La citogenética y sus aplicaciones clínicasDra. Catalina Obando MQC Citogenética La citogenética es la disciplina que estudia morfología, estructura y cantidad de los cromosomas presentes en las metafases de la células nucleadas, que son cultivadas in vitro, y son analizadas mediante un estudio de cariotipo. Se divide en: Citogenética convencional o de Bandas G y Citogenética molecular: FISH y CGH ¿Qué es un cariotipo? Se llama cariotipo a la representación gráfica del contenido de cromosomas de las células somáticas de una especie dada, que permite observar la forma, tamaño, número y otras características de los cromosomas. Las células somáticas de la especie humana poseen 23 pares de cromosomas (2N), de los cuales 22 pares son autosomas y un par sexual. ¿En que casos se realiza? . . medicamentos. paciente sin antibióticos. estéril. cámara flujo laminar . fiebre. tubos. células neoplásicas. gripe etc. Sangre periférica.Técnica de laboratorio Muestras: Médula ósea. Líquido amniótico Tejidos tumores Sangre periférica:1 ml de sangre. vitaminas. Cultivo en condiciones estériles. medios. antibióticos y agentes inductores de la mitosis (Fitohemaglutinina. se colocan en tubo cónico con medio de cultivo.Técnica: cultivo En el caso de un cultivo de sangre o médula ósea. . de crecimiento con nutrientes. Phaeolus vulgaris Linfocitos Linfoblastos. y se mantiene a 37ºC durante 72h. el procedimiento que se sigue es el siguiente: Unas gotas de sangre periférica anticoagulado con heparina. El cultivo se somete a un choque hipotónico KCL que rompe la membrana celular y la suspensión de núcleos es fijada. . se añade al medio de cultivo un agente antimitótico denominado colchicina que permite detener la división celular en metafase.Cosecha Tras este periodo de incubación. Fijación y Lavados Luego de la fijación: Se hacen lavados al botón de células. agregando solución ácido acético y metanol y se centrifuga hasta obtener un botón blanco listo para realizar láminas . nuevas Se agrega gotas a la lámina de tal forma que resbale y se usa calor para que se dispersen mejor las mitosis.Láminas Se realizan con láminas prelavadas sin grasa. Paso crucial para obtener metafases de calidad que facilita análisis . Bandeo El tratamiento con una enzima denominada tripsina y la tinción con el colorante Giemsa permite generar en los cromosomas un patrón de bandas claras y oscuras (bandas G) que permite identificar cada par cromosómico. . Utilización de microscopio con cámara.Análisis cromosómico El estudio de la morfología cromosómica permite estudiar tanto alteraciones numéricas como estructurales. software y hardware especial para análisis cromosómicos . Análisis de bandas . Morfología Cromosómica Metacéntrico (Cromosoma 1) Submetacéntrico (Cromosoma 9) Acrocéntrico (Cromosoma 14) . Patrón Normal Masculino 46.XY . Cariotipo Patrón Normal Femenino 46.XX . Euploidía: 46 cromosomas humanos Aneuploidía: ganancia o pérdida cromosómica poliploidía: más de un conjunto haploide de cromosomas. Monosomías: 45. Tetrasomía: 48.Alteraciones cromosómicas Alteraciones numéricas: Pueden ser resultado de no disyunción o no separación cromosómica.X.XXX +21. Trisomía: 47. Doble trisomía: 48.XXXX .XY+21. Alteraciones cromosómicas Alteraciones estructurales: Exposición a agentes ambientales mutagénicos. Duplicación: un segmento o una misma secuencia de genes aparece en forma doble en el mismo cromosoma. Inversión: un segmento cromosómico rota 180° sobre sí mismo. Paracéntrica (no incluye el centrómero). Pericéntrica . Deleción: pérdida de un segmento. Anomalías cromosómicas estructurales Inversiones Anillos translocaciones deleciones . Anomalías cromosómicas estructurales . Definición de sexo.Citogenética Clínica Estudios cariotipos pacientes: Síndrome genéticos innatos Adquiridos: neoplasias. pubertad. retraso sicomotor y aprendizaje. . cáncer Alteraciones cromosómicas estudios familiares. leucemias. abortos. Problemas de desarrollo. Principios de Citogenética Clínica Gersen and Keagle. 1999 ¨Ningún análisis cromosómico clínico puede ser realizado sin al menos conocer el tipo de muestra y sus condiciones para ser analizada. así como el diagnóstico y características del paciente en estudio¨ . 4. 2. hipotonía rasgos faciales singulares anomalías menores enfermedad cardiaca congénita atresia duodenal retraso mental Etiología: Trisomía 21 (en el 95% de los casos) Suele generarse por falta de disyunción (lo más frecuente es la materna. Translocación Robertsoniana (2-4% de los casos) Mosaicismo (1-3% de los casos) . Es la causa más común de retraso mental moderado. 3.Síndrome de Down Aneuploidía autosómica Trisomía 21 Su incidencia es de uno por cada 800 nacimientos vivos. 5. Características clínicas: 1. 6. en la meiosis I): Está asociada con edad avanzada de la madre. +21 47: el número total de cromosomas (46 es lo normal).+21 Este cariotipo es un ejemplo del Síndrome de Down.XX. XX: los cromosomas sexuales (femeninos).XX. +21: indica que el cromosoma extra es un 21. .Síndrome de Down 47. la anomalía numérica más frecuente en recién nacidos. Se caracteriza por un cromosoma 21 extra y el cariotipo se escribe así: 47. 21) translocación .t(14.Síndrome de Down 46.XY. +21 Doble aneuploidía .XYY.Síndrome de Down 48. retraso mental severo Supervivencia: 50% de mortalidad a 1 mes 10% sobreviven a 1 año . enfermedad cardiaca congénita 5. hernia de diafragma 6. anomalía peculiar en las manos 4.000 nacimientos vivos. Características clínicas: 1.Síndrome de Edwards (trisomía 18) Su incidencia es de uno por cada 6. crecimiento prenatal deficiente 2. rasgos faciales singulares 3. Síndrome de Edwards (trisomía 18) . . aplasia cutánea Supervivencia: similar a la de la trisomía 18. microftalmia 4.000 Características clínicas: 1.Síndrome de Patau (trisomía 13) Su incidencia es de uno por cada 10. labio leporino o fisura palatina 3. polidactilia 5. holoprosencefalia 2. Síndrome de Patau (trisomía 13) . XY.p11.dic(13.46.+13.2.2) .14)(p11. Anomalías cromosómicas Anomalías autosómicas Anomalías congénitas múltiples: malformaciones severas anomalías leves dismorfismos Fallo de crecimiento. Crecimiento: variable. . Retraso mental o retraso en el desarrollo Estudio por abortos Otros síndromes con alteración cromosómica (microdeleciones) diagnóstico confirmatorio FISH Anomalías en cromosomas sexuales Malformaciones congénitas: infrecuentes. Infertilidad. Intelecto: comúnmente normal. intelecto normal. infertilidad 7. linfedema (manos o pies al nacer. anomalías renales (50%) 6. dificultad en la percepción espacial Características clínicas: 1. corta estatura 2. amenorrea. enfermedad cardiaca congénita (20%). cuello corto con pliegues laterales desde la oreja al acromion (“cuello alado” o pterygium colli)) 4. estrechamiento aórtico . disgénesis gonadal (ovarios rudimentarios). carencia de caracteres sexuales secundarios.Aneuploidía en cromosomas sexuales Síndrome de Turner Incidencia: 1/5. 5. anomalías leves de cara y extremidades 3.000 nacimientos femeninos vivos (la mayoría de las concepciones se pierden mayorí antes del nacimiento). Síndrome de Turner Etiología: Un ~50% de los casos tienen genotipo 45,X No hay disyunción (lo más común es la pérdida del X paterno) Un 30-40% de los casos son mosaicos Lo más común es 45,X/46,XX Con menor frecuencia, 45,X/46,XY (con riesgo de gonadoblastoma) Síndrome Turner Un 10-20% de los casos tienen una anomalía estructural en el cromosoma X Aneuploidía en cromosomas sexuales Síndrome de Klinefelter (47, XXY) Incidencia: 1/1.000 nacimientos masculinos vivos. Características clínicas: estatura alta constitución eunucoide ginecomastia y riesgo aumentado de cáncer de mama atrofia testicular, carencia de caracteres sexuales secundarios, infertilidad intelecto: ~2/3 tienen dificultades de aprendizaje Etiología: El cromosoma X extra es de origen materno en la mayoría de los casos (mayor incidencia con edad materna avanzada) 15% de mosaicismo pero se conocen casos con descendencia Intelecto: ~2/3 tienen dificultades de aprendizaje Etiología: La mayoría son resultado de no disyunción materna (mayor incidencia con edad materna avanzada) .000 nacimientos femeninos vivos Características clínicas: Pueden ser más altas que la media La infertilidad es común.XXX Incidencia: 1/1.Aneuploidía en cromosomas sexuales Mujer 47. 47. y por lo tanto no aumenta su incidencia con edad materna avanzada . fertilidad normal 3. intelecto: ligera reducción en el coeficiente intelectual 4. los problemas de comportamiento pueden ser más frecuentes Etiología: No es resultado de no disyunción materna. pueden ser más altos que la media 2.XYY Incidencia: 1/1.000 nacimientos masculinos vivos Características clínicas: 1. Cariotipos en Médula ósea Diagnóstico de neoplasias hematológicas: Leucemias agudas y mieloide crónica Linfomas Anemias aplásicas Síndromes mielodisplásicos La aspiración de médula ósea es la extracción de este tejido para su análisis: Morfología hematológica Citometría de flujo Citogenética Biología molecular . antibióticos Cultivo directo de cromosomas o 24 h Agrega colchicina. 20-30 min.Procedimiento Cultivo de médula ósea 3 ml de médula ósea Medio especial de transporte RPMI enriquecido suero fetal. proceso de choque hipotónico Fijación carnoy (acido acéticometanol)1:3 Lavado del botón de células Láminas Bandeo análisis . Carlos Sáenz Herrera” .Morfología cromosómica en médula ósea Foto Fuente: Laboratorio de Citogenética Hospital Nacional de Niños “Dr. 2) 20-30% adultos. M-bcr y m-bcr Ph+ Foto Fuente: Laboratorio de Citogenética Hospital Nacional de Niños “Dr. 6-17% niños mal pronóstico. q11.LLA-t (9.22) (q34. Carlos Sáenz Herrera” . (CD10+). 19) t(9.11) t(1.Leucemias Agudas: Linfocíticas Línea B. T Translocaciones t(4.22) . +der(22)t(9.+17.XY.22)(q34.+4.t(9.HIPERDIPLOIDEA Ph+ LLA Cercano a diploide : 47-50 Hiperdiploide : 51-60 5% 25% 1-6% Cercano a haploide: 48.22) .q11). LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA L E U L E U C E M E M I A I A M M I E L O I E L O I D I D E E A A G G U U D D A A CITOGENETICA . 17) Foto Fuente: Laboratorio de Citogenética Hospital Nacional de Niños “Dr.Leucemias Agudas: mieloides t(15. Carlos Sáenz Herrera” . Carlos Sáenz Herrera” .Mieloides complejas Foto Fuente: Laboratorio de Citogenética Hospital Nacional de Niños “Dr. Cromosoma Filadelfia Leucemia Mieloide crónica Foto Fuente: Laboratorio de Citogenética Hospital Nacional de Niños “Dr. Carlos Sáenz Herrera” . Mieloides crónicas: Ph+ complejas Foto Fuente: Laboratorio de Citogenética Hospital Nacional de Niños “Dr. Carlos Sáenz Herrera” . Otras alteraciones hematológicas Anemia aplásica Síndromes mielodisplásicos Anemia Fanconi Síndromes mielolinfoproliferativos . Citogenética Molecular Hibridación in situ con fluorescencia FISH . . .FISH El FISH es una tecnología que utiliza sondas de ADN marcadas con fluorescencia para detectar o confirmar anomalías génicas o cromosómicas que generalmente están más allá del poder de resolución de la citogenética de rutina. . •En genética se refieren a este campo como citogenética molecular debido a que cruza la línea de la genética molecular (Sondas de ADN) y la citogenética (cromosomas). •Células en metafase e interfase involucrando desnaturalización del ADN genómico por medio de calor y formamida.•Desarrollado en el año 1986 por Pinkel et al. . Técnica . Procedimiento del FISH Análisis citogenético Sonda a aplicar Preparación de láminas Desnaturalización Sondas Hibridación 4-20 h . Reactivos. marcados con flourocromos • Reactivos de hibridación y lavados (formamida. sondas y equipo • Kits comerciales de sondas con ADN. NP40) HIBRIDIZADOR . de bandas específicas. Microscopio y Software FILTROS: ROJO 535nm VERDE:480 nm AZUL:360 nm BGR: combinación de los 3 . Para deleciones se observan más de 5 metafases Otras observaciones según la complejidad del caso . y en metafases las que se visualicen. Se sacan porcentaje de células positivas y negativas.Interpretación Depende de la sonda en estudio. se cuentan 200 células para análisis de translocaciones. JUDE . FISH EN METAFASE: Sobre metafases.TIPOS de FISH FISH en INTERFASE: Para detectar o descartar alteraciones concretas sin la necesidad de tener un tejido con capacidad de entrar en división (sangre. requiere experiencia en citogenética HNN ST. útil para el diagnóstico preciso de translocaciones. microdeleciones y aneuploidías. médula ósea y tejido parafinado). ÚTIL PARA DETECTAR TRANSLOCACIONES .FISH Multicolor CROSS SPECIES COLOR BANDING: RxFISH ÚTIL PARA DETECTAR INVERSIONES Y TRANSLOCACIONES ENTRE CROMOSOMAS HOMÓLOGOS HOMÓ SKY o mFISH: (cariotipo espectral o multicolor FISH). Utilidad Clínica FISH Sangre periférica: síndromes de microdeleciones. alteraciones sexuales. neoplasias Tumores y tejidos: cáncer . Médulas óseas: Leucemias. FISH en Microdeleciones Síndrome Prader-Willi PraderAngelman Miller-Dieker MillerLocalización Localizació 15q11-13 15q1115q11-13 15q1117p13.23 Xp22.2 . lociD22S609 and D22S942 D22S75(N25) 53%(9) The same as for DiGeorge LIM kinase Elastin gene Steriod sulfatase gene KAL gene WHSCR 165Kb D5S721 97%(10) 85%(11) Unknown (11) Presumably >95% (12) 98% (13) Velocardiofacial (VCFS) Williams X-Linked icthyosis Kallman Wolf-Hirschhorn WolfCri du chat 22q11.2 D22S75(N25) VYSIS:probe contains 85% (9) loci.3 4p16.3 Sonda SNRPN D15S10 LIS-1 LISPorcentaje detección con detecció FISH 70% (8) 70% (8) 33%(8) DiGeorge 22q11.3 Xp22.3 5p15.2 7q11.TUPLE 1. D22S553. XX. +anillos. XYY. con Y (gonadoblastoma) En síndromes .X/46. polisomías HNN HNN HNN XXY Isocromoma Yp XY . XXX. XXY.Identificación de Cromosomas sexuales Mosaicos en Síndrome de Turner:45. ya que es de buen pronóstico. Es muy importante determinar esta alteración.21).FISH Leucemias Leucemia Linfocítica Aguda t(9. por lo cual es muy útil el empleo de la técnica del FISH para el diagnóstico. se observa en el 25 .21) TEL-AML1 11q23 rearreglos MLL La translocación t(12.30% de los niños afectados con leucemia linfocítica aguda (LLA) de tipo B.22) BCR-ABL t(12. . Esta alteración no es detectable por citogenética convencional. Leucemias mieloides cr ónicas Cromosoma Filadelfia t(9.q11.22)(q34.2) . metafase Fusiones en metafase e interfase Fusiones en metafase e interfase Amplificación interfases Amplificación interfases Sarcoma Ewing Rhabdomyosarcoma Cáncer mama Glioblastoma 2q35/13q14 17q11.17 y 9p21 PAX3/FKR HER2/neu EGF-R Cáncer vejiga CEP 3. 7 and 17 and Enumeración interfase LSI 9p21 .FISH Aplicación en Oncología Neoplasma Neuroblastoma Localización Cromosoma 2p42 2p23-24 11q 24/22q12 Sonda MYCN LSI N-myc FLI1/EWS Análisis Interfase.2-q12 7q11. 7.23(?) Centroméros de cromosomas 3. FISH Sarcoma de Ewing HNN . Amplificación N-MYC Neuroblastoma . FISH en Tejidos parafinados tumores sólidos . Permite detectar alteraciones de todo el genoma Bajo costo económico Menos sensible FISH No requiere células en división Permite estudiar material parafinado o congelado Solo aporta información de la sonda que se utiliza Moderado costo económico Alta sensibilidad y especifidad .CITOGENÉTICA CONVENCIONAL vrs FISH CITOGENÉTICA Requiere células en división Requiere tejido fresco. 14) 16.Síndrome Cri Du Chat deleción 5p 5.21) 12.14) 15.inversión cromosoma 16 19.Myc Neuroblastoma .PML.BCR-ABL t(9.ETO – AML1 t(8.21) 14.11q23 rearreglos 17.17q rearreglos 18.Análisis FISH Laboratorio de Citogenética 2007-2009 Hospital Nacional de Niños Sangre periférica 1-Di George (22q11) 2.Región SRY cromosoma Y 9.IGH/ CEP8/ MYC t(8.N.Rara t(15.Síndrome Williams deleción 7q 4.Tel Vysion deleciones cromosoma 1p 3.18) y t(11.Síndrome de Prader Willi dos regiones SNRPN y D15S10 7.Deleción Yq y Xp Leucemias: Médulas óseas 10.Sarcoma Ewing 24.rearreglos cromosoma 5q 22.CEP X/ CEP Y post transplantes MO Tumores 23.t(14.TEL – AML 1 t(12.rearreglos cromosoma 9p21 21.Síndrome Wolf Hirschhorn deleción 4p 6.Centrómero Cromosoma X 8.22) 11.rearreglos cromosoma 7cen/ 7q 20.17) 13. MUCHAS GRACIAS .