FACULTAD DE INGENIERIA QUÍMICAIngeniería en Biotecnología Biología Molecular EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO 28 Agosto 13 Introducción Los plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena extracromosomal, pequeñas y circulares, que están presentes en muchos tipos de bacterias y también en algunas levaduras y hongos. Estos plásmidos pueden existir y replicarse independientemente del cromosoma o pueden estar integrados en éste y aunque no son necesarios para el crecimiento y la reproducción del hospedero, pueden contener genes que aportan a la bacteria una ventaja competitiva, por ejemplo la resistencia a antibióticos, nuevas capacidades metabólicas, etc. Cuadro III. Ejemplos de plásmidos naturales presentes en algunas bacterias Plásmido Tamaño (Kb) 95-100 80 21 9 83 75 Huésped Característica Factor F R1 pSH6 ColE1 Ent(P307) TOL E. coli, Salmonella, Citrobacter Banterias Gram negativas Staphylococus aureus E. coli E. coli Pseudomonas putida 1 Pilus sexual, conjugación Resistencia a antibióticos Resistencia a antibióticos Producción de colicana E1 Producción de enterotoxina Degradación de tolueno Prescott, Harley y Klein (1999) Debido a que los plásmidos pueden transferirse de una bacteria a otra, estas moléculas son de gran valor para los microbiólogos y genetistas moleculares en la construcción y transferencia de nuevas combinaciones genéticas y en la clonación de genes. Actualmente existen plásmidos recombinantes que portan genes de diferentes orígenes y permiten, mediante el uso de las enzimas de restricción, “cortar y pegar” genes y entonces transferir estas “construcciones” dentro de una bacteria, de manera que esta puede ser forzada a manufacturar el ADN y algunas veces la proteína producto de ese gen. Así se tiene una gran cantidad de ADN plasmídico conteniendo un gen de interés para otros usos, como por ejemplo obtener un ADN molde, obtener la secuencia del gen, realizar mutaciones en el gen para modificar su función, o simplemente producir una proteína de interés. Los plásmidos que se utilizan para la clonación de genes o fragmentos de ADN (Fig. 2) constan de los siguientes elementos básicos: un sitio de origen de la replicación (ORI) que permite la replicación autónoma del plásmido, una vez entro de la bacteria. un gen de resistencia a un antibiótico (Vg. Ampr) que permita la selección de las células bacterianas transformadas un sitio múltiple de clonación (SMC), que consiste en una región del plásmido que contiene sitios de reconocimiento y corte para diferentes 15 no hay evidencia de que estos fenómenos ocurran en células congeladas. El ADN plasmídico extraído puede ser almacenado en buffer TE a 4º C durante varias semanas o durante varios años a -20º C ó -70º C (preferentemente en etanol al 70%). Estructura básica de un plásmido recombinante. OR: sitio de origen de la replicación. Amp r: gen de resistencia a ampicilina. se prepara un cultivo saturado de la bacteria que contiene el plásmido en presencia del agente selectivo apropiado y se adiciona un volumen igual (aprox. Las células así conservadas deben ser recuperadas por crecimiento en placa con medio selectivo. SCM: sitio de clonación múltiple. 1 a 2 ml) de glicerol estéril y se congela a -70º C en viales estériles.enzimas de restricción. Este gen se conoce comúnmente como reportero. 16 . Objetivo Ensayar la recuperación de ADN plasmídico de un cultivo puro por dos métodos distintos. Este sitio está “embebido” dentro de un gen que al expresarse le confiere a la bacteria alguna característica distinguible y que permite conocer si la bacteria transformada porta un plásmido “vacío” (sin inserto) o “cargado” (con inserto). Figura 2. Los plásmidos pueden ser mantenidos por un periodo corto (hasta un mes) en cepas bacterianas de forma muy simple creciendo en placas selectivas y almacenándolas a 4º C. Muchos investigadores prefieren almacenar los plásmidos purificados y no las clonas bacterianas. debido a que los plásmidos conservados en bacterias algunas veces se pierden. Para almacenarlos por períodos de tiempo más largos. se reordenan o acumulan inserciones de secuencias durante el almacenamiento o la recuperación. Sin embargo. T: terminador de la transcripción Conservación de ADN plasmídico. un promotor (P) y un terminador (T) encargados de regular la trascripción del gen reportero. P: promotor. 5 ml ( tubos eppendorf o similares) Micropipeta de 1000µl con puntas. 17 . 3. Micropipeta de 200 µl con puntas Micropipeta de 10 µl con puntas 2 Pipetas pasteur Baño de hielo Microcentrifuga Vortex Cronómetro Desarrollo. coli (KRN) en medio líquido LB con ampicillina 5 ml de cultivo de E.5 ml del cultivo a máxima velocidad durante 20 seg. 1. 2. 300 l de solución GTE (Glucosa/Tris/EDTA) 600 µl de solución NaOH/SDS 400 µl de solución de acetato de potasio. Las centrifugaciones de los puntos 2 y 6 pueden realizarse a 4°C o a temperatura ambiente. Resuspender la pastilla en 100 l de solución GTE y dejarla reposar 5 min. Materiales y Equipos 5 ml de cultivo de E. 5 ml de Etanol 70% 80 µl de TE 5 tubos de microcentrífuga de 1. 4. Inocular 5 ml de medio de cultivo líquido con la cepa bacteriana de interés e incubar a las condiciones de crecimiento apropiadas hasta que el cultivo se encuentre saturado (16 h o toda la noche). 5. Miniprep o preparación en pequeña escala por el método de lisis alcalina.PROTOCOLOS (P) P1. Centrifugar 1. coli en medio líquido LB. La solución NaOH/SDS debe ser preparada en el momento en que se vaya a utilizar pues de lo contrario se precipita. 5 ml de Etanol absoluto. Adicionar 200 l de solución NaOH/SDS. Tiempos más prolongados de centrifugación pueden ocasionar dificultad para resuspender las células. mezclar por inversión y mantenerlo en hielo durante 5 min. Añadir 150 l de solución de acetato de potasio y mezclar en vortex a máxima velocidad por 2 seg. Colocar en hielo durante 5 min. Desechar el sobrenadante con una pipeta Pasteur. 8 ml de etanol al 95%. En este protocolo el punto 4 resulta crítico pues la lisis alcalina destruye el ADN bacteriano pero conserva el ADN plasmídico. y dejarlo reposar 2 min a temperatura ambiente para precipitar los ácidos nucléicos. esta interferencia puede eliminarse adicionando a la mezcla de digestión 1l de una solución de RNasa 10mg/ml (libre de DNasa) . Consideraciones de tiempo Utilizando este protocolo es posible procesar hasta 12 clonas en una hora. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. 10. Resuspender la pastilla en 30 l de buffer TE y comprobar la extracción del ADN plasmídico por electroforesis.6. Secar la pastilla a vacio. mezclar con 0. 18 . La contaminación por RNA puede interferir en la detección de fragmentos en el gel de agarosa. 7. de lo contrario se puede “curar” la clona y perder la construcción (ver introducción). Centrifugar 1 min a temperatura ambiente para precipitar el ADN y ARN plasmídico. Desechar el sobrenadante y lavar la pastilla con 1 ml de etanol al 70% . Puntos críticos Es importante tener en cuenta que la bacteria que contiene el plásmido de interés (clona) siempre tiene que ser resembrada en el medio que contenga la presión de selección que “obligue” a mantener el plásmido. Centrifugar por 3 min como en el paso 2 para separar debris celular y ADN cromosomal. 9. 8. 2. coli (KRN) en caja con medio LB y ampicilina. o 500 µl de agua desionizada estéril. 7. 6. Agitar en vortex.0 M pH 5. 2. o 5 ml de Etanol absoluto. o 1 Cultivo de E. Lavar la pastilla 2 veces con 1 ml de etanol al 70%. 19 .0 M pH 5. 3. Centrifugar 2 minutos a 14000 rpm. Tomar una cantidad de cultivo bacteriano directamente de la caja (equivalente a un grano de arroz) con un palillo de dientes estéril y resuspenderlo en 50 µl de agua estéril. Adicionar 150 µl de acetato de sodio 3. para mezclar completamente. o Micropipeta de 200 µl con puntas o Micropipeta de 10 µl con puntas o Palillos estériles o Baño de hielo o Microcentrifuga o Vortex o Cronómetro Desarrollo 1. coli DH5en caja con medio LB. Centrifugar 2 min a 14000 rpm para separar los restos celulares y el ADN. mezclar en vortex de 2 a 5 segundos. o 5 ml de Etanol 70% o 5 tubos de microcentrífuga de 1.5 ml ( tubos eppendorf o similares) o Micropipeta de 1000µl con puntas. Mezclar en vortex de 2 a 5 seg. Adicionar 300 µl de TENS. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y mezclar con 0. En este punto se precipita el plásmido. Miniprep en 10 minutos Materiales y Equipos o 1 Cultivo de E.9 ml de etanol absoluto frío (a -20°C). Procesar simultáneamente los dos cultivos que se proporcionan: E coli (KRN) crecido en medio LB con ampicilina y el cultivo E. 4. 5. coli DH5 cultivado en medio LB.2 . Secar.P2. o 800 µl de solución TENS (Tris/EDTA/NaOH/SDS) o 500 µl de solución de acetato de sodio 3. Invertir manualmente el tubo al menos 5 veces. Consideraciones de tiempo Dada la simplicidad de este protocolo y el poco tiempo necesario para la extracción del plásmido. La contaminación con ADN genómico puede ser deletérea en dependencia de la finalidad de la aplicación. es aconsejable evitar la presencia de ADN genómico que puede causar un “smear” que dificulte ubicar el fragmento de interés. este método es ideal cuando se desea procesar un elevado número de clonas. Conservar el ADN plasmídico en congelación. Resuspender en 50 µl de agua y comprobar la extracción de ADN plasmídico por electroforesis en gel de agarosa al 0. 20 . Debe tener presente que por el tamaño del plásmido tampoco se observa la característica “nube” de ADN después de agregar el etanol. sin embargo. Puntos críticos Es importante no tomar demasiada biomasa pues esto potencia la probabilidad de contaminación de la preparación con ADN genómico.8. Si se desea digerir el plásmido para obtener el inserto. confíe en le método y compruebe sus resultados mediante electroforesis. La calidad de esta preparación permite realizar digestiones con enzimas de restricción y “limpiar” el inserto a partir del gel de agarosa utilizando NaI y una suspensión de SiO2. se recomienda realizar una digestión con ARNasa y una segunda precipitación etanólica para garantizar un adecuado grado de pureza. si el plásmido resultante ha de ser subclonado o secuenciado. dada la pequeña cantidad de ADN obtenido.8% en TBE 1X. Sin embargo. En este tipo de preparaciones difícilmente se observa un precipitado. 0 Agua Agua Agua Agua Etanol 70% Refrigeración Refrigeración Muy inestable. Tris 10 mM pH 7. o TENS (Tris/EDTA/NaOH/SDS): NaOH 0.0 o Medio LB (Luria y Bertani): Extracto de levadura 5 g. Esta solución queda a una concentración de 250 mg/ml y puede conservarse en refrigeración y protegida de la luz hasta por seis meses. Las placas se pueden conservar a temperatura ambiente para evitar condensación de vapor de agua en la tapa. Disolver los ingredientes uno por uno y completar a un volumen de 1000 ml. Hidróxido de sodio 0. y EDTA 10mM. lo que puede causar contaminación del medio. Para preparar placas se añaden 20 g de agar bacteriológico antes de esterilizar el medio. pH final 8. NaCl 10 g. Esterilizar en autoclave y se almacenar a temperatura ambiente. Tris. Completar a 100 ml.0. por ejemplo mezclar 1ml de NaOH 1 N y 0.PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y MEDIOS DE CULTIVO o Solución GTE (Glucosa/Tris/EDTA): Glucosa 50 mM. EDTA 1 mM pH 8. Acetato de potasio 5M: A 29.1 M. final (µg/ml) 50 20 200 15 30 15 30 12 21 . Esterilizar en autoclave y almacenar en refrigeración. Preparar al momento de usar y descartar el sobrante Refrigeración Congelación (-20°C) Refrigeración Refrigeración Congelación y protegido de la luz (-20°C) Conservación Conc. SDS 0.1 N.HCl 25 mM pH 8. Almacenar a temperatura ambiente. Preparar inmediatamente antes de usarse. Esterilizar en autoclave y se almacenar a temperatura ambiente. Se utiliza un ámpula de Binotal (Bayer) de 500 mg.5 ml de SDS 10% y se lleva a 5 ml con agua destilada.2 N y SDS 1% (w/v). Los antibióticos se adicionan una vez que el medio líquido está estéril y a temperatura ambiente. Se pueden prepara soluciones concentradas. Triptona 10 g.0. o Ampicilina 250 mg/ml. En el caso de los medios con agar se espera a que la temperatura del medio ya estéril sea aproximadamente 45°C (que pueda tocarse con la mano sin que queme) y se adiciona el antibiótico antes de vaciar el medio a la caja.5 ml de ácido acético glacial agregar perlas de KOH hasta obtener un pH de 4. Antibiótico Ampicilina Cloramfenicol d-Cicloserina Gentamicina Kanamicina Acido nalidíxico Streptomicina Tetraciclina Stock (mg/ml) 5 10 10 10 10 5 50 12 Disolvente Agua metanol Buffer fosfato 0.8 (De 20 a 30 g). pH 8. o Solución NaOH/SDS. Aforar a un litro.5%. ¡No autoclavear esta solución! Acetato de sodio 3 M: Disolver 408g de acetato de sodio trihidratado (x 3H2O) en 800 ml de agua. o Otros antibióticos Algunos antibióticos comúnmente utilizados en la selección de plásmidos recombinates.5. Añadir el diluyente (2 ml de agua estéril libre de pirógenos) directamente en el frasco usando una jeringa estéril.