5/03/2018Introducción Unidad 3 Catalizadores biológicos: por primera vez a comienzos del ENZIMAS s. XIX: digestión de la carne por secreciones del estómago y la conversión del almidón en azúcar por la saliva. 1835: J.J. Berzelius: Diastasa de la malta, señalando que la hidrólisis del almidón se catalizaba más eficazmente por ésta que por el ácido sulfúrico. 1860: Louis Pasteur: propusó que la fermentación del azúcar para transformarse en alcohol era inducida por ciertos catalizadores biológicos, llamados inicialmente "fermentos". Pasteur supuso que dichos catalizadores se hallaban unidos de modo indisoluble a la estructura de las células de la levadura por lo que no podían actuar fuera de estas. Introducción POLÍMEROS BIOLÓGICOS 1878: Kühne: Denominación "enzima" (etimológicamente "en • Catalizadores; aceleran la velocidad la levadura"). Invertasa, diastasa, pepsina ya aisladas; ≠ de Rxns bioquímicas y no se altera de forma permanente por la reacción Levadura (Formada por células). ENZIMAS 1897: E. Büchner: Extrae de las células de la levadura; • Reacción bioquímica: cuando las moléculas que chocan poseen una enzimas que catalizan la fermentación alcohólica. Demostró cantidad mínima de energía (energía de activación, Ea, o energía libre de que pueden actuar independientemente de la estructura activación, ΔG). celular. Estudio "in vitro" la actividad y propiedades de los • Energía de activación (ΔG): cantidad enzimas, aislarlos en estado puro y analizar su composición. de energía que se requiere para convertir 1 mol de moléculas (sustrato o reactante) desde el Segunda mitad del siglo XX: se purifican y caracterizan estado basal (la forma basal de baja energía) al estado de transición millares de enzimas, lo que ha permitido conocer su mecanismo de acción. • Estado de transición: intermediario transitorio en el que no existe sustrato libre ni producto. Enzimas • Son proteínas. Pero no todas las proteínas son enzimas • Son específicas • Funcionan en soluciones acuosas bajo suaves condiciones de T° y pH • Su actividad puede regularse • Muy potentes y eficaces • Actúan en pequeñas cantidades • Se recuperan indefinidamente • No llevan a cabo Rxs que son E desfavorables • No modifican el sentido de los equilibrios químicos ACTIVIDAD BIOLÓGICA de Enzimas Diagnóstico enfermedades Enfermedad de Gaucher: falta de enzima glucocerebrosidasa. Se acumulan sustancias dañinas en el hígado, huesos, médula ósea: impiden que células y órganos funcionen apropiadamente. Fenilcetonuria: ausencia de enzima fenilalanina hidroxilasa (Phe -X Tyr). Phe se acumula y retraso mental. 1 5/03/2018 AUMENTO DE LA VELOCIDAD DE REACCION: ESTRUCTURA DEL SISTEMA ENZIMÁTICO Actividad Catalítica ENZIMAS: Formadas por una o varias cadenas proteínicas. Depende: SUSTRATO: Molécula sobre la que actúa la enzima y cuya transformación está condicionada por ella. 1. Moléculas con energía cinética suficiente PRODUCTO: molécula resultante de la acción de la enzima sobre el o los sustratos (a menudo se obtiene varios productos) 2. Orientación correcta para reaccionar (aproximación Holoenzimas: Poseen una parte proteica llamada apoenzima y otra no proteica entre si a la distancia de formación de enlace) denominada cofactor. 3. Concentración de los reactivos HOLOENZIMA = APOENZIMA + COFACTOR Cofactor: componente químico adicional necesario para la actividad enzimática. 4. Enzimas: nativa o desnaturalizada, otros grupos Iones metálicos. Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+; moléculas orgánica: PLP, pridoxal fosfato; químico. FAD: flavin adenina dinucleótido. Son esenciales: estructuras 1aria, 2aria, 3aria, 4aria Unión al apoenzima es covalente Grupo prostético: proteínas conjugadas. No es covalente Coenzima: se modifican durante la reacción química: NAD+ NADH Muchas vitaminas son cofactores o precursores de cofactores de enzimas. Grupo prostético Función Flavín mononucleótido Reacciones redox Flavín adenín dinucleótido Reacciones redox Pirroloquinolina quinona Reacciones redox Transaminación, descarboxilación Fosfato de piridoxal y desaminación Biotina Carboxilación Metilcobalamina Metilación e isomerización Pirofosfato de tiamina Descarboxilación Hemo Reacciones redox Molibdopterina Reacciones de oxigenación Ácido lipoico Reacciones redox 2 5/03/2018 Apoenzima Un tercio de los enzimas requieren algún ión -Proteína globular formada exclusivamente por secuencias de aminoácidos. -Determinan la especificidad de la reacción enzimática. metálico para catalizar -Se pueden distinguir 4 tipos de AAs según la función que desempeñen en la actividad enzimática. a) No esenciales: No intervienen en el proceso catalítico. Si se eliminan de la cadena, la enzima no Enzima Cofactor pierde la actividad enzimática. b) Estructurales: Mantienen la estructura tridimensional de la proteína. No intervienen directamente Citocromo oxidasas Cu+2 en la actividad enzimática, pero si se alteran pueden cambiar la posición del grupo activo. Citocromo oxidasas, Catalasas, Peroxidasas Fe o Fe+3 +2 c) De unión o de fijación: Establecen enlaces débiles con el sustrato orientándolo para aproximar la Piruvato quinasa K+ parte del mismo que ha de ser atacada por la enzima. Hexoquinasas, Glucosa6-P, Piruvato quinasa Mg+2 d) Catalíticos: Se unen al sustrato mediante un enlace covalente debilitando su estructura y favoreciendo su ruptura. Dinitrogenasa Mo Ureasas Ni+2 Centro Activo Glutation Peroxidasa Se -Pequeña parte de enzima: lugar donde encaja específicamente el sustrato. -Tiene una estructura tridimensional en forma de hueco, generalmente hidrófoba -Es donde actúan las cadenas laterales de los aminoácidos con poder catalítico -El centro activo se une al sustrato y, si lo hay, al coenzima. ACTIVADORES, INHIBIDORES y MODULADORES Modifican la velocidad de las reacciones enzimáticas ACTIVADORES: Iones que aceleran la velocidad de una reacción Son cationes: Mg2+, Mn2+, Ca2+, K+ En ocasiones se unen a la apoenzima. Más común con el sustrato o la coenzima. INHIBIDORES: Sustancias que disminuyen la velocidad de reacciones catalizadas por las enzimas MODULADORES: Moléculas que actúan sobre enzimas oligoméricas Con características de cooperatividad funcional Influyen sobre la velocidad de Rxs enzimáticas: • POSITIVOS: Estimulan la velocidad. • NEGATIVOS: Inhiben la velocidad. NOMENCLATURA Y CLASIFICACIÓN 1. Denota la subclase a la cual pertenece la enzima. Indica mayor especificidad de los cambios químicos señalados por la subclase (7). Por ejemplo, detallar sobre Antiguamente, recibían nombres particulares asignados por su descubridor antes de cuáles átomos se realizan las oxidaciones o reducciones, o cuales reciben a los que conocer función. se transfieren o cuales grupos o átomos se transfieren o desprenden o cuales enlaces se forman o rompen. PEPSINA actúa en la digestión. Pepsin griego: digestión. 1. Este último número corresponde a la identificación precisa de las sustancias sobre Se basan en la reacción química catalizada (propiedad específica de cada enzima). las cuáles actúa la enzima, y normalmente indica el orden en el que cada enzima se va agregando a la lista. COMISIÓN ENZIMÁTICA (1964) – Unión Internal de Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB): nombre de completo no ambiguo y código numérico. EC 2.7.1.1. ATP glucosa fosfotransferasa: cataliza la transferencia de un grupo fosforil desde ATP a glucosa. 2: Clase a la cual pertenece la enzima. Indica el cambio químico global que realiza la enzima sobre el sustrato. 7: Subclase. Un cambio más específico en la transformación del sustrato. El grupo funcional que se oxida o se reduce. El grupo funcional que se transfiere. El grupo funcional que se transforma. El enlace que se forma o se destruye. 3 5/03/2018 NOMENCLATURA Sistemática: Cada enzima tiene 2 partes: 1.- Nombre del sustrato (o sustratos) 2.- Tipo de reacción catalizada 3.- Terminación ASA Ejemplo: Ejemplos: CLASIFICACIÓN: 6 grupos de enzimas. 1.- OXIDO-REDUCTASAS Enzimas relacionadas con las oxidaciones y las reducciones biológicas. Transferencia 3.- HIDROLASAS de hidrógenos o e- . Hay varias subclases: Poseen la capacidad de introducir los elementos del agua, H+ y -OH, en el sustrato Deshidrogenasas y oxidasas importantes en los procesos oxidativos de la atacado, produciendo así su rompimiento respiración celular Peroxidasas usan agua oxigenada (H2O2) como oxidante Subclases importantes: Hidroxilasas incorporan átomos de oxígeno en los sustratos Esterasas atacan diversas uniones éster Fosfatasas enzimas encargadas de la eliminación de fosfato Glicosidasas sobre compuestos glucosídicos Enzimas activas sobre uniones peptídicas muy comunes en el aparato digestivo 2.- TRANSFERASAS 4.- LIASAS Catalizan el traspaso de grupos químicos entre dos sustratos (excepto el hidrógeno) Catalizan la introducción o la eliminación de un grupo químico a un doble enlace. Principales grupos: Tienen varias subclases de acuerdo con la unión atacada y el grupo separado o Metiltransferasas traspaso de grupos metilo entre 2 sustratos añadido: Aciltransferasas catalizan el traspaso de grupos acilo Descarboxilasas aldehído-reductasas Glucosiltransferasas catalizan el traspaso de residuos de azucares Cetoácido-liasa Transferasas enzimas de la transferencia de grupos nitrogenados Quinasas traspaso de grupos fosfatos por medio del ATP 5.- ISOMERASAS 6.- LIGASAS Catalizan diversos tipos de isomerización (óptica, geométrica, funcional, de posición) Intercorversión de isómeros Permiten la unión de 2 moléculas simultáneamente a la degradación del ATP u otro enlace químico, con la liberación de la energía necesaria para la unión de dichas Varias subclases: moléculas. Racemasas responsables de racemización de aminoácidos Epimerasas responsables de epimerización de azúcares Grupos importantes: Isomerasas cis-trans modifican la configuración geométrica a Acetil coenzima A sintetasa formadora de acetil-CoA a partir del nivel de un doble enlace acetato y coenzima A Óxido-reductasas intramoleculares catalizan la interconversión de aldosas y Enzimas activadoras de aminoácidos cetosas o cambian de lugar los dobles enlaces Transferasas intramoleculares (mutasas) facilitan el traspaso de grupos químicos de una parte a otra de la molécula 4 5/03/2018 PROPIEDADES A. Velocidades de las reacciones que catalizan extraordinariamente elevadas (aumento de la velocidad 105 veces mayor) REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Una molécula de enzima no tiene porque actuar siempre a la misma velocidad. Su actividad puede estar modulada por: Cambios en el pH Cambios en la temperatura Presencia de cofactores Las [sustrato] y [productos] Presencia de inhibidores Isoenzimas B. Muy especificas para las reacciones que catalizan (extremadamente selectivas; tipo de reacción, sustrato o conjunto pequeños de sustratos), poco habitual productos secundarios. C. Estructuras complejas D. Pueden regularse EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA • Los enzimas poseen grupos químicos ionizables • La mayoría de enzimas son muy sensibles a los (carboxilos -COOH; amino -NH2 ; Grupo R: tiol -SH; cambios de pH. imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus Aas. • Desviaciones de pocas décimas por o del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. • Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica +, -, 0. • Pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10. • Como la conformación de las proteínas depende, en • Ligeros cambios del pH pueden provocar la parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para conformación será la más adecuada para la actividad mantener estable el pH intracelular: Los catalítica. Este es el llamado pH óptimo. amortiguadores fisiológicos. EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ENZIMÁTICA 5 5/03/2018 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA • En general, ↑ Temp. aceleran las Rxs químicas: 10 ºC • Temp. Óptima: Temp actividad catalítica máxima. de incremento Vel. Rxn (↑ duplica). • Por encima de esta, el aumento de Vel de Rx debido a la • Rxs catalizadas por enzimas siguen esta ley general. temp es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, y la actividad , al ser proteínas, a partir cierta temp. (Desnaturaliza). enzimática decrece rápidamente hasta anularse. EFECTO DE LOS COFACTORES SOBRE LA ACTIVIDAD EFECTO DE LOS COFACTORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ENZIMÁTICA • Casi un tercio de los enzimas conocidos requieren para • Grupos prostéticos: Si cofactores y coenzimas se su función la presencia de sustancias no proteicas que encuentran unidos covalentemente al enzima. colaboran en la catálisis: cofactores y coenzimas. • Cofactores: Iones inorgánicos como el Fe++, Mg++, Mn++, • Holoenzima: La forma catalíticamente activa del enzima, es Zn++ etc.. decir, enzima unida a su grupo prostético. • Coenzima: Se trata de una molécula orgánica. • Apoenzima: La parte proteica de un holoenzima (inactiva). EFECTO DE LAS CONCENTRACIONES SOBRE LA EFECTO DE LOS INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA La Vel de Rx enzimática depende de la concentración de • Ciertas moléculas pueden inhibir la acción catalítica de un enzima: son los inhibidores. sustrato. • Estos inhibidores bien pueden ocupar temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el sustrato original (inhibidor La presencia de los productos finales puede hacer que competitivo) o bien alteran la conformación espacial del enzima, la reacción sea más lenta, o incluso invertir su sentido. impidiendo su unión al sustrato (inhibidor no competitivo). Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo 1 2 6 5/03/2018 Modulación alostérica de la Actividad Enzimática Modulación alostérica de la Actividad Enzimática EFECTO DE LA MODIFICACIÓN COVALENTE SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA • Otros enzimas pasan de una forma menos activa a otra Phosphorylation inactivates más activa uniéndose covalentemente a un grupo químico de pequeño tamaño como el Pi o el AMP. • También se da el caso inverso, en el que un enzima muy activo se desactiva al liberar algún grupo químico. Phosphorylation activates En las enzimas de las vías DEGRADATIVAS del metabolismo, la forma fosforilada es más activa que la no fosforilada, mientras que en las vías BIOSINTÉTICAS ocurre lo contrario. ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Modificación Covalente Irreversible Pro-enzimas o zimógenos: Enzimas que se sintetizan sin actividad enzimática, como Dentro del grupo de las modificaciones covalentes irreversibles, proteínas precursoras: destaca por su importancia, las modificaciones por Proteólisis Parcial. 1.Para activarse, sufren ataque hidrolítico liberación uno o varios péptidos. 2.El resto de la molécula proteica adopta la conformación y las propiedades del enzima activo. 7 5/03/2018 * Sin embargo la activación del pepsinógeno es un proceso Enzimas que se activan por proteólisis parcial mucho más simple: ENZIMA PRECURSOR - Tripsina Tripsinógeno Secreción pancreática - Quimotripsina Quimotripsinógeno Secreción pancreática - Elastasa Proelastasa Secreción pancreática - CarboxipeptidasaProcarboxipeptidasa Secreción pancreática - Fosfolipasa A2* Fosfolipasa A2 Secreción pancreática - Pepsina Pepsinógeno Secreción gástrica (jugo gástrico), actividad óptima pH 1-5 -Trombina Protrombina Parte del sistema de coagulación sanguíneo- - Quitina sintasa** Zimógeno Implicada en la formación del septum - El pepsinógeno es una proteína de masa molecular 40 kDa que durante la división celular en las levaduras se auto-hidroliza al bajar el pH, eliminándose un péptido de ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- * Dijkstra et al (1981) Nature 289, 604 ** Cabib (1976) Trends Biochem Sci. 1, 275 naturaleza básica de 44 AAs del extremo N-terminal. * Los zimógenos tras un proceso de proteólisis parcial, en el duodeno, se * La transformación de los zimógenos o proproteasas en transforman en las correspondientes enzimas activas. Estas enzimas tras proteasas activas la podemos representar esquemáticamente de cumplir sus fines, se degradan completamente, por lo que no ponen en la siguiente manera: peligro el tejido intestinal. Tripsinógeno Enteopeptidasa Enteropeptidasa Quimotripsinógeno Tripsina Proelastasa Procarboxipeptidasa -Quimotripsina Elastasa Carboxipeptidasa -Quimotripsina * El primer paso es la activación de la tripsina en el duodeno. * Se elimina un hexapéptido del extremo N-terminal del tripsinógeno gracias a la enteropeptidasa, proteasa secretada por las células duodenales. 8 5/03/2018 ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA DE LA ACTIVIDAD Cómo actúa enzima? ENZIMÁTICA • Centro activo; superficie de unión de forma única Función del centro activo: • Si por alguna razón se activa en el propio páncreas, la glándula sufre un proceso de autodestrucción (pancreatitis aguda), a menudo mortal. 1. Es el sito de unión del sustrato a la enzima (pequeña hendidura o Dado que la activación de la tripsina puede ser autocatalítica, la presencia grieta) de una sola molécula activa de tripsina podría poner en marcha toda la cadena de manera prematura. 2. Los aminoácidos presentes participan activamente en el proceso catalítico * En consecuencia el páncreas se protege a sí mismo mediante la síntesis de una proteína denominada Inhibidor de la Tripsina Pancreática Secretora. Este inhibidor competitivo se une de manera tan intensa al 3. La información dentro del lugar activo; su forma y distribución centro activo de la tripsina que la inactiva de manera efectiva incluso a de carga se utiliza para orientar concentraciones muy bajas. de forma óptima al sustrato 4. Reduce la energía necesaria para que se produzca la reacción hasta el producto Acción enzimática ESPECIFICIDAD ENZIMA SUSTRATO Característica de mayor relevancia Determinante en la regulación del metabolismo celular PRODUCTO Reduce la variedad de sustratos sobre los que una enzima puede actuar INHIBIDOR Tipos de especificidad: • Proporcionan una ruta de reacción que requiere de menos energía de activación a) La especificidad óptica; solo sobre isómeros de la que la reacción sin catalizar serie L (catabolismo de aminoácidos), sobre los de la serie D (metabolismo de carbohidratos) • No altera el equilibrio si no que aumenta la velocidad hacia el equilibrio b) Especificidad de grupo; sobre un grupo • El equilibrio se alcanza en segundos o minutos en lugar de horas o días determinado de moléculas CÓMO ACTUA ENZIMA? ACCIÓN ENZIMÁTICA Reacción en varios pasos, el paso o pasos con Ea más alta: ETAPA LIMITANTE 9 5/03/2018 ACCIÓN ENZIMÁTICA ACCIÓN ENZIMÁTICA ACCIÓN ENZIMÁTICA TEORÍAS DE LA ACCIÓN ENZIMÁTICA 1. Modelo llave-cerradura ( Emil Fischer) 2. Modelo de ajuste inducido (Daniel Koshland) 3. Estado de Transición (Henry Eyring) 1. Modelo llave-cerradura 2. Modelo de ajuste inducido (estructura flexible de las (lugar activo rígido) proteínas): Cada enzima se une a un El sustrato no se ajusta con único tipo de sustrato precisión a un lugar activo rígido. El lugar activo de la enzima y el sustrato Las interacciones no covalentes poseen estructuras entre la enzima y el sustrato modifican la estructura complementarias tridimensional del lugar activo. El sustrato entra e interacciona con el lugar Tanto E y S sufren alteración. activo (forma global y distribución de carga) 10 5/03/2018 3. ESTADO DE TRANSICIÓN • La enzima y el sustrato sufren cambios conformacionales en el estado de transición • El sitio catalítico no es un lugar estático y rígido, dinámico y transitorio • Al final de la reacción la enzima recupera su estructura original FUENTE Y APLICACIÓN • La forma del lugar activo adopta la forma del sustrato en la conformación del estado de transición ENZIMÁTICA ANIMALES, PLANTAS Y MICROORGANISMOS: FUENTES DE ENZIMAS PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE ENZIMAS Procedencia comercial de las enzimas: Descubrimiento de enzimas digestivas → S. XIX. Microbianas Desarrollo de métodos obtención de enzimas Matanza Plantas de animales. Animales Pepsina: Forro de estómago de cerdos y ganado, del cuajo del estómago de becerros. Etapas en la obtención de enzimas industriales: Tripsina, Quimiotripsina, Lipasas y amilasas: Páncreas de Selección de la fuente cerdo (Cócteles de enzimas) . Optimización de la producción Extracción, aislamiento y purificación Ingeniería y diseño de enzimas ANIMALES, PLANTAS Y MICROORGANISMOS: ANIMALES, PLANTAS Y MICROORGANISMOS: FUENTES DE ENZIMAS FUENTES DE ENZIMAS Europa: Difícil obtener enzimas de plantas. Ablandadores de carne, digestión y limpieza de lentes de contacto. Suministro y concentración de las enzimas varía con las estaciones del año. Papaina: Papaya. Requerimiento de grandes cantidades de plantas Ficina: (Cisteinilproteasa): Higueras. como material. Procesamiento de grandes cantidades de plantas: Trabajo Duro, Delicado, Costoso. Bromelaina: Piña. 11 5/03/2018 PROCEDENCIA COMERCIAL DE LAS ENZIMAS PROCEDENCIA COMERCIAL DE LAS ENZIMAS X X CULTIVOS ANIMALES PLANTAS MICROORGANISMOS CELULARES CULTIVOS CELULARES Fácil manejo Rendimiento Estabilidad Microorganismos: Fuente de enzimas industriales. Ventajas Microorganismos: Fuente de enzimas industriales. Ventajas Microorganismos son muy versátiles: Encontrar un microorganismo que produzca un enzima concreto. Microorganismos: Fáciles de cultivar Velocidades Pueden ser modificados genéticamente para producir de crecimiento y de producción (Baratas, mayor cantidad de enzima. Abundantes) Recuperación de las enzimas microbianas suele ser fácil Extracelulares. Tecnología a gran escala Fácil escalado Producción de enzimas microbianas: Materias primas + Estables: Que de Plantas y Animales. fáciles de conseguir. Medios de cultivo Escasos requerimientos. ENZIMAS INTRACELULARES: ENZIMAS EXTRACELULARES Permanecen en el interior de la célula. Actúan sobre sustratos de bajo peso molecular. Glucosa isomerasa, Sustratos de PM. Se sintetizan en Glucosa oxidasa, Penicilin acilasa, -Galactosidasa grandes cantidades. Muy reguladas. pullulanasa y Lactasa. Necesaria la Integridad de la célula: Síntesis de Hidrolasas enzima y preservar su estabilidad. Segregada fuera de la célula No requieren técnicas de ruptura celular. (Difíciles Obtener Enzima: Romper las células y Separar el producto de restos celulares Difícil y Costosa de aplicar a gran escala). Enzimas: Contaminadas (Otras proteínas Número de proteínas segregadas es limitado intracelulares). Fácil aislar una enzima a partir de la mezcla. Separación de células del medio de cultivo Obtener Estructura más compacta y menos preparados muy concentrados que facilitan la susceptibles a la desnaturalización. purificación. 12 5/03/2018 MICROORGANISMOS: FUENTE DE ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DE ENZIMAS INDUSTRIALES ENZIMAS Enzimas hidrolíticas simples: Selección de la fuente Proteasas, Amilasas, Pectinasas. Producción de células con un alto nivel de la enzima Degradan polímeros naturales: Rotura celular y eliminación de los restos celulares Proteínas, Almidones o Pectina. Enzimas extracelulares. (enzimas intracelulares) Poco específicas. Concentración y enriquecimiento Fácil extracción Purificación con alta resolución (dependiendo de su Bajo costo uso final) Concentración y formulación del preparado Aplicaciones de las Enzimas Microbianas Amilasas ENZIMA FUENTE APLICACIÓN INDUSTRIAL INDUSTRIA • Degradación del polisacárido almidón. Hongos Pan Panadera Bacterias Revestimientos amiláceos Papelera • Últimos 20 años: Reemplazado la hidrólisis ácida. Hongos Fabricación de jarabe y glucosa Alimentaria • -amilasa de Bacillus y glucoamilasa de Amilasa Aspergillus. Bacterias Almidonado en frío de la ropa Almidón Hongos Ayuda digestiva Farmacéutica • Sacarificación genera mucha dextrosa, Bacterias Eliminación de revestimientos Textil degradación de almidón más corta, sin Bacterias Eliminación de manchas; detergentes Lavandería tratamiento ácido. AMILASAS Amilasas Producción de Cerveza Hornear pan Reemplazo de malta por granos sin germinar El uso de enzimas en panadería se ha vuelto popular. de maíz o arroz. Prácticamente no contienen enzimas. Las amilasas aceleran la degradación del almidón, y así [azúcar] en la masa Fermentación volumen + Enzimas: del pan. Amilasas, Glucanasas y Proteasas (Hongos y Bacterias). Almidón Azúcares: Sufren fermentación alcohólica por levaduras. 13 5/03/2018 PROTEASAS ENZIMAS MICROBIANAS Y SUS APLICACIONES Ablandan la carne Enzima Fuente Aplicación industrial Industria Invertasa Levadura Relleno de caramelos Confitería Papaya: [] Papaína y Quimiopapaína. Glucosa Oxidasa Hongos Eliminación de glucosa y Alimentaria oxígeno, papeles para Farmacéutica pruebas de la diabetes Degradan el tejido conectivo de la Glucosa Isomerasa Bacterias Jarabe de cereales rico en Bebidas glucosa refrescantes carne: Pectinasa Hongos Prensado, clarificación del Zumos de frutas Colágeno y Elastina + Tierna. vino Renina Hongos Coagulación de la leche Quesera Se frota la carne y se deja a Tamb Celulasa Bacterias Suavizante y abrillantador Lavandería varias horas. de tejidos; detergente Ficina: Higos. Lipasa Hongos Degradar la grasa Lechería, lavandería Bromelaina: Piña. Lactasa Hongos Degradar la lactosa a Lechería, glucosa y galactosa alimentos DNA polimerasa Bacterias; Replicación del DNA por Investigación Archea PCR biológica y forense. Extremoenzimas A)Temperatura - Psicrófilos - Mesófilos - Termófilo - Hipertermófilos B) Acidez y alcalinidad • Acidófilos • Alcalófilos C) Disponibilidad de agua - Sal: Halófilos y Halófilos extremos - Azúcar: Osmófilos - Secos: Xerófilos Crecimiento de una cianobacteria termófila: Arroyo caliente, Parque Nacional de Yellowstone (USA) 14 5/03/2018 ENZIMAS Microorganismos Acidófilos y Obtención de enzimas industriales: procesos a partir de microorganismos Alcalófilos ENZIMAS Obtención de enzimas industriales: procesos a partir de microorganismos CINÉTICA ENZIMÁTICA Estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Cultivo sumergido Sonicación Hidròlisis paredes celulares Relacionada con: de microorganismos (lisozima) Determinación cuantitativa de las reacciones que catalizan las enzimas Centrifugación o Filtración Estudio sistemático de los factores que afectan dichas velocidades Miden la afinidad de las enzimas por los sustratos y los inhibidores Ultrafiltración Mecanismos de reacción catalítica y especificidad de la enzima (diàlisis) Velocidad de una reacción bioquímica: Concentración Precipitación El cambio de la concentración de un reactante o producto por unidad de tiempo. Alta purificación (D.Org., sulfat amònic) aA + bB → pP + qQ Adición soporte inerte y envasad Liofilitzación (Yeso granulado, polietilenglicol) Conceptos básicos de cinética química Tipos de Reacción y parámetros cinéticos En una reacción de orden cero, la velocidad de formación del producto es independiente de la concentración de sustrato: v = k En una reacción de primer orden la velocidad de formación de los productos es directamente proporcional a la concentración del sustrato: v = k [A]. Así, en la reacción: La velocidad de hidrólisis de la sacarosa es, en todo momento, proporcional a la concentración de sacarosa. Dicho matemáticamente, donde [A] es la concentración de sacarosa a cada tiempo (t) y k es la constante de proporcionalidad. Se dice que ésta es una reacción de primer orden. Una reacción de segundo orden es aquella en la que la velocidad de formación del producto depende •de la concentración de dos sustratos (como en una reacción de condensación): v = k [A1] [A2] •del cuadrado de la concentración de un único sustrato (reacción de dimerización): v = k [A]2 15 5/03/2018 t A lnA 1/A 2,5 Tipos de Reacción y parámetros cinéticos 0 400 2,32 1,72 0,84 0,54 0,43 0,58 2 800 1,3 0,26 0,77 1,5 1 1200 0,98 -0,02 1,02 H 2O2 H 2O O2 [A] 1600 0,73 -0,31 1,37 1 A 2 2000 0,54 -0,62 1,85 Lineal (A) tiempo (s) [H2O2] (M) 2400 0,39 -0,94 2,56 0,5 y = -0,0007x + 2,01 2800 0,28 -1,27 3,57 0 2,32 0 R² = 0,9313 400 1,72 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 t (s) 800 1,30 1200 0,98 1,00 4,00 1600 0,73 Orden de 3,50 2000 0,54 0,50 3,00 2400 0,39 2,50 0,00 2800 0,28 Reacción??? 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 2,00 ln[A] 1/[A] lnA 1/A 1,50 -0,50 Lineal (lnA) Lineal (1/A) 1,00 y = 0,0011x + 0,041 R² = 0,9022 -1,00 y = -0,0007x + 0,8581 0,50 R² = 0,9991 0,00 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 -1,50 t (s) t (s) 91 vo= velocidad inicial de Rx CINÉTICA ENZIMÁTICA -Cuando la [S] es mucho más grande que la [E] La Vrxn.: se puede medir fácilmente. -Se considera como la velocidad medida antes de que más del 10% de [S] se convierta en producto = [S] es constante. Se realizan medidas en condiciones óptimas: pH, T°, presencia de -No se considera la Rx inversa la cantidad de P es muy pequeña cofactores, etc. Se utilizan [sustrato] saturantes Simplifican las ecuaciones de velocidad. Bajo estas condiciones: La vrxn observada es la vmáx. Se determina midiendo: Aparición de P o Desaparición de R y se obtiene: -Se puede explorar en función de la [S] (la cual es ajustada por el investigador) “curva de avance de Rx”=cinética de rxn. Manteniendo la cantidad de enzima constante. Acumulación P Representamos v 0 frente a [S]0 Consumo del Cuando [S]0 es pequeña: la velocidad inicial es Estudiar los efectos a medida que la Rx directamente proporcional a la concentración de sustrato: sustrato de Rx transcurre: la reacción es de primer orden. -Con respecto al S: difícil porque se va A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el consumiendo. sustrato, y la velocidad ya no depende de [S] 0. -Con respecto al P: la vacum,P va En este punto, la reacción es de orden cero y la disminuyendo velocidad es máxima (Vmax). Para evitar esta complicación se mide vo= pendiente Saturación Enzima por el sustrato MODELO CINÉTICO MICHAELIS-MENTEN Efecto de la concentración inicial del sustrato sobre la actividad enzimática CONCEPTO: Complejo-Enzima (ES): Rxn catalizadas x E se dan en 2 etapas Cantidad ES muy pequeña y cte en la Rx Formación de productos es cte. 16 5/03/2018 CONSTANTE Km KM :indicador de la afinidad de la enzima por el sustrato Etapa Limitante concentración de sustrato a la ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN que la enzima tiene la mitad de la velocidad máxima KM grande: se necesitará una concentración mayor de sustrato para alcanzar la mitad de la velocidad máxima Tiene unidades de [ ] KM pequeña: es menor la cantidad del sustrato para alcanzar la mitad de la velocidad máxima de la enzima ( enzima Cálculo de Km y Vmáx. más afín a su sustrato) VELOCIDAD MAXIMA DE REACCION vo cuando: 1. [S] es muy baja 2. [S] es >>>KM Vmáx: punto de la reacción en el que no importa con cuanto sustrato se realice la medición de la actividad enzimático , pues la velocidad de la reacción no aumenta más. Vmáx ; corresponde al punto de saturación de la enzima. Punto de saturación; todos los sitios catalíticos de las enzimas están ocupados y por lo tanto no pueden interactuar con mas moléculas de sustrato Determinación KM es aproximado. Método más conveniente REPRESENTACIONES DOBLES INVERSAS DE LINEWEAVER-BURK PARÁMETROS ENZIMÁTICOS: La ecuación de Michaelis – 1.Kcat (constante para cada enzima) = Número de recambio = # de Menten se ordena obteniendo su moléculas de sustrato convertidas en producto por molécula de enzima y unidad de tiempo, en condiciones de saturación de sustrato. inversa o recíproca 1 = KM 1 + 1 2. Se define la unidad de actividad enzimática (U) : cantidad de enzima que V Vmax [ S ] Vmax cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. Expresa velocidad. Gráfica de línea recta 3. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/mL). La pendiente de la línea es Km/Vmax Si se conoce el peso molecular del enzima puro y el número de centros activos La intersección en el eje vertical es 1 / Vmax por molécula de enzima, las medidas de actividad enzimática permiten calcular el número de recambio del enzima: número de reacciones elementales que La intersección en el eje realiza el enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo. horizontal es – 1 / Km 17 5/03/2018 K M parámetro importante: No Recambio ≡ KCAT de algunas enzimas KM es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. ENZIMA SUSTRATO Kcat (s-1) El valor de KM : afinidad del enzima por el sustrato: A menor KM Catalasa H2O2 40.000.000 mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM menor afinidad. Acetil colinesterasa AcCoA 14.000 La KM del sustrato natural es menor que la de los sustratos Anhidrasa carbónica HCO3 - 400.000 análogos. Fumarasa Fumarato 800 VARIABLES QUE INFLUYEN EN LA VRxn enzimática 2. Concentración Sustrato 1. Concentración de Enzima 3. Efecto del pH 18 5/03/2018 4. Efecto de la Temperatura 5. Efecto de Inhibidores Agentes moleculares que interfieren con la catálisis relentizando o parando las Rxs. Enzimáticas. Están entre los más importantes agentes farmacéuticos. Inactiva Enzimas Destruyen grupo funcional de E que es esencial para la actividad Forman asociación No covalente pero ESTABLE Ejemplo: intoxicación MeOH 19 5/03/2018 20 5/03/2018 6. Efecto de los activadores Concentración Velocidad inicial (mM/min) de sustrato Sin Inhibidor Con Inhibidor 2 10 8 3,5 12 10 4,3 18 12 5,3 24 18 6,4 24 24 7,8 24 24 Naturaleza del inhibidor???? 21 5/03/2018 Enzimas Enzimas -Cinética enzimática: aplicación industria de alimentos Quiz 1. La enzima X tiene un peso molecular de -Cinética enzimática: aplicación industria 48.000. Convierte el sustrato Z en el producto Y. farmacéutica Z absorbe a 340 nm, y Y absorbe a 480 nm. A)¿En qué longitud de onda mediría el cambio en la -PCR absorbancia al ensayo para la enzima X? ¿Aumentaría o disminuiría la absorbancia con el tiempo? B)Si Vmax = 60 μmol / min y se utilizaron 400 μL de -ELISA una solución de 0,1 mg / mL de enzima, ¿cuál es el número de recambio? 2. ¿Qué tipos de grupos funcionales esperaría que 3. Para una reacción catalizada por una enzima de estuvieran involucrados en el enlazamiento de sustrato único, se determinaron las piridoxal-5'-fosfato a las enzimas transaminasas representaciones de las dobles recíprocas para que requieren a este como cofactor (Derivado de la tres diferentes concentraciones de enzima. ¿Cuál vitamina B6)? Represente los grupos funcionales de las siguientes curvas (curvas 1, 2 ó 3), se apropiados alrededor de este Cofactor. esperaría obtener para una enzima que obedece la cinética de Michaelis-Menten? Explique. 22 5/03/2018 A) Usted podría analizar la enzima de dos maneras. La primera es medir el aumento de Y a 480 nm. El segundo es medir la disminución de Z a 340 nm. B) 0,1 mg / mL es lo mismo que 0,1 μg / μL. Si tiene 400 μL de una solución de 0,1 μg / μL, tiene 40 μg. 40 μg / 48.000 μg / μmol = 8,33 x 10 -4 μmol El número de recambio es Vmax / μmol enzima = 60 μmol / min ÷ 8,33 x 10-4 μmol = 7,2 x 104 / min.. 3. El diagrama # 2 sería esperado para una enzima que obedece a la cinética de Michaelis-Menten durante tres diferentes concentraciones de enzimas. Si [E] T se incrementa, Vmax también aumentará porque Vmax = k2 [E] T. Pero, KM = (k-1 + k2) / k1, es decir, KM es independiente de [E] T. El gráfico 1 muestra que tanto KM y Vmax cambio y la curva 3 muestra que Vmax no cambia mientras KM hace. El grupo 2 es Correcto porque muestra que KM no cambia mientras Vmax lo hace. 23