123-Laa-Int-53 Control Calidad Medios de Cultivo (Mètodo Ecometrico)

Código 123- LAA-INT-53VICERRECTORIA DE INVESTIGACIONES, Versión 1 Fecha 18/09/12 INNOVACIÓN Y EXTENSIÓN Pagina 1 de 12 INSTRUCTIVO PARA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO MÈTODO ECOMÈTRICO Describir la metodología empleada para realizar el control de calidad a los medios de cultivo destinados para los diversos análisis microbiológicos realizados por el laboratorio de aguas y alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira 1. CONTENIDO El análisis microbiológico es una herramienta fundamental para el monitoreo y control de calidad en los diversos procesos productivos , permitiendo determinar los focos de contaminación por los cuales se está generando un producto deficiente, además de ser clave para el manejo, monitoreo y control de sistemas en los cuales la inocuidad de los productos sea uno de los principales objetivos; estos análisis se realizan de manera rutinaria en muchas empresas para determinar la aptitud en los productos generados. Basados en la naturaleza del producto, se aplican diversos protocolos, los cuales permitirán aislar microorganismos de interés, y que son comunes encontrar en este, si se han presentado falencias en las etapas de procesamiento y elaboración, pudiendo llegar a ser nocivos para los consumidores; a razón de lo anterior, los resultados obtenidos del análisis microbiológico son determinantes. Conociendo la gran responsabilidad que tienen los laboratorios de microbiología al dar un dictamen final, se hace necesario realizar pruebas de verificación que certifiquen el perfecto estado de los equipos, materiales, y reactivos que se usan a la hora de ejecutar dichos análisis. Para evaluar un medio de cultivo se realiza frecuentemente una técnica llamada Método Ecométrico, el cual fue descrito por Mosselt et al., 1983, y que permite medir la Productividad que es la capacidad de los medios de cultivo para favorecer el crecimiento y desarrollo de un microorganismo, esta característica se determina a través de la comparación que se realiza entre el medio por evaluar y un medio control (Soler, 2006). Agar BHI.LAA-INT-53 VICERRECTORIA DE INVESTIGACIONES. Agar Standard plate Count. al realizar esto se verifica la productividad del medio y. Código 123. tales medios pueden ser: Agar tripticasa de soya. se determinara la selectividad.. Villalobos et al.2007) Figura 1 Representación gráfica de marcaje y siembra en método ecométrico Nota: Realizar el mismo procedimiento tanto para el medio prueba como el medio de referencia. et al. Agar nutritivo. aquel medio de cultivo cuya composición sea muy completa y permita el crecimiento de un gran numero de microrganismos. 1997 . se usa como medio de referencia. INFORMACION ANTES DE INICIAR EL PROCESO Para llevar a cabo la prueba de control de calidad de medios de cultivo (Mètodo Ecométrico).. . 2. Versión 1 Fecha 18/09/12 INNOVACIÓN Y EXTENSIÓN Pagina 2 de 12 INSTRUCTIVO PARA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO MÈTODO ECOMÈTRICO Otro aspecto es la Selectividad referida a la resistencia que genera el medio de cultivo a la colonización por microorganismos interferentes o indeseados ( Doyle. con el ensayo del microorganismo interferente . además se puede presentar contaminación de la muestra. Influyen también factores como la temperatura y tiempo de incubación. . 2. Versión 1 Fecha 18/09/12 INNOVACIÓN Y EXTENSIÓN Pagina 3 de 12 INSTRUCTIVO PARA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO MÈTODO ECOMÈTRICO Al momentos de incubar las pruebas tener en cuenta los requerimientos tales como temperatura. Código 123. Las mesas de trabajo deben ser superficies lisas fáciles de limpiar y desinfectar.  Medio prueba Depende de los medios a los que se les realice la prueba. 3. Interferencias.2 Condiciones Ambientales. atmósfera (Presencia o ausencia de oxígeno). DESCRIPCIÓN DE MATERIALES. Los cultivos de organismos infecciosos deben realizarse en cabina de flujo laminar inoxidable y/o en un área de trabajo previamente desinfectada.LAA-INT-53 VICERRECTORIA DE INVESTIGACIONES.1. tiempo de incubación del microorganismo prueba e interferente para así contar con resultados reales. REACTIVOS Y EQUIPOS 3. 2. Evitar las corrientes de aire y restringir el paso de personas ajenas a la práctica en dicha área. Reactivos  Medio de referencia Agar BHI o Tripticasa de Soya o Standard Plate Count. Trabajar en el área de esterilidad que genera un Bactoincinerador.1. Se pueden presentar interferencias en la lectura final debido a la manipulación de material y reactivos no estériles o contaminación por agentes presentes en la atmósfera. LAA-INT-53 VICERRECTORIA DE INVESTIGACIONES. Còdigo de inventario 310209  Incubadora a 37 º C.  Caldo BHI 3. IDENTIFICACIÓN DE LOS PELIGROS  Clasificación de la sustancia o de la mezcla REGLAMENTO (CE) No 1272/2008 No peligroso .3 Equipos  Bactoincinerador . Versión 1 Fecha 18/09/12 INNOVACIÓN Y EXTENSIÓN Pagina 4 de 12 INSTRUCTIVO PARA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO MÈTODO ECOMÈTRICO 3. Còdigo de inventario. Marca Mc Cormick Scientific.  Cuenta Colonias. Código de inventario 310981.a. Proteger contra la humedad. Automat 3400  Incubadora a 22 ºC. marca Labnet International. Código de inventario 315141.  Asa Calibrada. Marca Velp SCIENTIFICA. Código de inventario 308742 MANIPULACIÒN Y ALMACENAMIENTO  Asegurar de que la ventilación sea la apropiada. s.  Vortex Mixer. Marca Binder. 313581  Autoclave.2 Materiales  Cajas Petri pequeñas con 20 ml de medio de cultivo. Marca JP Selecta. Marca CI Dental XRAY SAS. Serial 0456452.  Conservar el envase herméticamente cerrado en un lugar seco y bien ventilado. Inc. Evitar contacto con piel y ojos. No respirar el polvo. Código 123. cerrar los tubos Esterilizar en autoclave a 121 FINAL En caso de uso posterior °C. Versión 1 Fecha 18/09/12 INNOVACIÓN Y EXTENSIÓN Pagina 5 de 12 INSTRUCTIVO PARA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO MÈTODO ECOMÈTRICO  Clasificación de acuerdo con las Directivas de la UE 67/548/CEE ó 1999/45/CE  Elementos de la etiqueta R22 .1 Preparación de Caldo BHI Disolver 37 g (CM1135.Nocivo en caso de ingestión H335 . Código de Código de Riesgos Consejos de Nombre colector color específicos prudencia Antes de descartar Muestra Bolsa roja ----.Puede irritar las vías respiratorias 3.1. H302 .1 Residuos Generados. Código 123. Biológico someter a esterilización. 4. Oxoid) en Disponer 6 ml en tubos de ensayo de INICIO 1000 ml de agua destilada. minutos . 15 almacenar a 4ºC. 15 Libras de presión. 10 ml. PROCEDIMIENTO 4.Nocivo por ingestión R37 .LAA-INT-53 VICERRECTORIA DE INVESTIGACIONES.Irrita las vías respiratorias. del Agar Servir en cajas de Petri Esterilizar en autoclave a 121 °C.CM 0003) en observar una completa disolución 1L de agua destilada. Versión 1 Fecha 18/09/12 INNOVACIÓN Y EXTENSIÓN Pagina 6 de 12 INSTRUCTIVO PARA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO MÈTODO ECOMÈTRICO 4. hasta FINAL su uso 4.2 Preparación Agar Standard Plate Count INICIO Disolver 23.3 Preparación Agar Nutritivo Disolver 28 g de Agar Standard Calentar brevemente hasta INICIO Plate Count (OXOID. 15 Libras previamente estériles Llevar a 50º C de presión.5 g de Agar Standard Plate Calentar ligeramente hasta observar Count (OXOID. FINAL hasta su uso 4. 15 minutos Conservar a 4ºC. Servir en cajas de Petri Llevar a 50º C Esterilizar en autoclave a 121 °C.CM 0463) en 1L de agua una completa disolución del Agar destilada. 15 previamente estériles Libras de presión.4 Preparación de inóculo INICIO A partir de la cepa contenida en Incubar a 37ºC/ 18-24 Horas caja de petri a 4ºC realizar un repique a caldo BHI FINAL . Código 123. 15 minutos Conservar a 4ºC.LAA-INT-53 VICERRECTORIA DE INVESTIGACIONES. trazar cinco estrías en cada uno de en caldo BHI e incubar durante ellos y una línea en la intersección de los 18-24 Horas a 37ºC. Con un asa tomar muestra del cultivo y proceder a Disponer el medio prueba y medio sembrar de acuerdo a la secuencia de rotulado de la control (en sus respectivas cajas ya caja 1. CÁLCULOS Y RESULTADOS Figura 1 Representación gráfica de marcaje y siembra en método Ecométrico . ya que el inoculo debe ser fresco) 4. (Por separado) para bacterias. Incubar a la temperatura.4 sin volver a tomar inóculo. según sea el incubación. Código 123.2.5 Método Ecométrico Sembrar previamente los Dividir la base de las cajas petri en cuatro INICIO microrganismos: cuadrantes y marcar cada uno de estos como El de interés y el interferente 1.3. 3. por ultimo sembrar la línea central (Ver Fig1). Versión 1 Fecha 18/09/12 INNOVACIÓN Y EXTENSIÓN Pagina 7 de 12 INSTRUCTIVO PARA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO MÈTODO ECOMÈTRICO Nota: Transcurrido el periodo de incubación realizar la prueba. estrías en forma paralela a las dibujadas en la base de la caja Petri. atmósfera y tiempo Transcurrido el tiempo de indicado. realizando esterilizadas y esperar a que solidifique. realizar lectura de FIN microorganismo resultados 5. 2.LAA-INT-53 VICERRECTORIA DE INVESTIGACIONES. 4. de lo contrario mantener en refrigeración (No por mucho tiempo. cuadrantes (Ver Fig 1). 5 POCA . con el ensayo del microorganismo interferente.5 . y esto es denominado Índice de Crecimiento Absoluto (ICA) (Tortora.5 MEDIA < 2. Código 123.2 y la línea central (Color Naranja) un valor de 1. para lo cual se considera que (Véase Tabla 1): Tabla 1: Valores asignados para determinar la productividad de un medio de cultivo ICA PRODUCTIVIDAD 4.1 Lectura de resultados Se considera válida cualquier estría que tenga un crecimiento superior al 25% de la línea total. Por ello el Indice de Crecimiento Absoluto indica la productividad del medio de prueba.5 ALTA 2.LAA-INT-53 VICERRECTORIA DE INVESTIGACIONES. 5. 2003).5 . por lo tanto el valor máximo para crecimiento en este ensayo es de 5. se determinara la selectividad. Mossel. teniendo cada estría (Color Azul) un valor de 0.4. Versión 1 Fecha 18/09/12 INNOVACIÓN Y EXTENSIÓN Pagina 8 de 12 INSTRUCTIVO PARA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO MÈTODO ECOMÈTRICO Nota: Realizar el mismo procedimiento tanto para el medio de prueba como el medio de referencia. al realizar esto se verifica la productividad del medio y.1993 . 2003).R.J 1997.5 NO HAY SELECTIVIDAD 2.. .Washington D.L.5 .T.M. Beuchat.C. 1983). Food Microbiology : Fundamental and frontiers. DOCUMENTOS DE REFERENCIA Doyle.4. American Society For Microbiology Press...P. Versión 1 Fecha 18/09/12 INNOVACIÓN Y EXTENSIÓN Pagina 9 de 12 INSTRUCTIVO PARA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO MÈTODO ECOMÈTRICO 0 NO PRODUCTIVOS El ICA permite determinar la selectividad del medio cuando se siembra en este. Se determina aplicando la siguiente fórmula: 6. Código 123. Montville. respecto al medio de cutivo control (Mossel.5 BAJA < 2.5 MEDIA 0 ALTA Existe otro parámetro que se considera y es el Indice de Crecimiento Relativo (ICR) el cual determina la capacidad que posee el medio de prueba para recuperar la flora. Tabla 2: Valores asignados para determinar la selectividad de un medio de cultivo ICA SELECTIVIDAD 4. el microorganismo interferente y para ello entre menos sea el valor del ICA mayor es la selectividad del medio (Mossel et al.5 .LAA-INT-53 VICERRECTORIA DE INVESTIGACIONES. 311-7. y Werdle.V AN laarhoven. Microbiología Industrial. T. Z. J.. en muestras de alimentos bajo el contexto de la norma ISO NTC 17025. Validación secundaria de número más probable y recuento en placa para coliformes totales y termotolerantes en muestras de ensalada y arroz basado en la norma ISO NTC 17025. S. Journal of Food Protection. Zaragoza.. Soler J.A. Michanie.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.A. Departamento de Microbiología. 1983. Rees. 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Elaborado por: Revisado por: Aprobado por: Personal UTP Jefe de Calidad Director del Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos .. Figueroa.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.A. Editorial Acribia S. Código 123.G. Disponible (on line) http://www. . Universitas Scientiarum.J. Oxoid Microbiology Products. Zaragoza. Código 123.LAA-INT-53 VICERRECTORIA DE INVESTIGACIONES. Versión 1 Fecha 18/09/12 INNOVACIÓN Y EXTENSIÓN Pagina 12 de 12 INSTRUCTIVO PARA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO MÈTODO ECOMÈTRICO .