación se invierte en los años siguientes hasta el 2009. El número total de investigado- res activos, muestra un incremento de aproximadamente un 12% entre el año 2003 y el 2009. En la realización de convenios Interinstitucionales también se crean redes de trabajo colaborativo. El país con el cual se han suscrito el mayor número de conve- nios y por lo tanto el más susceptible para la observa- ción del efecto spillover en redes es España, hecho se refuerza con la información sobre la movilidad de los docentes hacia este país, en segundo lugar se encuen- tra México, seguido por Ecuador. Observación del efecto spillover combinado. Se es- tableció que uno de los mecanismos a través de los cuales fluye el conocimiento fruto de la investigación, que además se dirige a un mercado de la I&D, es la producción intelectual. La figura 5 explica el compor- Figura 3. Producción Unicauca registro en SCOPUS Fuente. Adaptado de MODELOS REGIONALES DE COMPETITIVIDAD, 2010 [7]. Figura 4. Investigadores activos Unicauca Fuente. Adaptado de MODELOS REGIONALES DE COMPETITIVIDAD, 2010 [7]. Figura 5. Productos que generan nuevo conocimiento Fuente. Adaptado de MODELOS REGIONALES DE COMPETITIVIDAD, 2010 [7]. Figura 2. Difusión resultados de investigación Fuente. Adaptado de modelos regionales de competitividad, 2010 [7] 110 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (101 - 111) tamiento de esta variable, la cual muestra que existe una mayor tendencia de difusión del conocimiento a través de los artículos de investigación, seguido por los capítulos de libro y los libros de investigación. CONCLUSIONES Esta investigación examinó la existencia de Spilloves causados por la I&D universitaria sobre las variables o indicadores de capacidades de investigación de la Universidad del Cauca desde la perspectiva de Gestión del Conocimiento para el período 2003-2009, incor- porando dentro de su análisis, los tres posibles tipos de Spillovers: Los impactos de investigación que las universidades generan a nivel de conocimiento, mer- cado y de redes. Los resultados del análisis indican que además de preesentarse en la universidad del cauca las tres categorias de efecto spillovers (conocimiento, red y mercado) se presento el efecto combinado, a través de la propiedad intelectual; los articulos y libros de investigación podrían ser importantes mecanismo de transmisión de externalidades positivas. En particular, se encuentra como las Base de datos Scienti, Colcien- cias son el canal más importante de difusión de cono- cimientos causados por la I&D. Se encuentra evidencia de que los spillovers positivos de conocimiento causados por la I&D están asociados a los trabajos de grado en postgrados, a los proyectos presentados a entidades financieras estatales y privadas y a productos que generan nuevos conocimientos publi- cados en revistas indexadas y bases de datos recono- cidas, y parecen aumentar entre mayor sea el numero de docentes becarios de programas de postgrado y en formación investigativa. Esto podría reflejar que los do- centes en periodo de formación han tenido la posibilidad de producir un gran número de productos de su activi- dad investigativa, por lo que apoyar la formación de los docentes en la Universidad causaría gran impacto. Por otra parte, sería interesante incorporar en las me- didas de Investigación, no sólo las relaciones intersec- toriales con personas e instituciones vinculadas a la investigación, sino considerar también las redes con el sector de servicios, lo que, podría cambiar funda- mentalmente la conclusión de este estudio sobre la insignificancia de las redes que las universidades es- tablecen con clientes locales como un canal relevante de difusión de Spillovers. La modelación de un sistema de medición para las variables de la Investigación es una herramienta que ayuda a mejorar las métricas de I&D y el modelar los impactos de la Investigación en términos de externa- lidades para ser observadas puede constituirse en un medio de comunicación a los grupos de interés sobre cómo la Universidad traslada beneficios hacia la so- ciedad y no los apropia para si misma AGRADECIMIENTOS Las autoras hacen un especial reconocimiento al apo- yo suministrado para esta investigación a la Universi- dad del Cauca, al Ingeniero Eduardo Rojas Pineda, Vi- cerrector de investigaciones, al grupo de investigación Modelos Regionales de Competitividad, dirigido por el Ingeniero Adolfo Plazas Tenorio. REFERENCIAS [1] SUCSO, R. Panel de expertos. Comisión Europea (2005). Publicación electrónica. Available: http://ec.europa.eu/europeaid/evaluation/.pdf [citado el 1 de septiembre de 2012] [2] ARIÑO, A. El impacto socioeconómico de las universidades. 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Construcción de un sistema de indicadores para la medición de las capacidades de investigación de la Universidad del Cauca desde la perspectiva 111 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (101 - 111) de la gestión del conocimiento¨ Documento sin publicar. [8] AGUILAR, M.J. Técnicas de Animación Grupal. Buenos Aires (Argentina): Paidós, 2000, 225 p. [9] CUESTA, A. Gestión por Competencias. La Haba- na (Cuba): Academia, 2001, 93 p. [10] ORGANIZACIÓN PARA LA COOPERACIÓN Y EL DESARROLLO ECONÓMICOS (OCDE). Proposed standard method of compiling and interpreting Technology Balance of Payments data. París (Francia): 1990, 82 p. [11] RUEGG, R. and FELLER, I. A Toolkit for Evaluating Public R&D Investment. Models, Methods and Findings from ATP’s First Decade. Economic As- sessment Office Advanced Technology Program National Institute of Standards and Technology. Gaithersburg (Estados Unidos): 2003, 388 p. [12] PINEDA, L. Marco Conceptual de los Sistemas Nacionales de Innovación. Memorias Primer En- cuentro Nacional de Innovación DNP- COLCIEN- CIAS- ANIDE. Bogotá (Colombia): 2002. [13] CASTRO, E., CONESA, F., FERNÁNDEZ, I. y GU- TIÉRREZ, A. El contexto de la cooperación empresa/universidad. 1999. Sala de lectura CTS+I de la OIE. Disponible en http:// www.dnp.gov.co/PortalWeb/.pdf. [citado 31 de enero de 2011.] 112 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (112 - 117) EFECTOS SIMULTANEOS DE LAS VARIABLES DE PROCESO SOBRE LAS PROPIEDADES DE FLUJO DEL SUERO COSTEÑO SIMULTANEOUS EFFECTS OF THE PROCESS VARIABLES ON THE RHEOLOGICAL PROPERTIES OF SUERO COSTEÑO EFEITOS SIMULTÂNEOS DAS VARIÁVEIS DE PROCESSO SOBRE AS PROPRIEDADES DE FLUXO DE SORO COSTENHO DIOFANOR ACEVEDO C. 1 , AIDA RODRIGUEZ S. 2 , ALEJANDRO FERNANDEZ Q. 2 RESUMEN El Suero costeño es un producto lácteo fermentado elaborado tradicionalmente en la Costa Caribe Colombiana. La sinéresis es un proceso de separación del Lactosuero de la cuajada simultáneamente con su encogimiento, es el mayor de- fecto de calidad de productos lácteos. El efecto simultáneo de temperatura de fermentación (TF, 27,7-39,4 ºC), nivel de sólidos totales (ST, 10,6-17,3%, w/v) y concentración del inoculó (CI, 0,97-6,00 %v/v) sobre el índice de flujo, umbral de fluencia y coeficiente de consistencia del Suero Costeño, fue estudiado por medio de la metodología de superficie de respuesta con tres variables y cinco niveles. El tratamiento estadístico dio lugar a la generación de modelos matemáticos, estos explican que el nivel de sólidos totales es la única variable que afecta significa- tivamente el coeficiente de consistencia, índice de flujo y umbral de fluencia. El nivel de sólidos totales es la única variable que afectó significativamente las propiedades reológicas del Suero Costeño, y la adición de lactosuero parcial- mente desmineralizado aumentó el esfuerzo de fluencia y el coeficiente de flujo, disminuyendo el índice de flujo. El aumento de sólidos totales por adición de proteínas del lactosuero es una manera adecuada para mejorar la consistencia, sabor y untabilidad del Suero Costeño. Recibido para evaluación: 03-02-2012. Aprobado para publicación: 20-07-2013. 1 Doctor en Ingeniería de Alimentos. Docente Programa de Ingeniería de Alimentos. Universidad de Cartagena. 2 Doctores en Ingeniería de Alimentos. Docentes Escuela Ingeniería de Alimentos. Universidad del Valle. Correspondencia:
[email protected] 113 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (112 - 117) ABSTRACT The suero costeño is a fermented dairy product traditionally made in the Colombian Caribbean Coast. The syneresis is a separation process whey from the curd simultaneously with shrinkage, is the biggest flaw of qua- lity dairy products. The simultaneous effect of fermentation temperature (TF, from 27,7 to 39,4 °C), total solids level (ST, 10,6 to 17,3%, w/v) and concentration of the inoculated (CI, 0,97-6,00% v/v) on the flow rate, yield stress and consistency coefficient Coastal Serum was studied by the res- ponse surface methodology with three variables and five levels. Statistical treatment resulted in the generation of mathematical models, they explain that the total solids level is the only variable that significantly affects the consistency coefficient, flow rate and fluence threshold. Total solids level is the only variable that significantly affect the rheological properties of Suero Costeño, and the addition of partially demineralized whey increased yield stress and flow coefficient, decreasing the flow rate. Total solids increased by addition of whey proteins are an appropriate way to improve the consis- tency, taste and spreadability Suero Costeño . RESUMO O Suero costeño é um produto lácteo fermentado tradicionalmente feito na costa do Caribe colombiano. A sinérese é um processo de separação do soro de leite a partir da coalhada em simultâneo com o encolhimento, é o maior defeito de qualidade de produtos lácteos. O efeito simultâneo da temperatura de fermentação (TF, 27,7-39,4 ° C), o nível de sólidos totais (ST, 10,6-17,3%, w / v) e concentração do inoculado (Cl, 0,97 -6,00% v / v) sobre a taxa de fluxo, a produção de estresse e consistência coeficiente costeira Serum foi estudada por metodologia de superfície de resposta com três variáveis e cinco níveis. O tratamento estatístico resultou na ge- ração de modelos matemáticos, eles explicam que o nível total de sólidos é a única variável que afecta significativamente o coeficiente de consistên- cia, caudal e limite de fluência. Nível de sólidos total é a única variável que afectam significativamente as propriedades reológicas do costeña soro de leite, e a adição de soro de leite parcialmente desmineralizado aumentou o limite de elasticidade e o coeficiente de fluxo, diminuindo a taxa de fluxo. Sólidos totais aumentaram adição de proteínas de soro de leite é uma for- ma adequada para melhorar a consistência, sabor e espalhabilidade Suero Costeño . INTRODUCCION El Suero costeño es un producto lácteo fermentado elaborado tradicional- mente en la Costa Caribe Colombiana, el cual es producido por la acidifi- cación espontánea de la leche cruda, debido a la acción de los microorga- nismos autóctonos. Se diferencia de las leches fermentadas porque hay ruptura del gel, desuerado y adición de sal (NaCl). El producto final es simi- lar a la crema agria, un poco acido generalmente es usado como aderezo. La fermentación produce un sistema de dos fases una liquida y otra sólida; PALABRAS CLAVE: Índice de flujo, Umbral de fluencia, Coeficiente de consistencia, Su- perficie de respuesta, Lactosuero parcialmente desmineralizado. KEYWORDS: Flow rate, Threshold fluence, Con- sistency coefficient, Response sur- face, Partially demineralized whey. PALAVRAS-CHAVE: Taxa de fluxo, Fluência limiar, Coe- ficiente de consistência, Superfície de resposta, Soro de leite parcial- mente desmineralizado. 114 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (112 - 117) donde la parte liquida es llamada Lactosuero y la otra es conocida como suero con propiedades organolép- tica deseable [1,2]. La sinéresis es un proceso de separación del Lacto- suero de la cuajada simultáneamente con su encogi- miento, es el mayor defecto que afecta la calidad de los productos lácteos, se observa líquido en la su- perficie del producto causando el rechazo por el con- sumidor. La aceptación de los productos lácteos fer- mentados por los consumidores depende de la acidez, aroma y la percepción de las propiedades de textura. Diferentes factores afectan las propiedades reológicas de los productos lácteos tales como la temperatura de incubación, el tipo de cultivo iniciador, los componen- tes de la leche y el tratamiento térmico [3]. La demanda creciente de los consumidores hacia pro- ductos más naturales que contengan menos o ningún aditivo o estabilizantes ha motivado la investigación del uso de componentes de la misma leche o el control de las variables de proceso para mejorar los productos lác- teos y evitar problemas como la sinéresis ,textura exce- sivamente blanda y poco tiempo de conservación [4]. La leche en polvo descremada, o proteínas concen- tradas del Lactosuero (WPC-Whey Protein Concen- trate) son ampliamente utilizadas para la estandari- zación del yogurt, esto mejora el cuerpo y reduce la sinéresis. El contenido de sólidos totales de la leche tiene efectos sobre la firmeza y la viscosidad [5]. En Colombia la producción industrial de Suero costeño tiene un bajo consumo, porque presenta defectos de calidad tales como: textura granulosa, sinéresis y con- sistencia variable. En este trabajo se evaluaron los efectos simultáneos del nivel de sólidos totales, temperatura de fermenta- ción y concentración del inoculo sobre índice de flujo, umbral de fluencia, coeficiente de consistencia del Suero Costeño. MÉTODO Se realizaron veinte experimentos de acuerdo a un di- seño central compuesto rotable de segundo orden con tres variables y cinco niveles para cada variable. Las variables independientes fueron: Nivel de sólidos totales (ST) que depende de la adición del lactosuero en polvo parcialmente desmineralizado, temperatura de fermen- tación (TF), y concentración del inóculo (CI) que es fun- ción del volumen de inoculó por unidad de volumen de leche a fermentar. Se utilizó la metodología de superficie de respuesta (MSR) para establecer los efectos simul- táneos de las variables independientes sobre: índice de flujo, umbral de fluencia, coeficiente de consistencia del “Suero Costeño”. Los ensayos se realizaron por tripli- cado. El análisis estadístico de los datos se realizo con el programa MINITAB 14, mediante pruebas de varianza (ANOVA), manteniendo un intervalo de confianza del 95% para evaluar el efecto principal de cada factor y el efecto de interacción entre los mismos sobre la res- puesta. Todos los términos del modelo de superficie respuesta de segundo orden polinomial, fueron llenados para cada respuesta basada en la Ecuación 1. 2 2 0 1 1 2 2 3 3 11 1 22 2 2 33 3 12 1 2 13 1 3 23 2 3 Y X X X X X X X X X X X X b b b b b b b b b b e = + + + + + + + + + + Ec.1. Aquí, | 0, | 1 ...| 23 representan los coeficientes de regre- sión, con | 0 como intercepto, | 1, | 2 y | 3 son los efec- tos lineales, | 11, | 22 y | 33 son los efectos cuadráticos, | 12, | 13 y | 23 son las interacciones y es el error alea- torio, X 1, X 2 y X 3 son las variables independientes (ST, TF y CI) respectivamente. Para simplificar el modelo, solamente se incluyeron los coeficientes que tienen s|gu|l|cauc|a eslad|sl|ca, es dec|| P ± O,O5. El Cuadro 1 muestra los datos escogidos para el es- tudio. En el Cuadro 2 se muestran los valores mas optimiza- dos para los diferentes ensayos a realizar con las tres variables Con estos parámetros seleccionados, se realizaron combinaciones de las Cepas Lactococcus lactis Subs. Lactis (ATCC29146), Lactobacillus Paracasei Subs. paracasei (ATCC 334), en las proporciones: 3,2 (v/v) para cada nivel. Preparación del suero costeño a diferentes condi- ciones de proceso Las condiciones de proceso estudiadas en esta inves- tigación fueron: Nivel de sólidos totales, temperatura de fermentación del Suero Costeño y concentración del inoculo. Los frascos donde se preparó la leche y se fermentó se esterilizaron a 121 °C por 10 minutos. La leche en polvo se disuelve en agua destilada junto con el suero parcialmente desmineralizado (SPD), hasta al- canzar los sólidos de la experimentación, se agito para 115 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (112 - 117) disolver bien la mezcla, luego se calentó a 80 ºC por 20 minutos, después del tratamiento térmico, se ino- culó con las concentraciones establecidas, se incubó a la temperatura de fermentación seleccionada por 12 horas hasta alcanzar el pH de 4,6, luego de obtenido el coagulo se realizó su ruptura y la separación del 20 % del lactosuero en relación al volumen inicial de leche, haciendo pasar por un filtro, se adiciono 1,2 % de sal del volumen inicial de leche y se realizo la homogeni- zación para conseguir una consistencia adecuada [5]. El lactosuero preparado anteriormente posee la com- posición descrita en el Cuadro 3. Determinaciones reológicas de flujo Los geles fueron sometidos en un reómetro marca bohlin VOR a un ciclo de deformación, con un tramo ascendente de 0,0716 a 100S -1 en 60 segundos y uno descendente los datos de las curvas fueron ajustados por medio del software Bohlin Rheometer a los mo- delos de Herschel-Bulkley y Casson, obteniendo los valores de los parámetros reológicos: índice de flujo, umbral de fluencia, coeficiente de consistencia [6]. RESULTADOS Para evaluar los parámetros de las variables del suero costeño, se analizaron los datos del Cuadro 4 donde se observan altos coeficientes de regresión. A través de un diseño de segundo orden se obtuvo un modelo polinomial cuadrático que indica la rela- ción entre las variables temperatura de fermentación, concentración de sólidos y concentración de inócu- lo sobre el coeficiente de consistencia, el índice de comportamiento de flujo y el umbral de fluencia. Los coeficientes de regresión del modelo se reportan en el Cuadro 4. Al efectuar los cálculos para ajustar el modelo según los coeficientes de correlación establecidos, se obtie- nen los modelos ajustados reportados en el Cuadro 5. Estos modelos indican que la única variable que ejerce una influencia sobre el comportamiento reológico del Suero costeño es el contenido de sólidos totales. La presencia de las proteínas del lactosuero parcialmente desmineralizado determina una mayor interacción y la formación de una estructura tridimensional más densa y con mayor cuerpo, debido a que los grupos tioles de las proteínas del lactosuero formen enlaces disulfuro Cuadro 1. Diseño experimental propuesto Ensayos Temperatura Sólidos Totales Concentración Inóculos 1 33,5 14,0 3,5 2 37,0 12,0 5,0 3 30,0 16,0 5,0 4 39,38 14,0 3,5 5 33,5 14,0 3,5 6 33,5 10,63 3,5 7 30,0 16,0 2,0 8 37,0 16,0 5,0 9 33,5 14,0 3,5 10 37,0 16,0 2,0 11 37,0 12,0 2,0 12 33,5 14,0 6,02 13 27,6 14,0 3,5 14 30,0 12,0 2,0 15 33,5 14,0 0,97 16 30,0 12,0 5,0 Cuadro 2. Factores y Niveles Factores Sólidos totales (X 1 ) Temperatura de fermen- tación en ºC (X 2 ) Concentración de inóculo en % v/v (X 3 ) Niveles ST TF CI 10,6 27,6 0,97 12,0 30,0 2,0 14,0 33,5 3,5 16,0 37,0 5,0 17,3 39,4 6,0 Cuadro 3. Composición del Lactosuero en polvo parcialmente desmineralizado (SPD) Componentes Porcentaje (%p/p) Ceniza 6,11 Grasa 0,10 Lactosa 86,78 Humedad 4,20 Proteína 2,86 Sal 1,56 Acidez titulable 0,08 116 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (112 - 117) fuertes con la caseína en consecuencia los esfuerzos de cizalla aumentan considerablemente [7]. Las gráficas representadas por las ecuaciones corres- pondientes al Cuadro 5 se relacionan a continuación De las tres gráficas de superficie de respuestas se puede determinar que el aumento en el contenido de sólidos totales incrementa el coeficiente de consis- tencia y el umbral de fluencia mientras disminuye el índice de comportamiento de flujo, también se puede decir que con el tiempo de almacenamiento el índice de flujo aumentó, mientras el umbral de fluencia y el coeficiente de consistencia disminuyeron ,esto puede ser debido a que durante el tratamiento térmico las proteínas del suero parcialmente desmineralizado por su capacidad de retención de agua ,la formación de Cuadro 4. Coeficientes de regresión del modelo polinomial de segundo orden para las variables de respuestas Factores Umbral de fluencia Consistencia (K) Indice de flujo (n) C 78,808** 89,7976 3,5563** TF -0,8868 -1,8964 -0,0402 ST -10,075* -0,4028*** -0,2532** CI -0,7497 -1,0690 -0,0890 (TF) 2 0,0172 -0,0286 0,00064 (ST) 2 0,4294* 0,3967* 0,00624** (CI) 2 0,0902 0,1557 0,00270 TxST -0,0132 -0,0010 -0,00003 TxCI -0,0176 -0,0014 -0,00062 STxCI 0,0477 0,0022 -0,00609 R 2 0,967 0,859 0,926 C=Constante; TF= Temperatura de fermentación; ST=Sólidos totales; CI= Concentración de Inóculo; R 2 = Coeficiente de co- ||e|ac|óu, *P ±O,OO1, **P ±O,O1O, ***P ±O,O5O Figura 1. Superficie de respuesta para Índice de flujo en función de Temperatura y Sólidos totales Figura 2. Superficie de respuesta para Umbral de fluencia en función de Temperatura y Sólidos totales Figura 3. Superficie de respuesta para el coeficiente de consistencia en función de la temperatura y sólidos totales Cuadro 5. Modelo ajustado para Índice de flujo, Umbral de Fluencia y Consistencia Respuesta Modelo ajustado Umbral de Fluencia 78,808-10,0750X1+ 0,4294X12 Consistencia -0,4028X1 +0,3967X12 Índice de flujo 3,5563-0,2532X1 +0,00624X12 117 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (112 - 117) enlaces disulfuro con la caseínas hacen la estructura más compacta [8]. CONCLUSIONES Este trabajo de investigación concluye que el nivel de sólidos totales es la única variable que afecta significa- tivamente las propiedades reológicas del Suero Coste- ño; la adición de lactosuero parcialmente desminerali- zado, aumenta el esfuerzo de fluencia y el coeficiente de flujo y disminuye el índice de flujo. El aumento de los sólidos totales por adición de proteínas del lacto- suero es una manera adecuada para mejorar la con- sistencia, sabor y untabilidad. REFERENCIAS [1] ACEVEDO, D., RODRÍGUEZ, A. and FERNÁNDEZ, A. Determinaciones oscilatorias de baja ampli- tud del suero costeño. Rev. U.D.C.A Act. & Div. Cient., 15 (1), 2012, p. 219-225. [2] GRANDOS, C., ACEVEDO, D. and TORRES, R. Calidad de la leche y del suero costeño de los municipios Turbaco, Arjona y Carmen de Bolí- var–Colombia. Rev. Lasallista Investigación., 9 (2), 2012, p. 132-137. [3] SIMANCA, M.M., ANDRADE, R.D. y ARTEAGA, M.R. Efecto del Salvado de Trigo en las Propie- dades Fisicoquímicas y Sensoriales del Yogurt de Leche de Búfala. Información Tecnológica, 24 (1), 2013, p. 79-86. [4] LUCEY, J. and MUNRO, P. Microstructure, per- meability and appearance of acid gels made from skim milk. Food Hydrocolloids, 12 (2), 1998, p. 159-165. [5] AMATAYAKUL, T. and SHERKAT, F. Physical cha- racteristics of set yoghurt made with altered with altered casein to whey protein ratios and EPS pro- ducing starter cultures at 9 and 14% total solids. Food Hydrocolloids, 20 (2-3), 2006, p. 314-324. [6] COLOMBIA. INSTITUTO DE CIENCIA Y TECNOLO- GÍA DE ALIMENTOS. Inventario y desarrollo de la tecnología de productos lácteos campesinos en Colombia. Bogotá (Colombia): 2000. [7] PUVANENTHIRAN, A., WILLIANS, R. and AU- GUSTIN, M. Structure and viscoelastic properties of set yoghurt with altered casein to whey protein ratios. International. Dairy Journal, 12 (4), 2001, p. 383-391. [8] ACEVEDO, D., RODRIGUEZ, A. and FERNÁNDEZ, A. Efecto de las Variables de Proceso sobre la Ci- nética de Acidificación, la Viabilidad y la Sinére- sis del Suero Costeño Colombiano. Información Tecnológica, 21 (2), 2010, p. 29-36. 118 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (118 - 125) EVALUACIÓN DE ÍNDICES DE CONVERSIÓN ENERGÉTICA EN LA PRODUCCIÓN DE GAS COMBUSTIBLE A PARTIR DE BIOMASA EVALUATION THE RATES OF ENERGY CONVERSIONIN THE PRODUCTION OF BIOMASS FUEL GAS DETERMINAÇÃOTAXAS DE CONVERSÃO DE ENERGIA NA PRODUÇÃO DE GÁS COMBUSTÍVEL DE BIOMASSA GERARDO CABRERA C. 1 , SANTIAGO MADRIÑAN M. 2 , DEYANIRA MUÑOZ M. 3 RESUMEN Los índices de conversión energética en la gasificación de biomasa, permite com- paraciones entre gasificadores y obtener el mejor desempeño en un proceso in- dustrial. Se utilizó un reactor de prueba tipo Imbert de 7 KW y biomasa de bagazo de caña de azúcar, madera y árbol de algarrobo. Se realizaron análisis elementa- les, proximales y los balances másicos y térmicos en el cálculo de los índices de conversión de energía volumétrica y másica (). Los valores del poder calorífico del gas generado a una temperatura mínima de 850°C y óptima de 1050°C, en el reactor fueron: 3679 Kj/Kg de carbón de algarrobo, 4603 Kj/Kg de madera y 5009 Kj/Kg de bagazo de caña. Mientras los índices de aprovechamiento volumé- trico fueron: 3509,39 Kj/Nm 3 de carbón de algarrobo, 3804,39 Kj/Nm 3 de madera y 4847,83 Kj/Nm 3 de bagazo de caña de azúcar. Se concluye que una eficacia del 70% en el gasificador, el índice de conversión es apropiado para estimar el poder calorífico, la masa del gas producido combustible puede ser recuperada en una combustión, el poder calorífico del gas de síntesis es aproximadamente el 10% del poder calorífico de la gasolina y las pérdidas de calor son del 30%. ABSTRACT Recibido para evaluación: 01-05-2012. Aprobado para publicación: 13-02-2013 1 Msc. Ingeniero mecánico. Facultad de Ingeniería. Profesor asociado. Universidad del Valle. 2 Ingeniero mecánico. Facultad de Ingeniería. Universidad del Valle. 3 Msc.en Ingeniería énfasis ingeniería Sanitaria y Ambiental. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Departamento de Agroindustria. Profesor Titular. Universidad del Cauca. Correspondencia:
[email protected] 119 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (118 - 125) The energy conversion ratios in biomass gasification, allows comparisons between gasifiers and decide best performing one in an industrial process. The research used a test reactor type Imbert 7 KW, biomass sugarcane bagasse, wood and carob tree. Elemental and proximal analyzes were per- formed and thermal mass balance calculations involved in the conversion rates volumetric energy and mass (I). The calorific values of each biomass gas at a minimum temperature of 850°C and 1050°C optimum reactor ope- ration where: 36779 kJ/kg of coal carob, 4603 kJ/kg of wood and 5009 kJ/ kg of bagasse cane. While volumetric utilization rates where: 3509.39 of coal carob, 3804.39 Kj/Nm3 wood and 4847.83 Kj/Nm3 sugar cane ba- gasse. We conclude gasifies efficiency is 70%, the conversion rate is ap- propriate for estimating the calorific mass of the fuel gas produced can be recovered in a combustion heating value of the synthesis gas is about 10% power gas heating and heat losses are 30%. RESUMO Os rácios de conversão de energia em gaseificação de biomassa, permite comparações entre gaseificadores e decidir melhor desempenho em um processo industrial. A pesquisa utilizou um tipo de reactor experimental Imbert 7 KW, a biomassa de bagaço de cana, madeira e alfarrobeira. Ele- mental análises foram realizadas e proximal, e os cálculos de equilíbrio de massa térmica na conversão de taxas volumétricas de energia e de massa (I).Os valores caloríficos de cada gás de biomassa, a uma temperatura mínima de 850 ° C e 1050 ° C a operação do reactor era óptimo: 3679 kJ / kg de carvão de alfarroba, 4,603 madeira Kj / Kg e 5.009 kJ / kg de bagaço cana. Enquanto as taxas de utilização volumétricas foram: carvão Kj/Nm3 alfarroba 3.509,39, 3.804,39 e 4.847,83 Kj/Nm3 bagaço de ma- deira Kj/Nm3 cana. Concluímos eficiência gaseificador é de 70%, a taxa de conversão é adequada para estimar a massa calorífica do gás combustível produzido pode ser recuperado em um valor de aquecimento de combus- tão do gás de síntese é poder cerca de 10% aquecimento a gás e perdas de calor são 30%. INTRODUCCIÓN Toda América Latina tiene inmensos terrenos deficientemente utilizados, con abundante vegetación y cuya población es pobre [1]. Al contar con sistemas productores de energía, el nivel tecnológico de explotación agro- pecuaria se elevará, eliminando una de las causas que es la falta de sumi- nistro de energía mecánica y eléctrica. Por lo tanto, producir energía carburante en la zona rural significa mejorar la plataforma tecnológica y posibilitar el uso de motores en el campo de manera sostenible [2]. La gasificación de la madera no es nueva, se usó como sustituto de la gasolina durante la guerra en Europa, luego por el auge del petróleo se abandonó esta tecnología [3]. Actualmente, cuando se vislumbra el ago- tamiento del petróleo, de nuevo se ha retomado [4]. Así por ejemplo, la India actualmente está usando gasificadores para la generación de gas con PALABRAS CLAVES: Gasificación, Energía, Reactor, Eficiencia. KEY WORDS: Gasification, Energy, Reactor, Effectiveness. PALAVRAS-CHAVE: Gás de gaseificação, Reactor, Ener- gia, Eficácia 120 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (118 - 125) destino a motores y para la combustión en algunos procesos industriales [5]. El objetivo principal de esta investigación es obtener el índice de conversión energética del proceso de gasifi- cación de biomasa, que permita comparaciones entre gasificadores y la toma de la mejor decisión técnica, económica y ambiental. Se realizaron mediciones y cálculos de suministro, pérdidas y producción de masa y energía, en un ga- sificador tipo Imbert para conocer la eficacia de su funcionamiento, mediante el índice de conversión de energía volumétrica y másica (), en la producción de gas combustible a partir de madera y carbón de alga- rrobo y bagazo de caña de azúcar. La producción del gasificador se valoró conside- rando su uso como combustible para motores de encendido por chispa en reemplazo de la gasolina. MÉTODO Se usó un reactor de prueba tipo Imbert de 7 KW, biomasa de bagazo de caña de azúcar, de madera y de árbol de algarrobo, el cual está distribuido en toda América latina. En Colombia es muy común y se usa en posteadura y obtención de carbón [6]. El procedimiento consistió en: caracterización de la biomasa (cuadro 1), mediante análisis elementales y proximales en cada una de las materias primas, se usaron los protocolos de las nomas ATSM (cuadro 2), especificadas para combustibles. Los ensayos se hicieron en el laboratorio de Combustión Com- bustibles de la Universidad del Valle. Se escogió el tamaño del trozo siguiendo las recomen- daciones del manual del gasificador [7], se trabajó con trozos de forma cilíndrica de 6 cm de diámetro y 3 cm de altura. Los materiales antes de ser cargados al reactor, se secaron al sol hasta alcanzar una humedad inferior al 20%. Para la caracterización del gas se realizaron dos cargas por cada tipo de biomasa, y se tomaron lec- turas cada 10 minutos, la cantidad de cada carga dependió de la densidad de cada biomasa y de la capacidad en volumen de la tolva. Cuadro 1. Caracterización de la biomasa Madera Carbón Bagazo Elemental Humedad (%) 12,03 7,87 16,03 Cenizas (%) 2,82 11,99 5,41 Carbono (%) 46,62 74,00 43,48 Hidrógeno (%) 5,73 2,33 5,10 Nitrógeno (%) 0,20 0,40 0,85 Azufre (%) 0,08 0,23 0,10 Oxígeno (%) 32,52 3,18 29,03 Próximo Humedad (%) 12,03 7,87 16,03 Materia Volátil (%) 70,65 17,20 69,71 Cenizas (%) 2,82 11,99 5,41 Carbón Fijo (%) 14,50 62,94 8,85 Poder calorífico (BTU/Lb) 7024 11136 6999 Azufre (%) 0,08 0,23 0,10 Cuadro 2. Normas ASTM de combustibles Análisis Norma ASTM Humedad (%) D 5142 Cenizas (%) D 5142 Carbono (%) D 5373 Hidrógeno (%) D 5373 Nitrógeno (%) D 5373 Azufre (%) D 4239 Oxígeno (%) D 5373 La autonomía de las cargas dependieron fuertemente del tipo de biomasa, para el bagazo se tuvo una au- tonomía promedio de 45 minutos, para la carga de madera fue de 4 horas y media, y para el carbón se obtuvieron valores promedio de 8 horas. Para determinar la temperatura óptima de opera- ción del reactor se usó el diagrama de Ellingham [9], obtenido como una aplicación de la primera ley de la termodinámica expresada mediante las ecuaciones 1 y 2. La segunda ley expresada por la ecuación 3, la ener- gía libre de Gibbs con la ecuación 4 y el cambio de energía libre, con la ecuación 5, para reactivos y productos de una reacción de oxidación graficada en función de la temperatura. 121 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (118 - 125) (Ec.1) (Ec.2) (Ec.3) (Ec.4) (Ec.5) Donde: Q: Calor agregado al sistema P: Presión del sistema (reactor) T: Temperatura del sistema S: Entropía del sistema H: Entalpia total del sistema G: Energía libre de Gibbs : Cambio en al energía interna : Cambio total del volumen del sistema : Cambio total de la entalpia del sistema : Cambio de la energía libre de Gibbs : Trabajo de frontera del sistema : Energía del sistema abierto en un proceso iso- térmico : Pérdida en la capacidad de trabajo que acom- paña a un proceso irreversible Se consideró lo que plantea la termodinámica quí- mica, que a menor cambio de la energía libre de Gibbs las reacciones son más espontáneas y tienen mayor probabilidad de ocurrir, por lo tanto entre más negativa ocurrirá más las reacciones [8]. Mediante el diagrama de Ellingham [9], se obtuvo una temperatura mínima de operación de 850°C. Por debajo de ésta, se favorece la formación del dióxido de carbono CO 2 , mientras por encima la del monóxido de carbono CO. Además de la energía libre de Gibbs, otro parámetro de interés en el cálculo de la temperatura óptima de funcionamiento del reactor fue la zona de oxidación del gasificador, donde debe reaccionar una parte del combustible para que exista carbono disponible y se reduzca los gases de combustión. Del diagrama de Ellingham [9] y de la experimentación, se determinó que 1050°C, es la temperatura óptima de operación del reactor. Durante la experimentación al inicio de cada ensayo se retiraron los residuos del gasificador de opera- ciones anteriores, se pesaron 50 Kg de madera, 38 Kg de carbón de algarrobo y 7,5 Kg de bagazo, se introdujeron las cargas de cada biomasa de forma separada, y se encendió el gasificador poniendo en marcha todos los subsistemas. La entrada de aire se fue regulando en el transcurso de la prueba empezando con 50% hasta alcanzar la temperatura óptima (1050°C), controlada con ter- mocupla. Se determinaron los porcentajes de: CO, CO 2 , O 2 y los hidrocarburos con analizador de ga- ses. El agua se determinó midiendo la temperatura de bulbo seco y bulbo húmedo y referenciándolas en la carta psicrométrica. Mediante balance de masa [10], se determinaron: H 2 , CH 4 , SO 2 y el N 2 . El flujo volumétrico de gas se calculó relacionando la presión estática y de estan- camiento, las cuales se midieron con el equipo Ba- charach PCA 35. Para la determinación de la energía involucrada en la producción de 1Nm 3 de gas se realizó el balance de energía: (Ec.6) Cuando el gasificador se ha estabilizado a la tempera- tura óptima la ecuación se transforma en: Ec.7) Donde: Coeficiente combinado de transferencia de calor : Flujo másico 122 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (118 - 125) : Poder calorífico : Entalpia especifica : Calor especifico : Temperatura absoluta : Área superficial El subíndice “co” se refiere al combustible. Las pér- didas de calor al ambiente son por transferencia en la superficie del reactor, en los humos y la ceniza. Para estimar las pérdidas de calor al ambiente por convec- ción y radiación se utilizó un pirómetro ThermoTech TT1610 Non-Contact Infrared Thermomete, para me- dir las temperaturas superficiales del gasificador. Se determinó un coeficiente combinado de transferen- cia de calor que representa la convección y la radia- ción. Para los cálculos de los coeficientes de convec- ción, la superficie del gasificador se dividió en dos, una lateral inclinada y una superior horizontal. A partir de las conclusiones de Churchill y Chu, se calculó el coeficiente de transferencia de calor por convección para las dos superficies [11]: (Ec.8) El número de Nusselt se calculó con la correlación empírica: (Ec.9) El número de Rayleigh fue hallado con: (Ec.10) Para la superficie lateral el número de Nusselt se cal- culó de acuerdo con la correlación [11]: (Ec.11) Para la radiación se utilizó la expresión para calcular un coeficiente [11]: (Ec.12) Donde: : 0.65 : Temperatura de la superficie : Temperatura de los alrededores En el cálculo de la radiación, el gasificador se dividió en dos: la tolva y el reactor (figura 1), los coeficientes de radiación se reportan en el cuadro 3. Con la ecuación de Newton se determinan las pérdidas de calor de convección y de radiación [11]: (Ec.13) RESULTADOS En el cuadro 4, se resumen los resultados de las pérdidas de calor total y coeficiente combinado de transferencia de calor en el gasificador. Esta pérdida es la suma de radiación, correspondiente a la tolva y el reactor, y de convección en las superficies late- rales y horizontales. Figura 1. Gasificador de pruebas 123 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (118 - 125) Para calcular el coeficiente combinado se empleó la siguiente expresión: (Ec.14) En este caso para radiación y convección la diferen- cia de temperaturas, el área superficial son iguales, entonces el coeficiente de transferencia de calor combinado es la suma de los coeficientes de radia- ción y convección. Otras fuentes de pérdidas de energía, es el calor sensible por cenizas e inquemados (cuadro 5) y el calor sensible del gas. Se estimaron las pérdidas por calor sensible de las cenizas, mediante la expresión [10]: (Ec.15) Donde: : Flujo másico de combustible : Porcentaje de ceniza en el combustible : Calor especifico de la ceniza : Temperatura de la ceniza Para el cálculo de las pérdidas por inquemados se empleó la siguiente ecuación: (Ec.16) Donde: : Flujo másico de ceniza : Fracción de combustible en la ceniza : Poder calorífico inferior del combustible Las pérdidas de calor por inquemados, se reportan en el cuadro 6: El calor sensible presente en el gas, se calculó a partir del calor específico de la mezcla (Ec.17) Donde: : Fracción másica del gas i : Calor especifico del gas i Los valores usados en la determinación del calor específico de cada gas y el de mezcla, se muestran en el cuadro 7[12]. El valor obtenido para la mezcla Cuadro 3. Coeficiente de radiación Dispositivo Temperatura prome- dio superficial [°C] hr (radiación) [w/m 2 °C] Tolva 85 5,36 Reactor 381 17,18 Cuadro 4. Calor perdido y coeficiente combinado Dispositivos Total Tolva Reactor Temperatura Promedio Superficie,ºC 75 360 Área Superficial, m 2 2,26 0,37 h, radiación W/m 2 ºC 5,1083 15,1891 h, combinado W/m 2 ºC 14,1083 25,8911 Calor Perdido, W 1434,82 3442,42 4877,28 Condiciones: Temp amb= 30ºC, emisividad prom=0,65 Cuadro 5. Cantidad de residuos Madera Carbón Bagazo Ceniza [g] 1410 4556,2 405,75 Carbón inquemados [g] 590 143,8 144,25 Cuadro 6. Pérdidas por inquemados Carbón Madera Bagazo Pérdidas(kw) 0,12 0,50 0,80 124 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (118 - 125) (C P,M ) fue de 1,273 Kj/Kg°K con el que se calculó la entalpia Las pérdidas por calor sensible en el gas se calcu- laron como: Ec.18) Un resultado esperado es que el calor específico de la mezcla de gas obtenido del carbón, la madera y del bagazo tiene un valor muy semejante. Por lo tan- to se usó en todos los casos 1,273 para calcular las pérdidas de calor sensible en el gas. La temperatura de salida de la zona de reducción en general se estima en la literatura en el rango 600°C- 800°C, pero por efectos de transferencia de calor el gas reduce su temperatura a la salida del gasificador a valores cercanos a los 600°C. En el cuadro 8 se resume las pérdidas de calor en el gasificador para los tres combustibles. El gas pro- ducido es combustible, por lo tanto tiene un poder calorífico en su masa que puede ser recuperado en una combustión. El total invertido para producirlo se calculó restando del calor suministrado todas las pérdidas y además éste calor potencial del poder calorífico volumétrico PC V y másico PC que carga (cuadro 9). (Ec.19) También con la expresión: (Ec.20) Los índices de aprovechamiento volumétrico y má- sico de interés en la investigación se estimaron con las ecuaciones 21 y 22 (estos índices de aprove- chamiento corresponden a una forma de valorar el funcionamiento de un gasificador implementadas por los autores). Los resultados se reportan en el cuadro 10. (Ec.21) (Ec.22) CONCLUSIONES El gas de síntesis resultó viable para uso en moto- res de combustión interna, se considera que el gas producido de la biomasa es útil si su poder calorífi- co tiene un contenido energético por encima de los 4MJ/Nm 3 (100 Btu/scf) [4]. Los valores del poder calorífico del gas (cuadro 9) y los índices de aprovechamien-to volumétrico y másico(cuadro 10) son aproximadamente iguales, Cuadro 7. Calores específicos Masa [g] gi Cp,i [Kj/Kg°K] gi x Cp,i CO 2 35963,44 0,1723 1,2544 0,2161 CO 39267,26 0,1881 1,1992 0,2256 C 6 H 8 17,21 8,24E-05 0,53 4,37E-05 O 2 3579,14 0,0171 1,0998 0,0189 H 2 0 3936,42 0,0189 2,3441 0,0442 SO 2 87,40 4,19E-04 0,6 0,00025 N 2 123499,91 0,5916 1,1823 0,6995 CH 4 1764,91 0,0084 2,6 0,0212 H 2 635,28 0,0031 15,119 0,0460 M(gas) 208750,94 1 1,273 Cuadro 8. Perdidas de calor en el gasificador Calores por Transfe- rencia Ceniza Gas Inquemados Carbón [KW] 4,90 0,07 4,68 0,12 Madera [KW] 4,90 0,04 6,13 0,50 Bagazo [KW] 4,90 0,07 4,68 0,80 Cuadro 9. Poderes caloríficos PC V,gas (Kj/Nm 3 ) PC (Kj/Kg) Carbón 3385 3679 Madera 4235 4603 Bagazo 4691 5099 125 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (118 - 125) mostrando la utilidad para estimar el poder calorífico del gas obtenido en un reactor tipo Imbert mediante un balance de energía. En la experimentación se tiene que los calores es- pecíficos de los gases producidos con las distintas biomasas, son aproximadamente iguales, indicando igual resultado para todas las biomasas cuando se utiliza un gasificador tipo Imbert. Entonces para fu- turos cálculos se puede utilizar un calor específico de 1,273 Kj/KgºC, porque: La relación estequiométrica (Kg de aire/Kg de com- bustible para la combustión con gas es de 1,1:1 y en el caso de la gasolina es de 15,2:1, entonces el motor aspira una mayor cantidad de carburante en el caso del gas, lo que permite mitigar la diferen- cia entre los poderes caloríficos. El poder calorífico del gas de síntesis es aproximadamente un 10% del poder calorífico de la gasolina y las pérdidas son aproximadamente del 30%. AGRADECIMIENTOS A la Fundación CIPA, a La Fundación UTA de Colom- bia, a la Universidad del Valle por la participación del Grupo de Investigación en Desarrollo y Difusión de Tecnologías Alternativas GDDTA y a la Univer- sidad del Cauca por la participación del Grupo de investigación en Diseños, procesos y Energía de la Facultad de Ciencias Agropecuarias. REFERENCIAS [1] KALKMANOVITZ, S. y LÓPEZ, E. 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Índice de aprovechamiento [KW] [Nm 3 / seg] [Kg/ seg] [Kj/Nm 3 ] [Kj/Kg] Carbón 22,67 6,46E-3 5,94E-3 3509,39 3814,55 Madera 32,87 8,64E-3 7,95E-3 3804,39 4135,21 Bagazo 31,22 6,44E-3 5,92E-3 4847,83 5269,38 126 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (126 - 135) MANEJO INTEGRADO VS. MANEJO TRADICIONAL DE ANTRACNOSIS EN CULTIVOS DE FRÍJOL EN TIMBIO CAUCA INTEGRATED MANAGEMENTVS. TRADITIONAL MANAGEMENT IN CROPS ANTHRACNOSE BEANS IN TIMBIO CAUCA INTEGRADA VS. GESTÃO TRADICIONAL EM CULTURAS BEANS ANTRACNOSE EM TIMBIO, CAUCA CONSUELO MONTES R. 1 , ARNULFO ÍBAGON 2 , FELIPE PERAFAN 2 RESUMEN Con el objeto de evaluar la antracnosis (Colletotrichum lindemuthianum) en el cultivo de fríjol (Phaseolus vulgaris) en el Municipio de Timbío, Departamento del Cauca – Colombia, se realizó un ensayo en un diseño de bloques completos al azar con dos tratamientos y tres repeticiones.Se evaluaron dos variedades de frijol (Diacol Calima y AFR 612) en dos sistemas de manejo: Manejo Tradicional, empleado por agricultores de la zona con aplicaciones frecuentes de fungicidas para controlar la enfermedad.Se evaluaron las variables incidencia y severidad de la enfermedad en hojas, flores y vainas en las etapas V2, V4, R6 del cultivo (primera hoja trifoliada, tercera hoja trifoliada y prefloración) y en las etapas R7 (formación de vainas) y R8 (llenado de vainas), vainas/planta, producción vainas/ parcela, rendimiento grano/parcela (g), peso de 100 semillas (g) y porcentaje de germinación.Los resultados mostraron que la variedad Diacol Calima bajo Manejo Tradicional presentó los porcentajes más altos de incidencia de antracnosis en las etapas V2, V4 y R6 para hojas y R8 en vainas.La variedad AFR 612 en Manejo Integrado presentó los porcentajes de incidencia de antracnosis más bajos y los mayores rendimientos. Recibido para evaluación:08-03-2012. Aprobado para publicación: 15-11-2013. 1 M Sc Profesora de planta, Universidad del Cauca, Departamento de Ciencias Agropecuarias. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Tull, Grupo de Investigación para el Desarrollo Rural, Popayán, Cauca, Colombia 2 Ingenieros Agropecuarios, Universidad del Cauca, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Tull, Grupo de Investigación para el Desarrollo Rural, Popayán, Cauca, Colombia correspondencia:
[email protected] 127 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (125 - 135) ABSTRACT The trial was aimed at evaluating anthracnose (Colletotrichum lindemuthia- num), in bean cultivars (Phaseolus vulgaris) in a rural area of Timbío, loca- ted in the Cauca Department of Colombia, applying a randomized complete block (RCB) design with 2 treatments and 3 repetitions. Two bean varieties were evaluated: Diacol Calima and AFR 612, under two agricultural mana- gement systems: Traditional Management (T), in which the protocol used by farmers in the area with frequent applications of fungicides to control disease was followed, and Integrated Management (IPM) . The incidence and severity variables in leaves flowers and pods at stages V2, V4, R6, R7 and R8 of the crop and number of pods / plant, production of pods / plot, grain / plot (g) yield, weight of 100 seeds (g) and percentage of germination were assessed.The results indicated that under Traditional Management the Diacol Calima variety showed the highest rates of incidence of anthracnose in stages V2, V4 and R6 in leaves and R8 in pods. The AFR 612 variety evaluated under Integrated Management, presented the lowest percentages of anthracnose’s incidence and the highest production yields. RESUMO A fim de avaliar a antracnose (Colletotrichum lindemuthianum) no cultivo de feijão (Phaseolus vulgaris) no Município de Timbío, departamento de Cauca - Colômbia, foi realizado um delineamento em blocos casualizados em um inteiramente casualizado com dois tratamentos e três repetições . O efeito de duas variedades de feijão (Diacol Calima e AFR 612) em dois sistemas de gestão: gestão tradicionais, utilizados pelos agricultores na área com aplicações freqüentes de fungicidas no controle da doença. As variáveis foram avaliadas a incidência ea severidade da doença nas folhas, flores e vagens em estádios V2, V4, R6 cultura (primeira folha trifoliolada, terceiro trifólio e antes da floração) e R7 estágios (formação de vagens) e R8 (o enchimento de vagens), vagens por planta, produção de vagens / parcela, produção de grãos / parcela (g), peso de 100 sementes (g) e porcentagem de germinação. Os resultados mostraram que a variedade Calima Diacol em Gestão Tradicional apresentou as maiores taxas de inci- dência de antracnose em estágios V2, V4 e R6 para R8 folhas e vagens. A variedade AFR 612 em Gestão Integrada apresentou as taxas de incidência de antracnose e menor rendimentos mais elevados INTRODUCCIÓN La antracnosis, causada por el hongo Colletotrichum lindemuthianum, es probablemente la enfermedad más importante del frijol y puede llegar a cau- sar pérdidas en rendimiento de hasta 95%, cuando se siembran variedades susceptibles [1].Esta enfermedad forma lesiones carnosas, coloreadas, que luego se transforman en chancros hundidos y afecta principalmente la calidad de la vaina de las plantas de fríjol[2].Así mismo, las semillas infectadas frecuentemente presentan decoloración y pueden formar chan- cros cafés a negros [3].Su severidad hace que muchos agricultores utilicen PALABRAS CLAVE: Hongos, Phaseolus vulgaris, MIP, Colletotrichum lindemuthianum, Manejo integrado de plagas. KEYWORDS: Fungal, Phaseolus vulgaris, Colleto- trichum lindemuthianum, Integrated disease control, Integrated protec- tion. PALAVRAS-CHAVE: Fungos, Phaseolus vulgaris, Pla- nos de gestão integrada, Colleto- trichum lindemuthianum, Métodos de controle. 128 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (126 - 135) una amplia gama de fungicidas, lo cual representa altos costos en la producción y contaminación ambiental [4]. En las regiones de clima medio como el Municipio de Timbío, departamento del Cauca, las condiciones am- bientales son óptimas para el desarrollo de la antrac- nosis.Además, la tradición del pequeño productor de intercambiar semilla y de utilizar como semilla parte de la producción de grano comercial, incrementan el problema de la enfermedad como el principal limitante del cultivo de fríjol en la región [2]. Con el propósito de contribuir a mejorar las labo- res agronómicas, aspectos sociales, ambientales y económicos de los productores de fríjol en la re- gión, en esta investigación se evaluaron alternativas de Manejo Integrado de la antracnosis en el cultivo de fríjol de las variedades Diacol Calima y AFR 612, tendientes a optimizar costos y mejorar la produc- ción de grano [4]. MÉTODO La investigación se realizó durante dos ciclos de culti- vo, en la vereda El Retiro, Municipio de Timbío, Depar- tamento del Cauca, tradicionalmente se ha sembrado frijol, pero sin manejo apropiado. La finca esta loca- lizada a 1.738 m.s.n.m., contemperatura promedio entre 18 y 24 ºC, clima tropical caracterizado por dos épocas de lluvia y dos relativamente secas a través del año. La precipitación promedio anual es de 1555.7 mm, brillo solar de 1835.3 horas/año, días de lluvia 186 y humedad relativa de 75,3%. Se utilizó un diseño de bloques completos al azar (BCA) con tres repeticiones.Los tratamientos con- sistieron en dos tipos de manejo de la antracnosis en campo: T1 = Manejo Tradicional del agricultor, y T2 = Manejo Integrado para las variedades de fríjol Diacol Calima y AFR612.Los bloques representaron las repeticiones y estuvieron determinados por la pendiente del terreno con relieve irregular. (Bloque 1: pendiente alta, bloque 2: pendiente media, bloque 3: pendiente leve). El Manejo Tradicional se hizo con base en las prácticas realizadas por los agricultores de la región y para el Manejo Integrado se tomaron como referencia las in- vestigaciones realizadas en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) [3].En cada tratamiento se realizaron las labores siguientes: Manejo Integrado Preparación del suelo. Se hizo descapote y picado del terreno a 30 cm de profundidad antes de hacer el trazado de parcelas. Para la desinfección,se utilizó el método de solarización del suelo por 15 días, ademá- saplicación de Validacin 3% (SL) de grado lV en dosis de 1cc/L de agua el día anterior a la siembra.Como fer- tilización se aplicaron 2500 kg/ha de abono orgánico, 80 kg/ha de urea y 25 kg/ha de bórax incorporados en el suelo 10 a 15 días antes de la siembra. Selección de semillas.Se utilizó semilla de fríjol ar- bustivo certificada Diacol Calima y AFR 612 proceden- tes de la estación experimental CIAT Popayán (Cauca), Diacol es la que se siembra comúnmente en la zona y AFR 612 es la recomendada para la región. Siembra.Se realizo 15 días después de la preparación del terreno, con una distancia de 0,15 m entre planta y 0,60 m entre surcos, depositando una semillas por sitio. Control de arvenses.El control de arvenses se reali- zó en forma manual, condicionando esta actividad al desarrollo del cultivo para favorecer el normal creci- miento de la planta, la cual requiere de por lo menos 28 días libre de arvenses para obtener buenos rendi- mientos [6].Con base en lo anterior se realizaron dos desyerbas entre los días 18 y 21 y 40 y 45 después de la emergencia de la planta. Manejo de la enfermedad.Para el control de la antrac- nosis se aplicaron productos preventivos como oxiclo- ruro de cobre (80/20 -g/L de agua) y biopreparados (caldo de ceniza) a razón de 1 lt/10 lt de agua.Estos productos fueron aplicados semanalmente de forma alterna en las etapas de cultivo V2, V3 y V4, que co- rresponden a hojas primarias, primera hoja trifoliada y tercera hoja trifoliada respectivamente.En las etapas desde R5 hasta R7 (prefloración y formación de vai- nas) se hicieron aplicaciones de Benlate WP a razón de 1.5 g/lt de agua a intervalos de 12 días. Manejo tradicional Preparación del suelo. Se hizo mediante arada a 18 - 20 cm de profundidad y posterior nivelación.La desin- fección: se hizo por solarización dependiendo del tiem- po que trascurre desde el descapote hasta el momento de la siembra (3 días).No se realizó análisis de suelo y se aplicó cal dolomítica a 35% en dosis entre 100 y 120 g/m, tomando como referencia de medida la can- 129 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (125 - 135) tidad que el agricultor toma en su mano.La fertilización con abonos orgánicos al momento de la preparación del suelo se hizo con gallinaza a razón de 3 t/ha.Las fertilizaciones edáfica y foliar se hicieron con productos comerciales como 10-30-10 y 13-26-6 en dosis de 25- 30 g/planta, aplicadas al momento de la siembra y 30 días después de la germinación de las semillas. Selección y siembra de semilla.La semilla se obtuvo de la parcelas de los productores de la vereda El Retiro. La siembra se realizó después de la encalada y fertilización del terreno, utilizando una distancia de 0,30 m/planta y 0,60 m/entre surcos, colocando dos semillas/sitio. Control de arvenses.Se realizaron dos desyerbas de forma manual, entre los días 20 y 21 y 43 y 44 des- pués de la emergencia del fríjol. Manejo de la enfermedad. Se hicieron aplicaciones semanales de fungicidas: ditiocarbamato(3 g/lt de agua), carbendazim 500 SC (1 cc/lt de agua) y control 500 SC (2.5 cc/lt de agua) y la mezcla entre produc- tosditiocarbamatos y carbendazim + control 500 SC; las aplicaciones se realizaron de forma alterna, desde el momento de la emergencia (V1) hasta finalizar la etapa de cultivo R8 (llenado de vainas). Variables de respuesta Las variables evaluadas fueron: (1) Grado de infes- tación por antracnosis en hojas, flores y vainas, pro- ducción de fríjol y estimación de la relación beneficio/ costo en cada tratamiento.(2) Grado de incidencia y severidad de la enfermedad en hojas, flores y vainas, mediante un conteo en las etapas de cultivo V2, V4 y R6 (primera hoja trifoliada, tercera hoja trifoliada y prefloración) y en las etapas R7 (formación de vainas) y R8 (llenado de vainas) para vainas, tomando 15 plantas/parcela.La severidad se determinó con base en la escala visual de síntomas adoptada por COR- POICA -Rionegro (citada por Tamayo, 1995). (Cuadro 1). (3) La producción de fríjol en cada tratamiento se evaluó al momento de la cosecha teniendo en cuenta los componentes de rendimiento (Número de vainas/ planta y de vainas/parcela, peso de 100 semillas y ren- dimiento grano/parcela), lo que permitió conocer cuál fue el mejor tratamiento. Análisis estadístico Los resultados fueron analizados mediante el empleo del programa estadístico Statistical 6.0 (IBM SPSS) y las variables fueron evaluadas previamentepor ajuste con la normalidad, por medio de la prueba de Kolmo- gorov - Smirnov y homogeneidad de varianza (P < 0,05).Para determinar el mejortratamiento se realizó la prueba de comparación de promedios de Tukey RESULTADOS Se encontraron diferencias significativasentre los fac- tores de variación época, tratamiento, variedad,pero no se encontraron diferencias entre bloques, lo cual signi- fica que ni pendientes ni otro gradienteinfluyó sobre las variables de respuesta ni sobre los tratamientos. Las variables porcentaje de incidencia en flores y en vainas en la etapa R7, y porcentajes de severidad en R7 y R8 no presentaron diferencias con respecto a las demás.Las variables porcentajes de incidencia y severi- Cuadro 1. Promediosy pruebas de Tukeypara dos ciclos de siembra, en el Manejo de antracnosis GRADO DESCRIPCION 1 Sin síntomas visibles de la enfermedad. 3 Presencia de muy pocas lesiones de tamaño pequeño, generalmente en el envés de la hoja o en la vaina, las cuales cubren el 1 % del área foliar. 7 Presencia de numerosas lesiones grandes en el envés de la hoja. También se pueden observar lesiones necróticas en el haz y en los peciolos. En las vainas, presencia de lesiones de tamaño mediano (más de 2mm de diámetro), aunque pueden hallarse algu- nas pequeñas y grandes, generalmente con esporulación, que cubre aproximadamente el 10 % de la superficie de las vainas. 9 Necrosis evidente en el 25 % o más del tejido de la planta como resultado de lesiones en hojas, peciolo, tallo, rama e incluso en el punto de crecimiento; esta necrosis causa frecuentemente la muerte de la gran parte de los tejidos de la planta. La presencia de chan- cros cóncavos, numerosos, grandes y con esporulación puede ocasionar la deformación de las vainas, un bajo número de semillas y finalmente la muerte de las vainas. Fuente: Tamayo, 1995 130 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (126 - 135) dad en las etapas V2, V4, R6, y porcentaje de incidencia en R8, así como las variables de producción, porcentaje de germinación, promedio de vainas/planta, producción vainas/parcela, rendimiento grano/parcela (g) y peso 100 semillas (g), presentaron diferencias por la prueba de sensibilidad de Tukey (cuadros 1 y 2). Incidencia de antracnosis Los índices más altos de incidencia se presentaron en Manejo Tradicional en las etapas V2 y R8.Esto fue de- bido, entre otros factores, a las variaciones climáticas presentadas en el primero y segundo ciclo de siembra (396,5 y 479 mm de lluvia, 14,2 y 23,8 ºC y 14,6 y 22,6 ºC de temperatura, y 83,2% y 87,8% de humedad rela- tiva, respectivamente) que favorecieron la proliferación de la antracnosis en el cultivo durante la evaluación. Lo anterior coincide con los hallazgos de Botero [7], que hace referencia a la gran influencia de las condi- ciones ambientales para la diseminación del patógeno. Por el contrario, otros consideran que la antracnosis se presenta con mayor severidad durante el período de lluvias, temperaturas máximas de 31°C y mínimas de 24°C y con valores de humedad relativa superior a 90 % [8]. En condiciones favorables, la alta precipitación es el factor más importante que se relaciona con la in- cidencia y severidad de la enfermedad, principalmente cuando ocurren precipitaciones con duración entre 2 y 5 días consecutivos. Los más altos índices de incidencia en las dos siem- bras ocurrieron en la variedad Diacol Calima entre las etapas V2 y R8.Esta alta incidencia pudo estar influen- ciada por la calidad de las semillas no desinfectadas provenientes de cosechas anteriores y cultivadas en suelo igualmente no desinfectado, aunque se ha de- mostrado que tanto el patógeno C. lindemuthianum como Rhizoctonia solani pueden ser transmitidos por semilla o encontrarse en el suelo en poblaciones con- siderables [9] y se indica que la comercialización de semillas entre productores de la misma zona o zonas productoras diferentes, facilita la diseminación de la antracnosis de frijol [1]. Incidencia por etapas de desarrollo de la planta. Etapa V2 (hojas primarias).En esta etapa se presen- taron diferencias significativas en los dos ciclos de siembra entre tratamientos y variedades (cuadro 2).El tratamiento con los índices más bajos de incidencia fue el Manejo Integrado para las dos variedades, en comparación con el Manejo Tradicional (cuadro 3). Cuadro 2. Análisis de varianza para dos épocas de siembra de fríjolyManejode la antracnosis primera siembra Tratamiento Variedad Tratamiento *Variedad % germinación 0,001* 0,86 0,56 % Incidencia en V2 0,001* 0,001* 0,3 Escala severidad en V2 0,001* 0,08 0,08 % Incidencia en V4 0,001* 0,07 0,99 Escala severidad en V4 1 0,2 0,2 % Incidencia en R6 0,14 0,01* 0,75 Escala severidad en R6 0,72 0,72 0,72 % incidencia en R8 0,001* 0,001* 0,88 Promedio vainas/ planta 0,001* 0,15 0,01* Producción vainas/parcela 0,001* 0,001* 0,001* Rendimiento grano/parcela(g) 0,67 0,01* 0,2 Peso de 100 semillas(g) 0,14 0,001* 0,07 Segunda siembra % germinación 0,09 0,001* 0,66 % Incidencia en V2 0,001* 0,001* 0,26 Escala severidad en V2 0,08 0,08 0,08 % Incidencia en V4 1 0,001* 0,19 Escala severidad en V4 1 0,2 0,2 % Incidencia en R6 0,19 0,03* 0,08 Escala severidad en R6 0,28 0,05* 0,28 % incidencia en R8 0,01* 0,02* 0,15 Promedio vainas/ planta 0,01* 0,17 0,72 Producción vainas/parcela 0,02* 0,01* 0,08 Rendimiento grano/parcela(g) 0,24 0,001* 0,16 Peso de 100 semillas(g) 0,06 0,001* 0,03* *Valores en las filas expresan la significancia según el análisis va||au/a pa|a cada va||ab|e (P±O,O5). 131 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (125 - 135) En ambos ciclos de siembra se presentaron diferencias entre los tratamientos, variedades y época-tratamiento (Cuadro 4).Los porcentajes más bajos de incidencia se presentaron en el Manejo Integrado con la varie- dad AFR 612 (0,001%), por el contrario, en el Manejo Tradicional la variedad AFR 612 presentó la más alta incidencia (26,67%) en la primera siembra. Etapa V4 (tercera hoja trifoliada).En esta etapa se presentaron diferencias en el primero y segundo ciclo de siembra entre tratamientos y entre las variedades (cuadro 2). Durante el primer ciclo de siembra el tratamiento con los porcentajes más bajos de incidencia fue el Manejo Integrado (cuadro 3).En el segundo ciclo, la variedad AFR 612 presentó los porcentajes más bajos de inci- dencia en los dos tratamientos. (cuadro 3). Las varia- ciones en los porcentajes de incidencia de la antrac- nosis en las etapas de cultivo V2 y V4, aparentemente estuvieron influenciadas por las condiciones climáti- cas que se presentaron durante la época de cultivo, con un rango de temperatura entre 14,2 y 23,2 ºC y promedio de 18,2 ºC; humedad relativa de 83,25% y precipitación de 242 mm condiciones que favorecie- ron la proliferación del patógeno, lo que coincide con [10] que encontró que la temperatura de desarrollo del patógeno es variable entre 13 y 26 ºC, con un óptimo de 17 ºC; por encima de 27 ºC la infección no se pre- senta y a temperaturas inferioresa 13 ºC se reduce el ataque del hongo. Etapa R6 (floración).En esta etapa se presentaron diferencias entre épocas, tratamientos y variedades (Cuadro 4).Los porcentajes más bajos de incidencia se presentaron en la variedad AFR 612 con el Manejo Inte- grado para los dos ciclos de siembra (cuadro 3).La baja incidencia de antracnosis bajo condiciones de Manejo Integrado es resultado de la aplicación de agroquímicos desde la etapaR5 (prefloración) y durante el desarrollo de las vainas en R7.Otro factor que influyó fue el uso de semillas sanas que dieron plantas con mayor vigor y más tolerantes frente al ataque de la enfermedad. Etapa R8 (llenado de vainas).Para ambos ciclos de siembra se presentaron diferencias entre época, tratamiento y variedad (cuadro 4).Los porcentajes más bajos de incidencia se presentaron en el Manejo Integrado para la variedad AFR 612 con un compor- tamiento similar en la primera y segunda siembra, la mayor incidencia fue encontrada en Manejo Tradicio- nal (cuadro 1). Cuadro 3. Promedios post ANOVA y prueba de Tukeyen Manejo de antracnosis en el cultivo de fríjol Primera siembra Tratamiento Manejo Tradicional Manejo Integrado Variedad Diacol AFR612 Diacol AFR612 Calima Calima % germinación 62,33 a 66,67 ab 88,67 b 86,33 ab % Incidencia en V2 46,67 c 26,67 b 11,10 ab 0,001 a Escala de severi- dad en V2 3,00 b 3,00 b 2,33 ab 1,00 a % Incidencia en V4 35,53 b 26,67 ab 17,80 ab 8,87 a Escala de severi- dad en V4 3,00 a 3,00 a 3,67 a 2,33 a % Incidencia en R6 37,77 b 24,47 ab 31,13 ab 20,00 a Escala de severi- dad en R6 5,67 a 5,00 a 5,00 a 5,00 a % incidencia en R8 43,11 c 33,36 b 28,93 b 18,51 a Promedio vainas/ planta 14,67 a 16,00 a 20,00 b 16,67 a Producción vainas/parcela 730,00 a 732,00 a 977,67 b 802,67 a Rendimiento gra- no/parcela (g) 2174,18 a 2629,70 a 1924,38 a 3113,27 a Peso de 100 semillas (g) 86,34 a 94,70 ab 84,27 a 111,15 b Segunda siembra % germinación 57,67 a 86,00 b 70,67 ab 94,00 c % Incidencia en V2 33,33 c 17,77 b 24,47 bc 2,23 a Escala de severi- dad en V2 3,00 a 3,00 a 3,00 a 1,67 a % Incidencia en V4 20,00 ab 11,10 ab 24,47 b 6,67 a Escala de severi- dad en V4 3,00 a 3,00 a 3,67 a 2,33 a % Incidencia en R6 24,43 ab 22,23 ab 26,67 b 8,90 a Escala de severi- dad en R6 5,67 a 5,00 a 5,67 a 3,67 a % incidencia en R8 52,41 b 44,50 b 41,76 b 14,38 a Promedio vainas/ planta 12,33 ab 10,67 a 15,33 b 14,33 ab Producción vainas/parcela 567,67 a 661,67 a 626,33 a 943,67 b Rendimiento gra- no/parcela (g) 1402,69 a 2342,99 b 1360,85 a 2754,79 b Peso de 100 semillas (g) 85,02 a 94,48 a 83,06 a 113,68 b Valores con letras diferentes en la misma fila difieren s|gu|l|cal|vameule seguu Tu|ey (P±O,O5). 132 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (126 - 135) Estos resultados con Manejo Tradicional se debieron a la mayor densidad de siembra en este sistema que favoreció mayor follaje y un microclima favorable para el inicio de la enfermedad, en tanto que [7] encontró resultados similares en el ataque de antracnosis en tomate de árbol.Por otra parte, la condensación de la humedad sobre el follaje favorece la distribución y la diseminación de conidios de la enfermedad.Otro fac- tor que incrementó la incidencia de la antracnosis en la segunda siembra fue las altas precipitaciones que se presentaron durante el ciclo hasta alcanzar la etapa R8, las cuales reducen la eficiencia de los fungicidas). Severidad del ataque de antracnosis. La severidad de la antracnosis sólo fue significativa en la etapa V2 (hojas primarias). El porcentaje más bajo de severidad se presentó en el Manejo Integrado en la variedad AFR 612 comparado conManejo Tradicional en las variedades Diacol Clima y AFR612 (cuadro 1). Según la escala de severidad de se considera este nivel de daño como bajo y la planta resistente [3]. Esto se explica por los bajos niveles de humedad relativa (76 %) que se presentaron duran- te la etapa V2 (hojas primarias).Para el desarrollo de antracnosis es necesario un nivel de humedad relativa superior al 92% [5]. Otros factores que pudieron influir en el bajo porcentaje de severidad de antracnosis fueron las prácticas cultu- rales anteriormente realizadas como: desinfección del suelo y de semilla, que son las principales fuentes de inóculo del patógeno, así mismo, el establecimiento del cultivo con densidades adecuadas de siembra que proporciona a la plantas condiciones favorables para su desarrollo. Lo anterior es similar a lo reportado por [10], quienes demostraron que tanto Rhizoctonia so- lani como Colletotrichum lindemuthianum pueden ser transmitidos por la semilla o encontrarse en poblacio- nes considerables en el suelo. Porcentaje de germinación. Se presentaron diferen- cias significativas para los dos ciclos entre tratamien- tos y variedades (cuadro 2) y entre tratamientos, varie- dad y época-variedad (cuadro 4). Los porcentajes más altos de germinación se presen- taron en el Manejo Integrado para la variedad AFR 612 (94%), con relación al Manejo Tradicional (66,67%). La baja germinación del Manejo Tradicional se atribu- ye a la calidad de la semilla, la mayoría provenía de cosechas anteriores y no se les realiza desinfección, igual sucedía con el suelo. Así mismo se indica que la emergencia está ligada al vigor de la semilla y a las propiedades del suelo como la humedad y la fertilidad del mismo [1]. Promedio vainas/planta. Durante los dos ciclosde siembra, los promedios más bajos de vainas/planta, se presentaron en el Manejo Tradicional para las dos variedades (cuadro 3) y la variedad con los promedios más bajos de vainas/planta fue Diacol Clima (cuadro 1). La diferencia entre épocas se debe a que para la prime- ra siembra, el terreno tenía un descanso de 9 meses, que favoreció la acumulación de nutrientes y aporte de microorganismos benéficos al cultivo. Otro factor fue el número de vainas/planta que se vio favorecido por la solarización a la que fue sometido el suelo en cada tratamiento para la primera siembra, ya que esta labor incrementa en cierta medida los rendimientos de producción. Esto es similar a lo reportado por [11], en ensayo sobre el efecto de la solarización en el rendimiento y control de las arvenses en fríjo, durante la solarización de la primera siembra tanto la temperatura como las horas luz fueron significativamente superiores a las de la segunda siembra. A pesar de que en las primeras etapas de cultivo (V0, V2 y V4) en la primera siembra, la precipitación estuvo por debajo de los requerimien- tos óptimos (120 mm) experimentales (V0 a V4 18,5 mm), esto no afecto la producción promedio de vai- nas/planta. Sin embargo, la precipitación total hasta la etapa R8 (396,5 mm) se acercó al óptimo (400 mm) según [16],citado por [11], lo que al parecer compen- só el déficit hídrico inicial. En contraste en la segunda siembra durante las etapas iníciales la precipitación alcanzo los 224 mm y entotal hasta la etapa R8 fue de 479 mm. El promedio de vainas/planta pudo también estar in- fluenciado por las distancias de siembra utilizadas para cada tratamiento: haciendo que se presente una mayor competencia por nutrientes en el Manejo Tradicional y limitando el potencial genético de cada variedad. Similar a lo reportado por [12], que afirma que al disminuir el número de plantas por área aumenta el número de vai- nas/planta y granos/vaina, ya que al disminuir la densi- dad poblacional cada planta obtiene condiciones favo- rables para desarrollarse, minimizando la competencia por nutrientes, agua y luz, efectuándose de esta mane- 133 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (125 - 135) ra el efecto de compensación entre los componentes. Así mismo [19], afirma que los patrones de compor- tamiento de vainas/planta difieren significativamente entre genotipos con distintas arquitecturas de planta y hábitos de crecimiento; probablemente, los resultados obtenidos se deban a esta aseveración,aunque las dos variedades en estudio presentaron el mismo hábito de crecimiento (arbustivo determinado). Producción vainas/parcela. Durante los dos ciclos de siembra, la producción de vainas/parcelamás altas se presentó en el Manejo Integrado para las dos va- riedades (Cuadro 3). Para los dos ciclos de siembra la producción de vainas/parcela fue similar en las dos variedades en el Manejo Integrado, mientras en el Ma- nejo Tradicional es menor en Diacol Calima (Cuadro 1). [11] citados por [19], señalan que la antracnosis es más severa en las etapas de floración (R6), formación de vainas (R7) y llenado de vainas (R8). En floración, los cambios fisiológicos ocurridos en las plantas en cuanto a producción de hormonas y azúcares favorece el desarrollo de la enfermedad; allí una alta severidad de la enfermedad conlleva a la reducción en el número de vainas y baja producción, debido a la caída de flores y vainas en formación. Esto destaca la importancia de las aspersiones con Benomil en las etapas de cultivo R5 (prefloración) a R7 (formación de vainas), que fa- vorecieron la protección de la planta y se disminuyó la severidad de la antracnosis, favoreciendo en cierto modo la floración y posteriormente la obtención de un número mayor de vainas sanas. Otro factor determi- nante fue el uso variedades con alta expresión genética. Rendimiento grano/parcela (g). Durante los dos ci- clos de siembra, los más altos rendimientos se pre- sentaron en la variedad AFR 612 en los dos tipos de Manejo (Cuadro 3). Para los dos ciclos de siembra, se presentaron diferencias significativas entre época y variedades (Cuadro 4). Los más altos rendimientos se presentaron en la variedad AFR 612 con 3113,27 g bajo Manejo Integrado en la primera siembra. [9], Citado por [13], menciona que el rendimiento es un carácter cuantitativo y está controlado por varios o muchos genes, siendo el producto de la interacción de los factores ecológicos y el genotipo de la planta; es función de varias características anatómicas y morfo- lógicas, que tienen que ver con el número de vainas/ rama, el número de vainas/planta, número de semillas/ vaina y el peso de la semilla. A pesar de que la varie- dad Diacol Calima tuvo los mejores resultados para las variables promedio vainas/planta y producción vainas/ Cuadro 4. Análisis de varianza para dos ciclos de siembra de fríjol y Manejo de antracnosis. Variables Época tratamiento Variedad % germinación 0,78 0,001* 0,001* % Incidencia enV2 0,5 0,001* 0,001* Escala severi- dad en V2 0,18 0,001* 0,01* %IncidenciaV4 0,02* 0,001* 0,001* Escala severi- dad en V4 1 1 0,06 %Incidencia R6 0,01* 0,04* 0,001* Escala severi- dad en R6 0,76 0,36 0,13 % incidencia en R8 0,04* 0,001* 0,001* Promedio vainas/planta 0,001* 0,001* 0,05* Producción vainas/parcela 0,001* 0,001* 0,06 Rendimieto gra- no/parcela(g) 0,001* 0,33 0,001* Peso de 100 semillas(g) 0,99 0,02* 0,001* Época/ trat. Época/ Var. Trat./ Var. Época/ trat./ Var. % germinación 0,13 0,01* 0,46 0,92 % Incidencia enV2 0,001* 0,5 0,82 0,13 Escala severi- dad en V2 0,18 1 0,01* 1 %Incidenciaen V4 0,001* 0,42 0,41 0,42 Escala severi- dad en V4 1 1 0,06 1 %Incidencia en R6 1 0,67 0,21 0,1 Escala severi- dad en R6 0,76 0,36 0,76 0,36 % incidencia en R8 0,37 0,25 0,13 0,16 Promedio vainas/planta 0,76 0,76 0,08 0,03* Producción vainas/parcela 0,85 0,001* 0,7 0,001* Rendimien- to grano/ parcela(g) 0,82 0,27 0,07 0,65 Peso de 100 semillas(g) 0,81 0,69 0,001* 0,83 *Valores en las filas expresan la significancia según el análisis va||au/a pa|a cada va||ab|e (P±O,O5) 134 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (126 - 135) parcela, su rendimiento en grano estuvo por debajo de la variedad AFR 612, debido a que el tamaño de vaina del Diacol Calima (8 cm promedio), fue más pequeño que la del AFR 612 (10 – 12 cm promedio). Por lo tanto, el número de grano fue menor. Así mismo [2],citado por [13], asegura que la gran pro- ducción de vainas/planta hace que haya mayor desgas- te y produzca menor cantidad de granos con tamaño más reducido. Otro factor que pudo afectar positiva o negativamente el rendimiento de grano/parcela es el ambiente, [14], lo mencionarefiriendo alcoeficiente de correlación ambiental entre el rendimiento/parcela y las semillas/vaina que se presenta sólo cuando el ambiente favorece un carácter en detrimento del otro. [12], expre- sa que bajo un determinado régimen climático, fertilidad de suelos y disponibilidad de agua, el cultivo es maneja- do para proveer las mejores condiciones de crecimiento y que los efectos de las plagas y enfermedades son mi- nimizados o están completamente ausente. Peso de 100 semillas (g). Se presentaron diferencias significativas para el primer ciclo entre variedades y en el segundo ciclo entre variedades y tratamientos-varie- dades (Cuadro 2). Para los dos ciclos de siembra, se presentaron diferencias significativas entre tratamien- tos, variedad y tratamiento-variedad (Cuadro 4). El mayor peso de 100 semillas fue en Manejo Integrado para la variedad AFR 612(Cuadro 1). Las diferencias entre variedades pudieron deberse al factor genético y su interacción con los factores medioambientales que favorecieron en cierta medida la expresión de sus características productivas. Con base en los resultados obtenidos, se puede afirmar que el Manejo Integrado con la implementación de diferentes prácticas culturales, utilización de semillas sanas y la aplicación de productos preventivos (caldo de ceniza y oxicloruro de cobre) y sistémicos (Beno- mil), fueron superiores al Manejo Tradicional por pre- sentar semillas más grandes y de mayor peso. Resultados similares han sido obtenidos por Gonzáles, et al, citados por [15] y [16],quienes expresaron que el peso de la semilla es condicionado por el traslado de los nutrientes de la planta a la semilla durante la fase vegetativa de la planta. Además, de ser un ca- rácter cuantitativo influenciado por el medio ambiente, es también un carácter influenciado por factores here- ditarios [9], citado por [13]. [14] señala que el peso de 100 semillas es un carácter que reflejael tamaño de los granos, que a su vez esta determinado con el largo, grueso y densidad del mismo. [11], [7],citado por [17] [18], expresa que existe tendencia a reducir el número de vainas/planta y granos/vaina cuando se aumenta la población de plantas por área, provocando un incremento en el peso de 100 semillas. CONCLUSIONES El Manejo Integrado presentó los mejores resultados con relación al Manejo Tradicional al disminuir los cos- tos de producción y mejorar la producción de grano. La variedad Diacol Calima bajo Manejo Tradicional presentó los porcentajes de incidencia más altos de antracnosis en las etapas de cultivo V2, V4 y R6 para hojas y R8 en vainas de fríjol. La variedad AFR 612 evaluada en el Manejo Integrado, presentó los porcentajes más bajos de incidencia de antracnosis (Colletotrichum lindemuthianum) y mayo- res rendimientos productivos. Las prácticas culturales como desinfección del sue- lo, uso de semillas sanas, tratamiento de semillas con productos químicos, prácticas agronómicas que reduzcan la humedad del cultivo y densidades ade- cuadas de siembra, ayudan a minimizar el daño y la población de patógenos en el suelo. El manejo químico constituye una herramienta im- portante del Manejo Integrado deantracnosis (Colle- totrichum lindemuthianum). Para ello es importante considerar que existen épocas o estados fenológicos en los cuales el patógeno no es controlado por otros métodos y en ese caso los fungicidas son oportunos para evitar el desarrollo del patógeno. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen a la Universidad del Cauca y a la comunidad de la Vereda el retiro del municipio de Timbio, por el apoyo durante el proceso de investiga- ción del trabajo de grado de Arnulfo Ibagón y Felipe Perafán, del cual se derivó el presente documento. REFERENCIAS [1] QUIRÓS, J., AREVALO, M., DÍAZ, C. y RÍOS, M. Factores relacionados con la adopción de tecno- 135 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (125 - 135) logía en el cultivo de fríjol en Uramita, Antioquia. Pub. No. 102. Centro de Investigación la Selva. Rionego (Colombia): Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (CORPOICA), Regio- nal 14, 1997, p. 12-27 [2] CHAVES, G. La antracnosis. Problemas de pro- ducción de fríjol. In: H. 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Este trabajo tuvo como objetivo principal el aislamiento e identificación de las levaduras encontradas en los zumos de mora, piña y uva. La identificación de las cepas se realizó mediante el uso de técnicas moleculares. Primero se realizó el análisis RFLP del gen ribosomal 5,8s y sus espaciadores transcritos internos con las enzimas CfoI, HaeIII y HinfI, para establecer agrupaciones de acuerdo a los patrones de restricción. Posterior- mente 28 cepas fueron seleccionadas como representantes de los grupos para secuenciar el dominio D1/D2 del gen ribosomal 26 s y poder definir a que especie pertenecían los diferentes aislados. Adicionalmente se hizo una caracterización fi- siológica parcial de cada una de las cepas. Finalmente se logró la identificación de 66 cepas levaduriformes, distribuidas en las siguientes especies: Hanseniaspora uvarum, Wickerhamomyces pijperi, Candida sp., Pichia kluyveri, Hansenia sporau- varum, Candida boidinii, Candida oleophila, Meyerozyma caribbica, Hanseniaspora Recibido para evaluación: 07-11-2012. Aprobado para publicación: 27-05-2013. 1 Bióloga. Joven Investigador Universidad San Buenaventura Sede Cali 2 Biólogo. Joven Investigador Universidad San Buenaventura Sede Cali 3 Biólogo. Magíster en Ciencias Biológicas. Doctorando en Ciencias Biológicas. Docente Asociado Programa de Agroindustria, Universidad de San Buenaventura Sede Cali. 4 Ingeniero Agroindustrial. Especialista en Docencia Universitaria y Gerencia de Mercadeo. Magíster en Mercadeo Agroindustrial. Docente Asociado Programa de Agroindustria, Universidad de San Buenaventura Sede Cali. 5 Biólogo. Doctor en Bioquímica. Docente Titular Universidad del Valle Correspondencia:
[email protected] 137 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (136 - 144) pseudo guilliermondii, Pichia sp.1, Pichia sp.2, Candida pseudointermedia, Pichia membranifaciens, Issatchenkia terrícola y Candida azyma ABSTRACT Fruits are important micro-habitats for a variety of yeast species in the wild due to its high concentration of simple sugars, low pH and constant visits by insect vectors. This work had as main objective the isolation and identi- fication of yeasts found in black berry juice, pineapple and grape. The iden- tification of this trains was performed by using molecular techniques. First performed RFLP analysis of ribosomal gene internal transcribed spacers 5,8s y her with enzymes Cfo I, Hae III and HinfI to establish groups accor- ding to restriction patterns. Then 28 strains were selected as representati- ves of groups to sequence the D1/D2 do main of 26S ribosomal gene and to define the specie of the different isolates. Additionally it was a partial physiological characterization of each of the strains. Finally achieving the identification of 66 yeast strains, divided into the following species: Hanse- niaspora uvarum, Wickerhamomyces pijperi, Candida sp., Pichia kluyveri, Hansenia sporauvarum, Candida boidinii, Candida oleophila, Meyerozyma caribbica, Hanseniaspora pseudo guilliermondii, Pichiasp.1, Pichiasp.2, Candida pseudointermedia , Pichia membranifaciens, Issatchenkia terríco- la and Candida azyma RESUMO As frutas são importantes microhabitats para uma variedade de espécies de leveduras na natureza devido à sua alta concentração de açúcares simples, baixo pH e visitas constantes por insetos vetores. Este trabalho teve como objetivo principal o isolamento e identificação das leveduras encontradas no suco de amora, abacaxi e uva. A identificação das estir- pes foi realizada utilizando técnicas moleculares. Primeiro realizada uma análise de RFLP do gene ribossomal espaçadores internos transcritos 5,8s y la com enzimas CFOI, HaeIII e HinfI para estabelecer grupos de acordo com os padrões de restrição. Em seguida, 28 foram selecionados como representantes de grupos a sequência do domínio D1/D2 do gene ribos- somal 26S e para definir a espécie dos diferentes isolados. Além disso, ele era um caracterização parcial fisiológica de cada uma das estirpes. Finalmente, chegando à identificação de 66 cepas de leveduras, dividi- dos nas seguintes espécies: Hanseniaspora uvarum, Wickerhamomyces pijperi, Candida sp, Pichia kluyveri, Wickerhamomyces anomalus, Candida boidinii, Candida oleophila, Meyerozyma caribbica, Hanseniaspora pseu- doguilliermondii, Pichia sp.1, Pichia. sp.2, Candida pseudointermedia, Pi- chia membranifaciens, tIssatchenkia terrícola e Candida azyma INTRODUCCIÓN Las levaduras son hongos unicelulares que pueden ser clasificados en dos grupo filéticos: levaduras ascomicetos asanamórficas y teleomórficas y levaduras basidiomicetos asanamórficas [1]. PALABRAS CLAVES: Frutas,Técnica, Dominio D1/D2, RFLPs. KEY WORDS: Fruit, Technical, Domain D1/D2, RFLPs. PALAVRAS-CHAVE: Frutas, Técnicas, Dominio D1/D2, RFLPs. 138 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (136 - 144) Debido a su gran diversidad fisiológica pueden crecer en un amplio rango de hábitats. Al ser organismos he- terotróficos requieren para su crecimiento nutrientes minerales y una cantidad significativa de carbono or- gánico. La variedad de hábitats en los cuales se pueden encontrar levaduras incluyen: suelos, insectos, plantas, frutas, exudados de árboles, algas, ambientes marinos y la atmosfera. De igual manera, su presencia también es común en alimentos manufacturados, bebidas fer- mentadas, en intestinos de animales entre otros [2]. Las frutas son micro hábitats importantes para una va- riedad de especies de levaduras en la naturaleza debido a su alta concentración de azúcares simples, bajo pH y la constante visita por insectos vectores [3]. En estos sustratos la sucesión de levaduras está involucrada en varios procesos bioquímicos y ecológicos, incluyendo el deterioro de las frutas. Esto ocurre debido a la habi- lidad de las levaduras para utilizar rápidamente azúca- res simples presentes en los sustratos. La presencia de especies proteolíticas y pectinolíticas sobre estos sustratos puede cumplir un papel muy importante en el establecimiento y mantenimiento de la comunidad levaduriforme [4]. Durante la colonización de las frutas algunos de estos factores pueden conferirle ventajas adaptativas a algunas especies. La presencia de ce- pas productoras de b-glucosidasa puede contribuir a mejorar las características aromáticas de las frutas, además de ser de importancia biotecnológica para su aplicación en la industria alimenticia [5]. En Colombia son pocos los estudios enfocados a la diversidad de levaduras presente en diferentes sustra- tos. En este sentido se destaca el estudio de Osorio et al. (2008), en el cual se evaluó la diversidad de levadu- ras asociada al “champús”, reportando las siguientes especies: S. cerevisiae, Issatchen kia orientalis, P. fer- mentans, Zygo saccharomyces fermentati, Torulospo- ra del bruekii, P. kluyverivar. kluyveri, y Galactomyces geotrichum [6]. López et al. (2009) identificaron las especies más re- presentativas en chichas de maíz, piña y arracacha: Candida tropicalis, Pichia kluyveri, Pichia guilliermon- dii, Hanseniapora guilliermondii, Pichia fermentans, Saccharomyces cerevisiae, Candida maltosa, Rhodo- torula glutinis, Torulaspora del brueckii, Hansenias- pora uvarum, Kazachstania exigua, Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lypolitica, Candida parapsilosis, Debaromyces hansenii, Cryptococcus arboriformis, Saccharomyces martiniae, Dekkera anomala, Aureo- basidium pullulans y Candida pseudo intermedia [7]. El propósito de esta investigación fue identificar las es- pecies de levaduras más representativas en tres frutas: uva, piña y mora. En este estudio se usaron métodos moleculares para la caracterización de las levaduras nativas presentes en las tres frutas. Para realizar esta caracterización se usaron las técnicas, análisis RFLP del gen ribosomal 5,8s y sus espaciadores transcritos internos, usando las enzimas de restricción Hhal, Hae- lll y Hinfl; y el secuenciamiento del dominio D1/D2 del gen ribosomal 26s. MÉTODO Preparación del zumo y aislamiento de las levaduras El zumo de las frutas (piña, mora y uva) se preparó agregando 10 g de la fruta en 100 mL de agua des- tilada estéril. Se realizaron 5 preparaciones de cada zumo. Para cada preparación diferente se hizo un muestreo, en cada uno de estos, se realizaron dilu- ciones seriadas (10 -1 -10 -5 ) y aislamiento en medio de cultivo YPDA (1% extracto de levadura, 2% peptona micológica, 2% de glucosa, 2% agar) suplementado con 25 mg/L de penicilina y cloranfenicol. Las placas se incubaron a 30°C por 3 días y se aislaron las colo- nias más representativas. Caracterización fenotípica Los aislados fueron analizados según criterios morfo- lógicos y fisiológicos de acuerdo a las descripciones realizadas por Boekhout et al. (2004). Se evaluó la morfología celular, modo de reproducción vegetativa y caracterización fisiológica. La habilidad para fer- mentar (2% de fuente de carbono) y asimilar (0,5% de fuente de carbono) glucosa, maltosa, sacarosa, y fructosa fue evaluada por la acumulación de dióxido de carbono en tubos durhamy turbidez en escala de Wickerham, respectivamente. Final-mente, se evaluó la halo-tolerancia(10, 15% p/v) en medio YNB, y la termotolerancia (28°C, 30°C y 35°C) en medio YPDA (Boekhout et al., 2004). Todas las pruebas fisiológicas se realizaron a 30°C. Extracción de ADN genómico de levaduras Para la extracción de ADN genómico de levaduras, se empleó el protocolo de Osorio-Cadavid et al. (2009): se tomó un cultivo fresco que se puso a crecer en me- dio YPD a 120rpm por 16 horas a 28°C. Posteriormen- te, se recuperaron las células por centrifugación. (Mi- 139 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (136 - 144) crocentrífuga Eppendorf) a 8000 rpm durante 5 min en un tubo de microcentrífuga. Luego se resuspendió el precipitado de células en 0,5 mL de una solución de Sorbitol 1 M, EDTA 0,1 M, (pH 5), que contenía 50 Unidades (U) de la enzima Beta-glucoronidasa (Sig- ma-Aldrich). La suspensión se incubó en baño maría a 37°C por 60 minutos, agitando periódicamente. Se- guidamente se centrifugó la suspensión a 8000 rpm por 10 minutos y se resuspendió el precipitado en 0,5 mL de Tris-HCl 50mM, EDTA 20mM, (pH 7,4). Se aña- dieron 50µl de SDS al 10% y se incubó en baño maria a 65°C por 30 minutos. Inmediatamente se agregaron 0,2 mL de acetato de potasio (KAc) 5M (pH 4,8), se resuspendió (mínimo durante 30 segundos) y se dejó en baño de hielo por 30 minutos. Después, se centrifugó a 14 000 rpm por 5 minutos y se trasladó el sobrenadante a otro tubo, repitiendo este paso nuevamente para eliminar otras impurezas. Luego se adicionó 1 mL de isopropanol (conservado a -20°C) y se incubó a temperatura ambiente por 5 minutos agitando suavemente el tubo. Posteriormente, se centrifugó a 14 000 rpm por 10 minutos y se des- cartó el sobrenadante. A continuación, se añadieron 0,5 mL de etanol al 70% (conservado a -20°C), y se centrifugó a 14 000 rpm por 5 minutos descartandose el sobrenadante. Finalmente, se dejó secar el precipita- do a temperatura ambiente, y se resuspendió en 50µl de TE (Tris-EDTA pH 7,4), se incubó por 5 minutos en baño maría a 100°C y se dejó enfriar a temperatu- ra ambiente. La extracción se verificó añadiendo 3µl en gel de agarosa al 1% usando TBE 1X (Tris-Borato- EDTA) a 100-110v, durante 30 min. PCR-RFLP´S de la región 5.8s-ITS Para la amplificación de la región que compren- de el gen ribosomal 5,8S y sus dos espaciadores transcritos internos (ITS1 e ITS2), se utilizaron los primers ITS1 (5´ CCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) e ITS4(5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´) (White 1990; Suárez 2007). Se preparó un cóctel de reacción de 28µl que con- tenía: 0,5 µM ITS1, 0,5 µM ITS4, 10 µM DNTPs, 1X NH 4 + , 1,5 mM MgCl 2 , y 1,2 unidades (U) de Taq Polimerasa, y se adiciono 7µl de ADN (600 ng aproximadamente) para un volumen final de 35 µl. La región del gen ribosomal 5,8S se amplificó en un termociclador (M.J. Research PTC-150, minicycler), bajo las siguientes condiciones: de naturación inicial a 94ºC por 5minutos, 30 ciclos de denaturación a 94ºC por 30s, apareamiento a 55ºC por 30s, y exten- sión a 72ºC por 1min, con una extensión final de 10 min a 72ºC. Los amplificados se verificaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio. La digestión de la región amplificada se realizó con las enzimas CfoI, HaeIIIy HinfI(Esteve-Zarzoso et. al 1999). Para la reacción con cada enzima se utilizaron 9µl del amplificado, 2 U de enzima y 1X del buffer de la enzima. La incubación se realizó por dos horas en un baño maría a 37°C. Los fragmentos de ADN gene- rados por cada enzima fueron visualizados en geles de agarosa al 1,5% teñidos con bromuro de etidio. Los tamaños, tanto de los amplificados como de los frag- mentos de restricción, se calcularon usando el soft- ware UvigelStartMw v11 ©, tomando como referencia el marcador de peso molecular Generuler 50pb. Secuenciación del dominio D1/D2 gen rRNA 26S Los aislados del cepario de la Universidad San Bue- naventura – Cali fueron identificados usando la se- cuencia del dominio D1/D2 del gen ribosomal 26S. Los primers utilizados para amplificar esta esta región fueron: NL1 (5´-CATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3´) yNL4(5´-GTCCGTGTTTCAAGACGG-3´). Las reacciones de amplificación (PCR) se realizaron en un termociclador (Multigene- Labnet, USA) bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94ºC por 5minutos, 30 ciclos de desnaturalización a 94 ºC por 1 min, apareamiento a 55 ºC por 30 seg, y extensión a 72 ºC por 1 min, con una extensión fi- nal de 10min a 72 ºC. (Osorio-Cadavid et al. 2008). Para la amplificación, se tomarán 7 uL (aproxima- damente 1 ng/µL) de ADN Genómico extraído y se resuspendió en 28µL de mezcla de PCR: 0,5 µM ITS1, 0,5 µM ITS4, 10 µM dNTPs, 1X NH 4 + , 1,5 mM MgCl 2 , y 1U de Taq Polimerasa. Los amplificados fueron visualizados por medio de electroforesis en geles de agarosa al 1,5% y visualizadas con Bromu- ro de Etidio a 240 nm. Los productos de PCR fueron purificados y secuencia- dos por la empresa Macrogen-USA. Posteriormente, las secuencias (Forward y Reverse) enviadas vía In- ternet fueron ensambladas y corregidas mediante el programa Chromas Pro v. 1,42 ® y comparadas con las secuencias reportadas en las bases de datos NCBI y CBS-KNAW usando el algoritmo “Basic Local Align- ment Search Tool (BLAST)”. 140 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (136 - 144) RESULTADOS A partir de los muestreos realizados se aislaron 66 cepas levaduriformes, de las cuales 28 pertenecieron al zumo de mora (LM), 20 al zumo de piña (LP) y 18 al zumo de uva (LU). Cada uno de los aislados se ca- racterizó morfológicamente, las colonias presentaron variedad en su elevación y margen, el color predomi- nante fue el blanco, seguido del crema y por último el rosado. La forma de todas las colonias fue circular. Entre las características observadas en las células es- tán: la forma, que varió entre redonda, ovalada, cilín- drica y apiculada. Posterior a esta caracterización se realizó la extracción de ADN genómico de todos los aislados obtenidos, encontrando valores promedio de concentración y pureza (ABS 260/280) de ácidos nucléicos de 9677 ng/ul y 2,1 respectivamente. En la figura 1 se muestra la corrida electroforética del ADN extraído a 18 cepas de levaduras. La caracterización molecular se inició con el análisis RFLP de la región que incluye el gen ribosomal 5,8s y sus espaciadores transcritos internos (5,8s-ITS). Los amplificados obtenidos fueron digeridos con las enzi- mas de restricción Cfol, Haelll y Hinfl, para obtener los fragmentos de restricción. Las amplificaciones y las digestiones fueron verificadas por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (figura 2 y 3). Los patrones de restricción se usaron para establecer las agrupaciones consignadas en el cuadro 1. Con base en esta información se seleccionaron las cepas a las cuales se les secuenció el domino D1/D2 del gen ribosomal 26 s. Se obtuvieron en total 28 secuencias que fueron usadas para la comparación mediante el algoritmo BLAST en las bases de datos NCBI y CBS- KNAW. Por medio de estas comparaciones se pudieron Figura 1. Verificación de extracción de ADN genómico de leva- duras en gel de agarosa al 1% Figura 2. Verificación de la amplificación de la región 5,8 s-ITS para 18 cepas, en gel de agarosa al 1,5% con marcador de peso de 250 pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112131415161718 19 20 Figura 3. Patrones de restricción de 6 cepas levaduriformes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112131415161718 19 20 En los carriles 1, 4, 7, 11, 15 y 18 la enzima Cfol; en los carriles 2, 5, 9, 12, 16 y 19 la enzima Haelll; en los carriles 3, 6, 10, 13, 17 y 20; y en los carriles 7 y 14 marcador de peso molecular 50 pb. 141 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (136 - 144) identificar hasta el nivel de especie los integrantes de los grupos 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 14 y 15, mien- tras que los integrantes de los grupos 3, 10 y 13 sólo pudieron ser asignados a nivel de género (Cuadro 2). En cuanto a la distribución de las especies, sólo Wic- kerhamomyces pijperi y Candida boidinii estuvieron presentes en dos de las tres frutas (ambas en mora y piña), mientras que las demás fueron únicas en cada fruto (Cuadro 1). En el zumo de mora, la mitad de las especies reporta- das solo cuentan con un aislado, mientras que la es- pecie Wickerhamomyces pijperi está representada por 13 de las 28 cepas aisladas. Las especies Hansenias- pora uvarumy Candida boidinii presentan 6 y 5 cepas respectivamente. De igual manera, de las 8 especies encontradas en el zumo de piña 3 estuvieron represen- tadas por un único aislado; no bostante no hay una do- minancia marcada por alguna de las especies. Por otro Cuadro 1. Agrupaciones establecidas a partir de los patrones de restricción de las cepas levaduriformes aisladas Grupo Cepas Amp Fragmentos de restricción Cfol Haelll Hinfl 1 LM: 1, 3, 5, 9,17,19 740 335 + 105 730 350 + 200 + 180 2 LM: 2, 4, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 18, 22, 23, 25, 28, LP-10 600 300 + 274 580 310 + 270 3 LM-6 375 165 220 220 4 LM-24 440 200 358 238 + 203 5 LM-26 650 560 610 300 Grupo Cepas Amp Fragmentos de restric- ción Cfol Haelll Hinfl 6 LM: 8, 15, 16, 20, 21, LP-14 720 320 + 290 690 388 + 180 7 LM-27 490 300 425 315 8 LP: 2, 3, 4, 7 700 300 + 280 700 ó 390 320 + 240 9 LP-20 500 250 + 215 440 260 + 240 10 LP: 5, 6, 17, 19, 21, 22 500 155 + 115 250 260 + 210 11 LP: 12, 13, 15 750 330 750 350 12 LP:11, 16 485 200 330 260 + 210 13 LP: 8, 18 500 185 + 115 315 300 + 210 14 LU: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18 750 310 750 330 15 LU: 11, 14, 5 430 140 + 95 270 220 + 140 Cuadro 2. Asignación a nivel de especie usando las secuencias del dominio D1/D2 del gen ribosomal 26 s Grupo Cepa Especie 1 LM-5, LM-17 Hanseniaspora uvarum 2 LM-2, LM-3 LM-18, LP-10 Wickerhamomyces pijperi 3 LM-6 Candida sp . 4 LM-24 Pichia kluyveri 5 LM-26 Hansenia sporauvarum 6 LM-8, LM15, LM-20, LM- 21, LP-14 Candida boidinii 7 LM-27 Candida oleophila 8 LP-3, LP-4 Meyerozyma caribbica 9 LP-20 Candida pseudointermedia 10 LP-5, LP-19, LP-21 Pichia sp.1 11 LP-13 Hanseniaspora pseudo guil- liermondii 12 LP-16 Pichia membranifaciens 13 LP-8, LP-18 Pichia sp.2 14 LU-15 Candida azyma 15 LU-5, LU-14 Issatchenkiaterricola 142 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (136 - 144) lado, en el zumo de uva sólo se reportaron 2 especies a partir de 18 aislados, dominando la especie Candida azyma con más del 83% de las cepas. En el caso de las especies compartidas, aunque Wickerhamomyces pijperi dominó ampliamente en los aislados del zumo de mora, sólo presentó un aislado en el zumo de piña. Algo similar pasó con la especie Candida boidinii, que tuvo 5 aislados en el zumo de mora y sólo uno el zumo de piña. En el cuadro 3 se encuentran consignadas algunas ca- racterísticas fenotípicas de los aislados de cada grupo conformado. El 71% de las cepas fermentaron gluco- sa, el 6% sacarosa, el 2% maltosa y ninguna fermentó lactosa. De las 15 especies reportadas 13 tuvieron al menos 1 cepa con la capacidad de asimilar la saca- rosa, y 9 con la capacidad de asimilar la maltosa. La especie Candida pseudointermedia fue la única capaz de crecer en los cuatro azúcares, además de fermentar maltosa. En cuanto a la especie Candida azyma todas sus cepas crecieron en medio con 16% de NaCl, sien- do igualadas únicamente por una cepa de pichia sp.1 y las dos cepas de Pichia membranifaciens. Discusión Las frutas son fuentes importantes de levaduras de- bido a su gran cantidad de azúcares simples y a la constante visita de vectores. De acuerdo a Skiner et al. (1980) y a Phaff (1990), la microbiota natural de las futas está compuesta comúnmente de levaduras y hongos levaduriforfmes de los géneros Aureobasi- dium, Rhodotorula, Sporobo-lomyces, Cryptococ- cus, Candida, Pichia, Aureobasidium, Rhodotorula, Sporobo-lomyces, Cryptococcus, Candida, Pichia, Hanseniaspora y raramente Saccha-romyces y Schi- zosaccharomyces [8,9]. En este estudio se encontró una gran riqueza de espe- cies principalmente en los zumos de mora y piña. Adi- cionalmente, varias de las especies reportadas tienen un gran potencial biotecnológico, especialmente en el campo del biocontrol. En este sentido, la especie P. membranifaciens fue usada por Cao et al. (2010) para el control del moho azul (Penicilliumexpansum) en peras. El tratamiento de la levadura adicionado con molibdato de amonio inhi- bió la germinación de las esporas y la elongación del tubo germinal del hongo [10]. Además no encontraron cambios en los parámetros de calidad de las frutas, por lo que puede considerarse un tratamiento promi- sorio para el control de esta enfermedad postcosecha. Por otro lado, la secreción de toxinas killer por parte de Cuadro 3. Caracterización fenotípica parcial de las cepas levaduriformes aisladas Fermentación Crecimiento (+) NaCl (+) Temperatura (+) Especie Glc Sac Mal Lac Glc Sac Mal Lac 10% 16% 28°C 30°C 35°C H. uvarum 2 6 3 6 5 W. pijperi 11 14 3 1 12 12 7 Candida sp. P. kluyveri 1 1 1 1 1 W. anomalus 1 1 1 1 1 1 1 C. boidinii 4 1 6 5 4 6 6 C. oleophila 1 1 1 1 M. caribbica 3 1 4 2 1 3 4 4 4 C.pseudointermedia 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Pichia sp.1 6 1 6 3 3 6 1 6 6 6 H. pseudoguilliermondii 3 1 3 3 3 3 3 Fermentación Crecimiento (+) NaCl (+) Temperatura (+) Especie Glc Sac Mal Lac Glc Sac Mal Lac 10% 16% 28°C 30°C 35°C P.membranifaciens 2 2 2 2 2 2 2 2 Pichia sp.2 2 2 2 2 2 2 C. azyma 15 15 15 15 15 15 7 I. terricola 3 3 3 3 3 3 143 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (136 - 144) esta especie también ha sido aprovecha para el control de levaduras contaminante en procesos fermentativos. Santos et al. (2009) encontraron que la toxina PKTM2 inhibió el crecimiento de Brettanomycesbruxellensis, una levadura contaminante de procesos fermentati- vos, sin afectar a Saccharomycescerevisiae [11]. Del total de especies encontradas en este estu- dio W. anomalus es la más repor tada en estudios de biocontrol y biorremediación. Pan et al. (2004) probaron su capacidad para degradar hidrocarburos aromáticos policíclicos, pudiendo degradar nafta- leno, dibenzotiofeno, fenantreno y criseno; tanto de manera individual como combinada [12]. Yang et al. (2011) repor taron valores de degradación de carbofurano del 95,2% en medios donde el insecti- cida era la única fuente de carbono, éste fue meta- bolizado por lacepa teniendo como intermediario el benzofuranol que después fue degradado [13]. En el campo del biocontrol se ha probado su efectividad en la reducción del crecimiento de mohos en gra- nos de cereales durante su almacenamiento. Melin et al. (2007) optimizaron una formulación liofilizada de esta especie con viabilidades superiores al 80%; y al ser almacenados a 30% por un año no mostró reducción significativa de la viabilidad [14]. Estos estudios son de gran impor tancia porque evidencian la diversidad metabólica de esta levadura. En estudios de producción de enzimas extracelulares se ha reportado la producción de b-glucosidadasa, peroxi- dasa y b-glucanasa, y en menor medida celulasa y po- ligalacturonasa; por parte de varias especies del género Pichia especialmente Pichia caribbica (M. caribbica) aisladas de ecosistemas oléicos [15]. En este sentido H. uvarum, una especie común en la elaboración del vino, presenta producción de enzimas extracelulares como b-glucosidasa y b-xilosidasa, que por medio de su actividad liberan compuestos aromáticos importan- tes en el vino [16]. Además, al igual que la especie P. memebranifaciens ha sido usada como biocontrol, en el tratamiento contra el moho gris de la uva mejorado con la adición de molibdato de amonio. Aunque los estudios de riqueza en zumos y mostos fermentados de uva presentan una gran variedad de especies, en este trabajo sólo se reportan dos espe- cies C. azyma, con el 83% de los aislados en uva; e I. terrícola con el 17%. No obstante estas especies también fueron aisladas por Chavan et al. (2009) du- rante el estudio de la flora levaduriforme en diferentes variedades de uva de la India para la fabricación de vinos. Cabe resaltar que todos los aislados de C. azy- ma fermentaron glucosa y fueron halotolerantes y ter- motolerantes hasta 35°C. Por otro lado las especies P. kluyveri y C. pseudo intermedia fueron reportadas en la fase inicial, durante la fermentación de la chicha de piña. La caracterización fenotípica parcial realizada en esta investigación mostró la gran variedad metabólica de las especies aisladas a partir de las tres frutas [17]. En cuanto a la identificación, 9 de los 64 aislados sólo pudieron ser asignados a nivel de género, lo que puede indicar la existencia de especies nuevas en estos sustratos de acuerdo a los parámetros de identificación basados en el domi- nio D1/D2 del gen ribosomal 26s [16]. AGRADECIMIENTOS Este trabajo se pudo realizar gracias a la financiación por parte de la Universidad de San Buenaventura-Cali y al Programa Jóvenes investigadores e innovadores “Virginia Gómez de Pineda” año 2010. REFERENCIAS [1] BOEKHOUT, T., ROBERT, V., SMITH, M., STAL- PERS, J., YARROW,D., BOER, P., BUIS, R., GIJ- SWIJT, G., KURTZMAN, C.P., FELL,J.W., GUÉHO, E., GUILLOT, J., and ROBERTS, I. Yeasts of the World Version 2.0. Amsterdam (Netherlands); ETI Biodiversity Center, p. 520-525. [2] KURTZMAN, C.P. and ROBNETT, C.J. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. 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Jour- nal of Molecular Biology, 2 (4), 1990, p. 32-40. 145 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (145 - 154) FENOLOGÍA DEL ROBLE (Quercus humboldtii bonpland) EN POPAYÁN (CAUCA, COLOMBIA) PHENOLOGY OAK (Quercus humboldtii bonpland) IN POPAYÁN (CAUCA, COLOMBIA) FENOLOGIA DO ROBLE (Quercus humboldtii bonpland) EM POPAYÁN (CAUCA, COLÔMBIA) CRISTIAN ANDRÉS PÉREZ L. 1 , JUAN CARLOS VILLALBA M. 2 , MARTHA ISABEL ALMANZA P. 3 RESUMEN Se realizó un registro fenológico del roble Quercus humboldtii Bonpland entre marzo del 2010 y marzo de 2011–en el municipio de Popayán (Cauca, Colombia). La producción de flores femeninas y frutos jóvenes se presentó entre finales de marzo y principios de abril, correlacionándose positivamente estas dos fenofases durante todo el año con la temperatura (r=0,64 y r=0,44, respectivamente) y en los inicios de estas dos fenofases se correlacionó con la precipitación (r=0,69 y r=0,92 respectivamente). Los frutos maduros aparecieron en mayo, aunque su cantidad se redujo hacia el final del año 2010 por el aborto de frutos en los meses anteriores. La actividad vegetativa se caracterizó por la presencia permanente de hojas nuevas, maduras, amarillas, sobremaduras y caída de follaje. Sin embargo, en agosto, debido al aumento significativo de la temperatura y a la disminución en la precipitación, se observó en los árboles caída de follaje, disminución de hojas maduras y producción de hojas nuevas. Recibido para evaluación: 07-11-2012. Aprobado para publicación: 27-05-2013. 1 Ing. Forestal, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad del Cauca, Popayán, Cauca. 2 Ing. Forestal, M.Sc. Profesor Departamento de Ciencias Agropecuarias, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad del Cauca, Popayán, Cauca. 3 Bióloga, Ph.D., Profesora Departamento de Ciencias Agropecuarias, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad del Cauca, Popayán, Cauca. Correspondencia:
[email protected] 146 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (145 - 154) ABSTRACT A phenological record of Oak Quercus humboldtii Bonpland was carried out during a year between March 2010 and March 2011 in the Colom- bian Popayán municipality. The female flowers and young fruits production took place between late March and early April, both phenological phases positively correlated throughout the year with the temperature (respecti- vely r=0.64 and 0.44), and with higher precipitation levels during its initial stages (respectively r=0.69 and 0.92). The fruits ripened in May, although their number was reduced to several by abortion by end of 2010. The ve- getative activity is characterized by continuous presence of new leaves, ripe, yellow, over ripened and fall foliage. With increased temperature and drought of August however, foliage fall, reduced formation of new leaves in simultaneous presence of mature ones were observed. RESUMO Foi feito um registro fenológico do roble Quercus humboldtii Bonpland en- tre março de 2010 até março de 2011 – no município de Popayán (Cauca, Colômbia). A produção de flores femininas e frutos jovens se apresentaram no final do mês de março e começo do mês de abril, apresentando uma correlação positiva desses dois estágios com a temperatura durante o ano todo (r=0,64 y r=0,44, respectivamente) e no começo com o aumento nos níveis de precipitação (r=0,69 y r=0,92 respectivamente). Os frutos maduros apareceram em maio, ainda a mesma quantidade foi reduzindo no final do ano 2010 pelo aborto de frutos nos meses anteriores. A Ativida- de vegetativa se caracterizou pela presença permanente de folhas novas, maduras, amarelas, sobremaduras e queda de folhagem. No entanto, em agosto, apresentou aumento significativo na temperatura e diminuição na precipitação, gerando nas árvores queda de folhagem, diminuição de fol- has maduras e produção de folhas novas. INTRODUCCIÓN La fenología puede entenderse como el estudio de las respuestas de los or- ganismos vivos a los diferentes cambios y estímulos originados por el medio externo, principalmente el clima y las interacciones con las otras formas de vida [1, 2]. Una concepción interesante fue expuesta por [3], el cual manifies- ta como la fenología se aprecia mejor dentro de la dinámica vegetal y de una temporada a otra durante el año; al cumplirse en estas los fenómenos visibles de su vida, y particularmente los que se acomodan a cierta periodicidad, relacionada con el clima del lugar en el que ocurren, y por tanto, determi- nando el tiempo de germinación de las semillas, duración y suspensión del crecimiento del tallo y ramificaciones, producción, brotación y caída de hojas, floración, maduración de los frutos y liberación de estos últimos. Desde la antigüedad, la fenología tiene un rol importante en el desarrollo de la humanidad, con base en esta información, ha sido posible predecir y planifi- car los recursos para su sostenimiento. Los pueblos recolectores y cazado- res han elaborado calendarios para la recolección de frutos silvestres y pes- PALABRAS CLAVE: Fenofases, Roble, Fenología, Quer- cus humboldtii. KEYWORDS: Phenophases, Oak, Phenology, Quercus humboldtii. PALAVRAS-CHAVE: Fenofase, Roble, Fenologia, Quer- cus humboldtii. 147 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (145 - 154) ca, permitiéndoles comprender los ciclos biológicos de su ambiente [4]. Los pueblos agricultores han realizado observaciones de los ciclos de crecimiento y fructifica- ción de las plantas cultivadas, relacionando las épocas de siembra y cosecha con fenómenos climáticos [1]. Por otro lado, se considera vital la comprensión de estos fenómenos biológicos, puesto que aportan co- nocimiento sobre las relaciones entre las plantas y los animales de una comunidad biótica y sus vecinas [2]. Además, el conocimiento de los patrones fenológicos también contribuye a la conservación de los recursos genéticos y al manejo forestal, puesto que informa so- bre las temporadas en que es posible la recolección de material de siembra para la propagación [5, 6, 7, 8]. El roble es una especie forestal considerada de alta im- portancia para Colombia, por los diversos beneficios que brinda a las comunidades con las que se encuentra asociada. En la época precolombina el roble era consi- derado como un árbol sagrado, siendo perseguido por la corona española; posteriormente adquirió gran rele- vancia por la calidad de su madera, motivando la so- breexplotación, situación que aún persiste [9, 10, 11]. Entre los estudios fenológicos realizados en Colombia sobre el roble, se destacan dos realizados en Bogo- tá, el primero encontró que el roble presenta caída de follaje en agosto, floración entre noviembre y diciem- bre, fructificación entre enero y marzo y brotación del follaje en diciembre [9]. El segundo señala que en los robles del Jardín Botánico de Bogotá es posible encon- trar frutos verdes durante casi todo el año, debido a que su formación empieza poco después de finalizada la floración, y el tiempo de madurez tarda cerca de diez meses; los frutos maduros pueden observarse en dos épocas del año, la primera comprendida entre octubre y diciembre (fin de la estación de lluvias e inicios de la estación seca) y la segunda entre abril y junio (esta- ción de lluvias) [12]. En dos veredas (Cachalú y Patios Altos) de la cordillera oriental en el municipio de Encino (Santander) se en- contró que el pico de producción de frutos del roble se presentó entre abril y mayo, coincidiendo con el periodo de mayores lluvias [13]. En Antioquia (corregimiento de Santa Elena en Medellín, municipios de Támesis, An- des, Liborina y Angostura), el roble presento períodos de floración variables, mientras en unos sitios la flora- ción se concentró entre noviembre y diciembre, en otros se extendió de enero a junio, concluyendo que esta fe- nofase no tuvo relación directa con las épocas de mayor o menor precipitación. Los frutos verdes empezaron a notarse dos meses después de iniciar la floración y se registraron principalmente de febrero a septiembre y de marzo a octubre; el desarrollo de los frutos es un pro- ceso que tardó entre 6 y 7 meses; la pérdida de hojas pareció estar asociada con los períodos de floración y fructificación, ya que durante estos se presentó mayor defoliación y el brote de hojas se presentó casi simultá- neamente con la caída de estas [14]. En Popayán, se han adelantado varios estudios sobre la especie: caracterización de los fenómenos de de- foliación en el roble a causa de un lepidóptero de la familia Geometridae [15]; caracterización de la ento- mofauna asociada a los bosques de roble [16]; ca- racterización florística a dos bosques de roble en las veredas Clarete Alto y Río Blanco [17]. Los estudios de fenología emplean diferentes mé- todos, uno de estos es el desarrollado por Fournier [18], el cual ha sido empleado en varias investiga- ciones relacionadas con especies y comunidades tropicales, es considerado como un método prácti- co, efectivo y de fácil aplicación en campo para el investigador [8, 19; 20, 21]. Este documento presenta los resultados de la investi- gación sobre el comportamiento fenológico del roble durante un año de observaciones en la vereda Clarete Alto (Popayán), caracterizando su actividad biológica, identificando fenómenos de foliación, floración, fructi- ficación y su relación con el entorno biótico y abiótico. MÉTODO El estudio se realizó en un robledal de 103,17 ha ubicado en la vereda Clarete Alto del municipio de Popayán (Cauca). Las coordenadas del sitio son 2°29´54.45”N–76°31´38.80”O y a 1986 msnm [17]. El lugar de estudio se encuentra en la meseta de Po- payán; con un rango de temperatura entre 22 y 24°C y dos periodos de lluvias durante el año [22]. El relieve es fuertemente quebrado, presenta cimas ligeramente redondeadas y pendientes rectas e irregulares de 25- 50-75% [23]. Obtención de Datos y Análisis Estadístico Las observaciones quincenales fueron realizadas del 21 de marzo del 2010 al 3 marzo del 2011. Se selec- 148 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (145 - 154) cionaron y marcaron 27 individuos con base en los siguientes criterios: buen estado sanitario, diámetro a la altura de pecho (DAP) mayor a 10 cm, buena posi- ción y forma de copa, estos dos últimos siguiendo la metodología propuesta por Dawkins [24, 25]. Se registraron dos tipos de variables biológicas: ve- getativas y reproductivas. Las variables vegetativas fueron hojas nuevas, hojas maduras, hojas amarillas, hojas sobremaduras y caída de follaje, esta última se apoyó con la instalación de trampas de 1mx1m. Las variables reproductivas fueron flor femenina, flor masculina (planta monoica), fruto joven y fruto adulto. También se registraron sucesos de semillación y pre- sencia de reposo con registros dicotómicos [26]. Ade- más, se tuvo en cuenta las variables climáticas: preci- pitación (mm), humedad relativa (%), temperatura (°C) y radiación solar (w/m²). Los datos climáticos fueron proporcionados por el Grupo de Estudios Ambientales (GEA.) de la Universidad del Cauca, obtenidos de la Estación Meteorológica Las Guacas. Las fenofases se registraron de acuerdo a la metodo- logía propuesta por Fournier [18]. Se observó la copa de cada uno de los árboles, determinando la presencia y la magnitud del fenómeno. La magnitud, se define con la escala que se presenta a continuación: 0: ausencia del fenómeno observado. 1: presencia del fenómeno con una magnitud entre 1 y 25%. 2: presencia del fenómeno con una magnitud entre 26 y 50%. 3: presencia del fenómeno con una magnitud entre 51 y 75%. 4: presencia del fenómeno con una magnitud entre 76 y 100%. En las observaciones se utilizaron binoculares y regis- tros fotográficos. Para efectos de esta investigación, el resultado men- sual de las observaciones a los árboles con base en la escala antes mencionada, se promedia cada caracte- rística observada en toda la muestra, los cuales defi- nen la presencia y la intensidad de las variables vege- tativas y/o reproductivas del estudio, denominándose dichos promedios Unidades de Fournier (UF) Los datos se analizaron mediante el diseño de dos matrices de correlación, utilizando el coeficiente de correlación de Pearson con ayuda del programa Mi- crosoft Excel. En la primera matriz se relacionaron las variables biológicas y en la segunda, se relacionaron las variables biológicas con las variables climáticas. RESULTADOS Fenología reproductiva La fenofase de la floración femenina se presentó sola- mente entre finales de marzo y finales de agosto (1,96 UF±0,98) con un pico máximo a mediados de mayo: 93% de los árboles con flor femenina (Figura 1a). La fenofase de fructificación se registró desde finales de marzo hasta mediados de septiembre (1,67UF±0,96) con un pico máximo a finales de junio: 89% de los árboles con frutos jóvenes (Figura 1a). La floración fe- menina y la producción de frutos jóvenes presentaron una correlación positiva y significativa (r=0,85) (Cua- dro 1). Así mismo, estas dos fenofases presentaron correlación positiva con la temperatura durante todo el año (r=0,64 y r=0,44, respectivamente) (Cuadro 2). El análisis de las variables floración y fructificación junto con el aumento de la intensidad de la precipi- tación entre marzo y abril del 2010, indican que esta variable climática activó estas dos fenofases; además cabe resaltar que en los meses anteriores se presentó el fenómeno del niño que probablemente coadyuvó a que estas fenofases se activaran (Figuras 1a y 2d). En relación con la floración, los resultados obtenidos difieren del estudio fenológico realizado a la misma especie en Medellín (Colombia), donde exponen que la floración no tiene relación directa con las épocas de menor o mayor precipitación [14]. Sin embargo, son evidencia de argumentos tales como que la sincroni- zación de la floración de muchas especies con una estación particular parece estar bajo el control de las condiciones climáticas prevalecientes [27]; o que los factores relacionados con la disponibilidad de agua en la planta pueden tener el mayor rol en el control de la floración de los árboles tropicales [21]. En relación con la fructificación del roble, los resulta- dos son contradictorios, en Bogotá encontraron que ésta se presenta entre los meses de enero y marzo, a mediados de la estación seca y principios de la esta- ción de lluvias [9]. En dos bosques andinos de la Cor- 149 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (145 - 154) dillera Oriental, encontraron que la mayor producción de frutos, estuvo concentrada en los meses de abril y mayo que corresponden al periodo de mayores preci- pitaciones en la zona [13]. Es importante mencionar que un mes después del ini- cio de la producción de frutos, es decir a principios de mayo, se observó el fenómeno de aborto, afectando al 74% de los árboles según el registro de semillación (Figura 1c). Este fenómeno fue reportado en un es- tudio sobre producción de frutos del roble en la Cor- dillera Oriental [13]; y en el estudio sobre defoliación de los bosques de roble en la meseta de Popayán, en donde se señala la caída de frutos en estado joven después del ataque de un insecto defoliador. [15].Los frutos adultos maduran de 2 a 3 meses después del inicio de la fructificación, es decir a mediados de mayo (0,04UF±0,19), la mayor cantidad se presentó entre finales de junio e inicios de octubre (0,70UF±0,61). Cuadro 1. Correlación de Pearson (r) con variables biológicas hojas nuevas hojas maduras hojas amarillas hojas sobrema- duras flor femenina fruto Joven fruto adulto caída hojas hojas nuevas 1 hojas maduras -0,79 1 hojas amarillas 0,01 -0,06 1 hojas sobremaduras -0,08 0,02 0,26 1 Flor femenina -0,02 0,46 0,02 -0,21 1 fruto Joven 0,02 0,42 -0,07 -0,17 0,85 1 fruto adulto 0,54 -0,43 0,07 -0,1 -0,18 0,19 1 caída hojas 0,16 -0,43 -0,09 -0,08 -0,22 -0,13 0,14 1 Cuadro 2. Correlación de Pearson con variables biológicas y variables climáticas radiación temperatura humedad precipitación hojas nuevas 0,36 0,37 -0,63 -0,44 hojas maduras -0,21 0,03 0,49 0,51 hojas amarillas 0,16 0,04 -0,17 -0,06 hojas sobremaduras 0,17 -0,16 0,19 0,11 flor femenina -0,09 0,64 -0,09 0,08 fruto Joven -0,15 0,44 -0,17 -0,01 fruto adulto 0,23 -0,07 -0,51 -0,32 caída hojas -0,32 -0,3 -0,16 -0,28 Los frutos maduros se presentaron hasta finales de noviembre (Figura 1a). La fructificación puede estar afectada por la cantidad de flores que se convierten en fruto, pues no todas llegan a este estado. Existe un límite para el número de frutos a establecerse en el árbol y suele estar determinado por los recursos minerales disponibles en el suelo y no por el número de flores femeninas presentes en la planta [28]; aunque también pueden presentarse altos niveles naturales de polinización, que superan el número límite de frutos que pueden establecerse, sin embargo, estas situaciones deben considerarse con cierto cuidado, debido a que las flores no son polinizadas cuando el polen recibido proviene de la misma planta (incompati- bilidad genética), y podría considerarse como un meca- nismo para evitar endogamia [29]. En Quercus alba se demostró que entre el 16% y 57% de las flores caídas habían recibido polen de la misma planta [29]. Otros 150 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (145 - 154) c. Sincronía de las variables reproductivas y semillación a. Variables reproductivas b. Variables vegetativas Figura 1. Fenología del roble durante un año de estudio en Popayán (Cauca) autores manifiestan que la sobreproducción de flores es una forma de polinizador-mediada, para tener acceso a otras parejas [30, 31, 32, 33]. Las observaciones permitieron evidenciar que ni la población ni los individuos presentaron un patrón re- gular de producción de flores y frutos, (Figura 1c). Debido a las variaciones ambientales y genotípicas, las plantas de una población raras veces florecen en exacta sincronía [34]. La floración femenina y la fructificación se caracteri- zaron por la presencia de pocos individuos al inicio y al final de las fenofases. Resultados similares indican que los patrones de floración varían ampliamente en- tre los individuos y entre las especies: escalonado por largos periodos o con picos más pronunciados; estos patrones presentan relativamente pocos individuos en la temprana y tardía parte de la floración [35]. Figura 2. Comportamiento de las variables climáticas d. Radiación y precipitación (mm) e. Temperatura (°C) y humedad relativa (%) 151 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (145 - 154) La semillación se presentó desde inicios de mayo has- ta mediados de diciembre. Se registró mayor número de árboles con semillación desde mitad de mayo hasta finales de septiembre (grafico 1c). Evidencias de la floración masculina se observaron en los inicios de la investigación; se encontraron flores depositadas en el suelo y suspendidas en las plantas del sotobosque. Fenología vegetativa. Las hojas nuevas se presen- taron durante todo el año de estudio, destacándose entre mediados de agosto y mediados de octubre (2,15UF±1,03) con un pico de producción a media- dos de septiembre (Figura 1b). Entre agosto y octubre la producción de hojas nuevas se mostró correlacio- nada positivamente con la temperatura y negativamen- te con la precipitación (Cuadro 2). Las hojas maduras se exhibieron abundantes duran- te todo el año. Entre mediados de agosto y mediados de octubre se registró el mínimo de estas, específi- camente a mitad de septiembre (2,44UF±1,12), rela- cionándose inversamente con la producción de hojas nuevas (Figura 1b). La producción de hojas maduras se correlaciona negativamente con la temperatura y positivamente con la precipitación (Cuadro 2). La caída de hojas se presentó durante todo el año de estudio; los picos máximos se presentaron a fina- les de agosto (1,33UF±0,48) y finales de diciembre (1,48UF±0,51). La presencia de este fenómeno en agosto es causante del declive de hojas maduras pre- sentado para la misma época, lo cual estuvo acompa- ñado de producción de hojas nuevas (Figura 1b). La caída de follaje en agosto estuvo altamente correlacio- nada con incrementos en la temperatura y negativamen- te correlacionada con los descensos de precipitación. Según lo mencionado hasta ahora sobre la fenología vegetativa, puede notarse como la producción de ho- jas es favorecida por aumentos en la temperatura y descensos en la precipitación, y desfavorecida por la presencia de hojas maduras bajo el mismo comporta- miento climático. Con base en estas evidencias, pue- de decirse que el factor hídrico en el robledal afectó significativamente la actividad vegetativa entre estos meses. Debe tenerse en cuenta que las hojas maduras son afectadas a su vez, por la caída de hojas, la cual se presentó durante todo el año, sin embargo, se in- tensificó con aumentos en la temperatura y descensos en la precipitación en estos mismos meses, indicando que la estacionalidad de la lluvia promueve senectud foliar. Este patrón de caída de follaje fue encontrado en Medellín en un estudio fenológico de roble, en el cual manifiestan que los brotes foliares se presentan casi simultáneamente con la caída de follaje [14]. Sin embargo, en los meses donde se intensificó la caída de follaje, los árboles no quedaron totalmente descu- biertos. Un patrón similar fue mencionado, señalando especies que se defolian en la mitad o al final de la es- tación seca y las yemas se rompen bajo condiciones de sequía o en respuesta a la lluvia [36]. A pesar de los picos de producción de hojas nuevas y disminuciones considerables de hojas maduras, la presencia de hojas nuevas, amarillas, sobremaduras y caída de follaje es continua, independientemente de la época del año. Cuando el patrón de cambio foliar es más o menos constante, y no tiene relación con los factores ambientales, sugiere que está determinado por factores genéticos y opera mediante los diferentes periodos de duración de las hojas; [37] expone que la senectud foliar es el reloj biológico de la periodicidad de la defoliación y su longitud está determinada por la longevidad promedio de las hojas que operan median- te mecanismos del sistema hormonal. Otro aspecto que afectó de manera importante la can- tidad de hojas maduras, fue la defoliación causada por un lepidóptero perteneciente a la familia Geometridae del género Alsophyla, el cual en sus primeros estadios de desarrollo se alimenta de las hojas de roble, tam- bién reportado por Paz [2004]. Dicho evento se registra desde inicios del estudio hasta agosto, intensificándo- se en julio. La defoliación afectó al 48% de la muestra. Esta forma de defoliación ha sido reportada [15]. El cese de la defoliación, estuvo influenciado por la caída y producción de follaje en agosto. Posterior a la madura- ción de las hojas, se observa que el denso bosque que rodea el robledal objeto del estudio ofrece condiciones para la llegada de la avifauna. Un estudio similar reporta señala que las aves migratorias y locales controlan las poblaciones de la polilla, puesto que utilizan los rodales como lugares de paso y anidamiento [15]. Relacionando el aborto de frutos y defoliación, estos ocurrieron en el lapso de abril-agosto, y es probable que mantengan cierta relación. Estudios similares ex- ponen que la reducción del área foliar en los árboles reduce los recursos disponibles para el desarrollo de los frutos y frecuentemente provocan altas tasas de aborto [28]. Por otro lado, la pérdida de frutos por 152 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (145 - 154) aborto en la especie, obedece a una característica idiosincrásica de la misma [13]. Al relacionar la producción de hojas en épocas de altas temperaturas y la herviboría, estudios similares, seña- lan que la producción de hojas nuevas en períodos de sequía es ventajosa, pues en estas épocas los insec- tos defoliadores son menos abundantes [35]. En el roble debe considerarse si la defoliación por el lepidóptero es cíclica, posiblemente la especie ha de- sarrollado algún mecanismo para sobrellevar la perdi- da de hojas por herviboría. Fenner [35], expone a la herviboría como una de las fuerzas determinantes en el comportamiento de la foliación. La producción de hojas amarillas y hojas sobremaduras se observó durante todo el año, manteniendo según la escala de Fournier, una intensidad constante (Figura 1b). CONCLUSIONES Se exhibió floración femenina y fructificación duran- te el año de registro, presentándose una correlación positiva entre las dos fenofases. De la misma mane- ra presentan correlación positiva con la temperatura. Además, los inicios de éstas coinciden con aumentos significativos en la precipitación. El estudio mostró que pocos frutos llegan al estado adulto, viéndose afectado por el fenómeno de abor- to de frutos jóvenes desde mayo. Sin embargo, debe tenerse en cuenta, que los frutos jóvenes se presen- tan desde abril hasta septiembre y los frutos maduros desde mayo hasta diciembre. Se recomienda recolectar la semilla entre los meses de mayo y junio, estableciendo límites en dicha reco- lección para no afectar la regeneración de la especie. Se presentó para todo el año una correlación negativa entre las variables vegetativas hojas nuevas y hojas ma- duras, especialmente entre los meses de agosto y octu- bre; al inicio de dicho periodo se registró una abundante caída de hojas que provoca disminución de hojas ma- duras. Simultáneamente se presentó una producción de hojas nuevas, favorecidas por aumentos en la tempera- tura y disminuciones en la precipitación y la humedad. La cantidad de hojas maduras, previo a su pico de dis- minución durante septiembre, se observó gravemente afectada por la defoliación del lepidóptero, y se le atri- buye a este fenómeno, una conexión con el aborto de frutos y muerte de flores femeninas. La caída de hojas se presentó durante todo el año, in- dicando que continuamente hay retorno de biomasa al suelo del ecosistema, contribuyendo a la formación de materia orgánica indispensable para el auto sosteni- miento del bosque [9]. Cuando el bosque se abre o se cierra, por la cantidad y estado de las hojas en los árboles, se establecen con- diciones que permiten actuar a otras formas de vida por los cambios y estímulos que se generan, por ejem- plo, posterior al pico de producción de hojas nuevas (en agosto), estás maduran (en octubre), generando el cierre del dosel del bosque, propiciando condicio- nes adecuadas para la llegada de avifauna. Con base en lo anterior, es posible resaltar la importancia de la relación de la fenología con los patrones de comporta- miento animal en el ecosistema. Durante el año de observaciones, no se presentó re- poso para ninguno de los árboles, es decir, que no se presentó inactividad fenológica en los individuos. No se presentó producción de flores masculinas du- rante el año de observaciones, indicando que la flora- ción masculina y femenina, están separadas en escala de tiempo (protandria). No se presentaron correlaciones significativas entre las variables biológicas y la variable radiación, sin embargo debe evaluarse más a fondo su posible incidencia. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen al Departamento de Ciencias Agropecuarias de la Universidad del Cauca por su apo- yo logístico, al Grupo de Investigaciones para el Desa- rrollo Rural–Tull. Al señor Carlos Ortega propietario del robledal por su amabilidad y respeto por la naturaleza y a todos los que de alguna forma influyeron en esta investigación. REFERENCIAS [1] LIETH, H. En: phenology and seasonality modeling. Introduction to phenology and the modeling of sea- sonality. New York (USA): Lied, H., 1974, p. 3-19. 153 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (145 - 154) [2] FOURNIER, L. y CHARPANTIER, C. El tamaño de la muestra y la frecuencia de las observa- ciones en el estudio de las características fe- nológicas de los árboles tropicales. Turrialba, 25, 1975, p. 45-48. 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Entre las estrategias que se han implementado para manejar este pro- blema, está la utilización de plantas transgénicas resistentes a insectos, usando genes derivados de Bacillus thuringiensis (Bt). La mayoría de estos genes están protegidos por patentes, y por tanto el acceso esta restringido. Se hace necesario buscar nuevas formas y herramientas que permitan el uso de estos genes, para la solución de problemas agrícolas. Se diseñó y construyo mediante paquetes bioin- formáticos, una versión semisintética del gen cry1Ac, optimizando su expresión para arroz (Oriza sativa), mediante el criterio del uso codónico de arroz y se realizo un análisis in silico de las características de la proteína traducida. Recibido para evaluación: 30-08-2011. Aprobado para publicación: 18-07-2013. 1 M.Sc., Grupo de Ingeniería Genética de Plantas. Departamento de Biología & Instituto de Genética. Universidad Nacional de Colombia. 2 Bióloga, Grupo de Ingeniería Genética de Plantas. Departamento de Biología & Instituto de Genética. Universidad Nacional de Colombia. 3 Ph.D. Grupo de Ingeniería Genética de Plantas, Departamento de Biología & Instituto de Genética .Universidad Nacional de Colombia. Correspondencia:
[email protected] ;
[email protected] 156 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (155 - 164) ABSTRACT The world’s population is exceeding 6 billion people and it’s necessary in the coming years to increase food production by 50%. Among the limiting factors to agricultural production are insect pests. It is estimated that los- ses caused by different pests are ranging between 20% and 40%. Among the strategies that have been implemented to handle this problem is the use of transgenic plants resistant to insects, using genes derived from Ba- cillus thuringiensis (Bt).Most of these genes are protected by patents and therefore access is restricted .It is necessary to find new ways and tools to enable access to these genes, for the solution of agricultural problems. It was designed and built through bioinformatics packages, a semi synthe- tic version of thecry1Acgene, codon optimized for the use of rice (Oryza sativa), and was performed in silico analysis of the characteristics of the translated protein. RESUMO A população mundial é superior a 6bilhões de pessoas, e é necessário nos próximos anos aumentar a produção de alimentos em 50%. Entre os fatores limitantes da produção agrícola são as pragas de insetos. Estima- se que as perdas causadas por pragas variam de20% a 40%. Diversas estratégias têm sido implementadas para lidar com este problema, um dos quais é o uso de plantas transgênicas resistentes a insetos usando genes derivados de Bacillus thuringiensis(Bt). A maioria destes genes estão pro- tegidos por patentes e, portanto,o acesso é restrito. É necessário encon- trar novas formas e ferramentas para usar esses genes para a solução de problemas agrícolas. Neste trabalho foi projetado e construído através da bioinformática, uma versão semi-sintético do genecry1Ac para otimizar a expressão para o arroz (Oryza sativa), pelo critériod e uso códon de arroz e foi realizada in silico análise das características da proteína traduzida. INTRODUCCIÓN La población mundial está excediendo los 6 mil millones de personas, es necesario que en los próximos años se incremente la producción de ali- mentos en un 50 %, [1,2]. Entonces, se debe combatir eficazmente uno de los factores más limitantes, que son los insectos plaga que atacan los cultivos. Se estima que las pérdidas en la producción agrícola mundial cau- sadas por plagas fluctúan entre 20% y 40%, con costos entre los 30 a 50 mil millones de dólares anuales [3,4]. La forma más usual para el control de insectos plaga de cultivos, es la aplicación de pesticidas químicos. El uso indiscriminado de insecticidas ha traído varias consecuencias: contaminación ambiental, resistencia en los insectos plaga, aumento en los costos de producción y problemas para la salud humana y animal [5, 2]. Una alternativa son las plantas transgénicas resistentes a insectos. La utilización de cultivos genética- mente modificados (GM) puede contribuir de manera significativa al ma- nejo integrado de plagas [6,4]. PALABRAS CLAVE: Cultivos Transgénicos, Arroz, cry1Ac, Genes Semisintéticos, Bioinformática. KEY WORD: Transgenic Crops, Rice, cry1Ac, Gen semi synthetic, Bioinformatics. PALAVRAS-CHAVE: Cultivos Transgênicos, Arroz, cry1Ac, Gene semi-sintético, Bioinformática. 157 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (155 - 164) Diferentes versiones de genes derivados de Bacillus thuringiensis han sido transferidos a algodón, tomate, papa y maíz [7,8]. El gen Bt más usado es el gene cry1Ac, que fue transferido a 15 variedades de algo- dón, una de tomate y 6 de maíz. Se ha reportado que en estos cultivos controla Heliothis virescens, Heli- coverpa zea, Pectinophora gossypiella, Ostrinia nu- bilalis, Diatrea grandiosella y Pseudoplusia includens [7,9,10]. En arroz, se han reportado varios trabajos experimentales usando el gen cry1Ac [11,12,13]. Bacillus thuringiensis es un bacilo flagelado, espo- rulado y gram + que produce durante la esporula- ción, un cristal de proteína tóxico para los insectos, conocido como delta endotoxina, que puede variar de forma y de tamaño [14,15]. Según el espectro de actividad insecticida que presentan, se clasifican en: Cry I tóxicos para lepidópteros, Cry II tóxicos para lepidópteros y dípteros, Cry III tóxicos para coleópteros, y Cry IV tóxicos para dípteros [16,17]. Si la proteína es ingerida por un insecto suscepti- ble en su fase larvaria, llega al intestino medio, se disuelve por la acción de los jugos intestinales de pH alcalino, sufre una proteólisis enzimática, origina una toxina activa, que se une a receptores específi- cos en las membranas epiteliales del intestino, ge- nerando poros que desequilibran el balance osmó- tico y provocan lisis celular, causando muerte del insecto por inanición [15,18]. Los derechos de propiedad intelectual que se han concedido, en la forma de patentes sobre materia biológica [19], generan redes de patentes que limi- tan las posibilidades de uso tecnológico del conoci- miento. Sobre el gene cry1Ac aparecen 16 reportes en la base de datos “Patentlens” usando la palabra clave “cry1Ac” en el “abstract”, búsqueda realizada el 10 de agosto de 2011 (www.patentlens.net). Se debe buscar maximizar la libertad de operación, so- bre la base de que las patentes: 1) tienen aplicación en jurisdicciones nacionales; 2) las leyes varían de país a país; y 3) son un monopolio limitado y expiran [20]. Los genes Cry se encuentran cercados por una red de patentes, pero gracias a las herramientas de bioinformática, es posible el diseño de genes semi- sintéticos a partir de secuencias conocidas. Luego se produce una nueva versión optimizada por uso codónico, cuya proteína traducida se analiza in sili- co. Varias empresas ofrecen la síntesis de secuen- cias de DNA, mediante un contrato de servicios, en el que se puede solicitar la exclusión de cualquier restricción de uso [21]. El presente trabajo trata sobre el diseño y construc- ción mediante paquetes bioinformáticos de un gen sintético Cry1Ac, su optimización por el uso codó- nico del arroz y el posterior análisis in silico de las características de la proteína traducida.El desarrollo de este gen semisintético está orientado a la obten- ción de plantas transgénicas de variedades colom- bianas de arroz que presenten resistencia al ataque de plagas de tipo lepidóptero. MÉTODO Desarrollo de la construcción semi-sintética del gen Cry 1Ac Se hizo la revisión de literatura correspondiente y la bús- queda de secuencias, para genes que codifiquen la pro- teína cry1Ac, usando bases de datos de acceso público y/o disponible en el sistema nacional de bibliotecas de la Universidad Nacional de Colombia (SINAB) [22]. Una vez identificadas las secuencias de los genes, se realizo el proceso de diseño y construcción de la versión semi-sintética, empleando los siguientes pa- quetes: BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/ bioedit.html); Lasergene (http://www.dnastar.com/t- products-lasergene.aspx); DNA 2.0 Gene designer (https://www.dna20.com/genedesigner2/); DNAsis SmartNote (http://smartnote.miraibio.com/index.htm). Empleando estos software se realizo: 1) alineamientos de las secuencias nucleotídicas de los genes seleccio- nados; 2) establecimiento de una secuencia consen- so; 3) selección y establecimiento de las secuencias de la región promotora y terminadora; 4) construcción del casete de expresión mediante el ensamble de las secuencias; 5) cambio de uso codónico para Oryza sativa en la región codificante; 6) ubicación de sitios de restricción dentro de la construcción y elaboración del mapa de restricción [1,22,23,24,25]. Análisis de la proteína CryIGP Para evaluar la predicción de las modificaciones post- traduccionales, se utilizó la herramienta SIGNAlP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), que predi- ce la presencia y localización del péptido señal y su punto de clivaje. En el análisis de la estructura prima- 158 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (155 - 164) ria de la proteína, se utilizaron distintas herramientas de EXPASY, para calcular el peso molecular y el punto isoeléctrico COMPUTE pI/Mw (http://expasy.org/tools/ pitool.html). Para calcular la hidrofobicidad, el por- centaje de residuos accesibles y la tendencia trans- menbranal, se usó PROTSCALE (http://expasy.org/ tools/protscale.html). La predicción trans-membranal se realizo con los programas TMHMM (http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) y TMPRED (http:// www.ch.embnet.org/software/TMPREDform.html). Los motivos y dominios conservados se analizaron con INTER PRO SCAN (http://www.ebi.ac.uk/Tools/ InterProScan/). Se realizo un Blastx en la base de da- tos NCBI de Proteinas no redundantes para buscar se- cuencias con alto nivel de homologia. El análisis de la estructura terciaria, se realizo por “threading” utilizando el servidor I-tasser [26,27,28]. Al mejor modelo obtenido por “threading”, se le realizo una evaluación de la estructura 3D, y una búsqueda de po- sibles errores, utilizando el algoritmo Rampage Rama- chandran [29]. Utilizando el servidor DALI se realizo una comparación de estructuras tridimensionales de todas las proteínas contenidas en esta base de datos [30]. RESULTADOS Desarrollo de la construcción semi-sintética del gen Cry 1Ac La revisión bibliográfica se realizo en bases de datos de ar tículos disponibles vía electrónica de acceso público y en las 62 bases de datos disponibles para el personal de la Universidad Nacional de Colombia. Como resultado de estas búsqueda se encontra- ron 9 genes cry1Ac de interés, cuyas secuencias fueron empleadas para realizar los alineamientos y determinar una secuencia consenso. La obtención de las secuencias de los genes que resultaron de la revisión de literatura, se hizo en las bases de da- tos: GeneBank del Centro Nacional de Información en Biotecnología de Estados Unidos (NCBI) (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/); EMBL-Bank del Labora- torio Europeo de Biología Molecular y el Instituto Europeo de bioinformática (EMBL-EBI) (http://www. ebi.ac.uk/), y DDBJ el banco de datos de ADN del Japón (http://www.ddbj.nig.ac.jp/) [25,22]. Identificadas y definidas las secuencias de los genes Cry1Ac, se realizaron los alineamientos de las se- cuencias nucleotídicas de los genes seleccionados mediante el programa Clustal W del paquete bioinfor- mático Lasergene: MegAlign, que permite comparar las secuencias entre sí, e identificar diferencias entre ellas, determinando el lugar y el nivel de conservación entre las secuencias alineadas [23,24,25,31]. Una vez alineadas y comparadas las secuencias se estableció la secuencia consenso mediante el paquete bioinformático Lasergene: SeqMan. La secuencia con- senso porta la información de la región codificante del gen de interés, y sobre ella se realizaron posteriormen- te comparaciones con otras secuencias reportadas en las bases de datos, mediante la herramienta BLAST del software DNAsis y de la plataforma NCBI. Esto se hizo para asegurar que no existieran diferencias signi- ficativas entre la secuencia consenso obtenida y otras secuencias reportadas para el gen Cry1Ac. Se empleó un bit score alto y un e-value menor al nivel de signifi- cancia empleado que fue de 0,05 [31,32]. Para el desarrollo de la construcción del casete de ex- presión se decidió emplear el promotor de la Ubiquitina de maíz y el terminador de la Nopalina sintetasa de Agrobacterium [33]. Las secuencias nucleotídicas del promotor y el terminador se buscaron en las bases de datos: GeneBank, EMBL-Bank y DDBJ [24,34]. Determinadas la secuencias tanto del gen de interés como del promotor y el terminador se procedió a la construcción del casete de expresión, median- te el ensamble de las secuencias, promotor de la Ubiquitina de maíz: secuencia consenso cry1Ac): terminador de la Nopalina sintetasa de Agrobacte- rium, obteniéndose así la secuencia del gen siemi- sintetico Cry1AcIGP [24,25,32]. Esto se hizo con el programa Lasergene: SeqBuilder. Ensamblada la secuencia, se procedió con el cam- bio de uso codónico para Oryza sativa en la región codificante, para optimizar la expresión del gen, en el genoma arroz [23,35,36]. Se recomienda la estrategia de optimización del uso codónico en el diseño de los genes semisintéticos [37,38]. Se des- cargó el uso codónico para Oryza sativa de la base de datos CODON USAGE (http://www.kazusa.or.jp/ codon/) y se transfirió al programa DNA 2.0 Gene designer. Allí se ejecuto el cambio de uso codónico de la secuencia consenso del gen [1,32]. Luego, se comparó la nueva secuencia optimizada con la se- cuencia consenso tanto a nivel de nucleótidos como de aminoácidos usando la herramienta Clustal W del 159 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (155 - 164) programa BioEdit. Esta versión también fue alineada contra secuencias de bases de datos de genes y proteínas, mediante las diferentes formas de BLAST existentes para comparar nucleótidos y aminoáci- dos, Blastn y Blastx del programa BioEdit [25]. Finalmente para terminar con la construcción del gen semisintético, denominado Cry1AcIGP a partir de aquí, se realizó un mapa de restricción sobre la secuencia completa empleando el programa BioE- dit. Una vez se conoció este mapa se escogieron los sitos de restricción más apropiados para ser introducidos dentro de la construcción, con el fin de facilitar su manipulación [31,32]. Ello se efectuó mediante el programa DNA 2.0 Gene designer. Una vez introducida esta modificación final a la se- cuencia se obtuvo la construcción definitiva del gen semisintético Cry1AcIGP (Figura 1). Análisis de la proteína CryIGP Según la predicción para péptido señal, basada en “redes neuronales”, hay valores suficientemente al- tos de score, como para considerar la presencia de péptido señal. En la predicción hecha con los mode- los escondidos de Markov, se determino que la pro- babilidad de encontrar péptido señal en la proteína CryIGP es de 0.39, y que el punto de clivaje estaría en el aminoácido numero 24. Adicionalmente la he- rramienta compute pI/Mw permitió el cálculo teórico del punto isoeléctrico y el peso molecular de la pro- teína CryIGP los cuales son: pI/Mw: 5,47 / 72985,07 [39,40,41]. Con base en estos datos se puede afir- mar que la proteína CryIGP, posee péptido señal. En el perfil de hidrofobicidad los picos más altos muestran las zonas de la proteína que tienden a ser hidrofóbicos. En la grafica resultante (datos no mostrados), no se muestra una tendencia de la pro- teína a estar en la membrana celular, ya que presen- ta tanto picos negativos como positivos. La predicción trans-membranal realizada con TMHMM es más precisa para el análisis, ya que esta no mues- tra la tendencia de los aminoácidos, sino que arroja la probabilidad de encontrar la proteína, dentro, entre o fuera de la superficie celular. Según la grafica lo más probable es que la proteína sea extracelular, además que la probabilidad de encontrar hélices trans-mem- branales es de 0,4, es la predicción basada en las re- giones de la proteína que abarcan la membrana y su orientación en esta misma [42]. Es posible afirmar de acuerdo con estos resultados que el ánimo terminal se encuentre al exterior de la membrana y que en la secuencia se hallan 3 hélices trans-membranales. El análisis de la estructura secundaria de la proteína CryIGP, arrojo un porcentaje de 36,09% para un alfa hélice en la posición 262; un porcentaje de 20,39% para una cadena extendida en la posición 148; una la- mina beta con un porcentaje de 8,40% en la posición 61 y por ultimo “random coil” en la posición 255 con un porcentaje de 35,12%. Las hélices hidrofóbicas y anfipaticas sugieren que este dominio puede ser res- ponsable para la formación de poros en el epitelio in- testinal del organismo susceptible [43]. Adicionalmen- te al comparar los sitios conservados de la proteína CryIGP, con los reportados para otras proteínas Cry, esta presenta varios dominios para endotoxinas, en especial un dominio de unión a la galactosa. En el alineamiento múltiple de proteínas, se encontra- ron varias proteínas Cry con un “E-valué” del 0,0 % (Figura 2), lo que indica que no se presenta ninguna diferencia en comparación con la proteína CryIGP. El cuadro 1 muestra los mejores resultados del alineamiento múltiple de la proteína. Blastx es un algoritmo que permite comparar una secuencia de nucleótidos con la base de datos para secuencias de aminoácidos para buscar homologías [46]. La evaluación de estos alineamientos se realizo con la matriz de substitución blosum62. Esta matriz eva- lúa los alineamientos y calcula el bitscore y el e- value de cada alineamiento. Los alineamientos con un valor de bitscore alto y e-value pequeño, repre- sentan homologías significativas estadísticamente, confirmando la veracidad del alineamiento. Todos los alineamientos presentes en el cuadro 1 tienen un e-value igual a cero. Esto indica que la proba- bilidad de encontrar dicho alineamiento al azar es Figura 1. Esquema del gen sintético Cry1AcIGP A B C D pUbi cry1Ac tNOS Sitios de corte de restrictasas: A (EcoRV); B (NotI); C (AvrII); D (Hind III). Tamaño total 4318 pb. 160 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (155 - 164) cero y que estos alineamientos reflejan verdaderas homologías. En el modelamiento 3-D por “threading”, se obtuvie- ron cinco resultados posibles, el que presento mayor score fue de 0,47 (datos no mostrados), mientras que los sitios de unión se establecieron en los aminoáci- dos GLN:160 ASN:161 TYR:162 GLN:163 VAL:164 ARG:218TRP:219 ASN:221 THR:222 GLY:223 LE U:224 GLU:225 ARG:226 TRP:228 [26,27,28]. Para evaluar la calidad de la estructura 3D modela- da, se realizo una evaluación de la posición espacial de los residuos que forman la proteína, mediante el servidor Rampage Ramachandran. Este servidor se basa en los ángulos de torsión para cada residuo en la estructura de la proteína. Los enlaces peptidicos tien- den a ser planos con dos organizaciones espaciales permitidas, trans= 180 0 y cis= 0 0 . Según la grafica de Ramachandran, la distribución de más del 98% de los aminoácidos se encuentra en regiones favorables, esto es un indicio de la calidad estereoquímica del mo- delo analizado [29]. Matemáticamente, el gráfico de Ramachandran es la visualización de una función. La glicina tiene un átomo de hidrógeno, con un pequeño radio de van der Wa- als, en lugar de un grupo metilo en la posición |. Por lo tanto, es menos restringido y esto se puede com- probar en el gráfico de Ramachandran de glicina para que el área permitida sea considerablemente mayor. En contraste, el gráfico de Ramachandran de prolina muestra sólo un número muy limitado de combinacio- nes posibles de ¢ y |. A pesar del cambio en la estructura de las proteínas como resultado de la evolución, existen patrones de organización en los residuos de las proteínas, enton- ces la estructura de las proteínas puede ser identifica- da mediante la detección de estos patrones conser- vados. La matriz de alineamiento a distancias DALI, rompe la estructura en hexapeptidos y calcula una ma- Figura 2. Blast de proteínas. Alineamiento múltiple de secuencias A. Dominios conservados [44,45,46,47]. B. alineamiento de secuencias de proteínas contenidas en la NCBI. Cuadro 1. Alineamiento BLASTX de la proteína. Accesion 1 Name 2 Bitscore 3 E-value 4 ADO64600.1 Cry1Ab/c [synthetic construct] 1247 0,0 ADO64599.1 Cry1Ac [synthetic construct] 1247 0,0 CAA70925.1 delta-endotoxin [Bacillus thuringiensis] 1247 0,0 BAH03128.1 insecticidal crystal protein [synthetic construct] 1236 0,0 ADV57667.1 Cry1Ac [Bacillus thuringiensis] 1235 0,0 AAU87037.1 Cry1Ac [Bacillus thuringiensis] 1235 0,0 AAM95162.1 insecticidal protein CryIAc1 [synthetic construct] 1235 0,0 ZP_04118188.1 Pesticidal crystal protein cry1Ae [Bacillus thuringiensisserovarkurstaki str. T03a001] 1235 0,0 AAA73077.1 Insecticidal delta endotoxin [Bacillus thuringiensisserovarkurstaki] 1233 0,0 ACM90319.1 Cry1Ac [Bacillus thuringiensis] 1232 0,0 1. Número de acceso en la base de datos del NCBI. 2. Nombre del la secuencia alineada. 3. Valor del bit score para las diferentes alineaciones. 4. E-value para los diferentes alineamientos. En todos los casos e-value= 0.0 mostrando robustez estadística en los alineamientos. 161 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (155 - 164) triz de distancia evaluando los patrones de contacto entre fragmentos sucesivos [48,49]. En la figura 2 se muestra 3 alineamientos a distancia usando la matriz DALI, donde la estructura 3D de la proteína CryIGP fue comparada con 3 proteínas Cry (CryIA, CryIIIA y Cry3bb). Se encontró que las pro- teínas comparten las mismas características o tienen similares características en aproximadamente las mis- mas posiciones, como también puede decirse que tienen similares plegamientos con bucles de longitud similar conectando sus elementos de estructura se- cundaria (Figura 3). EscucharLeer fonéticamente CONCLUSIONES Se obtuvo una versión semisintética del gene Cry1Ac, con modificaciones en su secuencia, resultantes tanto de la obtención de la secuencia consenso como de la optimización por uso codónico del arroz. Esta versión, aquí denominada Cry1AcIGP, difiere mínimo un 12% con respecto a secuencia reportadasanteriormente. El modelamiento molecular y bioinformático permite no solamente predecir la estructura tridimensional de la proteína CryIGP, sino también definir su función. Los dominios y sitios conservados indican su naturaleza de endotoxina con propiedades insecticidas y a su vez su gran parecido con proteínas producidas por la bac- teria gram negativa Bacillus thurigensis. Con el análisis de la estructura primaria, se confirmo que esta es una proteína extracelular, la cual actúa como toxina en diferentes grupos de insectos. El análi- sis de la estructura secundaria, permitió identificar los dominios conservados, los cuales permiten predecir su función y papel como toxina. Los análisis de alinea- miento múltiple, confirmaron la relación de la proteína Cry IGP, con otras endotoxinas reportadas, como tam- bién una muestra significativa de la diversidad de esta proteína en la naturaleza. Es clave realizar el estudio detallado, mediante el uso de herramientas bioinformáticas, de la estructura de las proteínas resultantes de genes semisinteticos, lo cual permitirá determinar de una forma presuntiva el buen diseño y expresión del gen. AGRADECIMIENTOS Al Biólogo Alejandro Rodríguez por su valiosa aseso- ría y colaboración para el desarrollo de este trabajo. Al convenio firmado por FEDEARROZ y la Universidad Nacional de Colombia para el desarrollo de sistema de ingeniería genética para cultivares colombianos de arroz, que financiaron este trabajo. REFERENCIAS [1] WU, J. and BALDWIN, I. New Insights into Plant Responses to the Attack from Insect Herbivores. Annu. Rev. Genet., 44, 2010, p.1–24. [2] KOS, M., LOON, J., DICKE, M. and VET, L. Trans- genic plants as vital components of integrated pest management. Trends in Biotechnology, 27(11), 2009, p. 621-627. [3] STRANGE, R. and SCOTT, P. Plant disease: A Threat to Global Food Security. Annu. Rev. Phyto- pathol, 43, 2005, p. 83–116. [4] XIA, H., CHEN, L., WANG, F. And LUA, B. Yield benefit and underlying cost of insect-resistan- ce transgenic rice: Implication in breeding and Figura 3. Alineamiento a Distancia DALI A. proteína CryIGP; B. proteína cryIA; C, cryIIIA delta endotoxina; D, Pesti- cidialCrystalProtein Cry3bb. Usando la base de datos para proteínas PDB, se realizo un alineamientomúltiple estructural, para hallar homología entre la estructura 3D de la proteínaCryIGP y las proteínas presentes en la base de datos. Los resultados muestran homología en los sitos de acción y en los motivos como también zonas variables con bucles indefinidos. 162 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (155 - 164) deploying transgenic crops. Field Crops Re- search, 118, 2010, p. 215–220. [5] FERRY, N., EDWARDS, M., GATEHOUSE, J., CAPELL, T., CHRISTOU, P. and GATEHOUSE, A. Transgenic plants for insect pest control: a forward looking scientific perspective. Trans- genic Research, 15, 2006, p. 13–19. [6] MEHLO, L., GAHAKWA, D., TRUNGNGHIA, P., THILOC, N., CAPELL, T., GATEHOUSE, J., GA- TEHOUSE, A. and CHRISTOU, P. 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Las composteras fueron de 1 m 3 , construidas en guadua y bajo cubierta plástica tipo invernadero. Se tomaron muestras del abono a los 8, 40, 48 y 56 días, las cuales se enviaron al laboratorio. Se registraron datos dos veces por semana de temperatura interna de cada pila, humedad y temperatura ambiente, realizando volteos cada semana. El análisis de varianza mostró que no hay diferencias significativas entre tratamientos ni repeti- Recibido para evaluación: 29-05-2013. Aprobado para publicación: 02-08-2013. 1 Ingenieros Agropecuarios, Facultad de Ciencias Agropecuarias – Grupo de investigación en Nutrición Agropecuaria – Universidad del Cauca. 2 Ecóloga. M.Sc. Profesora Titular, adscrita a la Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Ciencias Agropecuarias - Universidad del Cauca. 3 Ingeniero Agrónomo. M.Sc. Profesor Asistente, adscrito a la Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Ciencias Agropecuarias - Universidad del Cauca. 4 Ingeniero Agrónomo. C-M.Sc. Profesor Asociado, adscrito a la Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Ciencias Agropecuarias – Universidad del Cauca. Correspondencia:
[email protected] 166 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (165 - 173) ciones (p>0,05); pero se presentan variaciones en los valores para el T2 en variables como: pH, materia orgánica, CICe, porcentajes de N, P, K, Ca, Mg, cumpliendo la norma NTC 5167, a pesar de no incluir fuentes alternas de nitrógeno que mejoran el proceso de compostaje y el producto que de este se obtiene. ABSTRACT We performed the evaluation of different formulations of compost from crop residues of Tomato (Solanum lycopersicum), using four T1: 24% do- lomite lime, T2: efficient microorganisms (EM), T3: The combination of EM and dolomite lime and T4: traditional composting, which served as referen- ce for the formulas mentioned. 1m 3 the composting were built in bamboo and under plastic cover emissions. Manure samples were taken at 8, 40, 48 and 56 days, which were sent to the laboratory. Data were recorded internal temperature of each battery twice a week, humidity, temperature and precipitation, additionally conducted a dump each week. The analysis of variance showed no significant differences between treatments or re- plicates (p> 0,05), but there are variations in the T2 values for variables such as pH, organic matter, ICC, percentages of N, P, K , Ca, Mg, in some cases with values to the NTC 5167, despite not include alternative sources of nitrogen to improve the composting process and the product that this is achieved. Simultaneously performed cost analysis for each of the for- mulations, where you can choose any of the fertilizers obtained for each treatment. Additionally positive correlations were found between these va- riables and environmental parameters. RESUMO Realiza-se a evacuação de diferentes formulações de compostagem a par- tir de resíduos de colheita de tomate (Solanum lycopersicum), utilizando quatro tratamentos T1: cal dolomita do 24%, T2: microorganismos eficien- tes (E.M.), T3: combinação de E.M. com cal dolomita y T4: compostagem tradicional, que sérvio como referente para as formulações mencionadas. As compoteiras fueiro de 1m 3 , construídas em guadua e bajo coberta plás- tica tipo estufa. Tomaram-se mostras do abono a os 8, 40, 48 y 56 dias, as coalhes se enviaram al laboratório. Registraram-se dados dos vesses por semana de temperatura interna de cada pila, humidade y temperatura ambiente, adicionalmente se realizo um volteio cada semana. As análises de variância Não mostrou diferença significativa entre tratamentos e re- petições (p>0,05); mas se presentassem variações em os valores para o T2 em variáveis como: pH, matéria orgânica, CICe, porcentagem de N, P, K, Ca, Mg, em alguns casos com valores do norma NTC 5167, a pesar de não incluir fontes alternas de nitrogênio que melhoram o processo de compostagem e o produto que de este se obter. PALABRAS CLAVE: Microorganismos eficientes, Mate- ria orgánica, Humedad, Temperatu- ra ambiente. KEYWORDS: Efficient microorganisms, Organic material, Humidity, Temperature PALAVRAS-CHAVE: Microorganismos eficientes, Maté- ria orgânica, Humidade, Temperatu- ra ambiente. 167 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (165 - 173) INTRODUCCIÓN Los modelos tradicionales de crecimiento rural han causado graves problemas de contaminación del sue- lo, aire y agua; contribuyendo en parte a la crisis am- biental que se está viviendo por el incremento de las emisiones atmosféricas y en particular por la genera- ción de residuos sólidos [1]; siendo la agricultura uno de los sectores que más produce residuos en el mun- do, participando con 1319,8 Ton/ha/año, de las cuales la horticultura produce 30 Ton/ha bajo invernadero y 25 ton/h al aire libre y el cultivo de tomate representa el 30% de la producción hortícola mundial. Es así como la gestión de los residuos constituye sin duda uno de los retos de la sociedad del siglo XXI para contribuir en alguna medida a disminuir la huella ecológica genera- da por la actividad agropecuaria [2]. El tratamiento y destino de los residuos orgánicos son una preocupación permanente en la sociedad debido a que generan en su descomposición, fermentaciones incontroladas que causan problemas sanitarios afec- tando el medio ambiente [1]. En la actualidad el apro- vechamiento agrícola de residuos orgánicos es una práctica habitual en nuestra comunidad debido a las elevadas cantidades generadas de estos materiales, al intento de buscar la manera económica de gestionar- los y a la nueva tendencia legislativa mundial [3]. La transformación en compost puede hacerse sin fer- tilizantes químicos y es una técnica muy utilizada en China desde hace 400 años. El compostaje renueva los ciclos ecológicos, a la vez que evita que los resi- duos orgánicos terminen en los vertederos. Los mi- croorganismos son la clave para el éxito del reciclaje de los residuos, ya que reducen la materia orgánica dejando a disposición los macro y microelementos esenciales para el desarrollo de las plantas [4]. El compostaje supone una solución a la demanda de materia orgánica, desequilibrios nutricionales de los suelos, costos de fertilizantes y calidad ambiental que tienen que asumir los diferentes productores agríco- las con el fin, de mejorar sus producciones. Mediante este procedimiento, se podrían reducir en un 40 % el peso y en un 50 % el volumen de los residuos tratados; obteniéndose un producto final con valor potencial en el mercado o que podría ser utilizado por los mismos agricultores con múltiples beneficios. La finalidad de este trabajo fue la evaluación de dife- rentes formulaciones de compostaje a partir de resi- duos de cosecha de tomate (Solamun lycopersicum), en la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Univer- sidad del Cauca; además se plantearon unos objetivos específicos como: Determinar la mejor formulación a partir de los residuos de cosecha de tomate para pro- ducción de abonos orgánicos y realizar un diagnóstico de los residuos provenientes de la finca San Millan. MÉTODO Área de Estudio El proyecto se desarrolló en las instalaciones de la Fa- cultad de Ciencias Agropecuarias de La Universidad del Cauca, sede las Guacas, al nororiente del munici- pio de Popayán en la vereda Lame, a 2º 29” de latitud Norte y 76º 33” de longitud Oeste [5]. La zona se ubi- ca a una altitud de 1900 msnm, con una temperatura ambiente promedia de 19ºC, precipitación de 2000 mm/año y una humedad relativa del 80%, aspectos climatológicos que corresponden a un clima medio. La investigación comprendió diferentes etapas desde el acondicionamiento del sitio hasta el análisis de re- sultados obtenidos en laboratorio. Acondicionamiento del sitio. Se construyó una cu- bierta plástica tipo invernadero de 8 x 5x 2,5 metros de alto, ubicada de oriente a occidente para facilitar la circulación de aire, y además evitando que las pilas de compostaje quedaran directamente expuestas al sol y la lluvia. Composteras. Se construyeron ocho composteras en guadua de 1m3, teniendo en cuenta las cantida- des de material generado en la finca, y dispuestas en piso de tierra. Recolección de residuos orgánicos. En la finca San Millan perteneciente a TECNIAGRO del Cauca, se re- colectaron los residuos de dos lotes de tomate bajo invernadero en su fase de eliminación, cuantificando el total de residuos producidos en un área de 1500 m2 por lote. La información obtenida se consolidó en un registro, el cual muestra el número de surcos, el número de plantas por surco y finalmente el peso total de los residuos. Una vez tomadas las especificaciones del cultivo de tomate, se realizó el respectivo pesaje de los residuos de cosecha con un balanzón electrónico. En su mayo- 168 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (165 - 173) ría compuestos por tallos, raíces, hojas y frutos so- bremaduros. Llenado de composteras. Se empleó la técnica de sis- temas abiertos, los residuos se picaron con machete y se llevaron a las ocho pilas, cada una dispuesta en tres capas consecutivas hasta alcanzar una altura de 0,8 m, estas fueron volteadas cada semana durante los 56 días evaluados. Seguimiento y control de las pilas de compostaje. Se tomaron registros de temperatura de las pilas (TP) para diferenciar e identificar las fases de descomposición de la materia orgánica y determinar la incidencia de este factor en el proceso de descomposición, los datos fue- ron tomados dos veces por semana utilizando un ter- mómetro de mercurio durante la compostación. Toma de muestras. Se tomó una muestra compuesta de cada pila, a los 8, 40, 48, y 56 días, se tamiza- ron con el propósito de retirar impurezas y mejorar la apariencia, se empacó en bolsas plásticas rotuladas y fueron enviadas al laboratorio de la Secretaria de Agri- cultura y Desarrollo Minero para su análisis. Determinación de carbono orgánico oxidable total. Se aplicó el protocolo de Walkley y Black, para deter- minar los valores del contenido de carbono orgánico y corroborar los datos obtenidos por parte del labo- ratorio y lograr un referente confiable en cuanto a la relación C/N. Para la aplicación del protocolo se contó con los registros climatológicos de la zona de estudio, ya que estas variables (temperatura ambiente, hume- dad, y precipitación), están estrechamente ligadas con el proceso de descomposición de la materia orgánica. Modelo estadístico Se realizó un diseño experimental completamente al azar (DCA) con cuatro tratamientos y dos repeticiones (Cuadro 1). La variación entre los tratamientos estuvo en la cal y la presencia de Microorganismos Eficientes - EM, que fueron adquiridos en los distribuidores de FUNDASES garantizando la combinación de una bacteria acido láctica (Lactobacillus casei), una bacteria fototrófica (Rhodopseudomonas palustris) y una levadura (Sac- charomyces cerevisiae). Los datos obtenidos en campo y en laboratorios se analizaron con el programa estadístico SPSS 15. Las correlaciones se realizaron con base en los resul- tados de los análisis del laboratorio de La Secretaria de Agricultura, la información meteorológica de la es- tación del aeropuerto Guillermo León Valencia y los datos tomados en campo, verificando cuales de las variables ambientales fueron las más determinantes en el proceso de compostaje. RESULTADOS Durante el trabajo de campo, la precipitación promedia durante las siete semanas de evaluación fue de 36,17 mm, destacándose por ser un periodo seco con tempera- turas comprendidas en un rango de 19 a 20ºC; mientras que la humedad se mantuvo en un promedio de 75,21%. La cantidad de residuos de cosecha fue de 90,56 kg en 120 m 2 , que es el área por cama de dos surcos constituidos por 400 plantas. Al realizar la conversión a kilogramos por hectárea que es el área total aproxi- mada de la finca se obtendrían 6037,3 kilos de resi- duos orgánicos. Análisis descriptivo de los resultados de las prue- bas de laboratorio Se evidencian variaciones entre los resultados obte- nidos en el laboratorio de La Secretaria de Agricultu- ra, en los datos obtenidos de la prueba de Walkley y Black, y en el análisis descriptivo realizado con el soft- ware estadístico SPSS15. A continuación se describe el comportamiento de cada uno de los tratamientos, con respecto a cada parámetro, como pH, Materia orgánica, Capacidad de intercambio ca- tiónico (CICe) y elementos mayores como N, P, K, Mg, Ca. Cuadro 1. Conformación de los tratamientos Tratamientos T1 T2 T3 T4 Cal al 24% E.M. (0,3L) Cal + E.M. Testigo Cal (250 g) Residuos (63 Kg) Cal (250 g) Residuos (63 Kg) Residuos (63 Kg) E.M (0,075 L) Residuos (63 Kg) Tierra (50 Kg) Tierra (50 Kg) Tierra (50 Kg) E.M (0,075 L) Tierra (50 Kg) 169 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (165 - 173) pH. En la figura 1 se puede apreciar las variaciones en- tre tratamientos los cuales fluctuaron entre 5,9 y 6,6. Se puede observar que el pH entre los tratamientos fue similar, pero T2 registró valores mayores, esto proba- blemente dado a un mejor proceso de mineralización por la adición de microorganismos eficientes (E.M.). Estudios realizados aseguran que la adición de estos organismos mejora la disponibilidad de nutrientes en el suelo, debido a que la presencia de Saccharomyces cerevisiae, permite la mineralización estructuras vege- tales como ligninas presentes en los residuos de co- secha de tomate [6]. La mayoría de los cultivos prosperan mejor en tierras con valores de pH entre 6 y 7. El pH del suelo ejerce la influencia individual más importante sobre el apro- vechamiento de los elementos minerales que hacen crecer los cultivos, y del mismo modo, la eficiencia del aprovechamiento del fertilizante para el cultivo [7]. Por otra parte según la norma NTC 5167 para produc- tos orgánicos usados como abonos o fertilizantes y enmiendas de suelo el pH debe de estar en un rango entre 4 y 9, debido a su efecto sobre la concentración de elementos nutritivos disponibles para las plantas y la actividad microbiana [8]. Materia Orgánica. En la figura 2, se observa que los tratamientos en los cuales se utilizaron los E.M., pre- sentaron valores entre 2 y 3,8 % superiores a las otras formulaciones evaluadas. Lo anterior pudo generarse a la actividad de los lac- tobacilos, que al tener un metabolismo fermentativo, oxidan compuestos orgánicos (azúcares, glucosa) aumentan la fragmentación de los componentes de la materia orgánica, como la lignina y la celulosa [9], transformando esos materiales e incrementando los porcentajes de materia orgánica por encima del 10,3 que mejoran la fertilidad del suelo [10]. Capacidad de intercambio catiónico. El T2 fue el que registró mayores valores a diferencia del T3, dado a que la cal puede inhibir el intercambio de ciertos nutrientes por el contenido de carbonatos que esta contiene [11]. De acuerdo con estudios en la elaboración de com- postaje se afirma que el valor de CICe varía según la textura y el contenido de materia orgánica [12]. Es así como T2 presentó mejores niveles de materia orgánica (16,9%) y una textura franca características adecuadas para un mejor comportamiento del CICe, cumpliendo Figura 1. pH determinado en los tratamientos Figura 2. Materia orgánica determinada en los tratamientos Figura 3. Capacidad de intercambio catiónico encontrada en los tratamientos 170 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (165 - 173) con la norma NTC 5167 [13], la cual indica que para el intercambio catíonico el valor mínimo debe de ser de 35 meq/100 g para abonos orgánicos provenientes de residuos vegetales. Elementos mayores: Nitrógeno, Fosforo y Potasio. En la figura 4, se observan los valores en porcentaje de los elementos mayores (N,P,K) y de los residuos vegetales usados en para el composaje. El T2 presenta los contenidos más altos de Nitrogeno (0,75%), Fosfo- ro (0,0039%) y Potasio (0,64%). El aporte nitrogeno provenientes de los residuos de tomate (tallos y hojas) es del 2,33%, del cual el T2 al- canzó a mineralizar cerca del 32,18% del suministrado por el material vegetal. En cuanto al Fósforo el aporte es del 0,22%, alcanzando recuperar el 1,77% del total hallado y para el potasio la cantidad es del 1,85%, por lo tanto solo se alcanzó a extraer un 34,59% [11]. Los valores bajos de estos elementos, se deben en gran medida a la baja relación que se presentó en- tre C/N a través de todo el proceso de compostaje (15,5/1), ya que la relación optima debe ser de 25- 35/1 [12], para que el proceso se desarrolle de mane- ra adecuada, explicándose por la carencia de fuentes nitrogenadas como estiércoles de animales que pue- den aportar hasta el 54 % [14]. Los resultados obtenidos para fosforo, difiere de los expuestos en otros estudios [12], donde argumenta que el porcentaje debe estar entre 0,1 a 1,6%, atribu- yéndose en cierta medida a que su contenido depende de la cantidad de materia orgánica y el pH del sustrato en el compostaje, ya que la materia orgánica al des- componerse libera gran cantidad de ácidos orgánicos que solubilizan fosfatos y el pH hace que elementos como el Al y Fe se neutralicen y se permita la moviliza- ción del Fósforo [15]. El Potasio se encuentra ligado con el contenido de materia orgánica y en particular de los residuos del tomate, alcanzado valores del 0,64 % para el T2, esto debido a la mineralización por parte de los E.M.; y cumpliendo los rangos permitidos están entre 0,4 a 1,6 % [10, 12]. Calcio y Magnesio. En la figura 5 se aprecia que el T2 reveló los mayores porcentajes de los cuatro trata- mientos evaluados, 0,35% para Ca y 0,082% para Mg. Estos nutrientes se encuentran en tallos y hojas de tomate en un porcentaje de 3,48% para el caso del Calcio y de 0,96% para el Magnesio [11], con el com- postaje de los residuos de cosecha de tomate sólo se extrajo un 10,05% del total del Calcio y un 8,54% del total de Magnesio. El promedio de Calcio en los tratamientos fue de 0,31%, clasificando su contenido como bajo [12], quien establece que los niveles de Calcio para abo- nos compostados debe encontrarse en un rango de 6,0 a 11%. De igual manera se comportó el Magnesio con un ni- vel de 0,071%. Lo anterior se encuentra directamente relacionado con el pH, ya que a menor nivel de pH se presenta una baja concentración de este elemento Figura 4. Nitrógeno, Fósforo y Potasio determinados en los tratamientos Figura 5. Calcio y Magnesio determinados en los tratamientos 171 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (165 - 173) reportando niveles mínimos de este elemento 1,6% en abonos provenientes de residuos orgánicos [10, 8]. Resultados de análisis químico El análisis de nutrientes del abono obtenido correspon- de a un compost maduro, en el cual se identifica y determina el cumplimiento de algunos de los paráme- tros sugeridos por la Norma Técnica Colombiana (NTC 5167) [13]. Los resultados expuestos en el cuadro 2 muestran que algunos valores nutricionales están por debajo de los rangos que exige la NTC 5167 del ICONTEC. Esto se debe a que los diferentes abonos compostados que re- gula la norma provienen de mezclas heterogéneas de residuos vegetales y animales que han sido mezclados para la preparación de abonos orgánicos mejorados. En particular, este abono se puede calificar como abo- no simple dado a que solo se utilizó material vegetal de tomate. Los abonos orgánicos simples se consideran en la práctica como una enmienda orgánica, mejora la estructura del suelo, la porosidad, su abundancia en la aplicación permite recuperar los suelos, aportando algunos nutrientes dependiendo de su origen, y en cul- tivares de corto y mediano plazo dichos residuos ade- lantan el proceso de compostaje y pueden reemplazar las fertilizaciones hasta en un 20% [16]. Correlación ambiente – Registros Materia Orgánica. Se halló una correlación positiva con la variable de N-Total la cual presentó un valor de 0,844 (p<0,01). Esto se debe a que a mayor con- tenido de Nitrógeno se aumentan los niveles de Car- bono obteniendo un incremento de 1,724 veces más de materia orgánica mejorando la calidad del abono compostado [16]. Fósforo. La correlación fue significativa (p<0,05) con el N-Total con una relación de 0,408 y altamente significativa (p<0,01) con la variable materia orgá- nica con una relación de 0,416, esto se debe posiblemente a que el fósforo se encuentra entre un 50 a un 60% en el estado avanzado de descomposición de los materiales vegetales llegando a presentarse en los coloides en forma de humus, que es una forma estable de la materia orgánica; su mineralización está regulada por la biomasa microbiana que es el componente orgánico central del ciclo del fósforo contenido en el material orgánico [17]. La variable de precipitación, presenta una relación de (-0,419) parámetro que afecta en gran medida y de for- ma directa a la humedad, cambiando el ambiente propi- cio para la descomposición de la materia orgánica de la cual se obtiene el fósforo y otros nutrientes [16]. Potasio. Se halló una correlación positiva con los ni- veles de pH en una relación de 0,406 (p<0,05), de- mostrando que el incremento en el nivel de pH ayuda a mejorar el ambiente propicio para la acción de los microorganismos encargados de la mineralización del Potasio contenido en la materia orgánica [18]. También se halló una correlación (p<0,01) con la va- riable temperatura de pila en una relación de (-0,720), debido a que al disminuir la temperatura interna en la pila de compostaje se aumenta la humedad dentro de la misma lixiviando el Potasio existente en los materia- les compostados [16]. Cuadro 2. Composición nutricional de los compost obtenidos Vs. norma NTC 5167 Parámetro T1 T2 T3 T4 Limite Norma Mín – Máx Nitrógeno % 0,58 0,63 0,59 0,63 1,5 Fósforo % 0,0024 0,0027 0,002 0,0023 1,0 - 4,0 Relación C/N 11,65 13,08 13,91 12,03 < 20 Materia orgánica % 13,05 16,91 15,59 14,52 > 20 Carbono orgánico % 7,57 9,81 9,04 8,42 5 - 15 pH 6,15 6,25 6,15 6,20 4 - 9 CICe (meq/100 g) 36,31 41,29 34,53 35,23 > 35 Fuente: Norma NTC 5167 172 Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial Edición Especial No. 2 (165 - 173) Calcio. Presentó una correlación (p<0,05) con la hu- medad ambiental en una relación de (-0,403), debido a que en ambientes áridos o secos con baja humedad los niveles de Calcio son altos. También se presentó una relación (p< 0,01) con las variables: temperatura de pila y la precipitación con una relación de (-0,717) evidenciando que la temperatura de pila reduce el con- tenido de humedad en el compostaje por el aumento en la evaporación, factor que afecta la movilización del Calcio en forma de catión [17]. Intercambio catiónico. Presento correlación con la temperatura de pila presentando una relación de (-0,688) en (p<0,01), situación que se puede atribuir a que el aumento de temperatura interna de pila dismi- nuye el índice de humedad que es un factor necesario para el intercambio catiónico entre los diferentes coloi- des del suelo [18]. CONCLUSIONES Al realizar la evaluación de los diferentes tratamientos no se encontraron diferencias significativas para las variables analizadas, sin embrago, el T2 (adición de E. M.) mostró un mejor comportamiento para las varia- bles de pH, CICe, materia orgánica, Nitrógeno, Fosfo- ro, Potasio, Calcio y Magnesio. El compostaje es una de las alternativas que pueden mejorar la disposición final de los residuos de cosecha y teniendo en cuenta el nivel de residuos orgánicos generados en la finca San Millán, se pudo establecer que es una opción para la biotransformación de dichos materiales, ayudando así a la recuperación y ciclaje de nutrientes. Al realizar una comparación entre los resultados hallados en el estudio y las exigencias requeridas por la norma NTC 5167 del ICONTEC, para la producción y comer- cialización de abonos orgánicos en Colombia, se puede afirmar que estos se cumplen para las variables como pH, CICe, mas no para la variable materia orgánica. Para las demás variables es difícil afirmar el cumplimento de la norma dada la ambigüedad de la misma, donde no se indican los rangos permitidos para estos productos. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen a la empresa Tecniagro del sur, que permitió utilizar los residuos de la finca San Millan. A la Universidad del Cauca y la Facultad de Ciencias Agropecuarias, por permitir utilizar sus instalaciones para el desarrollo de la investigación. REFERENCIAS [1] BOTERO, R. Sistema Integrado de Manejo de Re- siduos, tecnología apropiada para el medio ru- ral en el trópico [online]. Available: http://www. emmexico.com/residuos.pdf. [Citado en 11 de Junio de 2010]. [2] DUPUIS, I. Estimación de los residuos agrícolas generados en la Isla de Tenerife, Información Téc- nica [online]. Available: http://www.agrocabildo. com/publica/publicaciones/sost_28_L_estima_ residu_agricola.pdf. [citado en 11 Junio de 2010]. [3] ESCOBAR, N., MORA, J. y ROMERO, N. Identi- ficación de poblaciones microbianas en com- post de residuos orgánicos de fincas cafeteras de Cundinamarca, Boletín Científico, Centro De Museos, Museo De Historia Natural, 6 (1), 2013, p.75 – 88. [4] FIAD, J. Residuos Orgánicos [online]. Available:http://www.monografias.com/traba- jos10/organ/organ.shtml [citado en 11 Junio de 2010]. 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