Laboratorio de Química orgánicaRESUMEN La cromatografía en papel es la técnica de separación de identificación de sustancias químicas en la cual la fase estacionaria es el agua absorbida que hay en el papel (papel filtro hecho de celulosa) y el soporte en el mismo papel. La fase móvil es una solución que consiste en un disolvente o de una mezcla de varios líquidos que contiene agua. La palabra cromatografía proviene de Kromatos, color y graphos, escrito. El nombre del técnica deriva de los primeros ensayos en los que se separaron pigmentos de plantas como la clorofila, los cuales tiene colores definidos, estos primeros pasos los dio el botánico ruso de origen italiano Mijail Tswett cuando separo diversos pigmentos de las plantas. Genética y biotecnología – Grupo 5 1 La fase estacionaria es el lecho a través del cual va a moverse la fase móvil. en función de su afinidad por dos fases diferentes. La fase móvil.Laboratorio de Química orgánica INTRODUCCION Las técnicas cromatográficas son técnicas de separación. Introducción del papel en la cubeta que contiene el disolvente. en la que irá disuelta la muestra. La fase móvil. puede ser un líquido o un gas en el cual están mezclados las sustancias a separar. y las menos solubles en agua y más solubles en el disolvente llegarán más lejos. Separación en función de la afinidad por las dos fases. Se aplica la muestra sobre el papel en un extremo de éste. que es la que constituye la fase estacionaria. es líquida también y está formada por disolvente cuya naturaleza se elige en función de los componentes que se pretenden separar. Las sustancias separadas se identifican mediante diversos procedimientos físicos o químicos. las más solubles en agua se quedarán cerca del punto donde se aplicó la muestra. En la cromatografía en papel se utiliza una hoja de papel de celulosa de elevada pureza recubierta de un capa de agua asociada a las fibras de celulosa. Éste atraviesa el papel por capilaridad arrastrando los componentes de la mezcla. es decir me permiten separar solutos que están mezclados en un disolvente. Genética y biotecnología – Grupo 5 2 . Se deja actuar el disolvente un tiempo determinado. fluye por él hacia abajo por una combinación de capilaridad y gravedad.3 En ambos casos el disolvente avanza a lo largo del papel pasando por encima de la mancha. una primera división de las variadas clases podría ser: 1. al avanzar disuelve y arrastra las sustancias de la mancha. Esta técnica se conoce como cromatografía monodimencional y el papel resultante recibe el nombre de cromatograma monodimencional.Laboratorio de Química orgánica PARTE TEORICA CROMATOGRAFIA EN PAPEL ¿Qué es la cromatografía en papel? La cromatografía en papel es la técnica de separación e identificación de sustancias químicas mediante un disolvente que se mueve sobre hojas o tiras de papel de filtro. cada una de ellas se mueve. Existen muchos tipos de cromatografía sobre papel. Se toma una pieza de papel de filtro y cerca de uno de sus extremos se deposita una gota de la solución que contiene la mezcla de las sustancias que se quieren separas. La resultante de las fuerzas: Cuando el disolvente avanza sobre las manchas de las sustancias. se seca el papel y se observan las sustancias separadas si tienen color. El extremo del papel mas próximo a la mancha se introduce en un disolvente apropiado.Cromatografía descendente: el disolvente esta en un recipiente esta en un recipiente del que cuelga el papel. 2. pero sin que la mancha llegue a introducirse en él. Las fuerzas propulsoras actúan apartando las Genética y biotecnología – Grupo 5 3 .Cromatografía ascendente: el disolvente se encuentra en el fondo del recipiente que sostiene al papel y va subiendo a través de el por capilaridad. comienzan a actuar dos tipos de fuerzas opuestas: unas que arrastran y otras que retardan. o en caso de no tener color se procede al revelado por una reacción química apropiada. Se deja secar la gota y quedara la mancha de las sustancias mezcladas. por lo general a distinta velocidad que las otras. Genética y biotecnología – Grupo 5 4 .La distancia recorrida por cada sustancia a partir del origen. si el disolvente fuese capaz de disolver instantánea y completamente todas las sustancias. estas avanzarían juntas hasta el final de la trayectoria del disolvente y terminaríamos donde empezamos con todas las sustancias juntas. en un tiempo dado. por ejemplo agua y azúcar. es la resultante de estas dos clases de fuerzas.Laboratorio de Química orgánica sustancias de su punto de origen y desplazándolas en dirección del flujo de origen. así pues. La corriente del disolvente es la misma para todas las sustancias de la mancha. En cambio si la sustancia fuera completamente insoluble en el disolvente en movimiento no se movería del origen. Las fuerzas retardantes tratan de impedir el movimiento de las sustancias. las fuerzas propulsoras más importantes son: el flujo de disolvente y la solubilidad de cada sustancia en le disolvente. llevándolas fuera del disolvente que fluye y hacia atrás en el papel. y no actuaran fuerzas de retardo la sustancia ascenderá desde el origen hasta donde llega el diluyente. Flujo del disolvente: Si la sustancia cromatografíada fuera completa e instantáneamente soluble en el disolvente que avanza. Fuerzas propulsoras: Cuando se realiza un cromatograma en papel. Las sustancias depositadas en el papel. Una de ellas es la corriente del disolvente circulando por el papel de filtro. en una medida considerable. Mientras que se va realizando el cromatograma. Genética y biotecnología – Grupo 5 5 . pueden ser más o menos adsorbidas en el papel. Esto contribuye de nuevo a la separación. Una hoja de papel de filtro aparentemente seca contiene entre un 6 y 12% de agua firmemente adherida a la celulosa. esto significa que unas sustancias son adsorbidas más que otras y. Fuerzas retardantes: Hay también dos fuerzas retardantes principales: la adsorción y el reparto. se llama coeficiente de reparto o razón de distribución. por consiguiente. se repartirá entre ellos. Reparto: La cromatografía se basa. en cromatografía. La cantidad que se encuentre en cada disolvente dependerá de la relativa solubilidad del soluto en cada uno. El grado de reparto. Aquí es donde entra en función el reparto. en la presencia de dos fases liquidas individualizadas. Pocas son las sustancias que ofrecen la misma solubilidad en cualquier disolvente. en efecto. Cuando una sustancia que es soluble en dos disolventes no mezclados es expuesta al mismo tiempo a ambos. mientras que las adsorbidas con menos fuerza avanzan hacia el frente. la liberación de las sustancias de las manchas variará de una sustancia a otra.Laboratorio de Química orgánica Solubilidad: Una fuerza diferencial es. La particular solubilidad de una sustancia en la corriente del disolvente es una fuerza propulsora que tiende a desplazarla. la solubilidad. La adsorción es otra de las fuerzas diferenciales. posee propiedades adsorbentes. manteniéndola en movimiento a lo largo del papel. las sustancias más fuertemente adsorbidas se van quedando atrás. una vez conseguido el equilibrio. Adsorción: La celulosa de la que está hecho el papel de filtro. La otra es la fase acuosa contenida en el mismo papel de filtro. Así un Rf de 50 indicaría que el compuesto avanzo la mitad de la distancia del frente del disolvente. af. El símbolo utilizado para designar esta distancia relativa es Rf y se define mediante: Como el denominador es siempre mayor que el numerador en Rf debería ser un decimal. Por razones de conveniencia se suele expresar como un porcentaje. Química) Afinidad química Emigración iónica Liquido Liquido iónico Genética y biotecnología – Grupo 5 6 . CROMATOGRAFIA EN PAPEL Nombre de la técnica Adsorción en papel De reparto en papel Cambio iónico en papel Electroforesis en papel Fase estacionaria Solido(papel) Liq. Polar adsorbido en papel solido Solido Solido (papel) Fase móvil Liquido polar Liquido no polar Desplazamiento fase móvil Capilaridad (gravedad) Capilaridad (gravedad) Capilaridad (gravedad) Emigración iónica Mecanismo de separación Adsorción Reparto (adsorción. Puede usarse como punto de referencia para expresar las distancias relativas recorridas por las diferentes sustancias en un cromatograma.Laboratorio de Química orgánica Constante Rf: El último punto alcanzado por el disolvente en su avance se denomina frente del disolvente. Retire con una pipeta el líquido sobrenadante y utilícelo para la cromatografía Eluyente: Metanol absoluto Genética y biotecnología – Grupo 5 7 . espinacas) Preparación del extracto de hojas verdes -Se ponen a secar en una estufa las hojas verdes y cuando ya están secas. -Guarde en la oscuridad hasta su uso. -Se pesan 1g de polvo obtenido y se añade 5ml de éter etílico -Agitar hasta que el líquido sobrenadante quede fuertemente coloreado. se trituran en el mortero hasta el polvo fino.Laboratorio de Química orgánica PARTE EXPERIMENTAL CROMATOGRAFÍA DEL PAPEL Materiales -Mortero -Embudo -Tubos de ensayo grandes -Gradilla -Placas petri -2capilares delgados -Papel de whatman Nro1 -Probetas -Corchos -Tijeras -Cinta scotch -Regla -Lápiz Reactivos Metanol Éter etílico MUESTRAS: -Extracto de hojas verdes (ejem. Laboratorio de Química orgánica PROCEDIMIENTO: -Se corta tiras de papel Whatman Nro1 del tamaño preciso para colocarlos dentro de las probetas que servirán como cámaras de separación.5 cm del borde inferior del papel y se marca con un punto en el lugar donde se colocará la mezcla a separar -Se aplica la muestra (extracto de hojas verdes). -Se deja secar y calcular los Rf expresando los resultados con dos cifras decimales y como tanto por ciento Genética y biotecnología – Grupo 5 8 . en el punto de lápiz trazado en el papel filtro. -Se traza una línea con lápiz de 1 a 1. para luego echar otra gota y dejar secar. con un capilar delgado colocando 1 gota y dejar secar. -Luego se introduce en la probeta de tal modo que el nivel del eluyente quede por debajo de la línea de siembra del papel y comprobando que esté completamente libre y no toque las paredes del tubo -Colocar un vaso de precipitación (en caso de no tener un corcho) encima de la probeta para así evitar la evaporación del eluyente -Se deja de correr el cromatograma y al retirar se marca con un lápiz el frente del disolvente. colocando entre 8 y 10 gotas de extracto -Se coloca un volumen apropiado de metanol en la probeta con la ayuda de una pipeta sin mojar las paredes -La tira de papel se sujeta mediante un clip o cinta de schotch a la probeta. Repetir esto. 9cm 7.7cm 7.50 0.64 0.9cm 11.75 Rf(%) 50 64 66 75 Pigmento 1 Pigmento 2 Pigmento3 Pigmento 4 Genética y biotecnología – Grupo 5 9 .53 0.9cm Rf 0.9cm 11.3cm 7.9cm 11.2cm dT 11.1cm 8cm 9.Laboratorio de Química orgánica CALCULOS EXPERIMENTALES Y RESULTADOS Cálculo de Rf: Logramos realizar el experimento dos veces obteniendo así dos cromatogramas : 1era cromatografía Rf = di 6.60 0.67 0.66 0.77 Rf(%) 53 60 Pigmento 1 Pigmento 2 Pigmento 3 Pigmento 4 67 77 2da cromatografía Rf = di 5.9cm 9cm dT 12cm 12cm 12cm 12cm Rf 0. suponemos. Clorofila a 4. por lo que consideramos que la clorofila está en mayor abundancia en la hoja de la planta opacando a los demás pigmentos. carotenos(amarillo claro) y xantofilas(amarillo anaranjado). Caroteno 2. Xantofila El único valor inesperado es la posición del caroteno. Esta observación también se debe de notar al observar la cromatografía. entonces: Pigmento 1: Caroteno Pigmento 2: Clorofila b Pigmento 3: Clorofila a Pigmento 4: Xantofila Sabemos que la distancia recorrida por los solutos depende de la solubilidad de esta en el eluyente. ahora por teoría sabemos que: Los cloroplastos poseen una mezcla de pigmentos de diferentes colores clorofila a(verde intenso). y además como sabemos la posición (velocidad sobre el papel) no solo depende de la solubilidad con el eluyente sino también de su interacción con el papel filtro Genética y biotecnología – Grupo 5 10 . Otras influencias en este resultado son errores humanos. Por lo que damos por sentado que cada color hallado en la cromatografía corresponde a los pigmentos correspondientes. verde claro. esto no fue muy notorio en ninguna de los dos experimentos Esperábamos una mayor separación de los pigmentos (observación de bandas) y una mejor observación de la separación de las clorofilas b y a En la primera y segunda cromatografía observamos 4 colores crema-anaranjado. ya que por teoría esperábamos que su posición estuviese en la parte superior del papel filtro (después de los otros 3 pigmentos). clorofila b(verde) .Laboratorio de Química orgánica DISCUSIÓN DE RESULTADOS A la hora de preparar la muestra observamos una predominancia del color verde. en consecuencia el orden de solubilidad en el eluyente quedaría en orden de menor a mayor de la siguiente manera: 1. ya que deberíamos observar una franja verde de mayor grosor que las demás. Clorofila b 3. es debido al diferente eluyente utilizado en la practica en comparación con el utilizado en la teoría vista y por ende la variación en la interacción con el eluyente (cambio en la velocidad). este cambio de posición . verde oscuro y amarillo. Laboratorio de Química orgánica Otro valor que tenemos es el grosor de las franjas Por teoria sabemos que los parámetros de Rf aceptable se encuentran entre 0. presentará siempre el mismo valor de Rf.2 y 0. Como observamos los valores hallados en los dos experimentos están en ese rango. Sin embargo. Aquí podemos observar el error cometido en la práctica. considerando la prueba satisfactoria. La relación de frente puede ser utilizada como un criterio de identificación negativo: si dos sustancias tienen diferentes Rf. pero no podemos afirmar que dos sustancias que tienen idéntico Rf sean el mismo compuesto. Genética y biotecnología – Grupo 5 11 . Si una determinada sustancia se cromatografía sobre el mismo tipo de adsorbente utilizando el mismo solvente de desarrollo. ya que como vemos los valores de Rf comparando a cada pigmento correspondiente hallado en los experimentos 1 y 2. la relación de frente no constituye un mecanismo de identificación.8 para extractos vegetales. entonces no son el mismo compuesto. no son iguales. ya que muchas sustancias pueden tener la misma relación de frentes. a no ser en las circunstancias específicas mencionadas. la cual puede ser sólida o líquida.Laboratorio de Química orgánica CONCLUSIONES La cromatografía es la técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (líquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria. Podemos concluir también que: A menor Rf la sustancia queda más retenida en la fase estacionaria A mayor Rf la sustancia no esta unida con fuerza a la Fase estacionaria y es arrastrada por la Fase movil Los valores de Rf son constantes y característicos para cada sustancia en un sistema cromatografico determinado y a una temperatura determinada Genética y biotecnología – Grupo 5 12 . Laboratorio de Química orgánica RECOMENDACIONES Es importante que la la muestra colocada en el papel filtro no quede sumergida en el metanol En algunas prácticas de cromatografía es recomendable usar una pequeña cantidad de carbonato cálcico (que evita la degradación de los pigmentos fotosintéticos). Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz: la elección del disolvente y la del papel de filtro. por lo que recomendamos una buena elección de ambas. Genética y biotecnología – Grupo 5 13 . 1CROMATOGRAMA DE PIGMENTOS VEGETALES Genética y biotecnología – Grupo 5 14 . de mayor a menor: carotenos. La solubilidad en alcohol de los pigmentos es.Laboratorio de Química orgánica APENDICE CUESTIONARIO 1. CAROTENO CLOROFILA A XANTÓFILA Fig. xantofila.7. clorofila a. clorofila b. Indicar a qué pigmento corresponde cada banda. ..... que le confiere cierta polaridad..........7...................... permitiendo extraer el pigmento del polvo de las hojas...... ¿Qué pigmentos son los más abundantes? La abundancia de un pigmento en solución se determinara por el grosor de las bandas..... 4....1.............. el orden de abundancia es: Pigmentos Grosor de la banda Xantofila ...1................................... Esto es debido a la presencia de una gran cantidad de enlaces dobles presentes en la estructura química desarrollada del caroteno................ Por encima de las clorofilas aparecen otras bandas ¿Qué significa esto? La presencia de bandas por encima de la banda de clorofila (a o b)....... En este caso según la fig........ Clorofila b . ¿Por qué empleamos éter etílico para extraer la clorofila? Debido a la composición química del éter etílico................................................... un disolvente orgánico..... Genética y biotecnología – Grupo 5 15 ... una cadena hidrocarbonada.. Clorofila a.. establece que hay sustancias más solubles en etanol que la clorofila........................Laboratorio de Química orgánica 2.... por tanto disolverse con mayor facilidad a medida que el etanol asciende.. Según la fig.... que dispersa a la clorofila por la cadena de fitol......... el caroteno es más soluble que la clorofila en el etanol. Este es una sustancia apolar........ Caroteno ...7.. Estructura del éter etílico La cadena de fitol de la clorofila 3..... “Introducción a las prácticas de química orgánica” (Pág.pdf http://www. pag.es/ciencia/joomla/datos/TecLab/guiones/73%20Cromatogr Genética y biotecnología – Grupo 5 16 .” Química orgánica experimental” (Pág. BIBLIOGRAFÍA L. “Química organica” volumen 1. Pearson.Wade.org. 42) http://www.60.G.porquebiotecnologia.elortegui.59.ar/adc/uploads/pdf/29Extraccion_pigmentos_ verdes.com. ed. 61 H. 81) Emil Hardegger.Laboratorio de Química orgánica Caroteno Etanol 5. sétima edición. ¿Cuáles son los residuos que se eliminan en la práctica realizada? El exceso de la disolución de del éter etílico con clorofila El etanol líquido que se encuentra en la probeta al retirar el cronograma Ramitas de las hojas que no se pulverizan. Dupont Durst. Laboratorio de Química orgánica afias%20clorofila.es/~quiored/doc/p23.pdf http://profe-farmacognosia.ar/Labescuela/Exp-9.oaq.ar/educacion/cuaderno/ec_106_act.pdf http://www.htm http://www.blogspot.html http://www.com.com/2009/05/cromatografia-rf-relacion-defrentes.asp?cuad erno=106 Genética y biotecnología – Grupo 5 17 .ugr.porquebiotecnologia.uba.