Laboratorio de Inmunología GeneralSemestre 2016-1 __________________________________________________________________ EJERCICIO EXPERIMENTAL No 2 Identificación de la estructura de los órganos linfoides primarios y secundarios _______________________________________________________________________________ OBJETIVO Identificar la estructura y localización de los diferentes órganos linfoides primarios y secundarios a través de sus características morfológicas y de afinidad por colorantes. ¿CÓMO? A través de la disección en ratones y la tinción tipo Romanowsky. MATERIALES Microscopio óptico Portaobjetos Agujas Guantes Jeringa de 1mL Tela de organza Tabla de disección Cronómetro Aceite de inmersión Colorantes de DADE Diff-Quik ®. Solución fijadora: 1.8 g/L Triarilmetano en alcohol metílico Solución I: 1 g/L Xanteno Solución II: 1.25 g/L Thiazine (Mezcla de 0.625 g/L de azur A y 0.625 g/L de azul de metileno) PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL (Es importante ver el video en you tube) SESIÒN No1 Localización de los órganos linfoides. ◙ Sacrificar al ratón por dislocación cervical. ◙ Fijar el ratón a la tabla de disección utilizando agujas ◙ Rociar alcohol sobre el ratón para facilitar el manejo del mismo. ◙ Realizar una incisión en V en la piel del ratón en región abdominal del mismo, retirar con cuidado la piel del ratón hacia los lados y comenzar la extracción de los ganglios linfáticos y timo. (Apoyarse con el esquema) ◙ Depositar 3 ganglios en 0.5 mL de PBS en una placa de 6 pozos. ◙ Disgregar el tejo con ayuda de una aguja. ◙ Depositar el timo en 0.5 mL de PBS en una placa de 6 pozos. ◙ Obtener el bazo y cortar una sección de alrededor de 0.04 g. ◙ Colocar el tejido en 0.5mL de PBS y disgregar con la ayuda del embolo de una jeringa de 1 mL y tela de organza. ◙ Una vez obtenidas las suspensiones celulares. ◙ Colocar una gota de la suspensión celular en un portaobjetos limpio y desengrasado. ◙ Cubrir con 100 μL de Diff-Quik Fixative (solución fijadora) dejar actuar durante 1 minuto. ◙ Escurrir la solución e inmediatamente colocar 100 μL de Diff-Quik Solución I (Colorante acido) y dejar actuar 30 segundos. C.L.M M.A.M 1 ganglios. prefundir el bazo con PBS y cortar una sección de alrededor de 0. ◙ Realizar una incisión en V en la piel del ratón en región abdominal del mismo.04 g ◙ Colocar el tejido en 0. 2.5 mL de PBS en una placa de 6 pozos. ◙ Dejar secar aireando el portaobjetos ◙ Observar al microscopio óptico con el objetivo de 40X y posteriormente a 100X utilizando aceite de inmersión o aceite de bálsamo de Canadá. ◙ Lavar con agua. timo y placas de séller. ganglios. ◙ Una vez obtenidas las suspensiones celulares. Observar al microscopio las preparaciones de bazo. ◙ Sacrificar al ratón por dislocación cervical. ◙ Cubrir con 100 μL de Diff-Quik Fixative (solución fijadora) dejar actuar durante 1 minuto. ◙ Obtener el bazo. Localización de los órganos linfoides. Observar al microscopio las preparaciones de bazo. 2. ◙ Dejar secar aireando el portaobjetos. timo y placas de peyer. Sesión No 2 ◙ Observar al microscopio óptico con el objetivo de 40X y posteriormente a 100X utilizando aceite de inmersión o aceite de bálsamo de Canadá. ◙ Depositar el timo en 0.5mL de PBS y disgregar con la ayuda del embolo de una jeringa de 1 mL y tela de organza. ◙ Escurrir la solución e inmediatamente colocar 100 μL de Diff-Quik Solución II (Colorante Básico) y dejar actuar 60 segundos. ◙ Lavar con agua. ayudarse del Anexo 2 para la identificación de los diversos componentes.L.M M. retirar con cuidado la piel del ratón hacia los lados y comenzar la extracción de los ganglios linfáticos y timo. (Anexo 1) ◙ Depositar 3 ganglios en 0. ayudarse del Anexo 3 para la identificación de los diversos componentes. ◙ Escurrir la solución e inmediatamente colocar 100 μL de Diff-Quik Solución I (Colorante acido) y dejar actuar 30 segundos. ◙ Disgregar el tejo con ayuda de una aguja. ◙ Fijar el ratón a la tabla de disección utilizando agujas ◙ Rociar alcohol sobre el ratón para facilitar el manejo del mismo.M 2 .A.Laboratorio de Inmunología General Semestre 2016-1 __________________________________________________________________ ◙ Escurrir la solución e inmediatamente colocar 100 μL de Diff-Quik Solución II (Colorante Básico) y dejar actuar 60 segundos. C.5 mL de PBS en una placa de 6 pozos. ◙ Colocar una gota de la suspensión celular en un portaobjetos limpio y desengrasado. A.Laboratorio de Inmunología General Semestre 2016-1 __________________________________________________________________ ANEXO1.L.M M. Esquema de los órganos linfoide primarios y secundarios de ratón C.M 3 . ◙ Macrófagos: son los leucocitos de mayor tamaño. ◙ Macrófagos: son los leucocitos de mayor tamaño. poco frecuente. tienen un solo núcleo que ocupa casi toda la célula. tienen un solo núcleo que ocupa casi toda la célula.L. laxo y redondo. tienen un solo núcleo que ocupa casi toda la célula. núcleo grande. poco frecuente. Timo: ◙ Linfocitos: de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos. laxo y redondo.A.Laboratorio de Inmunología General Semestre 2016-1 __________________________________________________________________ ANEXO 2. con una gran cantidad de prolongaciones citoplasmáticas. con una gran cantidad de prolongaciones citoplasmáticas. Características de lo órganos linfoide primarios y secundarios Bazo: ◙ Linfocitos: de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos. Ganglio: ◙ Linfocitos: de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos.M M. ◙ Células dendríticas: Mayores que los linfocitos muy poco frecuentes. núcleo grande. C. ◙ Células dendríticas: Mayores que los linfocitos muy poco frecuentes.M 4 . Bazo.A.Laboratorio de Inmunología General Semestre 2016-1 __________________________________________________________________ Anexo 3. Se pueden apreciar en ocasiones los centros germinales. Los corpúsculos de Hassall son exclusivos del timo y se localizan en la médula. Ganglios y Placas de Peyer. Son estructuras redondeadas y acidófilas constituidas por células epiteliales aplanadas dispuestas en forma concéntrica. El timo carece de nódulos linfoides y está sostenido por células reticulares epiteliales.L. que pueden sufrir queratinización y calcificación en la zona central. TIMO El timo está rodeado de una delgada cápsula de tejido conectivo que se proyecta hacia el interior como septos dividiendo al órgano en lobulillos.M 5 . particularmente íleon. En cada lobulillo se aprecia una corteza de linfocitos densamente agrupados y una médula más clara. C. PLACAS DE PEYER Las placas de Peyer están formadas por agregados de nódulos linfoides situados en la lámina propia y submucosa de intestino delgado. Cortes histológicos de Timo.M M. El tejido linfoide difuso entre dichos folículos linfoides está formado por linfocitos T. A. C. La pulpa blanca esta situada periarteriolarmente (alrededor de las ramas de la arteria esplénica central) formando estructuras envolventes o vainas cilíndricas conocidas como vaina linfoide periarteriolar que se mantienen parcialmente separadas de la pulpa roja por una capa de tejido linfoide laxo conocida como zona marginal.M M. en la parte cortical se observan folículos secundarios y tejido linfoide difuso quedando una porción central correspondiente a la zona medular rica en vasos sanguíneos y senos linfáticos.M 6 . Dentro de la pulpa blanca las células linfoides se distribuyen tanto de forma dispersa como agrupadas en folículos. La pulpa roja formado por senos venososo y cordones celulares (cordones de Billroth).L. El bazo consta de una porción conocida como pulpa blanca o pupa roja. BAZO La sección esplénica muestra una cápsula fibrosa de la que se desprenden trabèculas o septos que dividen parcialmente al parénquima esplénico.Laboratorio de Inmunología General Semestre 2016-1 __________________________________________________________________ GANGLIOS LINFÁTICOS En periferia se distingue el tejido conjuntivo capsular fibroso por debajo del cual aparece el seno subcapsular como un espacio vascular que en determinados puntos es difícil de apreciar. A.L.M 7 .Laboratorio de Inmunología General Semestre 2016-1 __________________________________________________________________ C.M M.