Analyse instrumentale II Niels LionSemestre été 2004 Série 1: Généralités de chromatographie Exercice 1 Evaluer les proportions d’un soluté dans la phase mobile et dans la phase stationnaire si tm=1 min, tR,1=3 min. Effectuer le même calcul pour un second soluté, avec tR,2=6 min. Exercice 2 Deux substances A et B ont des temps de rétention respectivement de 16.40 min et 17.63 min sur une colonne de 30 cm de long. Le temps mort de la colonne est de 1.30 min. Les largeurs de pic à la base sont respectivement 1.11 et 1.21 min. a) Calculer la résolution de la colonne, le nombre de plateaux théoriques et la hauteur de plateau théorique équivalente. b) Pour améliorer les performances de la séparation, on peut allonger la colonne ou améliorer le pouvoir de rétention de la phase stationnaire. Afin de quantifier ces deux approches, effectuer les calculs suivants : • La longueur de colonne qu’il faudrait utiliser pour avoir une résolution de 1.5 • Le temps de rétention qu’aurait B sur cette nouvelle colonne • La HETP nécessaire pour obtenir une résolution de 1.5 avec une colonne de 30 cm et les temps de rétention donnés ci- dessus Exercice 3 Les chromatogrammes suivants ont été mesurés en chromatographie gaz/liquide avec une colonne de 2m. Chromatogramme A : Néon (insoluble dans la phase stationnaire) Chromatogramme B : n-alcools C4-C8 Déterminer le temps de séjour (temps de rétention net) de chaque alcool dans la phase stationnaire, ainsi que les valeurs de R et q. 1/3 Analyse instrumentale II Niels Lion Semestre été 2004 Données : Chromatogramme a) RT=4.177 min Area/height=0.527 Chromatogramme b) tR Area% Area/height 7.125 13.681 0.584 9.374 14.670 0.724 13.124 22.35 0.973 19.419 20.954 1.368 29.946 28.346 2.01 Exercice 4 Quand une séparation n’est pas satisfaisante (hauteur de plateau théorique trop faible pour la substance analysée), on peut jouer sur plusieurs paramètres expérimentaux : 1. la nature de la phase stationnaire (changement de colonne) 2. la longueur de la colonne (cf exercice 2) 3. la nature de la phase mobile (phase plus ou moins polaire par exemple), et le mode d’élution (isocratique ou gradient et pente du gradient) 4. le débit de la phase mobile Ici, on cherche à analyser le propranolol (médicament β-bloquant servant dans les troubles du rythme cardiaque), sur une colonne C18 (interactions hydrophobes) de 15 cm, avec une phase mobile constituée d’eau acidifiée (avec 0.12% d’acide trichloracétique : TFA) et d’acétonitrile (ACN). L’élution se fait en mode gradient (linéaire) de la façon suivante : 2/3 Analyse instrumentale II Niels Lion Semestre été 2004 Temps (min) % (H2O + 0.12% TFA) % ACN 0 100 0 1 100 0 11 0 100 12 0 100 13 100 0 En répétant l’analyse du propranolol (50 µL injectés à une concentration de 0.6 mg/ml, mesure de l’absorbtion à 290 nm en sortie de colonne) à plusieurs débits, on obtient les résultats suivants : Débit de phase Temps de rétention Intensité du pic Aire du pic mobile (mL/min) (min) (UA) (UA×sec) 0.25 13.932 670928 1.01054e+07 0.4 11.4 614024 6.9134e+06 0.6 10.124 715452 6.02142e+06 1 8.287 618548 4.10206e+06 1.25 9.293 520217 4.25033e+06 1.5 8.733 578001 4.75557e+06 1.75 10.071 1.16294e+06 1.1834e+07 1. Tracer la composition de la phase mobile en fonction du temps (% ACN) 2. Tracer le diagramme de van Deemter (cf cours) : H=f(débit) 3. Proposer une fonction H=f(débit) 4. En admettant que cette fonction décrit la variation de la hauteur de plateau théorique avec le débit, calculer le débit optimal (H minimal) 3/3