CAPÍTULO 2.4.3.BRUCELOSIS BOVINA RESUMEN La brucelosis bovina suele estar causada por Brucella abortus, menos frecuentemente por B. melitensis y por B. suis. La infección está muy extendida por el mundo. Algunos países del norte y del centro de Europa, Canadá, Japón, Australia y Nueva Zelanda se consideran libres de su agente etiológico. La enfermedad se caracteriza clínicamente por uno o más de los síntomas siguientes: aborto, retención de placenta, orquitis, epididimitis y, raramente artritis, con excreción de los microorganismos en los exudados uterinos y en la leche. El diagnóstico depende del aislamiento de Brucella a partir de los abortos, de las secreciones de la ubre y de los tejidos analizados postmortem. Se puede realizar un diagnóstico preliminar determinando la respuesta específica mediada por las células o la serológica frente a los antígenos de Brucella. Brucella abortus, B. melitensis y B. suis son muy patógenos para el hombre y por los tanto, todos los tejidos infectados como los cultivos y el material potencialmente contaminado deben manejarse bajo condiciones apropiadas de contención. Identificación del agente: La evidencia preliminar de Brucella la suministra la observación de su morfología, mediante la tinción modificada de los ácido-alcohol resistentes, en los productos del aborto o los exudados vaginales, especialmente si está respaldada por pruebas serológicas. La reacción en cadena de la polimerasa recientemente desarrollada, proporciona medios adicionales de detección. Cuando sea posible, se debe aislar Brucella en medios normales o selectivos cultivando los exudados uterinos, los fetos abortados, las secreciones de las ubres o los tejidos seleccionados, como los ganglios linfáticos y los órganos reproductores masculino y femenino. Las especies y biovariedades deberían identificarse mediante fagolisis y según criterios de cultivo, bioquímicos y serológicos. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede proporcionar un método complementario para la biotipificación basado en secuencias genómicas específicas. Pruebas serológicas y alérgicas cutáneas: Las pruebas con el antígeno tamponado de Brucella, es decir la prueba con rosa de bengala y la prueba de aglutinación tamponada en placa, así como la fijación del complemento, el enzimoinmunoensayo (ELISA) o el ensayo de polarización de la fluorescencia, son pruebas adecuadas para analizar los rebaños y los animales individuales. Sin embargo, ninguna prueba serológica aislada es adecuada para todas y cada una de las situaciones epidemiológicas. Por tanto, la reactividad de las muestras que son positivas en las pruebas de análisis deben confirmarse utilizando una estrategia confirmativa establecida. La prueba de ELISA indirecto o la del anillo de leche, realizadas con muestras de leche completa, son eficaces para analizar y controlar la brucelosis en las vacas lecheras, pero la prueba del anillo de leche es menos fiable en los grandes rebaños. Otra prueba inmunológica es la prueba cutánea de la brucelina, que puede utilizarse en los análisis o como una prueba confirmativa en los rebaños cuando existe una reacción serológica positiva en ausencia de factores de riesgo obvios en los rebaños no vacunados. Se ha demostrado que la prueba interferón gamma, la prueba de precipitación que utiliza como antígeno el hapteno nativo y el ELISA indirecto en el que se utiliza como antígeno el lipopolisacárido rugoso han resultado prometedores para diferenciar entre la brucelosis y la exposición a los microorganismos con reacción cruzada. Se ha demostrado que las pruebas con interferón gamma, las pruebas con precipitina en las que se utiliza antígeno y hapteno nativo y el ELISA indirecto en el que se utiliza un antígeno lipopolisacárido rugoso son prometedores de cara a diferenciar entre la brucelosis y la exposición a los microorganismos con reacción cruzada. 682 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 Capítulo 2.4.3. — Brucelosis bovina Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: La cepa 19 de Brucella abortus continúa siendo la vacuna de referencia con la que se comparan otras vacunas. Debe prepararse a partir de los inóculos de siembra derivados de EE.UU., y cada lote debe cumplir un mínimo de condiciones respecto a la viabilidad, ligereza, virulencia residual y capacidad para inmunizar ratones frente a un desafío con una cepa virulenta de B. abortus o designar las unidades formadoras de colonia (UFC) por dosis. La vacuna con la cepa RB51 de Brucella abortus se obtuvo de una cepa mutante, rugosa, de laboratorio, derivada de la cepa lisa 2308 de B. abortus. Se han completado las pruebas de eficacia de la vacuna con la cepa RB-51 en el ganado vacuno y dicha vacuna ha sido autorizada en los EE.UU. También ha sido considerada como la vacuna oficial para la prevención de la brucelosis bovina en muchos otros países Las preparaciones de brucelina para la prueba intradérmica deben estar libres de lipopolisacárido liso y no deben producir reacciones inflamatorias inespecíficas ni interferir con las pruebas serológicas. Los antígenos para el diagnóstico deben prepararse a partir de cepas lisas de B. abortus, las cepas 1119-3 ó 99, y deben cumplir un estándar mínimo de pureza, sensibilidad y especificidad. A. INTRODUCCIÓN En el ganado vacuno la brucelosis suele estar causada por biovariedades de Brucella abortus. En algunos países, particularmente en el sur de Europa y en el oeste de Asia, donde el ganado se cría junto a ovejas o cabras, la infección también puede ser debida a B. melitensis (41). En ocasiones, B. suis puede causar una infección crónica de las mamas en el ganado vacuno, pero no se ha descrito que origine abortos o se extienda a otros animales (29). Normalmente la enfermedad es asintomática en las hembras no gestantes. Después de la infección por B. abortus o por B. melitensis, las hembras adultas en gestación desarrollan una placentitis que, por lo general, provoca el aborto entre el quinto y el noveno mes de gestación. Incluso en ausencia de aborto se produce una gran excreción de microorganismos a través de la placenta, los líquidos fetales y los exudados vaginales. Las mamas y los ganglios linfáticos regionales también pueden infectarse y los microorganismos pueden aparecer en la leche. Las gestaciones posteriores llegan, por lo general, a término, pero la infección uterina y la mamaria se repiten, con un número reducido de microorganismos en los productos del parto y en la leche. En las infecciones agudas, el microorganismo está presente en la mayoría de los ganglios linfáticos. Los machos adultos pueden desarrollar orquitis, y la brucelosis puede causar la esterilidad en ambos sexos. Una manifestación corriente de la brucelosis en algunos países tropicales son los higromas, por lo general en las articulaciones de las patas, que pueden representar el único indicador de la infección; con frecuencia, el líquido de los higromas está infectado por Brucella. La brucelosis se ha descrito también en el camello de una joroba (Camelus dromedarius) y en el de dos jorobas (C. bactrianus), así como en los siguientes camélidos de Sudamérica: la llama (Lama glama), la alpaca (Lama pacos), el guanaco (Lama guinicoe), y la vicuña (Vicugne vicugne) como consecuencia de contactos con rumiantes infectados con B. abortus o B. melitensis. Además, se ha observado en el búfalo doméstico (Bubalus bubalus), el bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), el yak (Bos grunniens), el alce o wapiti (Cervus elaphus), así como en el búfalo africano (Syncerus caffer) y en varias especies de antílopes africanos. Las manifestaciones de la brucelosis en estos animales son similares a las del ganado vacuno. En el manual de bioseguridad para los laboratorios elaborado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) clasifica a los microorganismos del género Brucella en el Grupo de Riesgo III. La brucelosis se transmite fácilmente al hombre y causa una enfermedad febril aguda – la fiebre ondulante – que puede convertirse en crónica y producir complicaciones graves que afectan a los músculos esqueléticos, al sistema cardiovascular y al sistema nervioso central. En las zonas en las que la enfermedad es endémica deben tomarse medidas para evitar la infección del hombre. A menudo la infección se debe a una exposición profesional y se adquiere por vía oral, respiratoria o conjuntival, pero el riesgo mayor para la población general es la ingestión de productos lácteos contaminados en las zonas en las que la enfermedad es endémica. Los veterinarios y los granjeros que manejan animales infectados, fetos abortados o placentas, están expuestos a ese riesgo laboral. La brucelosis es una de las enfermedades de más fácil adquisición en el laboratorio, y se deben observar precauciones de seguridad muy estrictas cuando se manejen cultivos y muestras infectadas, como lo son los productos del aborto. Existen recomendaciones específicas que han de seguirse con el material infectado por Brucella (para más detalles véanse las referencias 2, 42, 95 y el capítulo 1.1.2. Bioprotección y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología y en las instalaciones de los animales). La manipulación de los cultivos vivos o del material animal contaminado en el laboratorio es peligrosa y debe realizarse en un nivel de contención 3 o superior, como se indica en el capítulo 1.1.2, para reducir la exposición ocupacional. Es esencial que se utilice un nivel de contención 3 en los lugares en los que se realicen cultivos de Brucella a gran escala (p.ej. para la producción de antígeno o de vacunas). La evidencia genética e inmunológica indica que todos los miembros del género Brucella están estrechamente relacionados. Sin embargo, teniendo en cuenta que existen diferencias relevantes entre las principales variantes Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 683 Capítulo 2.4.3. — Brucelosis bovina en cuanto a la preferencia por el hospedador y a la epidemiología, así como evidencias moleculares de variaciones genómicas, el Comité Internacional de Sistemática de Procariotas, Subcomité de Taxonomía de Brucella, adoptó en 2005 una decisión firme sobre la vuelta a las posiciones anteriores a 1986 en lo relativo a la taxonomía de Brucella; como consecuencia de ese posicionamiento se volvieron a aprobar las seis especies tipo de Brucella con sus biovariedades reconocidas. Los nombres clásicos validados de las seis especies tipo de Brucella están publicados en las Listas Autorizadas de Nombres de Bacterias de 1980, y las cepas típicas designadas aparecen asociadas a esos nombres válidos publicados: B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B. canis (http://www.the-icsp.org/subcoms/Brucella.htm). Las tres primeras se subdividen en biovariedades por sus características de cultivo y las serológicas (véanse los cuadros 1 y 2). En la última década se han aislado cepas de Brucella de mamíferos marinos que no pueden adscribirse a ninguna de las anteriores especies reconocidas (18, 31). Hay investigaciones en curso para establecer su posición correcta en la taxonomía del género y se ha propuesto que podrían clasificarse en dos nuevas especies, B. ceti y B. pinnipedialis (18, 31, 40). Por último, Brucella muestra una estrecha relación genética con patógenos y simbiontes de plantas de los géneros Agrobacterium y Rhizobium, así como con patógenos animales (Bartonella) y con bacterias oportunistas o del suelo (Ochrobactrum). Cuadro 1. Caracteres diferenciales de especies del género Brucella Lisis por fagosa Tb Morfología colonialb Wb Iz1 R/C Especies Actividad ureasa Requiere suero 104RTD Oxidasa RTDc RTD RTD RTD Hospedador preferido B. abortus S –d + + + + – +e +f Vacas y otros bóvidos Biovariedad 1: cerdo Biovariedad 2: cerdo, liebre B. suis S – – + +g +g – + +h Biovariedad 3: cerdo Biovariedad 4: reno Biovariedad 5: roedores salvajes B. melitensis B. neotomae B. ovis B. canis S S R R – – + – – –k – – – + – – –i + – – + + – – – – + + + – – + +j +h – +h Ovejas y cabras Rata lanuda del desiertol Carneros Perros Tomado de las refs. 2 y 42. a b c d e f g h i j k l Fagos: Tbilisi (Tb), Weybridge (Wb), Izatnagar1(Iz1) y R/C Fase normal de presentación : S: lisa, R: rugosa RTD: dilución rutinaria de prueba Brucella abortus biovariedad 2 requiere generalmente suero para crecer en aislamiento primario Algunos aislamientos africanos de B. abortus biovariedad 3 son negativos Velocidad intermedia, excepto la cepa 544 y algunas cepas de campo que son negativas Algunos aislamientos de B. suis biovariedad 2 no son, o solo parcialmente, lisadas por el fago Wb o Iz1 Velocidad rápida Algunos aislamientos se lisan por el fago Wb Velocidad lenta, excepto algunas cepas que son rápidas Placas o calvas pequeñas Neotoma lepida 684 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 ovis B. pero en situaciones en las que no es posible el análisis bacteriológico.4.3. neotomae B. El diagnóstico inequívoco de las infecciones por Brucella solo puede hacerse mediante el aislamiento y la identificación de Brucella. — Brucelosis bovina Cuadro 2. melitensis 2 3 1 2 3 B. aunque el historial del rebaño puede servir de ayuda.Capítulo 2. a b c d e f g Concentración del colorante en medio de dextrosa con suero: 20 µg/ml Normalmente positivo en aislamiento primario Se han aislado algunas cepas sensibles a la fucsina básica Algunas cepas se inhiben con colorantes Se han aislado algunas cepas resistentes a la fucsina básica Negativo en la mayoría de las cepas Crecimiento a una concentración de 10 µg/ml de tionina B. suis 3 4 5 B. el diagnóstico Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 685 . El cuadro clínico no es patognomónico. 2 y 42. abortus 4 5 6 9 1 2 B. canis – – – – – – +b +b +b +b – – +o– – – – – – – + – – – – + + + + – – + + – – – – + – – + + + – – + – + + + + + + + + + + + – + +c + + + –e – + –f – – + + + + + – – + – + + + + – + – – + – + – – – + + – + – – – + + – – – – – – – – – – – – – – – – – – – + + –g + + – –f –f Tomado de las refs. Caracteres diferenciales de los biovariedades de especies de Brucella Producción de H2S Requiere CO2 Crecimiento con colorantesa Aglutinación con sueros monospecíficos Fucsina básica Tionina Especies Biotipo A M R 1 B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO Todos los abortos del ganado vacuno deben considerarse como casos sospechosos de brucelosis y deberían investigarse. y de otros líquidos del cuerpo. se recomienda un medio bifásico no selectivo conocido como medio de Castañeda. bacteriológicos y/o moleculares. Para demostrar el agente en diversas muestras biológicas. deben confirmarse por cultivo. En la interpretación de los resultados positivos por el método de Stamp también debe tenerse en cuenta que otros microorganismos que causan aborto son difíciles de diferenciar de Brucella. Normalmente se necesita una combinación de las características de crecimiento y métodos serológicos. el ácido nalidíxico y la bacitracina pueden tener efectos inhibidores sobre algunas cepas de B. la sensibilidad del aislamiento de B. La morfología de los microorganismos del género Brucella es bastante constante aunque en cultivos viejos se observan formas pleomórficas. estos métodos presentan una baja sensibilidad en la leche y en productos lácteos donde los microorganismos del género Brucella se presentan a menudo en escaso número. El medio SDA es normalmente el de elección para la observación de la morfología colonial. Se ha comercializado un suplemento de antibióticos liofilizado (Oxoid).3. abortus. Milán.000 unidades = 25 mg). No existe una prueba única que permita la identificación de Brucella. se pueden utilizar métodos basados en sondas de ADN o en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (11). Normalmente aparecen aislados. tanto positivos como negativos. Es necesario añadir 2–5% de suero bovino o equino para el crecimiento de algunas cepas como la biovariedad 2 de B. Italia) suplementado con hemoglobina (10 g/litro.5– 0.000 unidades = 5 mg).4. y muchos laboratorios lo añaden sistemáticamente al medio basal con resultados excelentes. 1.000 Unidades Internacionales [UI]/litro = 17. b) Cultivo i) Medio basal El aislamiento y cultivo directo de Brucella se realiza normalmente en un medio sólido. Por ello. natamicina (50 mg). 21. que se prepara añadiendo seis antibióticos a un medio base.7 mg) y anfotericina B (2.5 mg/litro). Este método constituye el procedimiento normal para el examen de frotis de órganos o de líquidos biológicos. y donde la presencia de glóbulos de grasa impide frecuentemente una interpretación correcta.6–1. a las concentraciones utilizadas en el medio de Farrell.Capítulo 2. melitensis (50). ácido nalidíxico (5 mg). En esencia. vancomicina (20 mg). melitensis aumenta cuando se utilizan tanto el medio de Farrell como el medio de Thayer–Martin. que se fijan previamente con calor o con etanol. ii) Medios selectivos Todos los medios base indicados anteriormente se pueden utilizar para la preparación de medios selectivos.7 µm de ancho. nistatina (100. La presencia de microoorganismos intracelulares con morfología de Brucella. este representa el método más satisfactorio porque permite el desarrollo de colonias aisladas fácilmente reconocibles. 42) Métodos de tinción El género Brucella está formado por cocobacilos o bacilos cortos que miden 0. a) Identificación del agente (2. Se añaden los antibióticos apropiados para evitar el crecimiento de organismos distintos a Brucella. Se dispone de un amplio rango de medios basales comercializados en forma deshidratada. Para el aislamiento de Brucella de la sangre o de la leche. Sin embargo. nistatina (100. bacitracina (25. como en el caso del agar sangre (Oxoid) o agar Columbia (BioMérieux). agar triptosa o (tripticasa)-soja (TSA). el empleo de los medios líquidos puede recomendarse para muestras voluminosas o con fines de enriquecimiento. También puede utilizarse una técnica basada en anticuerpos conjugados a un fluorocromo o marcados con peroxidasa (77).000 unidades). y con menos frecuencia en pares o en grupos pequeños. Este medio se emplea porque las brucelas tienden a disociarse en medio líquido y esto interfiere con la tipificación llevada a cabo mediante las técnicas bacteriológicas convencionales. por ejemplo el medio base para Brucella. ni fimbrias o cápsulas verdaderas. Se añaden las siguientes cantidades por 1 litro de medio: sulfato de polimixina B (5. y por este método los microorganismos se tiñen de rojo frente a un fondo azul. o inmunoespecíficamente teñidos. 20. nitrofurantoína (10 mg/litro).5 µm de largo por 0. como Chlamydophila abortus (antes Chlamydia psittaci) o Coxiella burnetii. No son verdaderamente bacterias ácido-alcohol resistentes. Difco) y metanosulfonato de colistina (7.5 mg/litro) (todos 686 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . Sin embargo. vancomicina (3 mg/litro). es una evidencia preliminar de la brucelosis. Se pueden utilizar otros medios satisfactorios como el agar suero-dextrosa (SDA) o el agar glicerol-dextrosa (2). Los microorganismos del género Brucella son Gram negativos y no suelen mostrar tinción bipolar. pero resisten a la decoloración por ácidos débiles y se tiñen de rojo por la modificación de Stamp del método de Ziehl– Neelsen. Sin embargo. Los resultados. donde se aconseja un cultivo de enriquecimiento. Los medios sólidos también limitan el establecimiento de los mutantes no lisos y el desarrollo excesivo de contaminantes. el medio modificado de Thayer–Martin se puede preparar con medio base GC (38 g/litro. abortus y B. — Brucelosis bovina puede basarse en los métodos serológicos. El medio selectivo más difundido es el de Farrell (30). No es una bacteria móvil. En general. Biolife Laboratories. débilmente resistentes a ácidos. No forma esporas ni flagelos. cortado en pequeños trozos y se maceran con un “Stomacher” o en un homogenizador de tejidos con una pequeña cantidad de solución salina estéril tamponada con fostato (PBS). En medios sólidos adecuados. y se extienden sobre los medios sólidos la capa cremosa y el precipitado por separado o Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 687 . Tejidos: Las muestras se toman asépticamente con instrumentos estériles. especialmente con subcultivos. abortus. Las muestras más adecuadas incluyen fetos abortados (contenido estomacal. como la biovariedad 2 de B. como la cepa 19 o la RB51 para el control de la calidad del medio. La aglutinación positiva con un antisuero anti-Brucella es una identificación preliminar de que el aislamiento corresponde a Brucella. antes de inocularlas en medios sólidos. y es menos arriesgado para el personal que el material del aborto. ácido nalidíxico (5 mg).. abortus. En el caso de colonias rugosas. Para el aislamiento de Brucella de la leche se recomienda a veces un medio selectivo bifásico que se compone del medio base de Castañeda al que se añaden los siguientes antibióticos en la fase líquida (las cantidades que se indican son por litro de medio): sulfato de polimixina B (6000 unidades = 6 mh). El enriquecimiento se puede realizar en medio líquido con suero-dextrosa. St Louis. El medio de enriquecimiento debe incubarse a 37°C en atmósfera aerobia con 5–10% (v/v) de CO2 hasta 6 semanas. abortus en fase lisa. bazo y pulmones).000 g durante 30 minutos en tubos cerrados (para evitar el riesgo de formación de aerosoles que contagien al personal). presentan una superficie mate más granular y el color varía de blanco mate a marrón con luz reflejada o trasmitida. semen y líquidos de las artritis o de los higromas. natamicina (50 mg). La identificación posterior completa se realiza mejor en un laboratorio de referencia.000 unidades = 25 mg). Como el número de microorganismos de Brucella en la leche. con bordes lisos.4. exudados vaginales (frotis). La leche se centrifuga a 6. EE. las colonias deben comprobarse con antisuero contra el antígeno R de Brucella. en el calostro y en algunas muestras tisulares. A diferencia de otras biovariedades de B. En el caso de la leche. la elección de las muestras depende en general de los síntomas clínicos observados. Se ha de tener cuidado para evitar el contacto entre la leche y las manos del ordeñador. Las colonias son entonces mucho menos transparentes. iii) Toma y cultivo de muestras Para el diagnóstico de la brucelosis animal mediante cultivo. UU) (50). los cambios de morfología de las colonias se asocian con cambios en la virulencia. Los primeros chorros se desechan y la muestra se recoge directamente en un recipiente estéril. y aparecen formas rugosas (R). melitensis no es dependiente de la presencia de una atmósfera con 5– 10% de CO2 (Cuadro 2). Dado que este organismo es un agente selecto en EE. el crecimiento de B. las colonias de Brucella son visibles después de 2–3 días de incubación. Por lo general. mamarios y genitales. y se deben tomar 10–20 ml de cada cuarterón. Posteriormente las colonias se hacen más grandes y ligeramente más oscuras.000 g durante 15 minutos o a 2. pero no se deben desechar los cultivos como negativos hasta después de 8–10 días. A los 4 días las colonias son redondas. con subcultivos semanales a un medio sólido selectivo. Si se prefiere. se recomienda un enriquecimiento.UU. — Brucelosis bovina los productos de Sigma Chemical. de 1–2 mm de diámetro. y el bazo). leche. y las ubres.000–7. los laboratorios que no tienen permiso para tener agentes selectos pueden sustituirlos por una cepa no regulada. sabiendo que estas cepas están adaptadas para el laboratorio y crecen en medios que inhiben las cepas de Brucella más difíciles de cultivar. los resultados también mejoran por centrifugación y cultivo de la capa cremosa y del precipitado. Descargas vaginales: Una fuente excelente para recoger Brucella es un frotis vaginal tomado después del aborto o del parto. con caldo de triptosa o caldo de (tripticasa)-soja (TSA) o con caldo para Brucella suplementado con una mezcla de antibióticos que lleve al menos anfotericina B (1 µg/ml) y vancomicina (20 µg/ml) (concentraciones finales). se puede utilizar un sistema bifásico con un medio selectivo líquido y sólido en la misma botella (técnica de Castañeda) para reducir el subcultivo.Capítulo 2. Es esencial que las muestras contengan leche de todas sus fracciones. El frotis se siembra directamente medios sólidos. D-cicloserina (100 mg). Los cultivos en fase lisa de Brucella (S) presentan tendencia a sufrir variaciones durante el crecimiento. bacitracina (25. Son translúcidas y de color miel pálido a la luz del día en medio transparente. en las propiedades serológicas y/o en la sensibilidad a los fagos. La comprobación de esta transición se realiza fácilmente por tinción con cristal violeta: las colonias rugosas aparecen rojas y las lisas de color amarillo pálido. anfotericina B (1 mg). a partir de inóculos pequeños.3. o preferiblemente con antisueros monoespecíficos contra los antígenos de superficie A y M. Las muestras de tejido se preparan retirando el material irrelevante (por ejemplo la grasa). Todos los medios de cultivo deben someterse a controles de calidad y deben permitir el crecimiento de cepas difíciles de cultivar. Los tejidos preferidos para cultivo de las canales animales son los del sistema retículo-endotelial (ganglios linfáticos de la cabeza. Si las colonias son lisas deben comprobarse con un antisuero anti-B. El crecimiento aparece generalmente después de 3–4 días. Vistas desde arriba son convexas y de color blanco perla. Leche: Las muestras de leche deben recogerse con limpieza después de lavar y secar toda la ubre y desinfectar los pezones. el útero inmediatamente antes o después del parto. vancomicina (20 mg). es probablemente menor que en material de abortos. membranas fetales. i) Brucella está considerada entre las bacterias más peligrosas con las que se trabaja.Capítulo 2. su distribución por las diferentes partes del producto varía en función de las condiciones físico-químicas locales relacionadas con la tecnología específica del proceso. como el requerimiento de CO2 para crecer. y a continuación se cultivan los bazos. en el medio de transporte de Ames) pero esto puede dar lugar a la aparición de mutantes rugosas. La identificación de los microorganismos se puede realizar mediante una combinación de las siguientes pruebas: morfología celular y tinción de Gram o de Stamp.1. aunque a veces constituyen el único medio para detectar la presencia de Brucella. Como en las fases no lisas se alteran las propiedades serológicas. c) Identificación y tipificación Cualquier colonia con una morfología similar a la de Brucella debe analizarse por la tinción de Gram (o por la coloración de Stamp). Para transportar cultivos de Brucella. Derivados lácteos: Los productos lácteos. Los métodos recomendados para observar la morfología de las colonias son el método de Henry mediante luz reflejada oblicua. por el riesgo a las infecciones adquiridas en el laboratorio. la prueba de la acriflavina descrita por Braun & Bonestell. Si las brucelas están presentes en la leche completa. sobre todo cuando las muestras están muy contaminadas o contienen un número bajo de microorganismos del género Brucella. Izatnagar (Iz) y RC. con preferencia. probablemente se necesitará un permiso de importación que debe obtenerse antes de despachar la ii) 688 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . la producción de H2S (detectada mediante papeles con acetato de plomo) y el crecimiento en presencia de fucsina básica y tionina a concentraciones finales de 20 µg/ml. Como es probable que estos materiales contengan un número pequeño de microorganismos. pruebas de ureasa. se detectan mediante pruebas rutinarias que pueden realizarse en laboratorios no especializados moderadamente equipados (véanse los cuadros 1 y 2). Como los cultivos de Brucella son infecciosos. No obstante. propiedades de crecimiento.4.1. Si las muestras traspasan fronteras nacionales. A su llegada. el Tbilissi (Tb).3. Cuando se envían cepas de Brucella a un laboratorio de referencia para su tipificación. Se necesita que las muestras estén homogenizadas cuidadosamente antes del cultivo. intravenosa en ratones. Estas regulaciones se resumen en el capítulo 1. Deben cultivarse las capas superficiales (corteza y región adyacente) y el interior del producto. es decir. todas las muestras deben enfriarse rápidamente y transportarse al laboratorio lo antes posible. después de haberlas sometido a un triturador de tejidos. su número suele ser muy bajo y es improbable el aislamiento a partir de tales muestras. se somete una muestra de suero a pruebas específicas a las 3 y 6 semanas de la inoculación. crecen y desaparecen rápidamente. Antes de enviar cultivos o muestras de diagnóstico para cultivo. la morfología colonial resulta esencial para las pruebas de tipificación que se describen más abajo. en el caso de los cobayas. El empleo de animales de laboratorio debe evitarse a menos que sean absolutamente necesarios. es esencial seleccionar las cepas lisas.1. tintoriales y de sensibilidad a los fagos. se recomiendan cultivos de enriquecimiento. También existen restricciones para enviar muestras sospechosas de brucelosis y se deben tener en cuenta las regulaciones de la IATA antes de su envío (39). se debe de contactar con el laboratorio receptor para determinar si se necesita algún permiso especial y si el laboratorio tiene la capacidad de realizar las pruebas solicitadas. sellarse en bolsas de polietileno y empaquetarse en un contenedor rígido de acuerdo con las exigencias de la Asociación para el Transporte Aéreo (IATA) para el envío de muestras peligrosas (39). algunas propiedades. La utilización simultánea de varios fagos. Los bazos de los ratones se cultivan durante 7 días después de la inoculación y. la leche y las muestras de tejidos deben congelarse si no se cultivan de inmediato. Los cultivos se liofilizan y se cierran en ampollas dentro de tubos con tampón de rosca o se subcultivan en agar inclinado contenido en tubos con tapón de rosca. deben cultivarse en los medios descritos arriba. Deben envolverse con papel adsorbente o con algodón. anti-M ó anti-R). Como las brucelas viven. representa un sistema de tipificación fágica que. Después de la toma. También deben seguirse otras directrices nacionales e internacionales (96). Recogida y envío de muestras de diagnóstico. cuya realización se lleva a cabo en laboratorios de referencia con experiencia en estos métodos. y la prueba de la aglutinación en porta con un suero policlonal anti-Brucella.2. La inoculación animal puede ser subcutánea o a través de la piel afeitada de cobayas o. a un “Stomacher” o a una batidora eléctrica con un volumen adecuado de PBS estéril. Weybridge (Wb). Este trabajo debe realizarse en condiciones de bioseguridad como se indica en el Capítulo 1. como los quesos. o el método de White & Wilson de tinción de colonias con cristal violeta (2). con suficiente experiencia. se designan UN2814 y se debe realizar una Declaración de Muestras Peligrosas. las tapas de los recipientes deben estar bien cerradas y selladas con tapones de PVC. oxidasa y catalasa. La identificación de especies y de biovariedades requiere pruebas más elaboradas (como la lisis por fagos y la aglutinación con sueros monoespecíficos anti-A. permite identificar las especies lisas y las rugosas de Brucella. — Brucelosis bovina conjuntamente. También deben enviarse cepas suspendidas en medio líquido (por ejemplo. 3.90 µg/µl 1.55 µg/µl • Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 689 . 69). en concreto las vacunales S10 y RB51. La prueba. 26. del Código sanitario para los animales terrestres). 5 µl de suspensión en 45 µl de agua). pero la PCR solo ha tenido una validación limitada para el diagnóstico primario. y 5 de B. melitensis. B. Se mezcla con suavidad pero a fondo. ovis. Sin embargo.30 µg/µl 1. hasta cierto punto. B. denominada PCR AMOS. se han introducido modificaciones en la prueba denominadas PCR BaSS para mejorar su rendimiento. el análisis del polimorfismo de fragmentos de restricción (RFLP) y la hibridación tipo Southern (para una revisión. Un método simple y eficaz consiste en seleccionar una sola colonia y. neotomae.ej. la diferenciación entre especies y algunos de sus biovariedades. La PCR BaSS permite la diferenciación de cepas adicionales. Preparación bacteriana Cualquier método aceptado de purificación de ADN sería adecuado. 6 y 9 de B. el material diluido debe descartarse de forma adecuada. transferir las bacterias a 100 µl de agua grado-PCR. se basaba en el polimorfismo resultante de la localización. B. pero no podían diferencias las biovariedades 3. abortus. Se ajusta la concentración bacteriana a una densidad de entre 1. abortus. — Brucelosis bovina muestra (capítulo 5. suis (solo la biovariedad 1. y B. Inmediatamente antes de su utilización.Capítulo 2. La PCR AMOS diferencia B.3. suis. Mediante el empleo de la PCR puede biotipificarse Brucella y pueden diferenciarse las cepas vacunales.60 µg/µl 1. 5. utilizando un asa de siembra estéril. B. “Transporte internacional y contención de agentes patógenos de los animales en los laboratorios”. abortus (69).8. como la PCR. y la única diferencia es la relativa a los cebadores de la mezcla base. de la secuencia de inserción IS711 en el cromosoma de Brucella e incluía cinco cebadores oligonucleótidos que podían identificar y diferenciar las biovariedades 1. (14.55 µg/µl 1. abortus.40 µg/µl 1. ver las referencias 11 y 53). B. aunque el resto de las biovariedades serán detectadas por los cebadores eri) hasta el nivel de especie. abortus. 14. pinnipedialis) no pueden detectarse mediante las pruebas PCR AMOS o PCR BaSS. 5. Los procedimientos de las dos pruebas son idénticos. específica de especie. canis. ceti y B. Se ha publicado recientemente que estos procedimientos de la PCR se han sometido a modificaciones adicionales para poder identificar también las serovariedades 3. y se incorporaron más cebadores específicos de cepa para la identificación de las cepas vacunales S19 y RB51 de B. otras especies y biovariedades (tales como las biovariedades 3. Una vez utilizado. las biovariedades 2. 16. Pese al alto grado de homología del ADN dentro del género Brucella. se han desarrollado varios métodos que permiten. 27). La primera prueba PCR múltiple específica de especie para la diferenciación de Brucella fue descrita por Bricker & Halling (15). La PCR AMOS y la PCR BaSS son pruebas PCR múltiple en un solo tubo. 5. d) Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos La PCR desarrollada recientemente supone un método adicional de detección e identificación de especies de Brucella (11. 16.35 µg/µl 1. 2 y 4 de B. Se debe hervir la suspensión bacteriana durante un mínimo de 5 minutos para matar las bacterias y facilitar la lisis de la mayor parte de las mismas como molde para la reacción. Secuencias de cebadores para PCR y concentraciones stock Cebador Específico para IS711 Específico para Abortus Directo universal para 16S Inverso universal para 16S Directo eri Inverso eri RB51-3 Secuencia de nucleótidos 5’ a 3’ TGC-CGA-TCA-CTT-AAG-GGC-CTT-CAT-TGC-CAG GAC-GAA-CGG-AAT-TTT-TCC-AAT-CCC GTG-CCA-GCA-GCC-GCC-GTA-ATA-C TGG-TGT-GAC-GGG-CGG-TGT-GTA-CAA-G GCG-CCG-CGA-AGA-ACT-TAT-CAA CGC-CAT-GTT-AGC-GGC-GGT-GA GCC-AAC-CAA-CCC-AAA-TGC-TCA-CAA Concentración de 100× stock 1. se vuelve a mezclar la suspensión de cultivo y se diluye en alícuota de 1/10 en agua grado-PCR (p. • • i) Se ofrece el ejemplo de la PCR BaSS como muestra de un procedimiento molecular (véanse las instrucciones detalladas en las referencias 16 y 27).4. 4. 6 y 9 de B.5 y 2 unidades de absorbancia a 600 nm con solución salina. 51). Con el tiempo. Se ha desarrollado también una electroforesis en campo pulsante que permite la diferenciación entre varias especies de Brucella (40. 6 y 9 de ese microorganismo. 5 µl 2. pueden guardarse indefinidamente las muestras sin abrir a 4°C hasta el momento de la detección.5 µl 2. Se amplifican los productos PCR utilizando los siguientes parámetros: 95°C 5. Se prepara el primer cóctel colocando los siguiente concentrados × 100 en un tubo de microcentrífuga de 1. Antes de su utilización.5 µl de la muestra desconocida o del control a cada tubo de ensayo. se descongela una cantidad suficiente de tubos con la mezcla base para los desconocidos y los controles.0 y 2.5× TBE) con un número adecuado de pocillos.0 minutos 1 ciclo vi) • i) iii) 95°C 15 segundos 52°C 30 segundos 72°C 90 segundos 4°C indefinidamente 40 ciclos La determinación del tiempo de puesta en marcha no parece ser importante iii) Después de la amplificación. Se hacen alícuotas de la mezcla base de 25 µl en tubos PCR con una pared de 0.5 ml: 233 µl 2. Si no se usa un potenciador.5 µl 2. Se guardan los tubos de ensayo a –20°C ±2°C.5 µl 2. El 100× stock permanece estable a 4°C durante al menos dos años siempre que se tome la precaución de no contaminar la solución.Capítulo 2. TAQ ADN polimerasa FastStart™ ii) iii) Se prepara la mezcla base colocando en un tubo desechable de 3 o 5 ml los siguientes ingredientes: 1130 µl 250 µl 150 µl 200 µl 250 µl 500 µl 20 µl iv) v) Se mezcla completamente y con suavidad la solución pipeteando arriba y abajo.5 µl 2. y se mezcla a fondo pero con suavidad golpeando ligeramente con el dedo. Amplificación de productos mediante la PCR Se añade entre 1.2 µl (o alternativamente una placa de 96 pocillos certificada para PCR). puesto que Brucella tiende a depositarse rápidamente.4. Se combina 1 µl de 6× tinción de carga con 8 µl de muestra amplificada y se mezcla bien antes de cargarlo en el pocillo de gel.5 µl 2. — Brucelosis bovina • • i) Amplificación mediante la PCR Preparación de la mezcla base (100 pruebas) Deben disolverse los oligonucleótidos sintéticos en tampón TE a una concentración de 100× (véase el cuadro anterior). de 5 mm de espesor (en 0. Debe rmezclarse por completo cada muestra inmediatamente antes de retirar la alícuota. abortus cebador directo universal para 16S (control opcional para los inhibidores) cebador inverso universal para 16SR (control opcional para los inhibidores) cebador directo para eri cebador inverso para eri cebador para RB51 agua grado-PCR 10× tampón de reacción sin MgCl2 (véase la Nota 6) 25 mM MgCl2 10 mM mezcla dNTP cóctel de cebadores del paso 2 GC potenciador.5 µl agua grado-PCR cebador específico para IS711 cebador específico para B.3. • i) ii) 690 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . Detección de los productos amplificados Se prepara un gel de agarosa al 2%. debe sustituirse por 500 µl de agua gradoPCR. repetir ede ario m al uir es la pr rueba con una nueva mues o simplem a stra mente repetir la prueba con la muestra orig a ginal.4. 0 Como altern nativa. e Leye endas de la Fig gura Figu A. Solo la cepa vacunal RB51 de B.5 hora para maxim as mizar la resolu ución sin que haya una difu usión significat tiva de las bandas. a ril ril Manual de la OIE s l sobre animales terrestre 2008 es 691 . Ni otras espec 00 B N cies de Brucel ni otras lla amp bact terias amplific carán este pro oducto. la secu uencia del 16 de 800 pb Si esta ban 6S b. — Brucelosis bovina iii) Se hace cor rrer el gel en 0. PR n RECAUCIÓN: el bromuro de etidio es e mutagénico y un carcinóg geno potenciall. loci (fila amplificado predichos p ura as) os para varias cate egorías de desconocidos (co olumnas). Pue ser necesa diluir la muestra origina para disminu los niveles de inhibidore en la reacción. o Se tiñe el g durante 45 minutos en solución de bromuro de etidio (250 μg gel 5 e g/500 ml de 0. Carr 3: RB51 gel . Patrone típicos amplificados a pa rtir de aislami ura es ientos bacteria anos en bovin detectados mediante nos s elec ctroforesis en g de agarosa. To el odas las espe ecies y cepas de Brucella. deberían a amplificar al menos un m prod ducto. pero puede que se necesiten a o s ajustes para otro equipo. e excepto la cep vacunal pa S19 de B. En la secc ción B de la fig gura siguiente se muestran algunos resultados. T Todas las mu uestras. Carril 1: cepa natural de B. abortus amp a B plificará un pr roducto de 300 pb a partir de locus wboA del IS711. nda no está presente. B: los productos pr s redichos deriv vados de la amp plificación efic (fs se refier a la cepa na tural de B. .5× TBE).Capítulo 2. Par el equipo a s ra aquí descrito. es p p posible que la muestra a cont tenga inhibido ores de la PC el ADN no se degradó. utilizamos 80–85 V dur rante 2. e artir sí erias. puede teñirse el ge antes de la electrofores o durante la misma mediante la el a sis adición de b bromuro de eti idio al tampón que se está corriendo. incl luidas las cep pas vacunales también plificarán un producto de 50 pb a partir del locus alkB del IS711. y 4).5× TBE hast que el marc 0 ta cador azul de bromofenol es al menos a 5 cm del sté pocillo para conseguir un buena sepa na aración de las bandas.3. Carr 2: s19 de B . abortus. A: Se muestran e los c cuatro loci para cada catego con sus c oría cebadores hibr ridantes. o pensó la mues stra en la mez zcla base. exce epto los contro oles negativos. abo caz re ortus). abortus amplificará el producto de 180 pb a pa del gen ervA. pero no as otras bacte 9 s. abortus. Interpretació de los datos ón iv) • dentificación s basa en el número y los tamaños de los productos amplificados por la PCR (v se l véanse las La id figur ras A & B). Figu B. abortus (biov variedades 1. o no se disp CR. Todos los aislam mientos de B. 2. pero crece en presencia de de estreptomicina a 2. Esto no impide el uso de pruebas modificadas o similares o la utilización de reactivos diferentes. Rev. 89. La incapacidad para producir OPS se puede demostrar haciendo reaccionar colonias de RB51 con anticuerpos monoclonales (MAb) específicos contra OPS. En algunos casos la cepa 19 crecerá en presencia de i-eritritol pero sin usarlo. los métodos y reactivos descritos en este capítulo suponen un estándar de comparación respecto a la realización esperada del diagnóstico. ni crece en presencia de bencilpenicilina (3 µg/ml = 5 UI/ml). presentando limitaciones en el diagnóstico de animales individuales (36. 2a y 2b PCR/RFLP para B. Pruebas serológicas Ninguna prueba serológica aislada es adecuada en cualquiera de las situaciones epidemiológicas. La prueba de la fijación del complemento (FC) es más específica que la SAT para el diagnóstico y además posee un sistema estandarizado de unidades. Se deben considerar todos los factores que influyen en la relevancia del método de prueba y de sus resultados para una aplicación o interpretación diagnóstica específica. se tiñó con bromuro de etidio. melitensis cepa Rev.Capítulo 2. La cepa RB51 de B. la prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de aglutinación tamponada en placa (BPAT). 24). y se visualizó con luz UV. la serología será negativa (81). 91).1 y RB51 se pueden identificar utilizando las PCR específicas (16. crecimiento en presencia de rifampicina (250 µg por ml de medio).4. abortus). 692 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . es preferible su utilización (64. ni con tionina (2 µg/ml) o bencilpenicilina (3 µg/ml) (concentraciones finales). La cepa Rev. tales como omp 25. Para el control de la brucelosis en un país o región. Conocida también como análisis de repeticiones en tándem de un número variable de locus múltiples (MLVA). en ensayos puntuales o por inmunotransferencia (77. (no B. Se cargó un gel de agarosa al 2% con 8 μl de producto amplificado y 1 μl de tinte de carga por cada pocillo. — Brucelosis bovina de B. abortus RB51 y B. que pueden utilizarse para la identificación de las especies de Brucella (17. no crece en presencia de fucsina básica. es decir. Las características diagnósticas de algunos enzimoinmunoensayos (ELISA) y la prueba de la polarización de fluorescencia (FPA) son similares o superiores a la FC y. esta prueba puede ser un complemento de los métodos clásicos de biotipificación de acuerdo con la taxonomía establecida (45). depende de pruebas adicionales. 18). con características de realización adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o alternativas en el comercio internacional. Un modo indirecto de demostrar la ausencia de OPS es inyectar 4 × 108 microorganismos RB51 viables en ratones BALB/c y determinar la inducción de anticuerpos anti-OPS. 98). e incapacidad para producir el polisacárido O (OPS) (81). e) Identificación de cepas vacunales La identificación de las cepas vacunales B. se sometió a electroforesis durante 2. 68). Esta prueba de identificación se ha elaborado recientemente y se ha comprobado que tiene un gran potencial como herramienta epidemiológica (12. Actualmente se dispone de otras pruebas. abortus S19. pero crece mucho más lentamente en medios ordinarios. azul tionina (2 µg/ml) o i-eritritol (1mg/ml) (concentraciones finales). así como ELISA y FPA. Las reacciones positivas deben volverse a comprobar utilizando una estrategia confirmativa adecuada.5 o 5 µg/ml (5 UI/ml) (2. Carril 5: bacterias distintas de Brucella. 81). 21. Carril 4: Brucella spp. 2. 1 de Brucella melitensis tiene las propiedades normales de una biovariedad 1 de dicha especie. Se ha incrementado la utilización de procedimientos moleculares para la identificación de las especies de Brucella y los procedimientos de la prueba han mejorado desde los años noventa. abortus presenta las propiedades normales de una biovariedad 1 pero no requiere CO2 para crecer. Debe resaltarse que la prueba de la seroaglutinación lenta en tubo (SAT) se considera inadecuada a efectos del comercio internacional. y presenta una elevada utilización de L-glutamato (2). 80.5 horas a 70 V. La cepa S19 de B. Sin embargo. como son más fáciles de realizar técnicamente y más consistentes. abortus se identifica por varias propiedades: morfología rugosa. son adecuadas para el análisis las pruebas con antígeno tamponado de Brucella. 13). B. Los métodos serológicos que se describen en este capítulo son métodos estandarizados y validados.3. Otra nueva prueba es HOOF-Prints. abortus. Las cepas vacunales S19.1. Se ha comparado el rendimiento de algunas de estas pruebas. abortus. 20. 6 pero tiende a subir a 7. Las cepas deben ser lisas y no autoaglutinables en solución salina con 0. bactrianus) y camélidos sudamericanos. extracto de levadura (Difco) (10 g). Estos se incuban luego a 37°C durante 72 horas con la superficie inoculada hacia abajo.UU. camellos (Camelus dromedarius. Inglaterra.4.1 M. • Sueros de Referencia Los estándares primarios de referencia bovina son aquellos frente a los que se comparan y calibran todos los demás estándares.3 g). Ames. New Haw. peptona de grado elevado (30 g). Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 693 . Los cultivos originales de siembra se cultivan para producir un lote de inóculo que debe tener las propiedades de estas cepas. yak (Bos grunniens). Alternativamente. Para estos animales pueden utilizarse los mismos procedimientos serológicos (59). y los microorganismos se inactivan por calentamiento a 80°C durante 90 minutos. Su empleo favorece la armonización internacional de las pruebas de diagnóstico y la estandarización de antígenos (98): • Para la RBT y la FC se emplea el suero estándar internacional de la OIE (OIEISS. Estos estándares de referencia están a disposición de los laboratorios nacionales de referencia y deben utilizarse para establecer estándares secundarios o nacionales frente a los que pueden prepararse otros de trabajo para utilización en el diagnóstico diario rutinario de laboratorio.1% de extracto de levadura. El pH inicial es 6. UU. Los frascos se agitan.85%).4 durante el crecimiento. La pureza del crecimiento se comprueba en cada frasco mediante la tinción de Gram. suis. Estos sueros se han desarrollado y designado por la OIE como Sueros Internacionales Estándar1. Son también de origen bovino y comprenden un estándar fuertemente positivo (OIEELISASPSS). bisonte americano y europeo (Bison bison. abortus de la OMS) que contiene 1000 UI y UIFC (unidades internacionales para la prueba de fijación del complemento). se decanta la suspensión. del nivel de microorganismos viables para que sea el adecuado y la ausencia de formas rugosas disociadas. melitensis o B. pH 6. otro débilmente positivo (OIEELISAWPSS) y otro negativo (OIEELISANSS). se dispone de tres sueros estándar de la OIE para ELISA. El cultivo continuo puede mantenerse más tiempo. las células se pueden producir en medio líquido o por cultivo continuo en un fermentador (38). en un medio que contenga (por litro de agua destilada) D-glucosa (30 g). Además. En la fase de recogida las células para utilización como antígeno deben comprobarse de nuevo su pureza y ausencia de disociación.3. Para confirmar su pureza deben realizarse controles del proceso del crecimiento tanto en medio sólido como líquido. elk/wapiti (Cervus elaphus). Disponible en el Departamento de Agricultura de los EE. Para la producción de antígeno.4 por adición de HCl 0. como por ejemplo en búfalos (Bubalus bubalus). C.Capítulo 2. y los microorganismos se recogen añadiendo a cada frasco 50–60 ml de solución salina con fenol (con un 0. Addlestone.1% (p/v) de acriflavina. fosfato sódico (9 g) y fosfato bisódico (3. El inóculo de siembra se prepara como se describió anteriormente. Después de una prueba de viabilidad. La pureza del crecimiento se comprueba suspendiendo a la cepa en PBS estéril. el antígeno se conserva a 4°C.4.2–7. 34). con adición de un 5% de suero equino o suero de ternero neonato y un 0. National Veterinary Services Laboratories (NVSL). 1800 Dayton Road. Surrey KT15 3NB. Durante el crecimiento se puede necesitar una aireación y agitación vigorosas y el ajuste del pH a 7. el inóculo de siembra se utiliza para sembrar varios tubos de agar inclinado con medio de infusión de patata que se incuban a 37°C durante 48 horas. Tienen que ser cultivos puros y cumplir las propiedades de las cepas de B. Iowa 50010. y se conservan por liofilización o por congelación en nitrógeno líquido. Bison bonasus). El cultivo se incuba a 37°C durante 48 horas. la infección por Brucella sigue un curso similar al del ganado vacuno. son satisfactorios con tal de que se utilice un inóculo adecuado como se recomienda arriba. • • Producción de células En la producción de antígenos para diagnóstico debe utilizarse siempre la cepa 99 de B. abortus (Weybridge) (S99) (ver dirección en la nota 1 a pie de página) o la cepa 1119-3 (USDA) (S-1119-3)2. EE. pero se necesita más experiencia.5% de fenol en una solución de cloruro sódico al 0. Debe comprobarse la capacidad de los lotes de peptona y de extracto de levadura para producir un buen crecimiento sin formación de células anormales o disociadas. Debe destacarse que el antígeno preparado de una de estas cepas también se utiliza en las pruebas para infección por B. Los medios sólidos SDA y TSA. y se utiliza para sembrar frascos Roux con medio sólido de infusión de patata o con glicerol-dextrosa.2–7. — Brucelosis bovina En otras especies. 1 2 Disponibles en el Laboratorio de Referencia de la OIE para la Brucelosis en la Veterinary Laboratories Agency (VLA) Weybridge. abortus biovariedad 1 que son independientes de CO2. pero cada uno debe ser validado para la especie de animal estudiada (33. antes designado Segundo suero anti-B. (USDA). — Brucelosis bovina El cultivo se recoge mediante centrifugación para precipitar los microorganismos. los residuos insolubles deben eliminarse antes de la tinción filtrando la suspensión por un prefiltro AMF-CUNO Zeta-plus [Tipo CPR 01A]). El antígeno debe almacenarse siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. que a continuación se resuspenden uniformemente a razón de 1 g de células por 7 ml de diluyente (21. Por tanto.056 ml con solución salina fenicada estéril). Cuando se utiliza en la prueba estándar. placa esmaltada o de plástico. normalmente 3. 694 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . Con las suspensiones se debe realizar una prueba de viabilidad sin que se evidencie crecimiento alguno después de una incubación de 10 días a 37°C. A cada 35 ml de esta suspensión se añade 1 ml de rosa de bengala (CI No.1 g de hidróxido sódico disueltos en 353 ml de solución salina estéril con fenol más 95 ml de ácido láctico. Sin embargo. el antígeno RBT debe dar una reacción positiva clara con dilución 1/45 del OIEISS diluido en 0. que se resuspenden en solución salina con fenol.Capítulo 2. o en una placa para hemaglutinación de la OMS. recogidas por centrifugación a 23. • Producción de antígeno El antígeno para la RBT se prepara depositando células muertas de las cepas de B. El color de esta suspensión debe ser rojo intenso y el sobrenadante de una muestra centrifugada debe carecer de colorante. pero suavemente.05 (54). mezclar cuidadosamente el suero y el antígeno (usando un porta limpio o una varilla de plástico para cada prueba) hasta producir una zona circular u oval de aproximadamente 2 cm de diámetro.3. 13430. La mezcla se filtra a través de una gasa estéril y se centrifuga a 10. La mezcla se agita suavemente durante 4 minutos a temperatura ambiente en un agitador circular o tridimensional (si la zona de reacción es oval o circular. a veces origina una reacción positiva debido a vacunación con S19 o a reacciones serológicas positivas falsas (FPSR). Sin embargo. Antes de las pruebas de cada día se debe comprobar que un suero control origine una reacción positiva mínima para verificar la sensibilidad de las condiciones de la prueba. dependiendo de la estandarización final frente a un suero calibrado contra el OIEISS.65 + 0. v) vi) La RBT es muy sensible. Inmediatamente después de añadir la última gota de antígeno en la placa. abortus S99 o S11193. Deben formar suspensiones estables en solución salina fisiológica sin evidencia alguna de autoaglutinación. Después de la filtración a través de una gasa.5% de solución salina con fenol.5%) a razón de 1 g por cada 22.05.65 + 0. se ajusta a un PCV de aproximadamente 8%. Colocar 25–30 µl de cada muestra de suero en una baldosa blanca. Los microorganismos se inactivan por calentamiento a 80°C durante 90 minutos y se guardan a 4°C.000 g para depositar las células teñidas. el pH debe ser 3. justo a los 4 minutos. Agitar bien el frasco de antígeno. respectivamente) Comprobar la aglutinación. las reacciones positivas deben confirmarse con estrategias confirmativas (que incluyan tanto la realización de otras pruebas como la investigación epidemiológica).(Nota: si se utiliza carboximetil celulosa sódica como agente sedimentador durante la preparación del concentrado celular. pero no a una dilución de 1/55.000 g durante 10 minutos a 4°C. y resuspendiéndolas uniformemente en una solución salina fenicada estéril (0. 45440) al 1% (p/v) en agua destilada estéril. y se guarda a 4°C en la oscuridad.000 g durante 75 minutos. a) • Pruebas de antígeno tamponado de Brucella (Prueba prescrita para el comercio internacional) Prueba del rosa de bengala Esta prueba es una prueba sencilla de aglutinación puntual que utiliza antígeno coloreado con rosa de bengala y tamponado a pH bajo. Las reacciones negativas falsas se producen muy raramente. sobre todo debido a los fenómenos de prozona y en ocasiones se pueden detectar diluyendo la muestra de suero o volviendo a probarla después de 4–6 semanas. que se ajusta a 1. • i) ii) iii) iv) Procedimiento de la pruebas Poner las muestras de suero y de antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4°C). como toda prueba serológica.5 ml. la RBT parece adecuada como una prueba para detectar rebaños infectados o para garantizar la ausencia de infección en rebaños libres de brucelosis. y colocar el mismo volumen de antígeno próximo a la gota de suero. El volumen de células empaquetadas (PCV) presentes en las suspensiones inactivadas puede determinarse centrifugando volúmenes de 1 ml en tubos Wintrobe a 3. También es conveniente comparar la reacción de antígeno nuevo y de lotes previamente estandarizados utilizando un conjunto de sueros definidos. la suspensión se filtra dos veces a través de un prefiltro de fibra de vidrio Sartorius No. pero normalmente no debe congelarse. Cualquier reacción visible se considera positiva.4. solo debe sacarse del refrigerador el antígeno suficiente para las pruebas del día. y la mezcla se agita durante 2 horas a temperatura ambiente. 03 y el pH de una mezcla suero-antígeno a una proporción 8:3 debe ser de 4.04. Las células empaquetadas de B. se mezclan completamente el suero y el antígeno (utilizando un vaso limpio o una varilla de plástico para cada prueba) hasta producir una zona circular de aprox. El diluyente tamponado se prepara disolviendo lentamente hidróxido sódico (150 g) en 3–4 litros de solución salina estéril con fenol. Se agita bien la muestra. Se extrae la placa y se mueve como antes. Inmediatamente después de añadir la última gota de antígeno a la placa.Capítulo 2.000 g a 4°C y las células precipitadas se resuspenden a continuación a una concentración de 50 g/100 ml en diluyente tamponado (como se describió anteriormente). v) vi) vii) Como la RBT. Se requieren dos soluciones de colorante: verde brillante (2 g/100 ml) y cristal violeta (1 g/100 ml) de calidad garantizada disueltos en agua destilada. Léase de inmediato la aglutinación una vez transcurridos 8 minutos. El antígeno tiene una caducidad de 1 año y no se debe congelar. el antígeno se guarda a 4°C hasta su utilización. USDA (ver nota 2 a pie de página para dirección). y las muestras positivas deben volverse a verificar con pruebas confirmativas. esta prueba es muy sensible. Se colocan 80 µl de cada muestra de suero en una placa de vidrio marcada con cuadros de 4 × 4 cm. El pH de la solución debe estar comprendido entre 3. — Brucelosis bovina • Prueba de aglutinación tamponada en placa • Producción de antígeno El antígeno para la BPAT se prepara a partir de la cepa S1119-3 de B. Se agita bien la botella de antígeno. y la mezcla se agita antes de filtrar por algodón absorbente estéril. abortus siguiendo el procedimiento descrito por Angus & Barton (3). La mezcla se agita vigorosamente durante 2 horas y después se diluye añadiendo 300 ml de diluyente tamponado por cada 100 ml de células resuspendidas (es decir. especialmente para la detección de anticuerpos inducidos por la vacuna. y luego se mezclan en volúmenes iguales en una botella opaca y se guardan en un refrigerador durante más de 6 meses antes de uso. a una concentración final de 50 g de células empaquetadas/400 ml de diluyente tamponado). Pendientes de pruebas de control final de calidad. 3 cm de diámetro. Una vez preparadas.70 ± 0. El pH del antígeno tamponado en placa debe ser de 3. Después de la mezcla inicial. A esta solución se añade ácido láctico (675 ml) y el volumen final se ajusta a 6 litros añadiendo solución salina estéril con fenol. Se sacará de la nevera solo el antígeno necesario para las pruebas del día.3. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 20–24 horas antes de que la concentración celular se ajuste al 11% (p/v) con diluyente tamponado. los lotes de antígeno deben compararse con el antígeno estándar preparado por el NVSL. Pueden producirse reacciones negativas falsas. b) Prueba de la fijación del complemento (prueba prescrita para el comercio internacional) La FC es una prueba confirmativa ampliamente aplicada y aceptada pese a la complejidad de su realización y a la necesidad de unas buenas instalaciones y de personal entrenado para titular y mantener los reactivos Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 695 . La suspensión al 11% de células teñidas debe ser azulverdosa. se añaden 6 ml de colorante por litro de suspensión celular. No hay sin embargo establecido un procedimiento de estandarización internacional para uso con el OIEISS. debidas por lo general a fenómenos de prozona. La mezcla de colorantes solo puede utilizarse entre 6 y 12 meses después de su preparación inicial. la placa se mueve tres veces para asegurar la dispersión homogénea de los reactivos y se incuba 4 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda. la cual puede eliminarse diluyendo el suero o volviendo a probar después de cierto tiempo. Cualquier reacción visible se considera positiva. pero con suavidad.67. Esta suspensión se agita durante toda la noche antes de uso.4. • i) ii) iii) iv) Procedimiento de la prueba Se colocan las muestras de suero y el antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4°C).02 ± 0. Debe probarse un suero control que dé una reacción positiva mínima antes de comenzar las pruebas de cada día para comprobar la sensibilidad de las condiciones de la prueba. abortus S1119-3 se diluyen a una concentración de 250 g/litro en solución salina fenolada. y se colocan 30 µl de antígeno cerca de cada gota de suero. las dos soluciones se almacenan por separado durante 24 horas. Cada lote de antígeno tamponado en placa debe comprobarse con al menos 10 sueros de reactividad débil y comparar los resultados con uno o más lotes previos de antígeno.63 y 3. Si es posible. incubando otros 4 minutos. Las células se centrifugan a 10. debe emplearse un antígeno preparado de una cepa lisa aprobada de B. y se deben probar varias diluciones para cada muestra. El antígeno debe estandarizarse para dar una fijación del 50% a una dilución 1/200 del OIEISS y debe mostrar también una fijación completa a diluciones más bajas de suero. • Producción de antígeno Existen numerosas variaciones de la prueba pero. cualquiera que sea el procedimiento. respectivamente.147 g) en 1 litro de agua destilada y se diluye antes de uso añadiendo cuatro volúmenes de una solución de gelatina al 0. Existen muchas variaciones de la FC. pero la prueba más adecuada se realiza en formato de microtitulación. No debe producir efectos anticomplementarios en las condiciones de la prueba. sin agregación visible ni formación de depósito después de incubar a 37°C durante 18 horas. abortus. sulfato magnésico (1.04%. excepto en la primera fila. Se añade a los pocillos de la primera fila 25 µl de tampón de FC (controles anticomplementario) para compensar la falta de antígeno. La apariencia del antígeno a una dilución 1/100 debe ser la de una suspensión blanca.4. se colocan 25 µl de suero problema inactivado diluido. Los SRBC están sensibilizados con un volumen igual de suero anti-SRBC de conejo diluido hasta contener varias veces (en general de dos a cinco veces) la concentración mínima necesaria para producir un 100% de lisis de SRBC en presencia de una solución titulada de complemento de cobaya.875 g). Para la incubación de suero. se pueden inactivar a 58°C ± 2°C durante 50 minutos.5 g).3. A continuación se hacen diluciones dobles seriadas transfiriendo volúmenes de 25 µl de suero de la tercera fila en adelante. ácido barbitúrico (2. Si previamente se han diluido a la mitad con una solución salina tamponada con veronal.25–2 C’H100 o 5–6 C’H50. dietil barbiturato sódico (1. El último se titula independientemente (en presencia o ausencia de antígeno. estas se definen como la unidad hemolítica de complemento al 50% o al 100%/ dosis hemolítica mínima (C’H ó MHD50 ó C’H ó MHD100). Con el empleo de placas de microtitulación estándar de 96 pocillos de fondo redondeado (en U). • Procedimiento de la prueba (ejemplo) Los sueros problema sin diluir y los estándar de trabajo adecuados se inactivan durante 30 minutos en una baño de agua a 60°C ± 2°C.5% o al 3%). porque una concentración demasiado baja (o demasiado alta) de antígeno puede no producir un 100% de fijación a diluciones más bajas de suero. Se descartan 25 µl de la mezcla resultante en la última fila. segunda y tercera filas. mientras que a 37°C aumenta la frecuencia e intensidad de las prozonas. Se han propuesto varios métodos para la FC que utilizan diferentes concentraciones de eritrocitos de oveja (SRBC) frescos o conservados (normalmente se recomienda una suspensión al 2. siendo preferible un micrométodo para la determinación óptima de C’H50. dependiendo del procedimiento escogido de la FC). Cuando son adecuadas dos diluciones de antígeno. antígeno y complemento. y 25 µl de complemento. 38) o utilizar células enteras diluyendo la suspensión stock de modo que la PCV de la suspensión de antígeno concentrado para la FC sea aproximadamente del 2% antes de la estandarización frente al OIEISS. alternativamente puede prepararse a partir de una solución stock de cloruro sódico (42.Capítulo 2. ii) iii) 696 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . Normalmente se utilizan en la prueba 1. pero se recomiendan diluciones seriadas a efectos de detectar la existencia de prozona. La primera fila es un control anticomplementario para cada suero. Se suele recomendar titular el complemento antes de cada serie de pruebas. En general solo se prueba rutinariamente una dilución del suero (1/4 o 1/5. Se añaden a cada pocillo volúmenes de 25 µl de complemento diluido hasta el número de unidades requerido.875 g). — Brucelosis bovina adecuadamente. El antígeno se guarda a 4°C y no debe congelarse. A cada pocillo. diluido a la concentración de trabajo.018 g) y cloruro cálcico (0. como la S99 o la S1119-3. la técnica se realiza normalmente del modo siguiente: i) En el pocillo de la primera. uniforme y densa. Se prepara con tabletas comerciales. se añaden 25 µl de antígeno. El antígeno para la FC puede preparase por métodos especiales (2. y que esté estandarizado frente al OIEISS. Varios factores influyen en la elección del método: la actividad anticomplementaria de muestras de suero de baja calidad es más evidente con la fijación en frío. diluido al número de unidades requerido. se puede utilizar la fijación en caliente o en frío: 37°C durante 30 minutos o 4°C durante 14–18 horas. El diluyente estándar para la FC es una solución salina tamponada con barbital (veronal). según el método) para determinar la cantidad de complemento necesaria para producir el 50% o el 100% de lisis de los SRBC sensibilizados por unidad de volumen de una suspensión estándar. A todos los otros pocillos se añade 25 µl de tampón de FC excepto a los de la segunda fila. debe escogerse la suspensión de antígeno más concentrada para evitar el fenómeno de prozona. El suero negativo y el control de tampón deben originar reacciones que estén por debajo del umbral positivo/negativo (97).4. Las placas se reincuban a 37°C durante 30 minutos. viii) Interpretación de los resultados: Los sueros con un título equivalente a 20 UIFC/ml o más. En consecuencia. entonces el factor de un suero problema probado por el mismo método se deduce de la fórmula: 1000 × 1/200 × título del suero problema = número de UIFC de anticuerpo en el suero problema por ml. — Brucelosis bovina iv) Se establecen controles con diluyente solo. pero a veces no es capaz de distinguir entre los anticuerpos debidos a vacunación por S19 u otros problemas de FPSR y los inducidos por las cepas patógenas de Brucella (60). justo por encima del umbral positivo/negativo. las reacciones positivas deben investigarse mediante estrategias confirmativas. Para facilitar la comparación entre países. y varios substratos/cromógenos. El Suero Estándar débilmente positivo de la OIE para ELISA debe dar siempre una reacción positiva que esté situado en la porción lineal de la misma curva dosis-respuesta. 200 (50% de hemolisis). la prueba I-ELISA debe considerarse como una prueba de diagnóstico más que como una prueba confirmativa con ganado vacunado o en rebaños afectados con problemas de FPSR. calculadas en relación con las obtenidas en una titulación paralela con un suero estándar. justo por debajo de la meseta. 75 y 100% de lisis. los sueros estándar nacionales también deben depender de este isotipo para su actividad específica de fijación de complemento. que contengan en cada caso 75 µl de volumen total. Si este suero se prueba por un método determinado y origina un título de. por ejemplo. abortus S19 entre los 3 y 6 meses se consideran generalmente positivas si los sueros dan una fijación positiva con un título de 30 o más UIFC/ml cuando los animales se diagnostican con una edad de 18 meses o superior. como todas las pruebas serológicas. 50. 25. El grado de hemolisis se compara con los estándares que correspondan a una lisis del 0. a veces da resultados positivos debido a vacunación con S19 o a consecuencia de la FPSR. Las hembras que se han vacunado con B. Este suero contiene 1000 UIFC (unidades internacionales de la prueba de fijación de complemento) por ml. En cada serie de pruebas debe probarse un suero control que dé una reacción positiva mínima para comprobar la sensibilidad en las condiciones de la prueba. Algunos I-ELISA validados en ensayos amplios de campo se han comercializado y son muy utilizados. Para una homologación internacional se deben usar los tres Sueros Estándar para ELISA de la OIE en los laboratorios nacionales de referencia para comprobar o calibrar el método de la prueba en particular. Sin embargo. antígeno + complemento + diluyente.3. La prueba I-ELISA es muy sensible.1. El umbral debe establecerse en la prueba con técnicas adecuadas de validación (ver Capítulo 1. Las placas se incuban a 37°C durante 30 minutos o durante toda la noche a 4°C y se añade a cada pocillo un volumen de SRBC sensibilizados (25 o 50 µl dependiendo de la técnica). La prueba la FC es muy específica. La ausencia de actividad anticomplementaria se comprueba en la primera fila para cada suero. diversos conjugados de antiglobulinas con enzimas. Los resultados se leen después de centrifugar las placas a 1.Capítulo 2. Estandarización de los resultados de la FC: Existe un sistema de unidades basado en el OIEISS. El OIEISS contiene IgG específica. que a su vez se calibra frente al OIEISS.000 g durante 10 minutos a 4°C y después dejarlas en reposo a 4°C durante 2–3 horas para permitir que sedimenten las células no lisadas. se consideran positivos. Este procedimiento es un ejemplo y se pueden escoger otros volúmenes y cantidades de reactivos con tal de que la prueba se calibre frente al OIEISS como se describe antes y que los resultados se expresen en UIFC/ml. Surgen dificultades en la estandarización porque diferentes técnicas favorecen selectivamente la FC por los diferentes isotipos de las inmunoglobulinas. v) vi) vii) c) Enzimoinmunoensayos (pruebas prescritas para el comercio internacional) • ELISA indirecto Se han descrito muchas variaciones de ELISA indirecto (I-ELISA) utilizando diferentes preparaciones antigénicas.4. La prueba debe calibrarse de modo que la densidad óptica (OD) del Suero Estándar de la OIE fuertemente positivo represente un punto de la porción lineal de una curva típica de dosis-respuesta. Se recomienda que cualquier país que use la FC a escala nacional acuerde entre los diversos laboratorios que realizan la prueba el mismo método para obtener el mismo nivel de sensibilidad. Principios de validación para las pruebas de diagnóstico de enfermedades infecciosas). Por consiguiente. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 697 . complemento + diluyente. los resultados deben expresarse siempre en UIFC. 2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS) en agua destilada. El sobrenadante se mantiene a 4°C. El precipitado se agita con 80 ml de agua destilada durante 18 horas y se centrifuga a 10. pH 6. El precipitado se resuspende en 80 ml de agua destilada y se agita otras 2 horas a 4°C.93 g) y carbonato bisódico (1. pH 7. El conjugado utilizado en este ejemplo es un MAb específico para la cadena pesada de la IgG1 conjugado con peroxidasa de rábano (HRPO).50 g) y Tween 20 al 0.000 g durante 10 minutos. El tampón del substrato es tampón citrato.05 M. el LPS se liofiliza en fracciones de 1 ml y se guarda a temperatura ambiente. el precipitado se recoge por centrifugación a 10. El antígeno no unido se elimina lavando todos los pocillos cuatro veces con PBST. antígenos del citosol o sustancias químicas caotrópicas como el tiocianato potásico. se cubren las placas y se incuba durante 18 horas a 4°C. El método de la prueba que se describe a continuación es un ejemplo que ha sido validado internacionalmente y utilizado por todo el mundo en proyectos de cooperación técnica e investigación científica con financiación internacional.6 g) y ácido cítrico (4.3. Para antigenizar las microplacas. las placas se pueden usar o se mantienen selladas y congeladas a –20°C hasta un año.Capítulo 2. se añaden 8 g de ácido tricloroacético a los 160 ml del LPS crudo.05 M. El LPS liofilizado se pesa. Después de la incubación. mientras que una proteína A/G conjugada con enzimas puede proporcionar un reactivo útil para las pruebas con diferentes especies de mamíferos (57. pH 9. La solución base de cromógeno es 0.6 (o a una dilución predeterminada por titulación frente al suero estándar de la OIE para ELISA). El tampón de dilución del conjugado y de los sueros problema es PBS 0. se enfría y se centrifuga a 10. que contiene ii) 698 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 .1). que contiene ortofosfato bisódico (1. se reconstituye a una concentración de 1 mg/ml en tampón carbonato 0. — Brucelosis bovina El problema de las FPSR se puede solucionar parcialmente mediante la realización de un I-ELISA utilizando rLPS como antígeno. se añade a todos los pocillos 100 µl de la solución de sLPS. son menos frecuente las reacciones cruzadas entre las regiones centrales del PLS (57). pH 9. Las placas congeladas se descongelan antes de uso durante 30–45 minutos a 37°C. dos cambios de 400 ml cada uno) y luego se liofiliza.4.16 M de 2. El sLPS se precipita añadiendo 500 ml de metanol frío que contenga 5 ml de metanol saturado con acetato sódico. La mayor parte de las FPSR son resultado de la reacción cruzada con la porción del polisacárido O de la molécula sLPS. abortus S1119-3 ó S99 se prepara calentando 5 g de peso seco (o 50 g de peso húmedo) de células suspendidas a 66°C en 170 ml de agua destilada y añadiendo 190 ml de fenol al 90% (v/v) a 66°C. 67). Un MAb específico para la cadena pesada de la IgG1 bovina puede mejorar la especificidad aún a costa de perder sensibilidad. El fenol parduzco de la capa inferior se extrae con una cánula larga y si es necesario los restos celulares se eliminan por filtración (utilizando un filtro de papel Whatman No.59 g) en 1 litro de agua (la azida sódica [0. cloruro sódico (8. que contiene carbonato monosódico (2. Después de 2 horas de incubación a 4°C. fosfato monopotásico (0. • i) Procedimiento de la prueba (ejemplo) El sLPS liofilizado se reconstituye con 1 ml de agua destilada y se diluye a 1/1000 con tampón carbonato 0. A continuación.20 g). La solución base de substrato es peróxido de hidrógeno al 3%. El tampón para antigenar es el carbonato/bicarbonato 0.20 g/litro] es opcional). compuesto por citrato trisódico hidratado (7.05% disuelto en 1 litro de agua destilada (PBST).01 M.5. A continuación.05 M.6 g) disueltos en 1 litro de agua destilada. El sobrenadante se recoge mediante centrifugación como antes y se mezcla con el sobrenadante recogido previamente.000 g durante 15 minutos a 4°C. el precipitado se elimina por centrifugación y la solución traslúcida que constituye el sobrenadante se dializa frente a agua destilada (como mínimo. Después de agitar durante 10 minutos. Para el I-ELISA de detección se deben utilizar como antígeno las preparaciones ricas en lipopolisacáridos lisos (sLPS).000 g durante 10 minutos. sin embargo. pH 9. La solución para detener la reacción enzimática es 4% de dodecil sulfato sódico (SDS). • Producción de antígeno (ejemplo) El sLPS de B.3. Este tampón también se usa como tampón de lavado. y se sonica en un baño de hielo utilizando tres sonicaciones de 6 vatios durante 1 minuto cada vez. pH 4.6.4 g).6.2. La mezcla se agita continuamente a 66°C durante 15 minutos. En función de la disponibilidad y de las necesidades concretas se pueden emplear antiglobulinas mono o policlonales o proteína A/G conjugadas con enzimas. A los pocillos especificados se añaden 100 µl de suero diluido de 1/50 a 1/200 con PBST. Ontario K2H 8P9. inhibición mínima). y la especificidad diagnóstica debe ser equivalente a la prueba de la FC en diagnósticos con ganado sin vacunar (66. la sensibilidad diagnóstica debe ser igual o mayor que los BBAT en pruebas con ganado infectado.5 mM de ácido etilén glicol tetraacético (EGTA) (PBST/EDTA) y se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. No obstante. próximo a la máxima inhibición). inhibición moderada). El suero negativo y el control de tampón/MAb deben dar reacciones siempre menores que el umbral positivo/negativo (es decir. — Brucelosis bovina 7. Canada. La elección del MAb y su singular especificidad y afinidad influencian las propiedades diagnósticas de la prueba. las reacciones (FPSR) debidas a bacterias con reacción cruzada (61). calibrados con Sueros Estándar de la OIE para ELISA. Los controles. 92). se ha comprobado que el CELISA elimina algunas. Los pocillos control que contienen el suero fuertemente positivo se consideran como un 100% de positividad y todos los datos se calculan de estas lecturas de absorbancia (entre 1. Con fines de estandarización y de investigación se encuentran disponibles3 el antígeno sLPS. un suero control negativo y un control del tampón. iv) v) vi) • ELISA competitivo El ELISA competitivo (C-ELISA) que emplea un MAb específico para uno de los epítopos de la Brucella OPS parece tener mayor especificidad que el I-ELISA (49. pequeñas cantidades del MAb específico para la cadena pesada del la IgG1 bovina. Mediante este protocolo descrito para I-ELISA. El Suero Estándar de la OIE débilmente positivo debe dar una reacción que caiga en la porción lineal de la misma curva de dosis-respuesta justo por encima del umbral positivo/negativo (es decir. La prueba debe calibrarse de tal modo que la densidad óptica del Suero Estándar de la OIE fuertemente positivo represente un punto en la zona lineal de una curva típica de dosis-respuesta justo por encima de la meseta (es decir.0 mM de H2O2 [100 µl/20 ml de tampón citrato] y 4.Capítulo 2. El método que se describe a continuación es un ejemplo de prueba que se ha validado internacionalmente y utilizado con una difusión mundial a través de proyectos de cooperación técnica y colaboración científica con financiación internacional. El C-ELISA también está disponible comercialmente.0 mM de ABTS [500 µl/ 20 ml de tampón citrato]). se debe considerar la disponibilidad general del MAb o del hibridoma para su aceptación internacional y su utilización generalizada. Puede esperarse que la sensibilidad diagnóstica en pruebas con ganado vacunado con la cepa S19 o en el caso de FPSR sea notablemente inferior a la prueba de la FC dependiendo de dónde se establezca el umbral de positividad/negatividad en el I-ELISA. las placas se agitan durante 10 minutos y el color desarrollado se determina en un espectrofotómetro a 414 o 405 nm. El exceso de conjugado se elimina con cuatro lavados. El C-ELISA es también capaz de eliminar la mayoría de las reacciones debidas a los anticuerpos residuales que se producen en respuesta a la vacunación con S19. otro débilmente positivo. se disponen en pocillos duplicados e incluyen un suero control fuertemente positivo. programas para la generación de datos empleando espectrofotómetros particulares y un protocolo estandarizado para la prueba I-ELISA. u otro similar calibrado frente a los Sueros Estándar de la OIE para ELISA. A cada pocillo se añade 100 µl de conjugado (MAb M23) específico para un epítopo de la cadena pesada de la IgG1 bovina unido a HRPO y diluido en PBST (predeterminado por titulación) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos. A cada pocillo se añade 100 µl de sustrato/cromógeno (1. Animal Diseases Research Institute. los laboratorios nacionales de referencia deben utilizar los tres Sueros Estándar de la OIE para el ELISA a fin de comprobar o calibrar el método concreto. Como en cualquier prueba basada en el MAb. 67). Se han descrito algunas variaciones de C-ELISA. Para una homogenización internacional. 83. 3851 Fallowfield Road. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 699 . Los sistemas de tampón son los mismos que los descritos para la prueba I-ELISA. Nepean. se puede añadir directamente a todos los pocillos 100 µl de SDS al 4% como agente de parada de la reacción.000 y 1. Si se desea. 64.4.800) empleando la ecuación: Porcentaje de positividad (%P) = absorbancia (muestra problema)/absorbancia (control fuertemente positivo) × 100. 3 Laboratorio de Referencia de la OIE para la Brucelosis.5 mM de ácido etilén diamino tetraacético (EDTA) y 7. pero no todas. El suero no unido se elimina lavando cuatro veces con PBST (no debe usarse PBS que contenga EDTA/EGTA con HRPO ya que inactiva el enzima). iii) Se añaden a las placas los sueros problema y se ensayan por separado o en duplicado.3. Se realiza seleccionando un MAb con mayor afinidad que los anticuerpos con reacción cruzada. una molécula pequeña gira más deprisa que una grande.4.0 mM de ABTS). • i) Procedimiento de la prueba El sLPS liofilizado se reconstituye con 1 ml de agua destilada y se diluye a 1/1000 con tampón carbonato 0. Los pocillos control que contienen el suero fuertemente positivo se consideran como una inhibición del 0% y todos los datos se calculan de estas lecturas de absorbancia (entre 1. se puede añadir directamente a todos los pocillos 100 µl de SDS al 4% como agente de parada de la reacción. La especificidad diagnóstica de C-ELISA es mayor que la de la FC y el I-ELISA en pruebas con ganado vacunado con S19. Mediante este protocolo descrito para C-ELISA. Este antígeno se añade a suero diluido o a sangre completa y en 2 minutos (para suero) o 15 segundos 700 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . se cubren las placas y se incuban durante 18 horas a 4°C. se marca con un fluorocromo un antígeno de pequeño peso molecular. La especificidad diagnóstica del C-ELISA debe ser equivalente o superior a la de la FC e I-ELISA en pruebas con ganado sin vacunar o en el caso de FPSR. El suero no unido se elimina lavando cuatro veces con PBST.800) empleando la ecuación: Porcentaje de inhibición (%I) = 100 – (absorbancia [muestra problema]/absorbancia [control de tampón] × 100). ii) iii) iv) v) vi) d) Prueba de polarización de fluorescencia (prueba prescritas para el comercio internacional) La FPA es una técnica sencilla para determinar la interacción antígeno/anticuerpo y puede realizarse en instalaciones de laboratorio o en el campo. Si se desea. la unión con el antígeno marcado provoca un descenso en su velocidad rotacional que puede medirse. En la mayoría de las FPA. abortus se prepara y se utiliza como para el I-ELISA.05 M y pH 9. las placas se pueden usar o mantenerlas selladas y congeladas a –20°C hasta un año. Los controles. El tamaño molecular es el principal factor que influencia la velocidad de rotación. otro débilmente positivo. El antígeno no unido se elimina lavando todos los pocillos cuatro veces con PBST. por lo menos durante los 3 minutos iniciales. se disponen en pocillos duplicados e incluyen un suero control fuertemente positivo. un suero control negativo y un control del tampón. inferior a 50 kD. A cada pocillo se añaden 50 µl de MAb (M84 en este caso) convenientemente diluido en PBST/EDTA e inmediatamente otros 50 µl de suero diluido 1/10 en PBST/EDTA. y se añade suero u otro líquido problema para detectar la presencia de los anticuerpos. — Brucelosis bovina • Producción de antígeno (ejemplo) El sLPS de la cepa S1119-3 de B. se añade a todos los pocillos 100 µl de la solución de LPS. Después de la incubación.5°C midiendo la intensidad de la luz polarizada en planos verticales y horizontales. se agitan las placas durante 10 minutos y el color desarrollado se determina con un espectrofotómetro a 414 o 405 nm. 66). con una relación de proporcionalidad inversa.3. Con fines de estandarización y de investigación se encuentran disponibles el antígeno sLPS. A cada pocillo se añade 100 µl de conjugado comercial de IgG anti-ratón de cabra (cadena H y L) unida a HRPO y diluida en PBST (predeterminado por titulación) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos. abortus y se marca con isotiocianato de fluoresceína. Para el diagnóstico de la brucelosis. la sensibilidad diagnóstica debe ser equivalente a los BBAT y el I-ELISA en pruebas con ganado infectado (63. Si una molécula se marca con un fluorocromo. programas para la generación de datos empleando espectrofotómetros particulares y un protocolo estandarizado para la prueba C-ELISA (ver dirección en nota 3 a pie de página). Una molécula grande emite más luz en un único plano (más polarizada) que una pequeña que gira más deprisa y emite luz más despolarizada.000 y 1. El mecanismo de la prueba se basa en la rotación aleatoria de las moléculas en solución. Se añaden a las placas los sueros problema y se ensayan por separado o en duplicado. se puede determinar el tiempo de rotación a través de un ángulo de 68. 64. calibrados con Sueros Estándar de la OIE para ELISA.Capítulo 2. Para antigenizar las microplacas. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. A cada pocillo se añade 100 µl de substrato/cromógeno (1. pequeñas cantidades del MAb específico para la cadena pesada del la IgG1 bovina. El exceso de conjugado se elimina con cuatro lavados. Es una prueba homogénea que no requiere la separación de los compuestos analizados y que por tanto es muy rápida. Así.0 mM de H2O2 y 4. Si están presentes anticuerpos. se emplea como antígeno un fragmento de bajo peso molecular (media de 22 kD) del OPS del sLPS de la cepa 1119-3 de B. Las placas congeladas se descongelan antes de uso durante 30–45 minutos a 37°C.6. u otro similar calibrado frente a los Sueros Estándar de la OIE para ELISA. y negativo. En cada serie de pruebas se incluye un suero estándar de trabajo fuertemente positivo. 100 volúmenes de agua destilada y se liofiliza.01 M (1.6 ml de hidróxido sódico 0. pero en general es de unos 10 µl. El diluyente utilizado es Tris 0. se obtiene una medida del contenido de anticuerpos mediante un analizador de polarización de fluorescencia (62 . aunque la prueba debe calibrarse localmente con un Suero Estándar de Referencia Internacional. y después se cambia el tampón a fosfato 0. Sin embargo se desconoce en la actualidad la especificidad de la FPA en condiciones de FPSR.000–300. ii) iii) iv) La sensibilidad y la especificidad diagnóstica de la FPA en la brucelosis bovina son casi idénticas a las de C-ELISA. 0.4. mP) indica una reacción positiva. ver nota 3 a pie de página). el sobrenadante se trata con 20 g de ácido tricloroacético para precipitar las proteínas y los ácidos nucleicos. pH 7. El antígeno se guarda como un líquido durante varios años a 4°C en un frasco opaco o se puede liofilizar en frascos opacos. otro débilmente positivo y un suero negativo (calibrados frente a los Sueros Estándar de la OIE). Se obtiene una lectura en el FPM para determinar la dispersión de la luz. se mezcla y se obtiene con el FPM una segunda lectura a los 2 minutos para suero y a los 15 segundos para sangre. se añaden 20 µl de suero a 180 µl de tampón. La cantidad de antígeno utilizada por prueba se determina diluyendo el material antes obtenido hasta lograr una intensidad de fluorescencia de 250.000 g durante 10 minutos a 4°C. después de añadir el antígeno. Se añade un antígeno titulado marcado adecuadamente (que por lo general origine una intensidad de 250. Se obtiene una segunda lectura en el FPM después de una incubación a temperatura ambiente de 2 minutos para suero y de 15 segundos para sangre tratada con EDTA. • Producción de antígeno (ejemplo) El OPS se prepara a partir de 5 g de peso seco (o 50 g de peso húmedo) de B.05% de Igepal CA630 (500 µl) (antes denominado NP40) y 10 mM de EDTA (3. Es importante mezclar bien.21 g) que contiene cloruro sódico 0.000). Después se añade 0.3 ml de isómero 1 de FICT a una concentración de 100 mg/ml en dimetil sulfóxido y se incuba otra vez durante 1 hora a 37°C. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 701 . autoclavando la suspensión durante 15 minutos a 121°C y eliminando los restos celulares mediante centrifugación a 10. Se disuelven 3 mg de OPS en 0.1 M. Se añade al tubo un volumen de antígeno que corresponda a una intensidad total de fluorescencia de 250–300 × 103 y se mezcla bien.000– 300. así como un suero de animal vacunado con S19. Una lectura superior al nivel del umbral establecido (en miliunidades de polarización. Este volumen puede variar de un lote a otro. se obtiene una lectura inicial para determinar la dispersión de la luz con un analizador de polarización de fluorescencia (FPM). Deben incluirse controles de suero positivo fuerte. abortus S1119-3 añadiendo 400 ml de ácido acético al 2% (v/v). pH 7. El sobrenadante se dializa frente. A continuación. • i) Procedimiento de la pruebas Se añade 1 ml de tampón Tris a tubos de vidrio de borosilicato de 10 × 75 mm y después 10 µl de suero o 20 µl de sangre tratada con EDTA. Un nivel umbral típico es 90–100 mP. Se puede disponer de pequeñas cantidades de antígeno marcado para la investigación y estandarización de procedimientos operativos relacionados con la obtención de antígeno y la realización de FPA (para dirección.Capítulo 2. la dilución para la prueba en tubo es de 1/50 y 1/5 para la prueba en placa (la sangre tratada con heparina aumenta la variabilidad de la prueba).000 en el FPM. La primera fracción (después de 10–15 ml de elución con tampón) es verde fuerte. Este último material es el antígeno utilizado en FPA.01 M. si se emplea sangre tratada con EDTA. — Brucelosis bovina (para sangre). La especificidad diagnóstica en ganado recientemente vacunado con la cepa S19 supera el 99% (62). La preparación de antígeno se puede aumentar proporcionalmente. Se eluyen 10–15 ml de tampón seguidos luego de 20–40 ml donde se obtiene el material verde fluorescente.4. Una lectura superior al umbral predeterminado indica una reacción positiva.73 g) por litro de agua destilada. La FPA debe estandarizarse de modo que los sueros positivos fuertes y débiles de la OIE suministren resultados positivos repetitivos.3. pH 7.5 g).15 M (8. positivo débil. El OPS conjugado se aplica a una columna de 1 × 10 cm de DEAE (dietilaminoetil) Sephadex A 25 equilibrada con tampón fosfato 0. La FPA se puede realizar en tubos de vidrio o en formato de placa de 96 pocillos. al menos.66). Para el formato de 96 pocillos.4. Después de mezclar. El suero bovino se diluye a 1/10 para la prueba en placa o a 1/100 para la prueba en tubo.1 M (4 g NaOH/litro) y se incuba a 37°C durante 1 hora.000 g durante 10 minutos a 4°C.2 (tampón Tris). El precipitado se elimina de nuevo mediante centrifugación a 10. Los antígenos pueden presentarse en forma concentrada siempre que el factor de dilución para uso se indique en la etiqueta del frasco. • i) ii) iii) iv) Procedimiento de la prueba Se inyecta intradérmicamente 0.000. Francia. El antígeno debe prepararse sin referencia a la concentración celular. 65). Un engrosamiento de la piel de 1. o el 75% con una dilución sérica final de 1/500 a 1/750.Capítulo 2.5–2 mm debe considerarse como una reacción positiva. Para reducir el nivel de resultados positivos falsos se puede añadir EDTA a la suspensión antigénica a una concentración final en la prueba de 5 mM. 78). a) Otras pruebas Prueba cutánea de la brucelina Una prueba inmunológica alternativa es la prueba cutánea de la brucelina. especialmente en áreas libres de brucelosis (23. pero su sensibilidad debe estandarizarse con relación al OIEISS de modo que el antígeno produzca el 50% de aglutinación con una dilución sérica final de 1/600 a 1/1. que puede utilizarse para el diagnóstico en rebaños no vacunados siempre que se utilice una preparación antigénica purificada (libre de LPS) y estandarizada (por ejemplo. Synbiotics Europe. b) Prueba de aglutinación del suero Aunque no se considera una prueba obligada o alternativa. No obstante. en la piel del costado lateral. produce una respuesta humoral anamnésica. La prueba se lee después de 48–72 horas. de modo que los animales sin vacunar que son serológicamente negativos y reaccionan positivamente en la prueba de la brucelina deben considerarse animales infectados (78). por lo que esta prueba sola no es recomendable como prueba única a efectos del comercio internacional. También se aconseja comparar la reactividad de los lotes de los antígenos nuevos con los estandarizados previamente utilizando un juego de sueros definidos. o de un lado del cuello. No todos los animales infectados reaccionan.85% [p/v] y fenol al 0. Una preparación de ese tipo es la brucelina INRA preparada de una cepa rugosa de B.5% [v/v]). Además. las reacciones dudosas requieren una interpretación cuidadosa. realizada con brucelina de la RB51 homóloga tras la vacunación de los terneros con RB51.1 ml de brucelina en el repliegue caudal. No debe usarse formaldehído. Por tanto. 74. La prueba cutánea. El antígeno es una suspensión bacteriana en solución salina fenolada (NaCl al 0.3. la asociación de la prueba cutánea y la prueba de FC con RB51 puede aportar un sistema de diagnóstico para identificar los animales individuales vacunados con RB51 (23). 2 rue Alexander Fleming. El OIEISS contiene 1000 UI de aglutinación.2 debe reajustarse en la suspensión de antígeno. Su especificidad mejora notablemente si se añade EDTA al antígeno (35. 702 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . En consecuencia. melitensis que está comercializada4. 69007 Lyon. el pH de 7. 48. Una reacción positiva fuerte se reconoce fácilmente como una inflamación local e induración. La prueba cutánea de la brucelina tiene una especificidad muy elevada. 4 Brucellergène OCB. la SAT se ha utilizado con eficacia durante muchos años en programas de vigilancia y control de la brucelosis bovina. Es esencial utilizar una preparación estandarizada y definida de brucelina que no contenga antígenos sLPS. La inoculación intradérmica de la brucelina puede originar una anergia temporal de la respuesta inmune celular. ya que este puede producir reacciones inflamatorias inespecíficas o interferir con pruebas serológicas posteriores.4. los resultados de esta prueba pueden ayudar a interpretar reacciones serológicas que se consideran como FPSR debidas a una infección por bacterias que tienen una reacción cruzada. brucelina INRA). El grosor de la piel en el sitio de la inyección se mide con un calibrador Vernier antes y después de la inyección. — Brucelosis bovina 3. y debe apoyarse en una prueba serológica fiable. en general se recomienda un intervalo de 6 semanas entre dos pruebas realizadas sobre el mismo animal. De esta forma. Aunque la prueba intradérmica de la brucelina es una de las más específicas de la brucelosis (en animales no vacunados) el diagnóstico no puede hacerse basándose solamente en reacciones intradérmicas positivas en unos cuantos animales del rebaño. Las muestras se ajustan de acuerdo con la siguiente fórmula: tamaño del rebaño <150 animales usan 1 ml de leche. como se ha demostrado en ganado infectado experimentalmente y en ganado con infección natural sometido a tratamiento antibiótico (42). y el ganado adulto vacunado subcutáneamente 4– 5 meses antes con dosis reducida de la cepa S19 no da reacciones positivas a menos que resulten infectados y excreten la vacuna en la leche (43). 47). — Brucelosis bovina La prueba se realiza en tubo o en microplaca.3. La dilución de sueros sospechosos debe llevarse a cabo de modo que la lectura de la reacción al límite de la positividad se haga en un tubo medio (o pocillo en el método de microplaca). A efectos de una armonización internacional. España. los laboratorios nacionales de referencia deben utilizar los tres Sueros Estándar de la OIE para ELISA con el fin de comprobar o calibrar el método particular de la prueba en cuestión. el tiempo de incubación puede acortarse a 6 horas. es decir. no se recomienda la utilización de esta prueba en granjas muy pequeñas. Pueden presentarse reacciones positivas falsas en animales vacunados 4 meses antes de la prueba. y habitualmente están disponibles en las centrales lecheras. 50080 Zaragoza. No obstante. La mezcla de antígeno con las diluciones de suero debe incubarse 16–24 horas a 37°C. Por tanto. Apartado 727. Los terneros vacunados subcutáneamente con la dosis estándar de la cepa S19 a los 3–5 meses de edad son negativos a los 2 meses de la vacunación. y el resto de la prueba es similar a lo descrito para suero. Servicio de Investigación Agraria/DGA. Un suero con 30 UI o más. de 1/2 a 1/10 en tampón de dilución. 150–450 usan una muestra de leche entera de 2 ml. se utilizan numerosas variaciones del I-ELISA para leche. todas las vacas que aportan leche deben comprobarse individualmente analizando sus muestras de sangre. La prueba I-ELISA en leche es sensible y específica. se considera positivo. Se ha demostrado que las pruebas de precipitación en las que se utiliza como antígeno el hapteno nativo o proteínas de citosol eliminan la mayoría de las reacciones FPSR causadas por Yersinia enterocolítica O:9 y las FPSR de origen desconocido (57). La MRT puede ajustarse para compensar el factor de dilución de las muestras de leche entera procedente de rebaños grandes. De estos tanques se puede obtener leche de forma más barata y frecuente que las muestras de sangre. La sensibilidad óptima se obtiene por un sistema de inmunodifusión radial inversa donde el suero difunde en un gel hipertónico que contiene el polisacárido (24. En poblaciones grandes (>100 terneros lactantes) la sensibilidad de la prueba tiene menos fiabilidad. la prueba del anillo de leche o MRT (sigla inglesa para ‘milk ring test’) puede utilizarse para el diagnóstico de la brucelosis en rebaños.Capítulo 2. La vacunación conjuntival (tanto en jóvenes como en adultos) reduce el tiempo de obtención de una respuesta negativa en las pruebas con hapteno nativo y poliB. • I-ELISA en leche Como con el I-ELISA para suero. Las muestras de leche completa se comprueban generalmente con diluciones mucho más bajas que el suero. Para cada suero debe prepararse un mínimo de tres diluciones para evitar respuestas negativas debidas a los fenómenos de prozona. • Prueba del anillo de leche En los animales lactantes. Cuando se obtiene un resultado positivo. La prueba del anillo de leche (MRT) es una alternativa adecuada cuando no se dispone de ELISA. Una característica notable de la prueba RID es que un resultado positivo se correlaciona con la excreción de Brucella. La prueba C-ELISA no debe utilizarse con leche completa pero puede usarse con muestras de suero. donde estos problemas presentan un mayor impacto en los resultados de la prueba. 5 El procedimiento detallado puede obtenerse del Departamento de Sanidad Animal. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 703 . El I-ELISA debe estandarizarse de modo que el estándar positivo fuerte positivo de la OIE para ELISA diluido a 1/125 en suero negativo y diluido después a 1/10 en leche negativa se comporte repetidamente como positivo. el procedimiento de la doble difusión en gel también resulta útil (46. d) Pruebas en la leche Un medio eficaz de examinar a las vacas lecheras es recurrir a la leche de los tanques de recogida. Interpretación de los resultados: El grado de aglutinación de Brucella por un suero debe expresarse en UI por ml.4. Se han comercializado varios I-ELISA que se han validado en ensayos de campo y son de uso amplio. Si la prueba se realiza en microplaca. 451–700 usan una muestra de leche de 3 ml. en muestras de leche anormal (como el calostro) o en casos de mamitis. y resulta particularmente útil para llevarla a cabo en grandes poblaciones de animales. c) Pruebas de hapteno nativo y poliB Las pruebas de hapteno nativo y poliB son pruebas confirmativas5 utilizadas con éxito en programas de erradicación en combinación con RBT como prueba de diagnóstico (4). 43). 5 ml) e hidróxido sódico al 10% (4. Si es necesario. Se permite la existencia de un poco de colorante libre en el sobrenadante de una muestra centrifugada. 704 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . Se centrifugan a 23. Después de 30 minutos a temperatura ambiente. El pH del antígeno debe estar entre 3.1 ml de una mezcla de nata negativa al tubo de ensayo y a continuación 30–50 µl del antígeno de la prueba del anillo. Cuando se diluye en leche de un animal sin brucelosis.000 g durante 10 minutos a 4°C y se resuspenden en solución de colorante hematoxilina. El antígeno debe estandarizarse frente al OIEISS de modo que una dilución 1/500 sea positiva y una dilución 1/1.4 ml) en 1. Una reacción fuertemente positiva se indica por la formación de un anillo azul oscuro por encima de la columna blanca de leche. Las células empaquetadas se suspenden en la solución de colorante a razón de 1 g por cada 30 ml de colorante y se mantienen a temperatura ambiente durante 48 horas (en vez de esto.1 y la solución se deja envejecer manteniéndola a temperatura ambiente durante 45–90 días en la oscuridad. algunos laboratorios prefieren calentar 80°C durante 10 minutos). La prueba es negativa si el color de la leche supera al de la capa cremosa. abortus S99 o S1119-3. pero generalmente debe guardarse a 4°C. Se agita suavemente la botella de antígeno. Se emplean varios métodos satisfactorios. La mezcla de nata negativa se recoge mediante la separación de la leche entera y sin pasteurizar procedente de un rebaño de 25 o más vacas que sean negativas a la brucelosis. calentadas. La solución de colorante se agita antes de utilizarlas y se filtra a través de una gasa. La prueba se lleva a cabo añadiendo 30–50 µl de antígeno a 1–2 ml de leche completa (el volumen de leche puede aumentarse para muestras de poblaciones grandes. sometidas a agitación violenta o guardadas durante más de 72 horas. El pH de la mezcla se ajusta a 3.3. La mezcla se filtra a través de una gasa. las mezclas de leche y antígeno se incuban a 37°C durante 1 hora junto con los estándares de trabajo positivos y negativos. a pH final de 3. Normalmente.4. Sin embargo. se incuba y se lee de la misma forma que para la MRT no ajustada. disuelta en 95% de etanol. Las células lavadas se resuspenden a razón de 1 g en 27 ml de un diluyente que consiste en solución salina con fenol al 0. Debe retirarse de la nevera solo el antígeno necesario para las pruebas del día.6 litros de agua destilada.02%) durante 2–3 días a 4°C antes de su utilización. A la solución se añaden 2 ml de iodato sódico al 10% (p/v) recién preparado.3 y 3. 5 ml) y fosfato bisódico 0. Véase más arriba la prueba del anillo de leche). Cualquier anillo azul en la interfase de leche y de crema debe considerarse como positivo y podría ser significativo. se comprueba el pH. se añade 0.5%. Las muestras de leche no deben haber sido congeladas. • Procedimiento de la prueba La prueba se lleva a cabo sobre las muestras del tanque de leche entera. la solución de color púrpura oscuro se añade a 940 ml de sulfato amónico alumínico al 10% (p/v) en agua destilada. especialmente en el caso de grandes poblaciones. 75290). i) ii) iii) Se debe procurar que las muestras de leche y el antígeno se mantengan a temperatura ambiente (20 ± 3°C). a una solución de sulfato amónico alumínico (5 g) en 100 ml de agua destilada y 48 ml de glicerol.0 por adición de ácido cítrico 0.1 M (aproximadamente 2.000 sea negativa. y se determina el PCV ajustándolo aproximadamente al 4%. cultivadas como se ha descrito con anterioridad. La altura de la columna de leche en el tubo debe ser como mínimo de 25 mm. ácido láctico al 85% (1. la incubación durante la noche a 4°C aumenta la sensibilidad de la prueba y permite una interpretación más fácil. El antígeno debe almacenarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. y se mantiene a 4°C durante 24 horas. La sensibilidad del lote nuevo debe compararse con la de un lote previamente estandarizado utilizando un juego de muestras de varios grados de reacción preparado diluyendo un suero positivo en leche.7 y su color debe ser azul oscuro. el antígeno debe producir una coloración uniforme de la capa de leche sin formar depósitos ni coloración en la capa cremosa.1% o bronopol al 0.4 g).5 M (aproximadamente 1 ml). las muestras se pueden pretratar con un conservante (formalina al 0. un ejemplo es el siguiente: se añaden 100 ml de hematoxilina al 4% (p/v) (Cl No. iv) v) vi) vii) viii) Cuando se ajusta la MRT para aplicarla en rebaños de gran tamaño (utilizándose 2 o 3 ml de leche). Después de mezclar. ajustada a pH 4.0. — Brucelosis bovina • Producción de antígeno El antígeno para MRT se prepara a partir de suspensiones concentradas de bacterias muertas de B. Las células teñidas se concentran por centrifugación y se lavan tres veces con una solución de cloruro sódico (6.Capítulo 2. Las reacciones positivas falsas conllevan rastreos retroactivos e investigaciones epidemiológicas que son caras y requieren mucho tiempo para su aplicación. generalmente la respuesta de los anticuerpos frente a OPS es insignificante. f) Detección de anticuerpos frente a Brucella rugosa La utilización de Brucella rugosa (RB51) como vacuna y en algunos casos de infección atípica por Brucella ha hecho necesaria la utilización de pruebas serológicas para la detección de anticuerpos contra el núcleo del sLPS. a fin de minimizar la exposición durante el trabajo. la prueba del interferón gamma implica la estimulación de los linfocitos en sangre completa con un antígeno adecuado. b) Método de cultivo (2) La cepa B115 de Brucella melitensis crece mejor en el medio de cultivo descrito con anterioridad para el cultivo en fermentador. melitensis y no producir LPS liso de Brucella. Francia. Debe presentar las propiedades de un cultivo puro de una cepa rugosa de B.3. C1.4. que incluye cepas de vacunas. 1. El rLPS se extrae con facilidad de la cepa RB51 de B. pero puede ser útil para el análisis de poblaciones. En general. Esta preparación no provoca la formación de anticuerpos reactivos en la BBAT. Se suministra a los pequeños rumiantes en 6 Se puede obtener del Institut National de la Recherche Agronomique (INRA). Puede crecer en fermentador por el método continuo o discontinuo o en matraces colocados en un agitador. Brucelina La brucelina INRA es un extracto libre de LPS de la cepa B115 de B. Entonces ese antígeno puede utilizarse en el IELISA (66. mediante la prueba de fijación del complemento. abortus mediante el método de Galanos et al. tal como se señala en el capítulo 1. Se ha comprobado que el protocolo de la prueba también es útil para la detección de FPSR en ovejas (25) y cerdos (76). También se ha comprobado que. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 705 . Debe comprobarse su pureza en cada recogida aislada y el organismo debe encontrase en la fase rugosa. Laboratoire de Pathologie Infectieuse et Immunologie. a) Control de inóculos Características del inóculo La producción de brucelina INRA se basa en un sistema de lotes de siembra como el descrito para los antígenos y las vacunas. Aunque se ha demostrado que el sLPS de la cepa RB51 de B. La preparación no es recomendable como un agente de diagnóstico para animales individuales. La preparación contiene un 50–75% de proteínas.Capítulo 2. De ahí que las pruebas que eliminen la FPSR serán cada vez más útiles. y no es por sí misma un agente sensibilizante. No provoca anticuerpos reactivos en las pruebas serológicas estándar para brucelosis. c) Validación como un reactivo para el diagnóstico in vivo Estudios de laboratorio y de campo realizados en Francia. 94). principalmente de bajo peso molecular. (32). aumenta la importancia de la precisión de las pruebas serológicas. Debe producir cantidades razonables de una mezcla de antígenos proteicos reactivos frente a antisueros contra cepas rugosas y lisas de Brucella. y un 15–30% de carbohidratos. No contiene antígenos LPS. 37380 Nouzilly. La manipulación en los laboratorios de cultivos vivos de Brucella.6. es peligroso y debe realizarse bajo un nivel 3 de contención o mayor. melitensis para producción de brucelina6 debe cultivarse para producir un lote de siembra que debe conservarse mediante liofilización o congelación en nitrógeno líquido. Más del 90% de los pequeños rumiantes infectados por B. en este caso. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO La brucelosis es una de las infecciones de laboratorio más fáciles de contraer y deben tomarse estrictas medidas de seguridad. han confirmado que la brucelina INRA es segura. El inóculo original de la cepa B115 de B. 93. melitensis en fase rugosa. se ha demostrado que la brucelina da buenos resultados y luego se mide la producción de interferón gamma resultante mediante un ELISA de captura (44. se detectan anticuerpos contra el rLPS utilizando un antígeno de célula entera (1). melitensis manifiestan una hipersensibilidad retardada a la brucelina INRA en alguna fase. abortus contiene pequeñas cantidades de OPS (19). la FC o el ELISA. — Brucelosis bovina e) Prueba del interferón gamma A medida que disminuye la prevalencia de la brucelosis.1. C. La brucelina INRA no provoca repuestas inflamatorias en animales no sensibilizados. no tóxica y de acción específica. y el rLPS es un antígeno más adecuado. 67). Se determina y mide la reacción eritematosa a las 24 horas y se calcula el título por comparación con una brucelina de referencia8. Las células secas se someten a una prueba de viabilidad. Después de lavados repetidos con acetona fría y de un lavado final con dietil éter. y una vez más al final del proceso. b) Inocuidad Las muestras de brucelina en sus recipientes finales deben someterse a la prueba estándar de esterilidad y también deben comprobarse la toxicidad anormal de las preparaciones. Las células se lavan con agua destilada estéril y fría y se deshidratan precipitándolas con tres volúmenes de acetona a –20°C. con 0. que es la brucelina sin estandarizar. 94706 Maisons-Alfort Cedex.5 ml de brucelina de referencia7 con adyuvante completo de Freund de 1 a 6 meses antes. BP67. Este método solo es válido para comparar preparaciones de brucelina obtenidas por el mismo protocolo que 7 8 Se ha producido por el INRA-PII (F-37380 Nouzilly. AFSSA. se enfrían a 4°C. las células se secan sobre cloruro cálcico y se mantienen a 4°C. Se suministra una inyección similar 15 días después a los mismos tres animales y a un lote control de tres cobayas del mismo peso que no se hayan inyectado previamente. 2. 94706 MaisonsAlfort Cedex. La mezcla se mantiene a 4°C durante 24 horas y el precipitado se centrifuga y el concentrado se redisuelve en agua destilada y se dializa para eliminar el etanol. a fin de comprobar una posible contaminación.000 g durante 6 horas a 4°C.Capítulo 2. Control del proceso Debe comprobarse la esterilidad del extracto crudo de brucelina después de su extracción con acetona para comprobar la inactivación de las células de Brucella.1 ml del producto examinado en el costado previamente afeitado y desinfectado de tres cobayas albinos normales que no se hayan expuesto con anterioridad a Brucella o a sus antígenos. tres veces cada 5 días. 23 avenue du Général-de-Gaulle. y se recogen por centrifugación a 9. No debe observarse reacción cutánea alguna. Los animales no deben convertirse en seropositivos cuando se examinan 24 horas después de la última inoculación por las pruebas estándar de brucelosis (RBT. France.000 g durante 15 minutos a 4°C. AFSSA. 706 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . Después de centrifugar a 105. Se inyectan intraperitonealmente dosis equivalentes a 20 dosis de ganado (2 ml) en un par de cobayas normales que no se hayan expuesto con anterioridad a Brucella o a sus antígenos.3.4. Puede liofilizarse en su totalidad o después de distribuirla en sus envases. Tanto los animales vacunados como los infectados dan reacciones positivas (78). France. 3. y luego se deja reposar a –20°C durante 24–48 horas. a) Control de lotes Esterilidad La esterilidad de las preparaciones de alérgenos debe comprobarse como se describe en el capítulo 1.9.5% hasta una concentración final del 5% (p/v) y se agitan durante 3 días a 4°C.1 ml de una dilución al 1/10 de la preparación examinada. La ausencia de sensibilización alérgica o serológica se comprueba mediante la inoculación intradérmica de tres cobayas albinos normales. Las células bacterianas se eliminan mediante centrifugación como se ha descrito con anterioridad y el sobrenadante se concentra a un cuarto de su volumen mediante ultrafiltración con una membrana Diaflo PM10 (Amicon) y se precipita añadiendo tres volúmenes de etanol frío. Deben determinarse el pH y la concentración de proteína y realizarse pruebas de identidad en la totalidad del material obtenido antes de proceder al llenado de los envases. Método de producción (2) Las células de la cepa B115 de Brucella melitensis se inactivan después del cultivo elevando la temperatura a 70°C durante 90 minutos. el sobrenadante. También se inyectan subcutáneamente cinco ratones normales con 0. El procedimiento estadístico puede obtenerse del Laboratorio de Referencia de la OIE para Brucelosis. 5 ml de brucelina examinada. se determinan mediante análisis sus proteínas y carbohidratos. Se resuspenden en cloruro sódico estéril al 2. Francia) una brucelina de referencia nacional que puede obtenerse del Laboratorio de Referencia de la OIE para la Brucelosis. 4. c) Potencia La potencia de las preparaciones de brucelina se determina mediante la inyección intradérmica de dosis graduales de brucelina en cobayas que se han sensibilizado con inoculación subcutánea con 0. La capacidad dermonecrótica se examina mediante la inoculación intradérmica de 0. — Brucelosis bovina dosis de 100 µg por vía intradérmica e induce una reacción local de hipersensibilidad retardada que es visible a las 48–72 horas en animales sensibilizados.1. Los animales se observan durante 7 días y no debe haber reacción local o generalizada a la inyección. FC) ni deben desarrollar respuestas de hipersensibilidad retardada. Sin embargo. La vacuna con B. Debe tenerse cuidado en evitar la inyección accidental o la contaminación de las mucosas.).3. f) Conservantes No se recomienda el uso de conservantes en las preparaciones liofilizadas. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 707 . se puede utilizar mertiolato sódico como conservante (máximo 0.Capítulo 2.c. b) Potencia Se realiza por inyección de una única dosis en cobayas según el procedimiento descrito en la sección C1. g) Precauciones (riesgos) La brucelina no es tóxica. esto produce protección sin una respuesta duradera de anticuerpos y reduce los riesgos de aborto y de la excreción en la leche. Estas pruebas pueden omitirse en el lote si se realiza la prueba completa en los lotes finales de llenado. El equipo de inyección utilizado y los recipientes deben descontaminarse cuidadosamente o eliminarse por incineración en contenedores adecuados de desecho. Se puede administrar al ganado adulto una dosis reducida de 3 × 108 a 3 ×109 microorganismos. Las pruebas de seguridad in vivo son las descritas para el control de los lotes (véase la sección C1. La preparación comercial líquida debe mantener su potencia hasta la caducidad recomendada. Se ha descrito la estandarización inicial de un lote de alérgeno y la sensibilización y titulación en rumiantes (2).4. ver nota 2 a pie de página) y cada lote ha de probarse para pureza (ausencia de microorganismos extraños). pero algunos animales desarrollan títulos duraderos de anticuerpos y pueden abortar y excretar la cepa vacunal por la leche (84).1 mg/ml). La virulencia residual y la inmunogenicidad de los lotes de inóculo para la producción de vacuna S19 deben comprobarse regularmente en ratones. a) Pruebas sobre el producto final Inocuidad La prueba de la esterilidad se debe llevar a cabo por el método recomendado.b.4. En la forma líquida. Los animales en la fase inicial de la infección. Si la preparación está liofilizada no debe reconstituirse hasta inmediatamente antes de su uso. abortus S19 induce una buena inmunidad frente a desafíos moderados por microorganismos virulentos. Los procedimientos de control para esta vacuna se indican más adelante. Vacunas Vacuna con la cepa 19 de Brucella abortus La vacuna más ampliamente utilizada para prevenir la brucelosis en el ganado vacuno es la vacuna con la cepa S19 de B. que continúa siendo la vacuna de referencia con la que se compara el resto de las vacunas. — Brucelosis bovina el alérgeno sensibilizante. Se utiliza como una vacuna viva que por lo general se suministra a terneras entre 3 y 6 meses como una dosis única subcutánea de 5–8 × 1010 microorganismos viables. e) Estabilidad La preparación liofilizada mantiene íntegramente su actividad durante varios años. viabilidad (bacterias vivas por dosis) y homogeneidad (determinación de la fase de disociación). pueden no manifestar hipersensibilidad a la inyección intradérmica. puede provocar reacciones graves de hipersensibilidad en individuos sensibilizados que se exponen accidentalmente a ella. o con infecciones crónicas. se puede administrar a ganado de cualquier edad en dos dosis de 5–10 × 109 microorganismos viables por vía conjuntival. Alternativamente. abortus. 5. C2. La vacuna debe prepararse a partir de inóculos derivados del USDA (para dirección.4. d) Duración de la sensibilidad La duración de la sensibilidad es dudosa. El grado de hipesensibilidad a la brucelina de los animales varía individualmente de forma considerable. Sin embargo solo hay un solo trabajo sobre esta materia que demuestra que S19 es capaz de controlar B.4 × 1010 microorganismos viables de la cepa RB51. Pueden ocurrir abortos cuando se utiliza la S19 en animales preñados (52. para determinar si la vacuna produce enfermedad en el hombre. 91). 87). melitensis. la vacunación de los adultos con 109 UFC (unidades formadoras de colonias) de RB51 no se ha asociado con notificaciones de incrementos significativos de abortos en las condiciones de campo (71). es motivo de controversia (55. La vacunación del ganado con mayor edad solo se hace bajo autorización de organizaciones estatales o federales de Sanidad animal y la dosis recomendada es de 1–3 × 109 microorganismos viables de la cepa RB51 (70. Además. ver nota 2 a pie de página) y utilizarse para producir un lote de inóculos conservado por liofilización o por congelación en nitrógeno líquido. EE. un mayor porcentaje de los vacunados con S19 eliminaron la cepa vacunal en la leche por un tiempo superior al del ganado vacuno vacunado con RB51 (71. Este estudio incluyó 26 participantes expuestos a la vacuna durante la vacunación de animales. En base a estas observaciones. Hasta que se realicen estudios sobre la seguridad y eficacia de Rev. Se han realizado estudios parciales con la RB51 en humanos. 58). No existen informes sobre datos epidemiológicos semejantes relativos a la vacunación de adultos con RB51. Debe destacarse que la S19 puede infectar al hombre y causar fiebre ondulante si no se trata (95). donde está bien documentado que se desarrolla la fiebre ondulante por exposición accidental sin tratamiento preventivo. En amplios estudios de tipo comparativo sobre las vacunas con S19 y RB51. pero parece que.1 debería ser una vacuna más eficaz en estas condiciones. abortus es la vacuna oficial en muchos países para la prevención de la brucelosis en el ganado vacuno (82). melitensis en ganado vacuno en países con una elevada prevalencia de esta infección en pequeños rumiantes (90). en Atlanta. En EE. El uso de S19 como vacuna de adultos en los rebaños infectados por Brucella ha facilitado la disminución de los abortos en los rebaños de ganado vacuno con infección aguda aunque no crónica (6). Cada país utiliza métodos ligeramente diferentes de administrar la vacuna. En contraste.1 en la infección del ganado vacuno por B. 79). El diagnóstico de la infección por RB51 requiere pruebas especiales que no están disponibles en la mayoría de los hospitales. del Departamento de Salud y Servicios Humanos.UU. — Brucelosis bovina Vacuna con la cepa RB51 de Brucella abortus Desde 1996 la cepa RB51 de B. 86. (CDC). establecieron una vigilancia pasiva sobre la inoculación accidental con la vacuna RB51 en EE. cuando los terneros vacunados con S19 fueron vacunados como adultos con RB51. 88). 79). 90). Tal como se ha demostrado en estudios realizados en EE. no se han realizado experimentos sobre la eficacia de Rev. 82). a) Control de inóculos Características del inóculo El inóculo original de B. 72.4. Georgia. El estudio indicaba que un uso apropiado de antibióticos protegía contra la infección pero no ha quedado determinado hasta qué punto otros componentes de la vacuna contribuyen a los efectos adversos (60). 85. Los Centros para el Control de Enfermedades. los terneros se vacunan subcutáneamente entre los 4 y 12 meses con 1–3.UU. 86).s 1.1 de Brucella melitensis Es frecuente aislar B. melitensis en el ganado vacuno a diferentes condiciones fisiológicas y bajo situaciones estrictamente controladas. Esto contrasta con la cepa 19. Vacuna con la cepa Rev. En otros países se recomienda la vacunación de terneros (4–12 meses) con dosis de 1–3.4 × 1010. el riesgo de padecer fiebre ondulante después de la exposición es mínima (5. 73.UU. El número de casos descritos de pacientes en este estudio (veinte y seis) es pequeño comparado con el número de vacunaciones (varios millones de terneros vacunados) y con las predicciones estimadas de inoculaciones fortuitas con la cepa RB51 (8 por 11. abortus S19 para producir vacunas debe obtenerse del USDA (para dirección. Tanto la RB51 como la S19 se han aislado de la leche de los vacunados después de la vacunación de los adultos (58. Los procedimientos de control para esta vacuna se indican más adelante. Debería informarse a los facultativos que toman decisiones respecto al tratamiento profiláctico por una exposición accidental a la RB51 que la cepa de esta vacuna es muy resistente a la rifampicina.000). Sin embargo. Las propiedades de este lote de inóculos deben ser las de un cultivo puro 708 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . la seguridad de esta vacuna es prácticamente desconocida en este ganado (8. melitensis en condiciones de campo (42. esta vacuna no debería recomendarse para esta especie. 84. en comparación con la S19. melitensis en el ganado vacuno y se ha supuesto que la Rev. Ha habido cierto debate sobre la eficacia protectora de la cepa S19 en infecciones por B. 56. la eficacia de la cepa RB51 en comparación con la protección inducida por la S19 en el ganado vacuno. debería aplicarse con prudencia la vacunación de vacas preñadas con S19 o RB51. 73. uno de los antibióticos de elección para el tratamiento de la brucelosis en los humanos. y la revacunación de 12 meses en adelante con una dosis similar para inducir un efecto de recuerdo y aumentar la inmunidad (79.3.UU.Capítulo 2.1 contra B. 3. o Veterinary Technologies Corporation. y pueden producirse infecciones accidentales. EE. pero se desconoce su duración exacta. 22). La duración de la protección frente a B. El microorganismo es atenuado en terneros y en adultos. melitensis es también desconocida. El microorganismo se comporta como una cepa atenuada para ratones. 9 Colorado Serum Company.g. azul de tionina e i-eritritol a las concentraciones recomendadas.3. Método de producción Para la producción de la vacuna S19 se pueden utilizar los procedimientos descritos anteriormente. En cualquier caso. excepto que las células se recogen en PBS. La vacuna es estable y no revierte de fase in vivo ni in vitro. disociación e identidad. abortus (2). abortus biovariedad 1 no dependiente de CO2. La cepa vacunal es estable y su reversión a la forma virulenta es extremadamente rara. La vacuna es segura para la mayoría de los animales si se administra a terneros entre 3 y 8 meses de edad. Produce una inmunidad duradera para un desafío moderado con cepas virulentas de B. que sea sensible a la bencilpenicilina. la cepa RB51 no induce anticuerpos detectables contra el antígeno OPS utilizando los procedimientos actuales de prueba (86). Antes de mezclarlas. Blacksburg. En casos raros puede producir una infección localizada en el tracto genital. abortus RB51 está comercializado9.O. b) Método de cultivo Para producir la vacuna de cepa S19 de B. 1872 Pratt Drive. pH 6. las inoculaciones accidentales deben tratarse con los antibióticos apropiados (véase la sección C2.4.5 g/litro. Además. Deben hacerse las mismas pruebas en el producto final. c) Validación como vacuna Muchos estudios independientes han confirmado el valor de la cepa S19 como vacuna que protege al ganado vacuno de la brucelosis. El producto final desecado no debe someterse a temperaturas superiores a 35°C durante el secado y el contenido en humedad residual debe ser el 1–2%. abortus es muy similar al utilizado para la S19. Produce inmunidad a desafíos moderados de cepas virulentas. Si se emplea un estabilizador debe tenerse en cuenta la pérdida de viabilidad en la liofilización. El producto obtenido de un fermentador o las células agrupadas de un lote de cultivos en frascos de Roux que se hayan inoculado al mismo tiempo y con el mismo lote de inóculo constituye una cosecha individual. Suite 1100B. abortus. 2. e incluso los grandes inóculos desaparecen rápidamente de los tejidos. Los ajustes de concentración se hacen añadiendo PBS a la vacuna presentada en forma líquida o un estabilizador a la forma liofilizada.Capítulo 2. El inóculo original de B. Denver. concentración celular. Con adultos. Box 16428. P. La cepa RB51 de B. y no debe superar el 50%. Parte del ganado vacunado como terneros puede desarrollar más tarde artropatía. Cuando se administra involuntariamente a animales grávidos se ha asociado con la aparición de cepas que utilizan i-eritritol. EE..UU. Estas compañías tienen los derechos legales de la vacuna. abortus sigue métodos similares de cultivo. Se puede juntar más de un lote para formar la masa final que se utiliza para llenar los recipientes terminales de un lote de vacuna. y desaparece rápidamente de los tejidos. y han de mantenerse a 4°C. Colorado 80216-0428. que debe tener un número de microorganismos viables comprendido entre 8 y 24 × 109 UFC/ml. Se debe tener cuidado en su preparación y manejo. El microorganismo se comporta como una cepa atenuada cuando se suministra a ganado sexualmente inmaduro. abortus se cultiva en un medio libre de suero o de otros productos animales. Puede utilizarse también en animales adultos con dosis reducida. bajo condiciones similares a las descritas antes para las cepas S99 ó S1119-3 de B. Estudios sobre desafíos experimentales y desafíos realizados en condiciones de campo destacan el valor de la cepa RB51 de B. así como incluir un aviso de riesgo en la etiqueta de los recipientes finales. Como esta cepa expresa niveles mínimos de sLPS no se produce seroconversión frente a sLPS en animales vacunados. El microorganismo se comporta como una cepa atenuada en varios tipos de animales. pero su duración exacta es desconocida. particularmente en las articulaciones de la tibia y el fémur (10.UU. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 709 . y se depositan por centrifugación o añadiendo carboximetil celulosa sódica a una concentración final de 1.). en cada lote individual se ha de comprueba la pureza. y que tenga una patogenicidad mínima en cobayas.4. 4950 York Street. Los envases deben cerrarse al vacío o en nitrógeno seco inmediatamente después del secado. es probable que se produzca una respuesta persistente de anticuerpos durante 6 meses o más en una proporción notable del ganado vacunado subcutáneamente con la dosis estándar. como en ratones. El proceso de producción para la cepa BR51 de B. abortus en la protección del ganado frente a la brucelosis. Las vacunas de capas S19 y RB51 tienen cierta virulencia para el hombre. Virginia 24060. — Brucelosis bovina de B. En los lotes debe comprobarse también el número de microorganismos viables. También debe realizarse una prueba de seguridad de la vacuna S19 en cobayas.4. Sin embargo.). La pureza y le fase rugosa de la vacuna con cepa RB51 de B. que puede realizarse mediante medidas de opacidad.1. Seis de las hembras se inyectan con una o con tres dosis recomendadas. abortus. En los lotes finales de llenado debe realizarse una determinación de microorganismos viables. inmunogenicidad y virulencia residual (9). si es satisfactoria respecto a su identidad. puede realizarse en ganado cuando se inicia un nuevo proceso de fabricación o cuando se espera alguna modificación de la seguridad de la vacuna. a) Control de lotes Esterilidad Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en los materiales biológicos se encuentran en el capítulo 1. abortus biovariedad 1 pero no requiere CO2 para crecer. pero en los lotes finales de llenado debe realizarse una determinación de microorganismos viables. b) Inocuidad La vacuna S19 es per se un producto virulento y debe mantenerse con mínima virulencia para que sea eficaz (véase la sección C2. se pueden inyectar intraperitonealmente ratones Balb/c hembras de 8–10 semanas con 1 × 108 UFC y se cultivan los bazos a las 6 semanas post-inoculación. abortus S19 tiene las propiedades normales de una cepa de B. Los animales no deben mostrar signos nocivos ni debe haber mortalidad. • Fase lisa (determinación de la fase de disociación) La vacuna S19 reconstituida en agua destilada se siembra en estría en seis placas con medio sólido (agar suero-dextrosa o agar tripticasa-soja (TSA) con 5% [v/v] de suero o 0.3. Los bazos deben estar libres de la cepa RB51 y los ratones no deben desarrollar anticuerpos anti-OPS. Las placas se incuban a 37°C durante 5 días y se examinan con luz 710 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . pH 7. No deben producirse lesiones locales o sistémicas significativas. abortus S19 debe comprobarse durante la preparación de cada cosecha individual. no se realizan pruebas de inocuidad con la vacuna de la cepa RB51 de B. ni crece en presencia de bencilpenicilina (3 µg/ml = 5 UI/ml). A grupos de 10 animales como mínimo se inyectan por vía intramuscular dosis de vacuna diluida en PBS. • Identidad La vacuna de cepa S19 reconstituida no debe contener microorganismos exógenos. serológicas y bioquímicas adecuadas y por cultivo: B. También debe comprobarse la concentración celular. Si para una dosis y una vía de administración dadas la prueba da buenos resultados para un lote representativo de vacuna. 4. c) • Potencia Vacuna S19 Una vacuna S19 es eficaz si posee las características de la cepa original S19. La B. Control del proceso La pureza y la fase lisa de la vacuna con B. Las pequeñas diferencias son más obvias en las colonias adyacentes que en las separadas. que contengan 5 × 109 microorganismos viables. Cada lote de seis terneras se mantiene por separado y se observan durante 21 días. es decir. Este control debe realizarse como sigue: la prueba utiliza 12 terneras de 4–6 meses. — Brucelosis bovina 3.2. azul de tionina (2 µg/ml) o i-eritritol (1 mg/ml) (concentraciones finales). abortus presente en la vacuna se identifica por pruebas morfológicas.1% [p/v] de extracto de levadura) de modo que las colonias estén juntas en algunas zonas mientras que en otras estén semiseparadas y en otras separadas.c. abortus debe probarse durante la preparación de cada cosecha individual.4. Su concentración en los recipientes finales debe ser de 1–3. También debe comprobarse la concentración celular. También debe comprobarse su identidad mediante pruebas de aglutinación con antisuero contra el antígeno A de Brucella. Normalmente. no tiene que repetirse con lotes de inóculo o de vacuna preparados con el mismo inóculo original y con el mismo proceso de fabricación. Si se desea. no se realiza rutinariamente una prueba de inocuidad.5. La concentración de microorganismos viables en los recipientes finales no debe ser inferior a 50 × 109 por cada dosis estándar después de la liofilización y al menos el 95% de las células deben estar en la fase lisa.Capítulo 2. Todas las colonias deben ser negativas en pruebas puntuales con MAb específicos para el antígeno OPS. Si se desea.4 × 1010 UFC por dosis (dosis de 2 ml aplicadas subcutáneamente) y el 100% de las células deben estar en fase rugosa. fase lisa. • Determinación de bacterias vivas Se siembran al menos cinco placas de agar triptosa. desarrollado específicamente para calcular RT50 (para obtener el SAS específico. — Brucelosis bovina reflejada oblicua (método de Henry) antes y después de teñir (tres placas) con cristal violeta (método de tinción de White & Wilson). Si no existe paralelismo. La función de distribución de este porcentaje describe una curva sigmoidal que debe linearizarse para calcular los valores RT50. abortus que se vaya a probar (vacuna problema) y del cultivo original de inóculo de S19 (como cepa de referencia).Capítulo 2. Las colonias R tienen un aspecto seco. Para esto. utilizando el SAS diseñado para este propósito.4. mediante el procedimiento computarizado PROBIT en el sistema estadístico SAS. la virulencia residual de la cepa problema se considera inadecuada y se rechaza.1 ml (108 UFC/ratón) de la suspensión de la vacuna problema en cada una de 32 hembras de ratón CD1 de 5–6 semanas. se puede obtener del USDA (para dirección ver nota 2 a pie de página). ver la dirección en la nota 5 a pie de página). A veces se observa un film superficial teñido que se despega de una colonia disociada y aparece adyacente a ella. Las colonias mucoides (M) son transparentes y grisáceas y pueden distinguirse por su consistencia pegajosa cuando se las toca con un asa de siembra. Apariencia de las colonias después de teñir con cristal violeta: Las colonias S no toman el colorante. 37. vii) Comparar estadísticamente el paralelismo (corte y pendiente) existente entre las líneas de distribución obtenidas para la cepa problema y para la cepa S19 de referencia. Además la S19 es sensible a la rifampicina. brillantes y de color azul a verde-azulado.1 ml de diluciones apropiadas de la vacuna que se extienden con un asa de vidrio. Extender en cada caso toda la suspensión completa de bazo sobre varias placas con un medio apropiado de cultivo e incubar en condiciones estándar para Brucella durante 5–7 días (límite inferior de detección: 1 bacteria por bazo). si son mucoides. KH2PO4 1.3. 24. Se pueden comparar estadísticamente dos valores RT50 solo cuando derivan de líneas de distribución paralelas. A las 3. agua destilada 1000 ml. Un animal se considera infectado cuando se aísla al menos 1 UFC del bazo. Las colonias disociadas (I. comparar estadísticamente los valores RT50 obtenidos para la cepa problema y de referencia utilizando el SAS diseñado para este propósito. 6. de agar suero-dextrosa o de cualquier otro medio sólido adecuado con 0. M o R) se tiñen en varios tonos de rojizo a púrpura y su superficie puede mostrar grietas radiales. en grupos de ocho elegidos al azar. La cepa S19 original de siembra. granular y son de color blanco amarillento. La fase de la colonia puede confirmarse mediante la prueba de aglutinación con acriflavina (2): Las colonias S permanecen en suspensión mientras que las R aglutinan rápidamente y. iii) iv) v) vi) viii) Si se confirma el paralelismo. 9 y 12 semanas. pH 6.0 g. cuya inmunogenicidad y virulencia residual sea satisfactoria. Las colonias intermedias pueden quedar en suspensión o formar una aglutinación muy fina. ii) Inyectar subcutáneamente 0. sacrificar los ratones por dislocación cervical. Para esto se determina el número de ratones curados (sin colonias aisladas en el bazo) a cada punto temporal de sacrificio (ocho ratones por punto) y se calcula el porcentaje acumulado de ratones curados con el tiempo por el método de Reed y Muench (descrito en la refª. el RT50 obtenido con la cepa problema no debe diferir significativamente del Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 711 .170 cuando se lee a 600 nm). Se lleva a cabo un recuento de las UFC por unidad de volumen de la vacuna. En paralelo se realiza una inoculación similar en otros 32 ratones con la suspensión que contiene la cepa de referencia S19. El número exacto de UFC/ml se determina después mediante la siembra en placa de las diluciones decimales sobre un medio adecuado (se recomienda agar sangre o TSA).0 g. forman tiras.8) y se ajusta la suspensión con BSS a 109 UFC/ml con un espectrofotómetro (OD = 0. 75) Preparar suspensiones adecuadas del lote de siembra o de vacuna de cepa S19 de B. Apariencia de las colonias antes de teñir: Las colonias de tipo S aparecen redondas. metal o plástico. • i) Virulencia residual (tiempo de persistencia al 50% o tiempo de recuperación al 50%) (9. Las colonias intermedias (I) son las más difíciles de clasificar y tienen una apariencia intermedia entre las formas S y R: son ligeramente opacas y más granulares que las colonias S. K2HPO4 2. 7). Extraer los bazos y homogenizarlos aséptica e individualmente en 1 ml de BSS estéril con un desintegrador de vidrio (o con un Stomacher en bolsas estériles adecuadas). Para ser aceptable para la producción de vacunas.5 g. se recoge un cultivo de 24–48 horas de cada cepa en solución salina estéril tamponada (BSS: NaCl 8. Calcular el tiempo de persistencia al 50% o el tiempo de recuperación al 50% (RT50) por el método estadístico SAS. iv) v) vi) vii) viii) Cada bazo se homogeniza asépticamente con un desintegrador de vidrio (o con un Stomacher en sacos estériles adecuados) en nueve veces su peso con BSS. no tiene que repetirse rutinariamente con otros lotes de vacuna preparados del mismo lote de inóculo y utilizando el mismo proceso de producción.4. Cuando no se cuentan colonias en la placa de la dilución 1/10. ver la nota 5 a pie de página con la dirección de contacto). y de cada homogenizado se hacen tres diluciones decimales seriadas (1/10. 9).Capítulo 2. Por cuadruplicado. que se eligen al azar. ajustada y comprobada como antes. después de hacer la siguiente transformación: Y = log (X/log X). Este número de Brucella por bazo se anota como X y se expresa como Y. Inyectar subcutáneamente una suspensión de la vacuna de referencia S19 que contenga 105 UFC de bacterias vivas en cada uno de los seis ratones del segundo grupo.html.1 ml/ratón) a cada uno de los seis ratones del primer grupo. los bazos pueden congelarse y mantenerse a –20°C de 24 horas a 7 semanas. además. Se calcula la respuesta de cada grupo de seis ratones como media y desviación estándar. Si la prueba se realiza con buenos resultados en un lote representativo de inóculo o de vacuna problema. El número exacto de UFC inoculado se comprueba después por siembra en placa de diluciones decimales sobre un medio adecuado (se recomienda agar sangre o TSA).5.5. y se pesa y homogeniza.3 semanas). • Inmunogenicidad en ratón (7. se considera que el bazo está infectado con cinco bacterias. Alternativamente.1 ml/ratón) que contenga 2 × 105 UFC de la cepa 544 de B. ii) la respuesta de los ratones vacunados con la vacuna S19 de referencia es menor de 2. Las condiciones del experimento son adecuadas cuando: i) la respuesta de los ratones no vacunados (media de Y) es por lo menos 4. 8) Esta prueba utiliza tres grupos de seis ratones CD1 hembras.000) en el mismo diluyente. no tiene que repetirse rutinariamente con otros lotes de vacuna preparados del mismo lote de inóculo y utilizando el mismo proceso de producción. pH 6. abortus 544 que es dependiente de CO2). preparada. La vacuna problema es apta si el valor de inmunogenicidad obtenido en ratones vacunados es notablemente inferior al obtenido en los controles sin vacunar y si. 712 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 .2 ml en placas con medio sólido y se incuban dos placas a 37°C durante 5 días en atmósfera con un 10% de CO2 (permite el crecimiento de la cepa vacunal y la desafío) y otras dos placas en atmósfera normal (se inhibe el crecimiento de la cepa de desafío B. Las bases del procedimiento estadístico para el cálculo anterior de la virulencia residual se han descrito recientemente con detalle (7.fr/interne/Rev2.8.0 ± 1.1 ml de BSS. Alternativamente. 1/100 y 1/1. i) ii) iii) Preparar y ajustar espectrofotométricamente las suspensiones de vacuna como se indicó anteriormente. de 5–7 semanas. Se realizan comparaciones estadísticas (se recomienda la prueba de diferencias menos significativas [LSD]) de los valores de inmunogenicidad obtenidos en los ratones vacunados con la cepa S19 que se prueba respecto a los obtenidos en los ratones vacunados con la vacuna de referencia y el grupo control no vacunado. Sacrificar los ratones 15 días más tarde por dislocación cervical. 30 días después de la vacunación (e inmediatamente después de 16 horas de ayuno) todos los ratones se someten a una inoculación intraperitoneal de desafío con una suspensión (0. x) xi) Si esta prueba se realiza con buenos resultados en un lote representativo de vacuna problema. El tercer grupo sirve como grupo control sin vacunar y se inocula subcutáneamente con 0. se extienden 0. se elimina la grasa. (Para una información detallada de este procedimiento. — Brucelosis bovina obtenido con la cepa de referencia S19 (RT50 y los límites de confidencia son normalmente 7. y iii) la desviación estándar calculada en cada lote de seis ratones es inferior a 0. no difiere significativamente del obtenido en ratones vacunados con la vacuna de referencia. ix) Se cuentan las colonias de Brucella en las placas que contengan menos de 300 UFC. Cada bazo se corta asépticamente.3. abortus (dependiente de CO2). Inyectar subcutáneamente una suspensión de la vacuna examinada (vacuna problema) que contenga 105 UFC (en un volumen de 0.afssa. los cálculos estadísticos descritos en los pasos vi) a viii) se pueden evitar con un programa específico de fácil empleo HTML-JAVA (Rev2) recientemente desarrollado y disponible sin coste alguno en la dirección: http://www.8. B. g) Precauciones (riesgos) Aunque son cepas atenuadas. e) Estabilidad La vacuna S19 de B. Sin embargo no existe evidencia probada de esto y en áreas endémicas puede ser aconsejable la revacunación. se han aprobado y utilizado los recuentos de placas de microorganismos viables para medir la potencia (este enfoque es idéntico al utilizado en las pruebas de potencia para la vacuna con S19 en EE. las pruebas de potencia in vivo no se aplican de forma rutinaria para las series de vacunas con RB51. En EE. La vacuna liofilizada muestra una pérdida gradual de microorganismos viables pero debe conservar su potencia hasta el el final del período de caducidad recomendado. abortus no deben utilizarse conservantes antimicrobianos. Se ha discutido con bastante detalle sobre las vacunas rugosas para la brucelosis (55). Los residuos de vacuna y el equipo de inoculación deben descontaminarse con un desinfectante adecuado (de tipo fenólico. el CDC suministra recomendaciones para el tratamiento. En caso de exposición accidental debe requerirse atención médica. En EE. No se ha establecido adecuadamente la eficacia del tratamiento antibiótico de las infecciones causadas por las cepas S19 y RB51 en el hombre. se recomienda un tratamiento combinado con doxiciclina y rifampicina. La reconstitución y el posterior manejo de las vacunas deben hacerse con cuidado para evitar una inyección accidental o la contaminación de los ojos o la piel. a) Pruebas sobre el producto final Inocuidad Véase la sección C2.b.Capítulo 2. que deben tratarse con trimetoprim sulfametoxazol. Sin embargo. abortus preparada a partir de inóculos de orígenes apropiados muestra unas características estables siempre que se cumplan los requisitos descritos anteriormente sobre el control del proceso y de los lotes. El mantenimiento de la cadena de frío durante la distribución de la vacuna asegura su viabilidad. los cultivos celulares y las suspensiones deben manejarse bajo condiciones apropiadas de contención para bioseguridad.4. se ha aprobado y utilizado la determinación en placa de microorganismos viables (85).. abortus S19 y RB51 son aún capaces de causar enfermedad en el hombre. abortus tiene una disrupción en el gen wboA debida a un elemento IS711 que impide la síntesis de OPS. Datos no publicados indican que también contiene una segunda mutación que afecta al transporte de OPS a la superficie externa bacteriana o al acoplamiento de OPS con el núcleo del LPS. d) Duración de la inmunidad Se considera que la vacunación de los terneros con una dosis completa de vacuna S19 confiere inmunidad duradera. pero la correlación de la prueba con la protección de la vacuna en el ganado vacuno no está completamente determinada.4. abortus no muestra tendencia a revertir a la fase lisa de Brucella virulenta después de muchos pases in vivo o in vitro. un 5% de sacarosa y un 1% de glutamato sódico. En caso de contaminación con la RB51 (que es resistente a rifampicina) debe evitarse el tratamiento con rifampicina y debe utilizarse un régimen de doxiciclina y estreptomicina o gentamicina.UU). La cepa RB51 es muy susceptible a la tetraciclina y el tratamiento solo con doxiciclina puede ser satisfactorio (5). — Brucelosis bovina • Vacuna RB51 Como la dosificación (UFC) del inóculo primario se correlacionó con la protección como parte de la autorización de la RB51 para el ganado vacuno en EE. existen estudios parciales sobre el tratamiento de los humanos expuestos a la RB51 (5) y ha habido al menos un informe de infección en humanos con RB-51. 5. La cepa RB51 de B. y no tiene tendencia a revertir a la virulenta. y no se recomiendan dosis posteriores. Se ha propuesto una prueba con ratones Balb/c hembras utilizando 1 × 104 microorganismos de la cepa 2308 de B. por ejemplo Triptona (Oxoid).3. Esto se debe probablemente a la naturaleza y localización de las mutaciones en esta cepa.UU. iodóforo o aldehído) a la concentración adecuada. o a ambos procesos. Si se produce contaminación por la cepa S19.UU.5% de hidrolizado de caseína. En función de este fenómeno se establece un cierto margen de seguridad. excepto en las mujeres embarazadas. sin embargo.UU. f) Conservantes En las vacunas vivas S19 o con la cepa RB51 de B. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 713 . disuelto en agua y esterilizado por filtración. Para la preparación de la vacuna liofilizada se recomienda un estabilizador que contenga 2. abortus como cepa de desafío. La cepa RB51 de B. de tal forma que el número de viables antes de la liofilización sea superior al mínimo exigido. . BRICKER B. Am. (1984). (1989).M.M. 15.J. Stand. Antimic. 19–20.G. PCR as a diagnostic tool for brucellosis. (1993). Spiegel R. 18. (1992). 11. The Netherlands. & JENSEN A. ed. 16. 13.E. GRAYON M.L. Enhancement of the Brucella AMOS PCR assay for differentiation of Brucella abortus vaccine strains S19 and RB51. BRICKER B. Paris. Le vaccin Rev. Techniques for the Brucellosis Laboratory. d'Immun.). and 4. 3435–3439. 37. 15. Vaccine.. 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