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miolo cromatografia-I1/31/06 1:06 PM Page 1 Fundamentos de CROMATOGRAFIA miolo cromatografia-I 1/31/06 1:06 PM Page 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Reitor JOSÉ TADEU JORGE Coordenador Geral da Universidade FERNANDO FERREIRA COSTA Conselho Editorial Presidente PAULO FRANCHETTI ALCIR PÉCORA – ANTÔNIO CARLOS BANNWART – FABIO MAGALHÃES GERALDO DI GIOVANNI – JOSÉ A. R. GONTIJO – LUIZ DAVIDOVICH LUIZ MARQUES – RICARDO ANIDO Collins Gilberto L. Braga Pierina S.miolo cromatografia-I 1/31/06 1:06 PM Page 3 Carol H. Bonato Organização Fundamentos de CROMATOGRAFIA . 924 544. Bonato. armazenada em sistema eletrônico. III.miolo cromatografia-I 1/31/06 1:06 PM Page 4 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA UNICAMP F962 Fundamentos de cromatografia / organizadores: Carol H. 2. Cromatografia de gás 544. Braga. Bonato. Cromatografia líquida 3.92 544. Collins. fotocopiada. reproduzida por meios mecânicos ou outros quaisquer sem autorização prévia do editor. Braga e Pierina S. – Campinas. Análise cromatográfica 2.92 544. Collins. 1. Gilberto Leite. CDD 544. I. Análise cromatográfica. Pierina Sueli. Cromatografia de gás. Cromatografia líquida. Carol Hollingworth. SP: Editora da UNICAMP.926 Copyright © by Organizadores Copyright © 2006 by Editora da UNICAMP Nenhuma parte desta publicação pode ser gravada. Título.926 ISBN 85-268-0704-8 Índice para catálogo sistemático: 1. Gilberto L. II.924 544. . IV. 2006. 3. .................................... 42 II – CROMATOGRAFIA EM PAPEL (GILBERTO LEITE BRAGA) 1 Introdução ... 57 4..............................................................................2 Cromatografia em papel com fase reversa........................................................... 57 Técnica da cromatografia em papel ................................................................................................................ 57 4............................. 58 5........... COLLINS) 1 Introdução ................................................................................................. 60 6.................... 51 3 Considerações sobre a cromatografia em papel........................................................................ 13 I – PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CROMATOGRAFIA (CAROL H....................................................1 Cromatografia em papel com fase normal ......................................................................................... 55 3................................................... 17 2 Aspectos da história da cromatografia ......................................3 Métodos biológicos e enzimáticos................miolo cromatografia-I 1/31/06 1:06 PM Page 5 SUMÁRIO APRESENTAÇÃO..1 Métodos químicos .................................................................... 56 Cromatografia em papel com fase normal e com fase reversa..................... 52 3............................................. 58 5......................................................... 22 4 Alguns termos técnicos ............................................................................................................................................. 47 2 Definições e termos usados na cromatografia em papel ............................................................................... 58 Métodos para detectar as substâncias separadas ................ 30 5 Referências bibliográficas ... 59 6................................... 53 4 5 6 7 3........................................................................................................3 Efeitos da temperatura .............................. 62 ..................................................................................................................................................................2 Métodos físicos................................................................................................................................2 Fase móvel......................................................................................... 61 Análise qualitativa ..............................................................................................................................................1 A amostra ............... 60 6................... 18 3 As classificações da cromatografia........................................................................................2 Aplicação da amostra ........1 Papel ..................................................... .......................................1 Diretamente sobre o papel ................................ 65 9 III – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (JOÃO LUÍS CALLEGARI LOPES) 1 Introdução ......................2 Alumina (Al2O3) ..........................................................................................................................................................................................................................................................................3 Seleção da fase móvel........................................................................................................................2 Extração da substância .............. 92 8 Enchimento da coluna e aplicação da amostra ....................... 68 2................................ 75 3........................6 Revelação dos cromatogramas................................................................ 67 2 Os adsorventes .................... 68 2............................................................................................................................................................4 Aplicação das amostras nas cromatoplacas .............................................miolo cromatografia-I 8 1/31/06 1:06 PM Page 6 Análise quantitativa.....5 Poliamida..................... 70 2........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 76 3..........................................................................................................................1 Preparação de placas .. 93 Eluição e localização dos compostos eluídos ................................................................................................................................................................................................................................................4 Celulose..... 74 3........................................... 85 IV – CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO (WALTER VICHENEWSKI) 1 Introdução ... 85 7 Referências bibliográficas....................................................................................................................................... 90 5 Preparação dos adsorventes .................................................................................................................................................................................... 72 3..................................................................................... 63 Aplicações da cromatografia em papel ............... 88 4 Os processos de adsorção em coluna .............. 62 8....................................... 62 8.. 82 5 Cromatografia em camada delgada de alta eficiência ................................. 87 2 A coluna ............................. 83 6 Aplicações da cromatografia em camada delgada ....................6 Outros..........................................3 Terra diatomácea .....................................................................................................................................................................................................5 Formas de desenvolvimento ............ 90 6 Reações na coluna ................................................................. 70 2.................................................................... 82 4 Análise quantitativa ............................. 69 2.........................................................................2 Ativação das placas..................................................................... 77 3............................................... 69 2...........................................7 Documentação.................................................. 92 7 Escolha de eluentes ...................................................................................1 Sílica (SiO2).............. 64 10 Referências bibliográficas ........................................................ 87 3 Adsorventes . 80 3............................ 72 3....................................... 98 9 ...................... 71 3 Técnicas gerais .............................................................................................................................. 94 10 Cromatografia em coluna seca ........................................................................ ........................................................................................................................................... 150 3..................5 Matrizes utilizadas em cromatografia líquida de alta eficiência........................2 Eluição ................................................... 115 4 Os grupos trocadores............................................................................6 Trocadores iônicos líquidos........................................... 115 5 Propriedades de trocadores iônicos ........................2 Seletividade.................................................................................................................................... 120 6 5.........................2 Trocadores inorgânicos sintéticos...................................................................................... 126 8 Aplicações......................................................................................1 Fases.............4 Trocadores orgânicos sintéticos..........4 Outros conceitos muito usados em cromatografia por exclusão ...... 120 5.................................................. SPADARO) 1 Introdução ... 123 6... 158 4 ................................................................................................................................................. 107 3............3 Natureza física do gel ...................................1 Capacidade .................................................................... 111 3.......3 A amostra ................................................ 148 3 Recheios usados em cromatografia por exclusão........................................................................................1 Trocadores inorgânicos naturais ................................................................................................................................................................... 141 2..................................................................................................2 A seleção da fase móvel................................................................. 114 3...1 A escolha do trocador iônico ................... 151 3......3 Trocadores com matriz orgânica natural ........................................3 Espalhamento da zona e resolução.......................................................................................................................... 149 3.... 142 2.............. 151 Equipamento para cromatografia por exclusão ........................ 108 3.................................................................................... 124 6.......................2 Natureza química do gel...............................................................................................................1 Coluna cromatográfica..................................... 158 4......................................miolo cromatografia-I 1/31/06 1:06 PM Page 7 11 Aplicações da cromatografia por adsorção ........................................................................................................................... 126 7 Eluição em cromatografia por troca iônica ...................................................................................................... 104 3 A matriz .............. 139 2 Conceitos que caracterizam a cromatografia por exclusão ................................ 100 V – CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (AUGUSTO CÉSAR C........ 123 6. 106 3.......1 Características da fase estacionária ............ 107 3.................................................. 129 9 Referências bibliográficas ............. 149 3.......................................................................................................................... 100 12 Referências bibliográficas ............................. 141 2.............................. 136 VI – CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO (ZULEIKA ROTHSCHILD) 1 Introdução .....................................................................................................................................................................................................................4 Tipos de gel... 121 Fatores que influenciam a cromatografia por troca iônica.................................................................................................... 145 2.............................................. 103 2 O mecanismo de cromatografia por troca iônica ................................................................. ....................................................................................................................................................3 Interações biomoleculares ..................................3 Registro das curvas de eluição......4 Matriz de poliacrilamida ................................................................... 183 5........... 199 6.................................... 162 5................................. 2 Princípio do método.......................3 Matriz de dextrana............... 173 3............................................................................................................................... SPADARO E MARIA JOSÉ VIEIRA FONSECA) 1 Introdução ............................................................2 Purificação de pequenas moléculas ................ 172 3.........................5 Matriz de trisacril........................................2 Dimensões da coluna ................................. 181 Metodologia operacional .............................................................1 Tipo de gel ............................................................. 164 6 Aplicações da cromatografia por exclusão.................... 175 4............................................................................................miolo cromatografia-I 5 1/31/06 1:06 PM Page 8 4....... 172 3..7 Exemplos de resinas por bioafinidade disponíveis comercialmente ....................... 158 4...................................................................................... 185 5.......................................................................... 200 ..................................1 Métodos de ativação de matrizes hidroxílicas ............................................... 170 4 5 6 7 167 3............3 Acoplamento do ligante à matriz ativada.................................................................. 186 5.......................................................................4 A preparação da amostra ... 185 5............... 195 6........................................................................................................................................................... 200 Referências bibliográficas .........1 Matriz de agarose ........................................................................................ 183 5......................................................................... 159 Parâmetros experimentais em cromatografia por exclusão .....................................................5 Tratamento da coluna ................... 195 6............................. 171 3........................................................................................................................................................... 184 5......................... 166 VII – CROMATOGRAFIA POR BIOAFINIDADE (AUGUSTO CÉSAR C...................................................5 O efeito de vazão e temperatura .......................1 Purificação de macromoléculas por cromatografia por bioafinidade......................................................................................................................... 159 5..4 Vazão da fase móvel...........................2 Ativação de matrizes não-hidroxílicas ........... 174 Preparação de fases estacionárias seletivas ......................... 160 5.....3 Tamanho da amostra ..................3 Determinação da capacidade ...7 Matrizes inorgânicas ........................................................................................................................................................................... 180 4..................................... 176 4....................................................................2 Tamanho da coluna .............2 Controle da vazão da fase móvel ...................................................................... 172 3........................... 184 5.............6 Outras matrizes orgânicas ...................................................................... 168 3 Seleção do suporte insolúvel ou matriz ................................ 170 3................................................................................................................................................ 163 5..........................................2 Matriz de celulose................................ 191 Aplicações da cromatografia por bioafinidade.............................................................................. 165 7 Referências bibliográficas .......................................1 Preparação da coluna ............. 163 5.....6 Métodos de eluição............................................... ..............1 Fonte do gás de arraste .............................................1 Fase estacionária sólida........................... 242 6 Derivação ...................3 Fase estacionária imobilizada....4 Espessura do filme da fase estacionária ...5 Tipo e vazão do gás de arraste ...........................................................................................................................................................................................miolo cromatografia-I 1/31/06 1:06 PM Page 9 VIII – CROMATOGRAFIA GASOSA (PIERINA SUELI BONATO) 1 Introdução ...............1 Fase estacionária ....... 247 7..... 232 Fases estacionárias para cromatografia gasosa ......................5 Sistemas de detecção....... 214 4............................................................ COLLINS E LUIZ FERNANDO LOPES GUIMARÃES) 1 2 Princípios de cromatografia líquida de alta eficiência .................... 223 4....................... 232 5. 231 4.................6 Temperatura da coluna .......................................................................................................................... 251 9 Análise quantitativa............3 Comprimento .............. 247 7............................ 205 3 Eficiência ............. 283 ............................. 250 7......................................... 219 4......... 273 1...........2 Cromatografia líquida de alta eficiência e cromatografia gasosa ......... 213 5 4...................................................1 Cromatografia líquida clássica e cromatografia líquida de alta eficiência......................................................................................................................2 Controladores de vazão e de pressão............... 247 7..... 270 IX – CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (ISABEL CRISTINA SALES FONTES JARDIM..................................................................................................... 262 11 Referências bibliográficas .............................................2 Diâmetro interno...............................................4 Fase estacionária quiral................................... 248 7............................................................................. 232 5........... 203 2 Técnicas usadas em cromatografia gasosa .......................................................................................................... 214 4............................................................................................................................3 Sistema de injeção da amostra ................ 275 1................................................................................................................................................................................................................................ 213 4......................6 Sistema de registro e tratamento de dados .................... 282 2..2 Cromatografia líquido-líquido ou por partição................................................................ 242 5............ 244 7 Seleção das condições cromatográficas e otimização da análise ............................................................4 Coluna cromatográfica............................................................................ 277 As técnicas da cromatografia líquida de alta eficiência .................................. 250 8 Análise qualitativa ................................................................................................................. 280 2................ 235 5...... CAROL H.................................................2 Fase estacionária líquida ....................................... 256 10 Aplicações.........................................................................................................................7 Controle de temperatura da coluna.................................... 207 4 Equipamento para cromatografia gasosa ...................................................................................3 Cromatografia líquida com fase ligada...............................................................1 Cromatografia líquido-sólido ou por adsorção .......................... 246 7....................................................................................... injetor e detector ....................................................................................................................................................... 280 2...................... .............................................6 Fases estacionárias para amostras iônicas: supressão iônica.........................................................3 Fases estacionárias para cromatografia líquida de fase quimicamente ligada................................................................................................2 Separação de nitrofenóis .......... troca iônica ............................................4 Fases estacionárias quirais....... 301 5 Características das partículas usadas em cromatografia líquida de alta eficiência .............................................................................................1 Separação de derivados cumarínicos ........................ 338 7 Equipamento para cromatografia líquida de alta eficiência ......................................................7 Detectores ........................................................................................................................ 296 3........................................................................................................ 289 3.............. 354 7...................................................................................................5 Cromatografia por troca iônica ..................................miolo cromatografia-I 3 1/31/06 1:06 PM Page 10 2....................... 387 8 Desenvolvendo uma separação ...........................2 Bombas de alta pressão ................................................................................... 284 2... 347 7................................................. 325 6.............................. 397 X – PRÁTICAS DE LABORATÓRIO 1 2 Cromatografia em papel ...........4 Solução-tampão ....... 287 Fases móveis usadas em cromatografia líquida de alta eficiência........................... 399 1.....................................4 Cromatografia líquida quiral ...........................................................................................4 Medidores e controladores de pressão................................ 308 6................................................................. 367 7.................................................................. 303 6 Características das fases estacionárias usadas em cromatografia líquida de alta eficiência........... 343 7............6 Colunas ..1 Separação de ânions .............2 Separação de cátions ................ 289 3........................................................................3 Preparação da fase móvel ..................................................................... 330 6....................1 Reservatórios da fase móvel ...... 360 7..................................................................................... 388 9 Aplicações da cromatografia líquida de alta eficiência ..... 312 6..................7 Cromatografia por exclusão .. 289 3......... 345 7...............1 Conceitos gerais................... 403 ............................................................................................ 287 2.................................... 308 6..................................................................... 399 1.......................... 287 2... 402 2.............................6 Cromatografia por bioafinidade ..........................5 Sistemas de injeção da amostra............................................................2 Critérios a serem considerados na seleção da fase móvel ........ 392 10 Referências bibliográficas ......................... 357 7.........................................8 Registro dos dados ........ 401 Cromatografia em camada delgada ......................7 Fases estacionárias para cromatografia por exclusão ..........1 Fases estacionárias para cromatografia líquido-sólido............................... 298 4 Eluição em cromatografia líquida de alta eficiência.............................................................................................................................................................2 Fases estacionárias para cromatografia líquido-líquido .................................... 314 6.............................5 Fases estacionárias para cromatografia por bioafinidade ......................................................................3 Programadores de fase móvel....................... 402 2................................................. 356 7......... 329 6....................................................... par iônico............. ..............3 Análise de alguns barbitúricos .......................... 411 Cromatografia por exclusão ................................................ 409 4............................2 Separação de cátions com resina de troca aniônica...4 Separação de nitroanilinas ....................... 404 2............................................................................................. 405 3............. 408 Cromatografia por troca iônica ...3 Análise de cafeína em refrigerantes .................................2 Análise de diazepam em formulações farmacêuticas......... 433 3 Símbolos para cromatografia por exclusão.................................................................................... 404 2...... 439 ÍNDICE REMISSIVO .............................................. 405 3.......................................................... 416 Cromatografia gasosa.............................................................................................miolo cromatografia-I 3 4 5 6 7 8 1/31/06 1:06 PM Page 11 2................. 420 7............................... 416 6............................................................................................................................................... 431 2 Símbolos para cromatografia planar .........3 Separação de corantes ..........1 Separação de cátions em resina de troca catiônica........1 Separação de albumina e azul de bromofenol .....2 Verificação da redução de meta-hemoglobinas usando cromatografia por exclusão ....................... 445 .......... 413 5........................................... 426 8.................... 434 4 Propriedades de fases móveis usadas em cromatografia líquida .............................................. 419 7............................ 424 8................................................................ 409 4...2 Separação de extrato de espinafre.......................................... 405 Cromatografia por adsorção.......................................... 415 Cromatografia por bioafinidade ...................................................1 Análise de analgésicos ........................................................ 428 APÊNDICE 1 Símbolos para cromatografia em coluna .......................................................................................................... 424 8.................. 437 SOBRE OS AUTORES ......................................................................................................................1 Separação de hemoglobinas glicosiladas ..1 Otimização da análise e quantificação de uma mistura de hidrocarbonetos ...........................................................................................................................................................................................................................................................................................1 Separação de fluoreno e fluorenona .............2 Determinação de cafeína em várias bebidas ............................................................................................................... 422 Cromatografia líquida de alta eficiência.............................................................5 Separação de aminoácidos ............. 413 5........................... 419 7...........3 Separação de dicromato e permanganato. 435 5 Comparação das malhas dos sólidos usados em cromatografia......................................................................... 407 3............................................................................................................................. miolo cromatografia-I 1/31/06 1:06 PM Page 12 . Entre esses dois extremos. a primeira edição deste livro básico sobre técnicas cromatográficas. a cromatografia por bioafinidade. O sucesso obtido motivou-nos a lançar uma nova edição. tanto no que se refere ao conteúdo dos capítulos já existentes como a um novo capítulo. tanto no nível acadêmico e em pesquisa como nas aplicações industriais. Esses métodos cromatográficos variam desde os de extrema simplicidade.. em 1990. sendo muito rica nesse tema. da toxicologia etc. publicamos. revista e ampliada. publicados em inglês ou outra língua estrangeira. . da bioquímica.miolo cromatografia-I 1/31/06 1:06 PM Page 13 APRESENTAÇÃO Os diversos métodos de separação cromatográfica têm sido aplicados em milhares de laboratórios no mundo para decifrar os inúmeros e complexos problemas da química. estão disponíveis vários livros especializados. com o título de Introdução a métodos cromatográficos. Na tentativa de evitar a dependência de livros em língua estrangeira. teóricas e práticas sobre essas técnicas de tão largo uso. usados só por especialistas. das ciências ambientais. Ao longo de mais de dez anos desde essa revisão. que descreve outra modalidade de cromatografia. são raros os livros em língua portuguesa que contenham as informações básicas. Para cada modalidade de cromatografia. que podem ser facilmente manipulados por aqueles que não são peritos. existem muitas variações de maior ou menor complexidade. a literatura especializada aumentou. que apresentou informações sobre as várias modalidades de cromatografia. até os de alta sofisticação. Porém. em 1987. Este livro continua sendo destinado ao uso. nem é um compêndio que abrange referências a todos os novos desenvolvimentos nesse campo. O livro consiste de um capítulo sobre alguns princípios básicos de cromatografia. Pode também servir como base para o pesquisador que pretende usar a cromatografia apenas como uma ferramenta em suas experiências. Chem. Apesar de os capítulos terem sido escritos por autores diferentes. e apêndices com os símbolos recomendados para uso em cromatografia na língua portuguesa. porém ainda mantendo o objetivo inicial de contar com uma obra que apresente informações básicas sobre as diversas modalidades de cromatografia. além de outras informações relevantes. .819). Entretanto. Fundamentos de cromatografia. Ettre. 65. os leitores que procurarem as referências citadas deverão estar alertas para o fato de que os símbolos e termos usados neste livro podem. cada um descrevendo a sua especialidade. S. oito capítulos que descrevem as diferentes técnicas cromatográficas. em 1993 (L. p. como texto. visto que ainda não existe uniformidade nos símbolos e termos usados nas diferentes modalidades de cromatografia. As unidades das quantidades físicas e símbolos adotados seguiram as indicações do Sistema Internacional de Unidades. ser substituídos por outros. um capítulo que reúne sugestões para experimentos na programação experimental das disciplinas de graduação. houve um esforço coletivo de uniformização do texto no que se refere aos termos e símbolos usados — em sua maioria. ou como livro introdutório às técnicas de separação cromatográfica para pós-graduandos. em cursos de graduação. procurando uma atualização mediante os constantes desenvolvimentos relatados na literatura. nem entre autores oriundos das diversas partes do mundo. Sendo assim. procedimentos e materiais como à divulgação de novas aplicações.. em demais obras. Conseqüentemente. a obra não se destina a especialistas.miolo cromatografia-I 14 1/31/06 1:06 PM Page 14 F U N D A M E N T O S D E C R O M AT O G R A F I A tanto no que se refere à divulgação de novas técnicas. os recomendados pela União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC). Pure Appl. sem necessitar de uma base teórica profunda. consideramos bastante oportuno realizar uma nova revisão. com um novo título. colaboraram. direta ou indiretamente. Além disso. agradeceriam não só sugestões como indicações de erros e/ou conceitos mal formulados. para que esta publicação se tornasse viável. em especial. pela dedicação no manuseio das novas figuras encontradas nesta edição. com seu trabalho e entusiasmo.miolo cromatografia-I 1/31/06 1:06 PM Page 15 A P R E S E N TA Ç Ã O Os organizadores e autores desta obra consideram que nela aplicaram o melhor de seus esforços. 15 . agradecem aos que. à doutora Carla Beatriz Grespan Bottoli. No entanto. miolo cromatografia-I 1/31/06 1:06 PM Page 16 . que estão em contato íntimo. . o que resulta em migrações diferenciais desses componentes. a cromatografia ocupa um lugar de destaque devido à facilidade com que efetua separação. enquanto neste serão apresentados alguns dos conceitos mais gerais. identificação e quantificação das espécies químicas. Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária. os componentes da mistura são distribuídos pelas duas fases de tal forma que cada um deles é seletivamente retido pela fase estacionária. como a espectrofotometria ou a espectrometria de massas. Collins 1 INTRODUÇÃO Entre os métodos modernos de análise. por si mesma ou em conjunto com outras técnicas instrumentais de análise.miolo cromatografia-I 1/31/06 1:06 PM Page 17 I PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CROMATOGRAFIA Carol H. A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura. enquanto a outra se move através dela. será relatada uma breve revisão histórica do desenvolvimento das técnicas cromatográficas mais importantes. Existem várias formas de realizar o processo cromatográfico. realizada através da distribuição desses componentes em duas fases. Antes disso. Uma das fases permanece estacionária. Detalhes sobre algumas dessas formas serão assuntos dos capítulos a seguir. já nessa época os processos que utilizavam a migração diferencial eram bem conhecidos. Em 1941. aplicaram à cromatografia o conceito já bem conhecido em outros processos de separação. para o desenvolvimento circular de misturas de sais inorgânicos. que. “cromatograma” e “método cromatográfico” são atribuídos ao botânico russo Mikhael Semenovich Tswett.miolo cromatografia-I 18 1/31/06 1:06 PM Page 18 F U N D A M E N T O S D E C R O M AT O G R A F I A 2 ASPECTOS DA HISTÓRIA DA CROMATOGRAFIA Os termos e expressões “cromatografia”. O uso de sólidos em camada delgada sobre vidro. e arrastou os diferentes componentes com éter de petróleo. e Day. embora ele tenha explicitado que o processo não depende da cor. de altura equivalente a um prato. Apesar dessas experiências. exceto para facilitar a identificação dos componentes separados. Bem antes deles. nas quais usou colunas de vidro recheadas com vários sólidos. finamente divididos. enquanto Schoenbein fez experiências similares com tiras de papel mergulhadas em solventes. Paralelamente aos desenvolvimentos de Tswett. os utilizou em dois trabalhos que descrevem suas experiências na separação dos componentes de extratos de folhas. repetindo as experiências de Tswett. Todavia. nos Estados Unidos. usando uma coluna recheada com carbonato de cálcio pulverizado como fase estacionária e éter de petróleo como fase móvel. na Inglaterra. Reed. respectivamente. no lugar de papel. Martin e Synge publicaram um trabalho importantíssimo no qual descreveram a cromatografia por partição (cromatografia líquido-líquido). O nome deriva das palavras gregas chrom (cor) e graphe (escrever). considerou-se que a época moderna da cromatografia começou na década de 1930. quando Kuhn e Lederer “redescobriram” e aperfeiçoaram a cromatografia em coluna. separando e identificando as xantofilas da gema de ovo. em 1906. e anteciparam o . aplicaram colunas contendo sólidos e misturas de solventes orgânicos para a separação de sais orgânicos e amostras de petróleo. Runge descrevera os “desenhos” feitos por misturas de sais e por tintas que foram colocadas no centro de um papel de filtro e depois espalhadas pela passagem de um solvente. foi experimentado por Beyerinck em 1889. reintroduziu a cromatografia em papel. por Pretorius e colaboradores e por McWilliams e Dewar. arrastando-os sobre sílica com um gás. A cromatografia gás-sólido foi descrita em 1941. Posteriormente. também em 1958. Por esse trabalho. nos anos 30. efetuado por Kirchner e colaboradores. baseadas em fenol e formaldeído. com James. enquanto Cremer e Prior foram os primeiros a descrever um cromatógrafo a gás completo. para a análise de produtos farmacêuticos. por Izmailov e Schraiber. feita por Adams e Holmes. A cromatografia gás-líquido foi relatada por Martin e James em 1952. por Ray. resinas de poliacrilato ou poliestireno entre- 19 . do método de preparar as placas com reprodutibilidade. o Prêmio Nobel. e. ampliou seus poderes analíticos a ponto de tornar a cromatografia gasosa o método analítico de separação e determinação mais usado no mundo. receberam. em 1952. no vapor a 100 ºC. aplicando as chamadas “fases reversas”. e o uso de um detector por condutividade térmica. mas não foi muito usada até o desenvolvimento. das primeiras resinas de troca iônica. em 1958. que permitem a troca de cátions. por Hesse e colaboradores. com a síntese. os primeiros equipamentos foram colocados no mercado dos Estados Unidos e da Inglaterra. A cromatografia em camada delgada foi reintroduzida em 1938. atualizou a cromatografia gás-líquido. na época moderna. do detector por ionização em chama. desenvolveu a cromatografia líquida.miolo cromatografia-I 1/31/06 1:06 PM Page 19 P R I N C Í P I O S B Á S I C O S D E C R O M AT O G R A F I A surgimento de duas técnicas cromatográficas pressurizadas. em 1954. Um ano depois. O desenvolvimento. a cromatografia gasosa e a cromatografia líquida de alta eficiência. dióxido de carbono. utilizando hidrogênio como gás de arraste. e por Stahl. do método de aderir o sólido ao suporte. quase simultâneo. com Howard. ampliou a detectibilidade do método cromatográfico. enquanto a introdução de colunas capilares por Golay. A cromatografia por troca iônica também teve seu início. que separaram dois ácidos graxos. Martin também participou em outros desenvolvimentos importantes na história da cromatografia: com Consden e Gordon. sílica como fase estacionária e um catarômetro como detector. os enchimentos para a cromatografia líquida de alta eficiência foram sendo desenvolvidos. e seu uso teve início com as experiências. por Kirkland e outros. operado com fase móvel líquida sob pressão e com métodos de detecção sensíveis. efetuadas por Cohn. por Ishii e por Novotny e seus colaboradores. Huber e Hulsman. por Scott. Paralelamente. em microescala. e. similar às usadas ainda hoje em cromatografia líquida de alta eficiência. com a introdução de uma bomba semelhante a um pistão. após uma reação pós-coluna para produzir os derivados com ninhidrina. substituíram as resinas originais. Kirkland e outros. . esse sistema para a análise de aminoácidos foi modificado por Hamilton e Andrews. ampliando as aplicações dessa técnica. inicialmente os peliculares (partículas superficialmente porosas). Outros desenvolvimentos na década de 1960. aperfeiçoaram os sistemas de bombeamento e detecção de cromatografia líquida de alta eficiência. possibilita análises de rapidez comparável àquela obtida em cromatografia gasosa. Jentoft e Gouw. Em 1959. com resultados altamente satisfatórios.miolo cromatografia-I 20 1/31/06 1:06 PM Page 20 F U N D A M E N T O S D E C R O M AT O G R A F I A cruzado com divinilbenzeno. quer orgânica quer inorgânica. as partículas completamente porosas de diâmetro pequeno (10 µm. que posteriormente a mecanizaram. usando uma bomba peristáltica para empurrar a fase móvel e um fotômetro para a detecção. comprovando que o uso desses equipamentos. viabilizou o uso de cromatografia 1íquida de alta eficiência para qualquer tipo de análise. A separação de aminoácidos foi aperfeiçoada por Moore e Stein. de separação de aminoácidos originados de proteína. por Nickless e colaboradores. As resinas de poliestireno-divinilbenzeno com substituintes iônicos são muito aplicadas em bioquímica. por Karr e colaboradores. 5 µm e 3 µm). de fases estacionárias contendo grupos alquilas quimicamente ligados ao suporte permitiu a aplicação da chamada “fase reversa” (fase estacionária apolar). posteriormente. por Halasz e Horvath. com substituintes sulfônicos e carboxílicos (para a troca de cátions) ou alquilaminos (para a troca de ânions). Snyder. O desenvolvimento. enquanto a introdução de colunas de diâmetro interno menores (as “microbores” e as “capilares recheadas”).